JPWO2017029992A1 - 免疫学的検出方法及びこれに用いるテストストリップ - Google Patents
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Abstract
Description
特に、イムノクロマトグラフィーを利用した免疫反応における非特異反応抑制剤、これを利用した非特異反応抑制方法、検出方法及びイムノクロマトグラフィー用テストストリップに関する。
これらの試料中に含まれる被検出物質をイムノクロマトグラフィーを利用して検出するためには、試料中に含まれるさまざまな検出妨害物質を排除する必要がある。妨害物質としては、イムノクロマトグラフィーによる試料の展開そのものの妨げになるような、つまり、展開用の不溶性メンブレンの詰まりの原因となるような物質や、被検出物質が存在しないにも関わらず、呈色反応を示すような、いわゆる非特異反応の原因となるような物質が挙げられる。
一般に、不溶性メンブレン中の詰まりの原因となるような物質を排除するためには、サンプルパッドにその分離機能を担保させたり、全血を試料とする場合には、血球を排除するために血球分離膜をサンプル添加部の下流に配置する方法が知られている。しかし、非特異反応については種々の原因が考えられるが未だ明らかではなく、したがって対応策も確立されていないのが現状である。
このような抗原抗体反応における非特異反応をブロッキングする試薬として一般的には、ゼラチン、カゼイン、ウシ血清アルブミン、合成高分子などが知られており、これらをイムノクロマトグラフィーを利用した反応の系内に共存させる方法が知られている(特許文献1、特許文献2)。
このように、非特異反応による影響を排除するための方法は種々知られているが、糞便由来サンプルに起因する非特異反応の抑制に対して効果があるのかどうかについては不明であった。
ところで、特許文献3には、糞便を検体に用いたELISA等では検出感度が低く、また非特異反応が多いことから結果の判定に苦慮していたという糞便を検体とする場合の問題点が挙げられ、これを解決するために、ノロウイルス又はサポウイルスをイムノクロマトグラフィーを利用して検出するに際し、pH9.0〜10.0の検体用希釈液を使うことで非特異反応を抑制する方法が開示されている。しかし、本方法では検体希釈液として一般的ではないアルカリ性にする必要があるため、取扱いの点において問題があった。
特に、糞便由来サンプルを不溶性メンブレン中を展開させることによりサンプル中の被検出物質を検出するイムノクロマトグラフィーを利用した検出方法における非特異反応抑制剤、非特異反応抑制方法、イムノクロマトグラフィー検出方法及びイムノクロマトグラフィー用テストストリップを提供することを課題とする。
そして、このような特有の原因物質に対して、非特異反応を抑制する効果を有する物質を検索したところ、意外にも抗IgA抗体を存在させた条件下で免疫測定法を利用した反応を行うことにより、非特異反応を抑制し、偽陽性反応を防止して対象物質を正確に検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の構成を有する。
<1>糞便由来サンプル中の被検出物質を免疫学的に検出する方法であって、抗IgA抗体存在下、免疫反応を行う前記方法。
<2>免疫反応が、抗IgA抗体及び抗IgM抗体の存在で行われる<1>に記載の方法。
<3>免疫学的に検出する方法が、糞便由来サンプルを不溶性メンブレン中を展開させることによりサンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を検出するイムノクロマトグラフィーを利用した検出方法であって、以下の(a)及び(b)の工程を含む方法である、<1>に記載の方法。
(a)抗IgA抗体存在下、サンプルと、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が標識体に固定化されたコンジュゲートを接触させてサンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を形成する工程
(b)前記複合体を不溶性メンブレン中を展開させて、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が固定化された検出部にて、前記複合体を検出する工程
<4>(a)の工程が、抗IgA抗体及び抗IgM抗体の共存下で、サンプルと、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が標識体に固定化されたコンジュゲートを接触させてサンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を形成する工程である<3>に記載の方法。
<5>糞便由来サンプル中の被検出物質を免疫学的に検出する方法における非特異反応抑制方法であって、抗IgA抗体存在下、免疫反応を行う前記方法。
<6>免疫反応が、抗IgA抗体及び抗IgM抗体の存在で行われる<5>に記載の方法。
<7>免疫学的に検出する方法が、糞便由来サンプルを不溶性メンブレン中を展開させることによりサンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を検出するイムノクロマトグラフィーを利用した検出における非特異反応抑制方法であって、以下の工程(a)及び(b)の工程を含む方法である、<5>に記載の方法。
(a)抗IgA抗体存在下、サンプルと、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が標識体に固定化されたコンジュゲートを接触させてサンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を形成する工程
(b)前記複合体を不溶性メンブレン中を展開させて、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が固定化された検出部にて、前記複合体を検出する工程
<8>(a)の工程が、抗IgA抗体及び抗IgM抗体の共存下で、サンプルと、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が標識体に固定化されたコンジュゲートを接触させてサンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を形成する工程である<7>に記載の方法。
<9>糞便由来サンプルを不溶性メンブレン中を展開させることにより、サンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を検出するイムノクロマトグラフィー用テストストリップであって、コンジュゲートは、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が標識体に固定化されたものであり、かつ以下の構成(1)及び(2)を含む、前記テストストリップ。
(1)サンプル供給部を有するサンプルパッドであって、抗IgA抗体が溶出可能に保持されている前記パッド
(2)被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が固定化された、サンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を検出する検出部を有する不溶性メンブレン
<10>コンジュゲートが溶出可能に保持されているコンジュゲートパッドを含む<9>に記載のテストストリップ。
<11>サンプルパッドに、さらに抗IgM抗体が溶出可能に保持されている、<9>又は<10>に記載のテストストリップ。
<12>抗IgA抗体を有効成分とする、糞便由来サンプル用の免疫反応における非特異反応抑制剤。
<13>さらに抗IgM抗体を含有する、<12>に記載の非特異反応抑制剤。
本発明における抗IgA抗体は、糞便由来サンプル中の非特異反応原因物質に結合し、非特異反応を抑制できる抗体であればポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれでもよい。抗IgA抗体は常法にしたがって調製できる。また、これらの抗体の分子全体のほかに、抗原抗体反応活性を有する抗体の機能性断片も本発明では同じく抗体として取り扱う。抗体の機能性断片としては、例えば、F(ab’)2 、Fab’などが挙げられる。これらの機能性断片は前記抗体をタンパク質分解酵素(例えば、ペプシンやパパインなど)で処理することにより製造できる。また、抗体は修飾して用いることもでき、高分子化合物を抗体に結合したり、化学修飾して誘導体化したものも利用することができる。
本発明の抗IgA抗体は、サンプル中の非特異反応を抑制できる状態で存在すればよく、免疫反応系に添加して用いることができる。例えば、サンプル希釈液に含まれていてもよく、また、イムノクロマトグラフィーを利用する場合には、サンプルパッド、サードパッド、コンジュゲートパッド、検出抗体を含む不溶性メンブレンに含まれていてもよい。
不溶性メンブレンに含ませる場合は、検出抗体の存在部位(検出部)よりも上流側であることが望ましい。このうちでもとくに、サンプル希釈液、サンプルパッド、またはサードパッドに含まれていることが望ましい。なお、サンプルパッドと不溶性メンブレンが同一のパッドからなり、同一パッド上で異なる部位にサンプル供給部と検出部の役割を担わせる場合には、抗IgA抗体は、サンプル供給部に存在していることが望ましい。
抗IgA抗体は、各デバイスに非特異反応を抑制できる量が含まれていればよく、例えば1デバイスあたりの含有量が10〜10000μg/testが挙げられ、10〜1000μg/testが好ましく、25〜500μg/testが更に好ましく、40〜200μg/test、40〜100μg/testが更によりいっそう好ましい。
また、糞便由来サンプル中に起因する非特異反応をより完全に近い形で抑制すべく、本発明の抗IgA抗体の他に、抗IgA抗体の非特異反応作用を阻害しない範囲で、他の非特異反応抑制物質と組み合わせることも可能である。そのような物質としては、いわゆる市販のブロッキング剤や抗IgA抗体以外の抗体、例えば、抗IgG抗体、抗IgM抗体、抗IgD抗体、抗IgE抗体等が挙げられる。該ブロッキング剤としては、例えばNEO PROTEIN SAVER(東洋紡エンザイム株式会社)、イムノブロックTM(DSファーマバイオメディカル株式会社)、Applie Block(生化学バイオビジネス株式会社)、SEA BLOCKTM/EIA/WB(East Coast Biologics社)、Blocking One(ナカライテスク社)、ウシ血清アルブミン(以下、「BSA」という)、Blocking Peptide Fragment(東洋紡エンザイム株式会社)、Starting BlockTM(PBS)Blocking Buffer(Thermo Fisher Scientific社)、Smart BlockTM(CANDOR Bioscience 社)、HeteroBlock(OMEGA Biologicals社)、等から、反応系に影響のないものを適宜選択可能である。抗体としては、前記のうちでもとくに抗IgM抗体が望ましい。
本発明者らは、抗IgA抗体単独及び抗IgM抗体単独では抑制できず、両者を存在させることによって初めて抑制できる非特異反応があることをつきとめたことから、両者を組み合わせることで原因物質を広く抑制することに初めて成功した。抗IgM抗体は、それが主成分である試薬として市販されているものとして、HBR(異好性阻止試薬、スカンティボディー社)が挙げられる(Clinical Chemistry 45:7,942-956,1999)。
抗IgM抗体は、1デバイスあたりの含有量が5〜500μg/testが好ましく、10〜250μg/testが更に好ましく、20〜100μg/test、40〜100μg/testがよりいっそう好ましい。
本発明において、試料としては糞便を用いる。糞便は、そのままサンプルとして用いてもよく、適宜希釈液によって希釈してサンプルとして用いてもよい。また、適宜希釈し濾過したものをサンプルとして用いてもよい。
本発明の被検出物質としては、試料である糞便中に含まれ、抗原抗体反応を利用して検出し得るものであればいずれでもよく、ウイルス、寄生虫、タンパク質などが挙げられる。
例えば感染性胃腸炎は、ウイルスおよび寄生虫が主な原因であり、被検出物質となるウイルスとしては、ノロウイルス、アデノウイルス、ロタウイルス、サポウイルス、エンテロウイルス等があげられ、被検出物質となる寄生虫としてはクリプトスピリジウム、アメーバ赤痢、ジアルジア等があげられる。
このほかにも、被検出物質となるウイルスとしてインフルエンザウイルス、被検出物質となるタンパク質としては、ヒトヘモグロビン、B型肝炎ウイルス抗体、C型肝炎ウイルス抗体、ヒト免疫不全ウイルス抗体等が挙げられる。
本発明により提供される免疫学的検出方法は、免疫反応を利用する検出方法であればいずれでもよく、例えば、粒子凝集イムノアッセイ法であるラテックス免疫凝集法(以下、LTIA法という)、代表的な標識イムノアッセイ法であるELISA法、イムノクロマトグラフィーを利用した検出方法等が挙げられるが、このうちでも特にイムノクロマトグラフィーを利用した検出方法が望ましい。
LTIA法は、典型的には、2種以上の抗検出対象抗体を用いて、少なくとも1種をラテックスに固定化させ、糞便サンプル中の被検出物質とラテックス固定化抗体との免疫複合体を形成させて凝集させることにより対象物質を検出する方法である。
臨床検査で使用されるLTIA法の試薬は、通常、第一試液、第二試液の形態で提供され、順次サンプルと混合して使用される。
本発明の抗IgA抗体は、第一試液または第二試液のいずれか一方あるいは両方に含まれる場合があるが、少なくとも第一試液に含まれていることが望ましい。また、本発明において抗IgM抗体を含む場合も、第一試液または第二試液のいずれか一方あるいは両方に含まれる場合があるが、少なくとも第一試液に含まれていることが望ましい。
LTIA法に使用されるラテックス粒子は、感度向上などの所望の性能を得るため、材質や粒子径、表面荷電量を適宜選択することができる。ラテックス粒子としては、抗検出対象抗体の担持に適したものであれば良い。例えば、ポリスチレン、スチレン−スチレンスルホン酸(塩)共重合体、スチレン−メタクリル酸共重合体、アクリルニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸エステル共重合体等が挙げられる。ラテックス粒子の形状は特に限定されないが、その平均粒子径は、ラテックス粒子表面の抗体と検出対象との凝集反応の結果生じる凝集体が、肉眼又は光学的に検出できるに十分な大きさを有することが好ましい。好ましい平均粒子径としては0.02〜1.6μmであり、特に0.03〜0.5μmが好ましい。また、金属コロイド、ゼラチン、リポソーム、マイクロカプセル、シリカ、アルミナ、カーボンブラック、金属化合物、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなる粒子をラテックス粒子に代えて使用することもできる。
ELISA法は、典型的には2種の抗検出対象抗体を用いて、(a)第1の抗検出対象抗体を固定化した固相(プレートなど)に試料を添加し糞便由来サンプル中の対象物と固定化抗体の複合体を形成し、(b)標識物質で標識された第2の抗検出対象抗体により当該複合体とサンドイッチを形成し、これを検出する方法である。
本発明の抗IgA抗体は、試料を希釈する希釈液に含まれている場合、(a)の固相にあらかじめ添加されて液状で存在する場合、添加された後乾燥されて使用されるまで乾燥状態で存在する場合、あるいは(b)の抗体を含有する溶液に含まれている場合など、固相上で免疫反応が行われる際に存在していれば、いずれでもよく、このうち試料を希釈する希釈液に含まれている場合が望ましい。
イムノクロマトグラフィーを利用した検出方法は、典型的には、以下のようなテストストリップを利用する。
本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップは、糞便由来のサンプルを不溶性メンブレン中を展開させることにより、サンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を検出するテストストリップであって、コンジュゲートは、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が標識体に固定化されたものであり、かつ以下の構成(1)及び(2)を有している。
(1)サンプル供給部を有するサンプルパッドであって、抗IgA抗体が溶出可能に保持されている前記パッド
(2)被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が固定化された、サンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を検出する検出部を有する不溶性メンブレン
サンプルの流れ方向の上流より下流に向かって、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、サードパッド、不溶性メンブレンの順で配置され、それぞれ上下の層と少なくとも一部が重複するように配置される。このような配置例のテストストリップを図1に示す。
このようなテストストリップのサンプルパッドに、被検出物質を含有するサンプルが供給されると、被検出物質はサンプルパッドを通過して下流側のコンジュゲートパッドへと流れる。コンジュゲートパッドでは、被検出物質とコンジュゲートが接触して複合体(凝集体)を形成しながら当該パッドを通過する。その後、複合体はコンジュゲートパッドの下面に接触して配置された多孔質サードパッドを通過し、不溶性メンブレンへと展開される。
不溶性メンブレンには、その一部に被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が固定化されているため、該複合体がここで免疫反応により結合して固定化されることになる。固定化された複合体は、コンジュゲートに由来する吸光度あるいは反射光を検出する手段により検出される。
上記タイプAのテストストリップとの違いは、サンプルパッドとコンジュゲートパッドが一体になった点であり、つまり、サンプルパッドの一部にサンプル供給部およびコンジュゲート部が構成されている点である。
上記サンプル供給部は、被検出物質を含有するサンプルを供給する部位であり、上記コンジュゲート部は、コンジュゲートを含有する部位であり、サンプル供給部がコンジュゲート部の上流側となる。
上記タイプAのテストストリップとの違いは、コンジュゲートパッドが存在せず、コンジュゲートは個別のコンジュゲート試薬として存在する点である。例えば、フィルター中にコンジュゲートが内蔵されたフィルターチップが挙げられる。このようなフィルターチップを使って、検体希釈液を通過させることでコンジュゲートと被検出物質が結合し、複合体(凝集体)を形成する。これをコンジュゲートパッドを有さないこと以外はタイプAと同一の前記テストストリップに供給することで、被検出物質を検出することができる。
本発明に用いられるサンプルパッドは、サンプルを受け入れる部位(サンプル供給部)を有する。パッド状に成型された状態で液体のサンプルを吸収し、液体と検出対象物とが通り抜けることができるどんな物質及び形態をも含む。サンプルパッドに適した材料の具体例として、ガラス繊維(グラスファイバー)、アクリル繊維、親水性ポリエチレン材、乾燥紙、紙パルプ、織物等が含まれるが、これらに限定されない。好適には、グラスファイバー製パッドが用いられる。該サンプルパッドには、後述するコンジュゲートパッドの機能を併せ持たせることも出来る。また、サンプルパッドには、抗体固定化メンブレンにおける非特異的反応(吸着)を防止・抑制する目的で、通常使用されるブロッキング試薬を含ませることができる。
サードパッドは、試料の性状等により必要に応じて配置されることが望ましく、サンプル中の被検出物質とコンジュゲートの複合体を透過させることができるものであればいずれでもよい。具体的には、ガラス繊維(グラスファイバー)、アクリル繊維、親水性ポリエチレン材、乾燥紙、紙パルプ、織物等が含まれるが、特に、ポリスルホンまたはセルロースアセテートからなる多孔質性の部材であることが望ましい。
また、本発明の多孔質性サードパッドの孔径は、平均孔径で1〜100μmであることが望ましく、より望ましくは10〜100μm、よりいっそう望ましくは20〜80μmであり25〜70μmがもっとも望ましい。1μm未満では詰まりの原因となり、検体の流れ自体が不良となるからであり100μmより大きいと前記非特異反応物質を捕捉することができないためと思われるからである。
本発明に用いられる不溶性メンブレンは、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が固定化された少なくとも1つの検出部を有する。被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原の不溶性メンブレン担体への固定化は、従来公知の方法で実施することができる。ラテラルフロー式のイムノクロマト試薬の場合には、上記の抗体または抗原を所定の濃度で含有する液を調製し、ノズルから液を一定の速度で吐出しながら水平方向に移動させることのできる機構を有する装置などを用いて、上記液をライン状に不溶性メンブレン担体に塗布し、乾燥させることにより固定化させることができる。上記液の抗体または抗原の濃度は0.1〜5mg/mLが好ましく、0.5〜2mg/mLがさらに好適である。また、抗体または抗原の不溶性メンブレン担体への固定化量は、ラテラルフロー式の場合には上記の装置のノズルからの吐出速度を調節することによって最適化でき、0.5〜2μL/cmが好適である。
なお、上記ラテラルフロー式のイムノクロマト試薬を用いた測定方法は、サンプルが毛細管現象により不溶性メンブレン担体に対して並行方向に移動するように展開する方式の測定方法である。
また、上記の抗体または抗原を所定の濃度で含有する液は、緩衝液に抗体または抗原を添加することにより調製することができる。該緩衝液の種類としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液など通常使用される緩衝液をあげることができる。緩衝液のpHは6.0〜9.5の範囲が好ましく、6.5〜8.5がより好ましく、7.0〜8.0がさらに好ましい。緩衝液には、さらに塩化ナトリウムなどの塩類、スクロースなどの安定剤や保存剤、プロクリン(登録商標)などの防腐剤等を含んでもよい。塩類は塩化ナトリウムなどのようにイオン強度の調整のために含ませるもののほか、水酸化ナトリウムなど緩衝液のpHを調整する目的で添加するものも含まれる。
不溶性メンブレンに抗体または抗原を固定化した後、さらに、通常使用されるブロッキング剤を溶液あるいは蒸気状にして抗体または抗原を固定化した部位以外を被覆し、ブロッキングを行うこともできる。
なお、不溶性メンブレンには、従来からイムノクロマト試薬で用いられているコントロール捕捉試薬を固定化してもよい。該コントロール捕捉試薬は、アッセイの信頼性を担保するための試薬であって、コンジュゲートパッドに含ませたコントロール試薬を捕捉するものである。例えば、コンジュゲートパッドに標識されたスカシ貝由来ヘモシアニン(以下、KLHという)をコントロール試薬として含む場合には、抗KLH抗体などがコントロール捕捉試薬に該当する。コントロール捕捉試薬を固定化する位置は、アッセイ系の設計に適合するよう適宜選択することができる。
本発明で用いられる被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原は、被検出物質に結合可能な抗体または抗原であり、被検出物質がウイルスや抗原の場合は抗体、被検出物質が抗体の場合は抗原が好ましい。被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原は、後述する標識体および検出部に固定化される。標識体および検出部に固定化される抗体または抗原は同一であってもよいが、標識体と検出部とで別のものであることが好ましい。
本発明で用いられる標識体は、従来からイムノクロマトグラフィー用テストストリップに用いられている公知の標識体を用いることができる。例えば、金コロイド粒子や白金コロイド粒子などのコロイド状金属粒子、カラーラテックス粒子、磁性粒子、蛍光粒子などが好ましく、特に金コロイド粒子、カラーラテックス粒子が好ましい。
本発明で用いられるコンジュゲートは、上記のような標識体に被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が固定化されたものである。コンジュゲートは、被検出物質としてノロウィルスを検出する場合、金コロイド粒子に抗ノロウイルスモノクローナル抗体が固定化されたものが好ましい。
被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原を標識体へ固定化させる方法としては、物理吸着、化学結合等が挙げられ、物理吸着により固定化させるのが一般的である。
本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップは、さらに測定条件、サンプルに応じて他の試薬や構成を含み得る。
他の試薬としては、例えば非特異反応を防止するブロッキング剤が挙げられる。
他の構成としては、例えば、不溶性メンブレンを移動・通過したサンプルを吸収することにより、サンプルの展開を制御する吸収パッドが挙げられる。
本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップの作製は実施例に記載の方法を適宜、修飾・改変して行うことができる。
本発明のイムノクロマトグラフィーを利用した検出キットは、前記イムノクロマトグラフィー用テストストリップを含むものであればよい。本検出キットは、他に検出に必要な試薬、試料の希釈液、試験用チューブ、便採取用の綿棒、取扱い説明書、テストストリップ格納用のハウジングなどを含んでもよい。
本明細書中、上流または下流という意味は、サンプルの流れる方向の上流側、下流側という意味で用いる。すなわち、本発明のテストストリップで上からサンプルパッド、コンジュゲートパッド、サードパッド、不溶性メンブレンが一部で重なるように積層されている場合、サンプルパッドがもっとも上流であり、不溶性メンブレンが下流ということになる。また、不溶性メンブレンの下流側端部が重なるように上にエンドパッドが積層されることがあるが、この場合、エンドパッドがもっとも下流である。
一般に非特異反応抑制剤として知られているブロッキング剤や界面活性剤とともに抗IgA抗体の非特異反応抑制効果を調べた。
1.イムノクロマトグラフィー用テストストリップの作製
1)金コロイド標識抗ノロウイルスモノクローナル抗体(抗ノロウイルス抗体コンジュゲート)の調製
(i)金コロイド溶液の調製
80℃に加温した精製水5,000mLに、5.0%クエン酸三アンモニウム水溶液および5.0% テトラクロロ金(III)酸水溶液をそれぞれ10mLずつ加え、撹拌しながら10分間反応させた。その後反応液を再び加温し、35分後氷水中で冷却して平均粒子径50nmの金コロイド溶液を作製した。当該金コロイド溶液を、RO水にて、極大吸収波長での吸光度が1.0 OD/mLの平均粒子径50nm金コロイド溶液(pH8.5)に調整した。
(ii)抗ノロウイルス抗体コンジュゲートの調製
上記(i)で得られた金コロイド溶液(pH8.5)20mLに対し、50μg/mL抗ノロウイルス抗体(コスモバイオ社)を含む2mmol/Lホウ酸水溶液(pH8.5)1.0mLを添加し、10分間撹拌した。その後、10%BSAを1.5mL添加し、さらに5分間撹拌して抗体感作金コロイド溶液を作製した。抗体感作金コロイド溶液を10℃で10,000rpm 45分間遠心し、上清を除き、遠心により沈殿した抗体感作金コロイドをコンジュゲート用希釈液(Conjugate Dilution Buffer、SCRIPPS社)で希釈して回収した。回収した抗体感作金コロイドを極大吸収波長の吸光度が1.5 O.D./mLとなるよう0.5%カゼインを含むコンジュゲート用希釈液で希釈して、コンジュゲートパッド塗布液とした(コンジュゲートパッド塗布液1)。
上記10%BSAに代えて他のブロッキング剤であるBPF(Blocking Peptide Fragment)(東洋紡エンザイム社製BPF-301)又はNPS(Neo Protein Saver)(東洋紡エンザイム社製 NPS−301)を同濃度で添加した以外は同様にして抗体感作金コロイド溶液を作製した(コンジュゲートパッド塗布液2,3)。
コンジュゲートパッド塗布液1に、界面活性剤であるエパンU108(第一工業製薬株式会社製)、エパン485(第一工業製薬株式会社製)、プルロニックF68(株式会社ADEKA社製)をそれぞれ0.1%、0.1%、0.05%となるように添加したものも併せて調整した(コンジュゲートパッド塗布液4,5,6)。
(iii)コントロールライン用金コロイド標識KLH(KLHコンジュゲート)の調製
上記1.0 OD/mLの金コロイド溶液(pH6.1)20mLに対し、2mmol/Lリン酸緩衝液(pH6.1)で620μg/mLとなるよう溶解したKLH(シグマ社製)を1mL添加し、室温で10分間撹拌した。当該金コロイドとKLHとの混合液に対し、10%BSA水溶液を1mL添加し、室温で5分間攪拌した。
その後、10℃にて、11900×gで45分間遠心した。上清を除去した後、得られた沈渣に、上記コンジュゲート希釈液を1mL添加してコンジュゲートを懸濁し、KLHコンジュゲートを得た。
上記1)で調製した各抗ノロウイルス抗体コンジュゲートパッド塗布液を3 OD/mL、KLHコンジュゲートを、それぞれ1.33%カゼイン、4%スクロース溶液(pH7.5)と混合してコンジュゲート液を作製し、一定体積のグラスファイバー製パッド((Millipore社)に該パッド体積の1.13倍容量滲みこませた。70℃のドライオーブン内で45分間加温することにより乾燥させ、コンジュゲートパッドとした。
標識抗体とはエピトープを異にする抗ノロウイルス抗体(コスモバイオ社)を0.75mg/mLとなるよう2.5%スクロースを含む10mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.2)で調製し、テストライン塗布液とした。また、同様に抗KLH抗体(ウサギ由来)を0.75mg/mLとなるよう2.5% スクロースを含む10mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.2)で調製し、コントロールライン塗布液とした。
テストライン塗布液およびコントロールライン塗布液をニトロセルロース膜(Sartorius社製)に幅1mmのライン状に間隔をあけて塗布した。塗布はイムノクロマト法用ディスペンサー「XYZ3050」(BIO DOT社製)を用い、塗布量を1.0μL/cmに設定して実施した。70℃のドライオーブン内で45分間加温することにより乾燥させて抗体固相化メンブレンを作製した。
0.5%スクロース、250mmol/L NaClを含む、20mmol/Lトリス緩衝液(pH7.2)を調製し、サンプルパッド塗布液とした(サンプルパッド塗布液1)。
また、前記サンプルパッド塗布液1に抗IgA抗体(コスモバイオ社)を1.5mg/mL(90.7mg/test)となるよう添加したものを併せて調製した(サンプルパッド塗布液2)。
一定体積のグラスファイバー製パッド(Lydall社製)に該パッドの2.58倍容量となるようにサンプルパッド塗布液1またはサンプルパッド塗布液2を塗布し、70℃のドライオーブン内で45分間加温することにより乾燥させて各サンプルパッドを作製した。
図1に、本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップの模式構成図を示した。
プラスチック製粘着シート(a)に不溶性メンブレン(b)を貼り、次いで、サードパッド(Pall社製) (g)、コンジュゲートパッド(d)、サンプルパッド(e)を順に配置装着し、反対側の端には吸収パッド(Whatman社製) (f)を配置装着した。コンジュゲートパッドには、金コロイドに抗ノロウイルス抗体を感作したコンジュゲートが含浸されており、不溶性メンブレンには、抗ノロウイルス抗体(c1)およびコントロール試薬(c2)が流れ方向に対して垂直にライン上に固定化され、テストラインが流れ方向の上流側になるように配置されている。各パッドは、上下のパッドとその一部が接するように積層して配置される。抗ノロウイルス抗体(c1)からなるラインをテストライン、コントロール試薬(c2)からなるラインをコントロールラインという。サードパッドはポリスルホンからなり、平均孔径20〜50μmの多孔質膜を用いた。このように各構成要素を重ね合わせた構造物を一定幅に切断してイムノクロマトグラフィー用テストストリップを作製した。テストストリップを専用のプラスチック製ハウジングに格納・搭載し、イムノクロマトテストデバイス(図示せず)の形態にすることもできる。
正常人9人の糞便を検体として用いた(検体はいずれもノロウイルスフリーの陰性検体である)。各検体を界面活性剤を含む20mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.6)に懸濁して0.1g/mLとし、ボルテックスにより良く撹拌したのち3000rpmで10分間遠心分離をし、得られた上清をサンプルとした。
上記(i)で作製した各種のテストストリップに上記サンプル120μLを滴下し、15分後に偽陽性の有無を目視観察した。
観察結果を表1に示す。非特異反応抑制効果があった場合を○、効果がなかった場合を×で示す。市販のブロッキング剤又は界面活性剤を添加した場合はいずれも非特異反応抑制効果が見られず、偽陽性を観察した。これに対して抗IgA抗体を添加した場合は、非特異反応が抑制された。
1.イムノクロマトグラフィー用テストストリップの作製
サンプルパッド塗布液として以下(1)〜(4)、コンジュゲートパッド塗布液として試験例1のコンジュゲートパッド塗布液1を用いて、試験例1と同様にテストストリップを作製した。なお、HBRは、有効成分を抗IgM抗体とする非特異反応抑制剤である(Clinical Chemistry 45:7,942-956, 1999)。
(1)試験例1のサンプルパッド塗布液1
(2)試験例1のサンプルパッド塗布液1にHBR(Scantibody社製)を0.75mg/mL(45.4μg/test)となるように添加
(3)試験例1のサンプルパッド塗布液1に抗IgA抗体(ヤギ由来)を1.5mg/mL(90.7μg/test)となるように添加
(4)試験例1のサンプルパッド塗布液1に抗IgA抗体(ヤギ由来)を1.5mg/mL(90.7μg/test)、HBRを0.75mg/mL(45.4μg/test)となるように添加
正常人42人の糞便を検体として用いた(検体はいずれもノロウイルスフリーの陰性検体である)。各検体を、界面活性剤を含む20mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.6)に懸濁して0.1g/mLとし、ボルテックスにより良く撹拌したのち3000rpmで10分間遠心分離をし、得られた上清をサンプルとした。
上記(i)で作製したテストストリップに上記サンプル120μLを滴下し、10、15、30分後に偽陽性の有無を目視観察した。目視観察結果は、テストラインの発色強度を「カラーチャート」という色見本を用いて数値化した。カラーチャートによる発色強度は0〜4まで0.25刻みの値で数値化されている。発色強度の評価結果から、非特異反応の強さの評価を行った。
各評価基準は、以下のとおりである。
++:強い非特異反応あり(1.0以上)
+:弱い非特異反応あり(0.25以上1.0未満)
−:非特異反応なし(0)
(1)非特異反応抑制効果
42検体のうち、抗IgA抗体を添加しない場合でも非特異反応が観察されない検体(すなわち、陰性検体)があった(結果は表に示さず)。これらの陰性検体を除いた残りの17検体は、抗IgA抗体を添加しなかった場合に非特異反応が起こる検体(偽陽性検体)であった。この偽陽性検体(検体番号1−17)についてHBR(主成分:抗IgM抗体)のみ添加、抗IgA抗体のみ添加、HBRおよび抗IgA抗体の両方を添加した場合の非特異反応抑制効果を調べ、結果を表2に示した。
検体番号1−3については、抗IgA抗体を添加した場合に効果があり、HBRを添加しても非特異反応は抑制されなかったことがわかる。
検体番号4−7については、HBRを添加した場合に非特異反応抑制効果があり、抗IgA抗体を添加しても非特異反応は抑制されなかったことがわかる。
検体番号8−15については、HBRまたは抗IgA抗体のいずれか一方を添加すれば非特異反応が抑制されたことがわかる。
検体番号16,17については、HBRのみ、あるいは抗IgA抗体のみの一方の添加では効果が見られず、両者を添加して初めて非特異反応が抑制されたことがわかる。
以上より、市販のHBRと同様に、抗IgA抗体単独でも約70%の偽陽性検体に効果があり、両者を組み合わせることでほぼすべての偽陽性検体の非特異反応を抑制することができた。
抗IgA抗体を添加することによるウイルスの検出感度について調べた。参考例として市販の非特異反応抑制剤であるHBRを添加した場合についても調べた。
1.イムノクロマトグラフィー用テストストリップの作製
試験例2と同じ。
2.試験手順
ノロウイルス陽性コントロールを生理食塩液にて任意の濃度に希釈した。希釈したノロウイルス陽性コントロールを検体希釈液1,000μLに10μL添加し、サンプル液とした。
上記1.で作製したテストストリップに上記サンプル液を120μL滴下し、15分後のテストラインにおけるライン強度をカラーチャートを用いて数値化して評価した。
3.試験結果
結果を図2に示す。抗IgA抗体を添加したものは、ノロウイルス陽性コントロールに対する感度の低下が見られなかった。一方、参考例のHBRを添加した例では、検出感度の低下が見られた。
以上より、抗IgA抗体は非特異反応抑制剤として実用性が極めて高いことがわかった。
さらには、抗IgM抗体と組み合わせることで非常に高い確率で非特異反応を抑制することができ、検出感度の低下も起きないことから非常に有用な免疫学的検出方法を提供することができた。
(b)不溶性メンブレン
(c1)抗ノロウイルス抗体
(c2)コントロール試薬
(d)コンジュゲートパッド
(e)サンプルパッド
(f)吸収パッド
(g)サードパッド
Claims (13)
- 糞便由来サンプル中の被検出物質を免疫学的に検出する方法であって、抗IgA抗体存在下、免疫反応を行う前記方法。
- 免疫反応が、抗IgA抗体及び抗IgM抗体の存在で行われる請求項1に記載の方法。
- 免疫学的に検出する方法が、糞便由来サンプルを不溶性メンブレン中を展開させることによりサンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を検出するイムノクロマトグラフィーを利用した検出方法であって、以下の(a)及び(b)の工程を含む方法である、請求項1に記載の方法。
(a)抗IgA抗体存在下、サンプルと、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が標識体に固定化されたコンジュゲートを接触させてサンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を形成する工程
(b)前記複合体を不溶性メンブレン中を展開させて、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が固定化された検出部にて、前記複合体を検出する工程 - (a)の工程が、抗IgA抗体及び抗IgM抗体の共存下で、サンプルと、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が標識体に固定化されたコンジュゲートを接触させてサンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を形成する工程である請求項3に記載の方法。
- 糞便由来サンプル中の被検出物質を免疫学的に検出する方法における非特異反応抑制方法であって、抗IgA抗体存在下、免疫反応を行う前記方法。
- 免疫反応が、抗IgA抗体及び抗IgM抗体の存在で行われる請求項5に記載の方法。
- 免疫学的に検出する方法が、糞便由来サンプルを不溶性メンブレン中を展開させることによりサンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を検出するイムノクロマトグラフィーを利用した検出における非特異反応抑制方法であって、以下の工程(a)及び(b)の工程を含む方法である、請求項5に記載の方法。
(a)抗IgA抗体存在下、サンプルと、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が標識体に固定化されたコンジュゲートを接触させてサンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を形成する工程
(b)前記複合体を不溶性メンブレン中を展開させて、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が固定化された検出部にて、前記複合体を検出する工程 - (a)の工程が、抗IgA抗体及び抗IgM抗体の共存下で、サンプルと、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が標識体に固定化されたコンジュゲートを接触させてサンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を形成する工程である請求項7に記載の方法。
- 糞便由来サンプルを不溶性メンブレン中を展開させることにより、サンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を検出するイムノクロマトグラフィー用テストストリップであって、コンジュゲートは、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が標識体に固定化されたものであり、かつ以下の構成(1)及び(2)を含む、前記テストストリップ。
(1)サンプル供給部を有するサンプルパッドであって、抗IgA抗体が溶出可能に保持されている前記パッド
(2)被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が固定化された、サンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を検出する検出部を有する不溶性メンブレン - コンジュゲートが溶出可能に保持されているコンジュゲートパッドを含む請求項9に記載のテストストリップ。
- サンプルパッドに、さらに抗IgM抗体が溶出可能に保持されている、請求項9又は10に記載のテストストリップ。
- 抗IgA抗体を有効成分とする、糞便由来サンプル用の免疫反応における非特異反応抑制剤。
- さらに抗IgM抗体を含有する、請求項12に記載の非特異反応抑制剤。
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