JPWO2015199242A1 - ウイルス抵抗性タバコおよびその作出方法 - Google Patents
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Abstract
本発明に係るウイルス抵抗性タバコは、翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子に変異を有しており、それによって、ウイルスに対して非機能的なｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質を生産するか、またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現が抑制されている、あるいは、本発明に係るウイルス抵抗性タバコは、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現量が野生型と比較して２０％以下である。
Description
本発明は、ウイルス抵抗性タバコおよびその作出方法に関するものである。
Potyvirus属は植物ウイルスの中で最大のグループであり、様々な植物を宿主とする。Potato virus Y（以下、ＰＶＹ）は、Potyvirus属のウイルスであり、アブラムシを通じて非永続的に伝搬し、ナス科植物の多様な種に感染する。中でもタバコに関していえば、ＰＶＹは、草丈の減少および葉脈の壊疽症状等を引き起こし、その結果葉たばこの品質ならびに収量の低下をもたらし、世界中のタバコ生産に大きな被害を及ぼす。またＰＶＹに感染し品質が低下した葉たばこを原料に使用した場合、生産されるたばこ製品の品質も大きく低下する。
一方、Tobacco bushy top virus（以下、ＴＢＴＶ）は、Umbravirus属に属するウイルスであり、アフリカおよびアジアに発生しているタバコブッシートップ病の原因ウイルスとして知られている。このウイルスは、自然界ではアブラムシによって永続的に伝搬され、タバコに生育停滞および葉のモットリング症状を引き起こし、品質および収量の低下をもたらす。特に、タバコブッシートップ病はアフリカ諸国における重要病害となっている。
タバコ（Nicotiana tabacum）においては、ＰＶＹに対する抵抗性を示す既存遺伝資源Virgin A mutant（以下、ＶＡＭ）が知られており、積極的にタバコ育種プログラムに活用されてきた。しかし最近、ＶＡＭの抵抗性を打破するＰＶＹの新系統であるVAM-Breaking系統（PVY-Breaking系統、またはＰＶＹ−Ｂと表記することもある）が世界中で報告された。現在、このVAM-Breaking系統に対する抵抗性タバコが強く求められている。最近、放射線照射によって、VAM-Breaking系統への抵抗性を獲得したタバコが報告されたが（非特許文献１）、原因遺伝子の同定には至っていない。また、例えばNicotiana africana等のタバコ野生種の中にPVY-Breaking系統に抵抗性を示すものがあることは知られているが、未だ育種プログラムに活用される段階にない。
さらにまた、タバコブッシートップ病に対する抵抗性源の探索が、４３種類のタバコ品種およびNicotiana属野生種を使って実施され、タバコ品種の中には抵抗性を示すものはなかったが、数種の野生種がウイルス病の症状を示さなかったことが報告されている（非特許文献２）。しかしながら、その抵抗性の遺伝様式は明らかにされておらず、さらに野生種から栽培種であるN. tabacumに抵抗性を導入した場合、品質および収量に悪影響を与える形質も同時に導入されることが予想されるため、実用化には未だ長い道のりがある。
およそ２００種類ある既知の植物ウイルス抵抗性遺伝子の約半分は劣性遺伝をする（非特許文献３）。これらはウイルス増殖および細胞間移行等に必要な宿主因子であると考えられる。ここ１０年の研究から、これらの因子の一部が明らかとなってきた。例えばｅＩＦ４ＥおよびｅＩＦ４Ｇ等の翻訳開始因子、DEAD-box RNA helicase-like protein（非特許文献４）、システインリッチなVPg-interacting protein（非特許文献５）、およびTranslation elongation factor（非特許文献６）等が、劣性のウイルス抵抗性遺伝因子として同定された。勿論これらが全てではなく、他にも多数の候補があると考えられ（非特許文献３）、例えばその他の候補として、植物ウイルスの師管輸送に関連する様々な植物因子（非特許文献７）が挙げられる。
ウイルスは自分自身のゲノムからタンパク質を合成する際、宿主の翻訳開始機構を利用する。２００２年に、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）におけるTurnip mosaic virus（ＴｕＭＶ）に対する劣性の抵抗性遺伝因子が、翻訳開始因子であるｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの変異であることが示された（非特許文献８）。それ以来、既知のPotyvirus属のウイルスに対する劣性抵抗性へのｅＩＦ４Ｅ遺伝子ファミリーの関与が幾つかの植物で検討されてきた。そして、実際にｅＩＦ４ＥまたはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの変異によって、劣性のウイルス抵抗性が獲得されたことが示されている。
例えば、特許文献１では、ｅＩＦ４Ｅ遺伝子（ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅは含まれない）の機能抑制によるウイルス抵抗性付与の方法が述べられている。また特許文献２では、ｅＩＦ４Ｅ遺伝子またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のスプライシング変異により、ウイルスが作用しないｅＩＦ４ＥまたはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅを持つ変異体が述べられている。変異はｅＩＦ４ＥもしくはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの非コード領域、またはスプライシングエレメント（エキソン／イントロン境界部位の±１０塩基の領域）の少なくとも１塩基に挿入、欠失、または置換を生じるものであり、望ましくはイントロン、より望ましくは第１イントロンが対象である。さらに特許文献３には、ｅＩＦ４ＥおよびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの両変異の組合せによるトウガラシ葉脈斑紋病（Pepper veinal mottle virus、ＰＶＭＶ）に対する抵抗性植物の選抜に関する方法、具体的には、ｅＩＦ４ＥおよびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅが全く発現せず、かつ変異ｅＩＦ４Ｅが発現する植物を選別する方法が述べられている。
さらに例えば、コショウのＰＶＹに対する劣性抵抗性の原因遺伝子はｅＩＦ４Ｅであることが示されている（非特許文献９）。また、Clover yellow vein virusはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ欠損シロイヌナズナでは増殖するが、ｅＩＦ４Ｅ欠損シロイヌナズナでは増殖しないこと、そして、これとは逆に、ＴｕＭＶはｅＩＦ４Ｅ欠損シロイヌナズナでは増殖するが、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ欠損シロイヌナズナでは増殖しないことが示されている（非特許文献１０）。さらにＰＶＭＶに対する抵抗性を獲得するには、ｅＩＦ４ＥおよびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの両方が同時に機能喪失していなければならない（非特許文献１１）。近年の翻訳開始因子および植物ウイルス抵抗性を総説したものとして、例えば、非特許文献１２および非特許文献１３等がある。
Potyvirus属以外のウイルスと翻訳開始因子との関連性も限定的ではあるが指摘されている。例えば、Cucumber mosaic virus（ＣＭＶ）は、Cucumovirus属ウイルスであり、ｅＩＦ４ＥまたはｅＩＦ４Ｇが破壊されたシロイヌナズナでは、ＣＭＶの細胞間移行に関与する３ａ ｐｒｏｔｅｉｎの生産が阻害される。また、Rice yellow mottle virus（ＲＹＭＶ）はSobemovirus属ウイルスであり、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｇが突然変異したイネはこのウイルスに抵抗性となる（非特許文献１４および非特許文献１５）。
タバコと同じナス科植物のトマトにおいては、トマト変異体パネルの網羅的解析に基づいて、Potyvirus抵抗性と翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅとの関係が研究されている。その中で、ｅＩＦ４Ｅ遺伝子ファミリーの一つであるｅＩＦ４Ｅ１の機能抑制が、ＰＶＹおよびPepper mottle virus（ＰｅｐＭｏＶ）に対する抵抗性を付与する一方、Tobacco etch virus（ＴＥＶ）に対しては抵抗性を付与しないことが示された（非特許文献１６）。また、ｅＩＦ４Ｅ２、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ、ｅＩＦ４Ｇ、およびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｇの機能抑制はこれらのPotyvirus属のウイルスに抵抗性を付与しないことも同時に示された。また、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）を用いてｅＩＦ４Ｅ１とｅＩＦ４Ｅ２とを同時に機能抑制すると、ＰＶＹ、ＰｅｐＭｏＶおよびＴＥＶを含む７種類のPotyvirus属のウイルスに抵抗性になることが示された。しかしながら一方で、興味深いことに、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥのＲＮＡｉではこれらのどのウイルスに対しても抵抗性にはならないことが示された（非特許文献１７）。また、トマトのｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥはPotyvirus属以外のウイルス抵抗性との関連性もないことも併せて示された（非特許文献１７）。
このように、これまでどの植物においても、ＰＶＹ抵抗性との関連性が指摘されていたのはｅＩＦ４Ｅであり、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅとの関連性は報告されていない。ｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥはｅＩＦ４Ｅファミリーにカテゴライズされるが、植物では一般に、ｅＩＦ４ＥとｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥとのＤＮＡ配列同一性は６０％に満たない。また、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥはｅＩＦ４Ｅとは異なる翻訳複合体を形成する。具体的には、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥはｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＧとともにｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｆという翻訳複合体を形成し、ｅＩＦ４ＥはｅＩＦ４ＧとともにｅＩＦ４Ｆという翻訳複合体を形成する。
タバコ（Nicotiana tabacum）においては、ｅＩＦ４Ｅ１またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの発現量を低下させた報告がある（非特許文献１８）。この報告ではアンチセンス技術を用いてタバコのｅＩＦ４Ｅ１またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの転写を抑制している。そして、ｅＩＦ４Ｅ１の転写物の量が対照の３０〜４０％まで抑制されたタバコ、およびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの転写物の量が対照の６０％にまで抑制されたタバコを作出したこと、ならびに両者を交配した後代ではｅＩＦ４Ｅ１の転写物の量が対照の２６％、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの転写物の量が対照の３１％にまで低減していたことが記載されているものの、ウイルス抵抗性との関連性は全く述べられていない。また、ＰＶＹのＨＣ−Ｐｒｏタンパク質がタバコのｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅと相互作用する可能性が、Nicotiana benthamianaを使ったアッセイ系から示唆されているものの（非特許文献１９）、抵抗性との関連性は指摘されていなかった。
さらにタバコにおいて、ＰＶＹ抵抗性のＶＡＭタバコおよびＰＶＹ感受性のタバコの転写物の網羅的解析から、ＶＡＭタバコにおいて特異的に転写量の低い遺伝子の中にｅＩＦ４Ｅがあることが見出され、この遺伝子に変異が生じたタバコはＰＶＹ抵抗性になることが示されている（非特許文献２０）。
しかし一方で、タバコのPotyvirus抵抗性と翻訳開始因子のｅＩＦ４ＥおよびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの変異とは関連しないという報告もある（非特許文献２１）。この報告では、タバコに感染するPotyvirus属のウイルスであるＰＶＹおよびＰｅｐＭｏＶに関して、これらのウイルスに抵抗性の品種および感受性の品種において、ｅＩＦ４ＥおよびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の塩基配列を調査している。その結果、両遺伝子に生じた変異とそれらのウイルスに対する抵抗性／感受性との関連性は見られなかったことが示されている。例えば、あるＰＶＹ抵抗性品種のｅＩＦ４ＥおよびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子には変異が検出されなかった一方で、ＰＶＹ感受性品種のそれらに変異が見られた。これまで他植物では同様の実験で、ＰＶＹ抵抗性品種のｅＩＦ４ＥおよびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子に変異が検出され、当該変異が抵抗性の原因であると考えられてきたことから、非特許文献２１ではタバコにおいては他のナス科植物とは異なり、ＰＶＹ抵抗性と翻訳開始因子ｅＩＦ４ＥおよびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅとの関連性はないと結論づけている。このようにタバコに関しては、他の植物とは異なり、Potyvirus抵抗性と翻訳開始因子との関連性は未だ混沌とした状況にある。
さらには、翻訳開始因子とUmbravirus属ウイルスに対する抵抗性との関連性は、タバコを含めたあらゆる植物種において一切知られていない。
タバコ（Nicotiana tabacum）は複二倍体であり、通常の二倍体植物に比べて遺伝子の数が多く、Nicotiana sylvestris由来の遺伝子とNicotiana tomentosiformis由来の遺伝子が、基本的には常に１組ずつ存在する。すなわち、タバコにおいては相同遺伝子が少なくとも２組存在する。そのため、他の二倍体の植物と比べて遺伝様式が複雑である。シロイヌナズナにおいてはｅＩＦ４Ｅが３種類、およびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅが１種類存在するとされており（非特許文献１２）、タバコではシロイヌナズナで見られる翻訳開始因子はすべて組になって存在すると考えられる。ｅＩＦ４Ｅと機能的に類似するcap-binding proteinまで含めると、タバコのｅＩＦ４Ｅファミリーは、少なくとも１２個存在することが分っている（非特許文献２０）。さらにｅＩＦ４ＧおよびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｇまで含めると、その数はさらに多くなる。
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PVY-Breaking系統に対して抵抗性を有するタバコは知られているが、上述のように、わずか一例に過ぎず、この抵抗性の持続性も未だ不明である。したがって、潜在的な遺伝的脆弱性を回避するためにも、PVY-Breaking系統を含むウイルスに対する別の新しい抵抗性タバコを開発することが急務である。また、未だ抵抗性の遺伝子が同定されていないことが、精密なマーカー育種の障壁となっている。
さらに、ＴＢＴＶに関しては、栽培品種を中心に抵抗性品種の探索が行われたが、当該ウイルスに抵抗性を示す品種は見出されず、その後、抵抗性品種の開発は行われていない。
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、ウイルスに対して抵抗性を有するタバコおよびその作出方法を提供することを主たる目的とする。
本発明に係るウイルス抵抗性タバコの一態様は、翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子に変異を有しており、それによって、ウイルスに対して非機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質を生産するか、または翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現が抑制されていることを特徴とする。
本発明に係るウイルス抵抗性タバコの別の一態様は、翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現量が野生型と比較して２０％以下であることを特徴とする。
本発明に係るウイルス抵抗性タバコ作出方法の一態様は、ウイルスに対して非機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質を生産するか、または翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現を抑制する変異を翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子に導入することによって、ウイルスに対して抵抗性を有するタバコを作出することを特徴とする。
本発明に係るウイルス抵抗性タバコ作出方法の別の一態様は、翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現量を野生型と比較して２０％以下に抑制させる因子を導入することによって、ウイルスに対して抵抗性を有するタバコを作出することを特徴とする。
本発明に係る検出用ポリヌクレオチドの一態様は、タバコの翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子における変異を検出するためのポリヌクレオチドであって、当該変異は、ウイルスに対して非機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質を生産するか、または翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現を抑制する変異であることを特徴とする。
本発明に係るウイルスに対するタバコの抵抗性の判定用ＤＮＡマーカーの一態様は、翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子における変異を含む連続した塩基配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドを含んでおり、当該変異は、ウイルスに対して非機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質を生産するか、または翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現を抑制する変異であることを特徴とする。
本発明によれば、ウイルスに対して抵抗性を有するタバコを提供することができる。
〔１．ウイルス抵抗性タバコおよびその作出方法〕
本発明の一態様は、ウイルスに対して抵抗性を有するタバコ（ウイルス抵抗性タバコ）に関し、より具体的には、細胞内における、ウイルスに対して機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現量（例えば、転写物の量）が減少した、ウイルス抵抗性タバコに関する。また、本発明の別の一態様は、ウイルスに対して抵抗性を有するタバコを作出する方法（ウイルス抵抗性タバコ作出方法）に関し、より具体的には、細胞内における、ウイルスに対して機能的なｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現量（例えば、転写物の量）を減少させることによって、ウイルス抵抗性タバコを作出する方法に関する。
本発明の一態様は、ウイルスに対して抵抗性を有するタバコ（ウイルス抵抗性タバコ）に関し、より具体的には、細胞内における、ウイルスに対して機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現量（例えば、転写物の量）が減少した、ウイルス抵抗性タバコに関する。また、本発明の別の一態様は、ウイルスに対して抵抗性を有するタバコを作出する方法（ウイルス抵抗性タバコ作出方法）に関し、より具体的には、細胞内における、ウイルスに対して機能的なｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現量（例えば、転写物の量）を減少させることによって、ウイルス抵抗性タバコを作出する方法に関する。
Nicotiana tabacumは複二倍体であり、祖先種であるNicotiana sylvestris由来のゲノム（Ｓ型ゲノム）およびNicotiana tomentosiformis由来のゲノム（Ｔ型ゲノム）の両方を有する。そのため、N. tabacumは、塩基配列が異なる２組のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子（対立遺伝子）を有する。また、N. tabacumのＳ型およびＴ型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子は何れも、図２および３にそれぞれ示されるとおり、５つのエキソンと４つのイントロンを有している。なお、図２および図３において、下部に記載の数字はナンセンス変異の候補箇所の数を示し、矢印は実施例におけるプライマーの位置を示す。Ｓ型の野生型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のｃＤＮＡ配列の一例を配列番号１（GenBankアクセッション番号：AY699609）に示す。配列番号１において、オープンリーディングフレームは、７０番目から６７２番目の塩基である。Ｔ型の野生型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のｃＤＮＡ配列の一例を配列番号２（GenBankアクセッション番号：EB683576）に示す。配列番号２において、オープンリーディングフレームは、３７番目から６２４番目の塩基である。また、Ｓ型の野生型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質のアミノ酸配列の一例を配列番号３に示す。Ｔ型の野生型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質のアミノ酸配列の一例を配列番号４に示す。また、Ｓ型の野生型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のｍＲＮＡ配列（ｃＤＮＡ配列におけるｔをｕに変更したもの）の一例を配列番号５に示す。Ｔ型の野生型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のｍＲＮＡ配列（ｃＤＮＡ配列におけるｔをｕに変更したもの）の一例を配列番号６に示す。また、Ｓ型の野生型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のゲノムの塩基配列の一例を配列番号７に示す。Ｔ型の野生型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のゲノムの塩基配列の一例を配列番号８に示す。配列番号７において、エキソンは、１３２番目から３９７番目の塩基（第１エキソン）、１７３０番目から１８９８番目の塩基（第２エキソン）、２０２９番目から２１５４番目の塩基（第３エキソン）、４７２３番目から４７８５番目の塩基（第４エキソン）、および４８９３番目から５０９６番目の塩基（第５エキソン）である。配列番号８において、エキソンは、１６４番目から３８２番目の塩基（第１エキソン）、１６２０番目から１７８８番目の塩基（第２エキソン）、１９１９番目から２０４４番目の塩基（第３エキソン）、３２０５番目から３２６７番目の塩基（第４エキソン）、および３３７３番目から３５９３番目の塩基（第５エキソン）である。
同一機能を有する植物の遺伝子のタンパク質コード領域の塩基配列は、遺伝子によっては栽培品種間において１％から数％程度の差異があり得、栽培品種と近縁野生種間においては数％から１０％程度の差異があり得る。本明細書において、変異を生じる前の野生型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子には、配列番号５または配列番号６に示す塩基配列からなるｍＲＮＡが生成される遺伝子、および、配列番号３または配列番号４に示すアミノ酸配列からなるｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする遺伝子が包含される。さらに、本明細書において、変異を生じる前の野生型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子には、配列番号５または配列番号６に示す塩基配列と、９２％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有するｍＲＮＡが生成されるものであり、かつ機能的なｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする遺伝子も包含される。さらに、本明細書において、野生型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子には、配列番号３または配列番号４に示すアミノ酸配列と９２％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有する機能的なｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする遺伝子も包含される。さらに、本明細書において、野生型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子には、配列番号５または配列番号６に示す塩基配列において１〜５０個、１〜４０個、１〜３０個、１〜２０個、１〜１５個、１〜１２個、１〜１０個、１〜８個、１〜５個、１〜３個、１〜２個、または１個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加された塩基配列を有するｍＲＮＡが生成されるものであり、かつ機能的なｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする遺伝子も包含される。さらに、本明細書において、野生型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子には、配列番号３または配列番号４に示すアミノ酸配列において１〜２０個、１〜１５個、１〜１２個、１〜１０個、１〜８個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、または１個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有する機能的なｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする遺伝子も包含される。なお、本明細書において、特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意図する。
例えば本明細書において、変異を生じる前の野生型のＴ型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子には、ｃＤＮＡ配列がGenBankアクセッション番号ＦＮ６６６４３４の配列となる遺伝子も包含される。この配列はタバコ品種Samsun NN由来のＴ型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子に由来する配列であり、タバコ品種Ｋ３２６由来のＴ型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥのｃＤＮＡ配列ＥＢ６８３５７６（配列番号２）との配列同一性は９７％である。これら２つの遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列の同一性（identity）は９７％、類似性（similarity）は９９％である。
なお、本明細書において、「塩基配列の同一性」とは、複数の塩基配列において、全く同じ塩基の並びがどの程度の比率で存在するかを指す。「アミノ酸配列の同一性」とは、複数のアミノ酸配列において、全く同じアミノ酸の並びがどの程度の比率で存在するかを指す。「アミノ酸配列の類似性」とは、複数のアミノ酸配列において、全く同じアミノ酸、または性質の似たアミノ酸の並びがどの程度の比率で存在するかを指す。性質の似たアミノ酸の例として例えば、正電荷をもつ残基を有するリシン、アルギニン、およびヒスチジン；負電荷をもつ残基を有するアスパラギン酸、およびグルタミン酸；非極性すなわち疎水性の残基を有するアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、およびプロリン；極性だが電荷のないグリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミン；が挙げられる。「塩基配列の同一性」、「アミノ酸配列の同一性」、または「アミノ酸配列の類似性」に関しては、当業者が通常用いる配列解析（相同性検索）プログラムBLAST（文献：Altschul et al. (1990) Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215:403-410.）等、または市販の核酸・アミノ酸解析ソフトを用いて、計算することができる。BLAST検索は、GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）またはDNA Data Bank of Japan（http://www.ddbj.nig.ac.jp/index-j.html）等のウェブサイトにおいて実施可能である。その際、各種の検索パラメーターの変更が可能であるが、通常はデフォルト値を用いる。
なお、本明細書において、「タバコ」とは、Nicotiana tabacumだけでなく、同じNicotiana属の他の種も包含する。Nicotiana属の他の種としては、例えば、N. paniculata、N. knightiana、N. solanifolia、N. benavidesii、N. cordifolia、N. raimondii、N. cutleri、N. rustica、N. tomentosa、N. tomentosiformis、N. otophora、N. kawakamii、N. setchellii、N. undulata、N. arentsii、N. wigandioides、N. glutinosa、N. thyrsiflora、N. obtusifolia、N. palmeri、N. langsdorffii、N. alata、N. forgetiana、N. bonariensis、N. longiflora、N. plumbaginifolia、N. azambujae、N. mutabilis、N. sylvestris、N. repanda、N. stocktonii、N. nesophila、N. nudicaulis、N. noctiflora、N. petunioides、N. acaulis、N. ameghinoi、N. glauca、N. paa、N. acuminata、N. pauciflora、N. attenuata、N. longibracteata、N. miersii、N. corymbosa、N. linearis、N. spegazzinii、N. quadrivalvis、N. clevelandii、N. benthamiana、N. umbratica、N. cavicola、N. debneyi、N. gossei、N. amplexicaulis、N. maritima、N. velutina、N. hesperis、N. occidentalis、N. simulans、N. megalosiphon、N. rotundifolia、N. excelsior、N. suaveolens、N. ingulba、N. exigua、N. goodspeedii、N. rosulata、N. fragrans、N. africana、N. burbidgeae、N. heterantha、N. stenocarpa、N. truncata、およびN. wuttkeiが挙げられる。また、「タバコ」には、タバコの植物全体、植物組織（例えば、葉、茎、花、根、生殖器官、胚およびそれらの一部など）、苗および種子、ならびに乾燥した葉、茎、花、根および種子等が含まれ得る。
これらNicotiana属植物のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のｃＤＮＡ配列は、配列番号１に示す塩基配列と９０％以上の配列同一性を有すると考えられる。実際、配列番号１に示す塩基配列はN. sylvestrisのｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のｃＤＮＡ配列と１００％の配列同一性を示す（イントロンは除く）。配列番号２に示す塩基配列はN. tomentosiformisのｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥのｃＤＮＡ配列と９９％の配列同一性を示す（イントロンは除く）。配列番号１に示す塩基配列および配列番号２に示す塩基配列はN. otophoraのｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥのｃＤＮＡ配列とそれぞれ９８％および９９％の配列同一性を示す（イントロンは除く）。また、N. sylvestris、N. tomentosiformis、およびN. otophoraのｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の構造は何れも、N. tabacumの遺伝子と同じ数のエキソン（５つ）、同じ数のイントロン（４つ）を有している。
上記野生種のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の塩基配列は、配列番号１に示す塩基配列を用いて、GenBankに登録されているN. sylvestris、N. tomentosiformis、またはN. otophoraのゲノム（Whole genome shotgun contigs）をBLASTプログラム等によって相同性検索することによって得られる。あるいは、Nicotiana属植物に由来する植物種のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の塩基配列は、例えば配列番号２５〜３６に示すプライマー配列を用いて、当該植物種のゲノムＤＮＡから、ＰＣＲ法によってｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子を増幅し、塩基配列を決定することによって得ることができる。相同性検索としてはBLASTプログラムを用いてもよいし、市販の核酸・アミノ酸配列解析ソフトを用いてもよい。
また、配列番号１または配列番号２に示す塩基配列をプローブとして用いて、タバコ野生種のゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから、ストリンジェントな条件でハイブリダイゼーション実験を行うことによって、タバコ野生種のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の塩基配列を取得することが可能である。
ウイルス抵抗性タバコが抵抗性を示すウイルスは、特に限定されないが、例えば、タバコに感染するAlfamovirus属ウイルス（例えばAlfalfa mosaic virus）、Curtovirus属ウイルス（例えばBeet curly top virus）、Begomovirus属ウイルス（例えばTobacco leaf curl virus）、Cucumovirus属ウイルス（例えばCucumber mosaic virus、およびPeanut stunt virus）、Ilarvirus属ウイルス（例えばTobacco streak virus）、Potyvirus属ウイルス（例えばPotato virus Y（PVY）、Tobacco etch virus、Tobacco vein mottling virus、およびTobacco vein banding mosaic virus）、Tobamovirus属ウイルス（例えばTobacco mosaic virus）、Tobravirus属ウイルス（例えばTobacco rattle virus）、Necrovirus属ウイルス（例えばTobacco necrosis virus）、Varicosavirus属ウイルス（例えばTobacco stunt virus）、Nepovirus属ウイルス（例えばTobacco ringspot virus）、Umbravirus属ウイルス（例えばTobacco bushy top virus、およびTobacco mottle virus）、Polerovirus属ウイルス（例えばTobacco vein distorting virus）、Mastrevirus属ウイルス（例えばTobacco yellow dwarf virus）、およびTospovirus属ウイルス（例えばTomato spotted wilt virus）等のウイルスが挙げられる。本発明に係るウイルス抵抗性タバコは、１種類のウイルスに対して抵抗性を有していてもよいし、複数種のウイルスに対して抵抗性を有していてもよい。本発明に係るウイルス抵抗性タバコは、Potyvirus属のウイルスに対して顕著な抵抗性を有していてもよく、なかでもPotato virus Y（PVY）のPVY-O系統、PVY-C系統、PVY-Z系統、PVY-N（NTNおよびNWを含む）系統、特にタバコのVirgin A mutantのウイルス抵抗性を打破するPVY系統（ＶＡＭ−Ｂｒｅａｋｉｎｇ系統）に対して抵抗性を有し得る。また、本発明に係るウイルス抵抗性タバコは、Umbravirus属のウイルスに対して顕著な抵抗性を有していてもよく、なかでもTobacco bushy top virus（TBTV）に対して抵抗性を有し得る。
本明細書において、「ウイルス抵抗性」とは、罹病性タバコ品種と比較して、ウイルス感染により、タバコに発生する症状が遅延もしくは発生しないことを指す。タバコに発生する症状としては、生育停滞、葉脈壊疽、茎壊疽、葉脈透過、およびモットリング等が挙げられる。あるいは、「ウイルス抵抗性」とは、罹病性タバコ品種と比較して、ウイルスの増殖が抑制される、またはウイルスの細胞間移行が抑制されることを指す。
（ウイルス抵抗性タバコおよびその作出方法の態様１）
本発明に係るウイルス抵抗性タバコの一態様は、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子に変異を有しており、それによって、ウイルスに対して非機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質を生産するか、または翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現が抑制されているウイルス抵抗性タバコである。
本発明に係るウイルス抵抗性タバコの一態様は、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子に変異を有しており、それによって、ウイルスに対して非機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質を生産するか、または翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現が抑制されているウイルス抵抗性タバコである。
本明細書において、「変異」とは、ＤＮＡにおける点変異、欠失、挿入、重複、転座および逆位を指し、特に記載がない場合は、野生型の塩基配列に対する差異を指す。
また、本明細書において、「ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子」とは、ゲノムにおいて、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードするコード領域だけでなく、イントロン、調節領域、および他の非翻訳配列等、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質の発現に必要な非コード領域も含む概念である。
「ウイルスに対して非機能的なｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質」とは、ウイルスが自己増殖または細胞間移行の際に利用できない（少なくとも部分的に利用が阻害される）ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質を指し、タバコにおいて正常なｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質の機能（翻訳開始因子としての機能）を果たしていない場合、および、タバコにおいては正常なｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質の機能を果たしているが、ウイルスが利用できない場合の両方を包含する。なお、後述の実施例で示されるとおり、タバコにおいて、野生型（変異を導入していない植物）のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質は、ウイルスの自己増殖または細胞間移行に使用されている可能性を発明者らは見出している。
「ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現量」は、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥのｍＲＮＡへの転写の量（転写レベルあるいは転写物の量）およびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質への翻訳の量（翻訳レベルあるいは翻訳産物の量）の何れであってもよいし、両方であってもよい。そのため、「ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの発現が抑制されている」とは、野生型と比較して転写が抑制されている場合も、野生型と比較して翻訳が抑制されている場合も、野生型と比較して転写および翻訳の両方が抑制されている場合も包含する。なお、「転写が抑制されている」には、転写物が分解される場合も包含される。
上述のように、N. tabacumはＳ型とＴ型の２組、合計４つ（Ｓ型で２つ、Ｔ型で２つ）のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子を有していると考えられる。一例において、ウイルス抵抗性タバコは、少なくともＳ型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子において変異を有していることが好ましい。この場合、ウイルス抵抗性タバコは、少なくともUmbravirus属のウイルス（例えば、ＴＢＴＶ）に対する抵抗性を有し得る。別の一例において、ウイルス抵抗性タバコは、少なくともＴ型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子において変異を有していることが好ましい。この場合、ウイルス抵抗性タバコは、少なくともPotyvirus属のウイルス（例えば、ＰＶＹ−Ｂ系統）に対する抵抗性を有し得る。さらに別の一例において、ウイルス抵抗性タバコは、Ｓ型およびＴ型の両方のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子において変異を有していることがより好ましい。この場合、ウイルス抵抗性タバコは、少なくともUmbravirus属のウイルスおよびPotyvirus属のウイルスの両方に対する抵抗性を有し得る。また、１つの型における変異はホモ（例えば、Ｓ型の２つのｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の両方に変異が入っている）であってもよいし、ヘテロであってもよいが、ホモであることが好ましい。
したがって、ウイルス抵抗性タバコの一例は、（ａ）配列番号３に示すアミノ酸配列からなるｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする野生型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子、（ｂ）配列番号３に示すアミノ酸配列と９２％以上の配列同一性を有する機能的なｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする野生型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子、（ｃ）配列番号５に示す塩基配列からなるｍＲＮＡが生成される野生型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子、または（ｄ）配列番号５に示す塩基配列と９２％以上の配列同一性を有するｍＲＮＡが生成されるものであり、かつ機能的なｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする野生型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子において１つ以上の変異を有しており、Umbravirus属のウイルスに対する抵抗性を有する。また、ウイルス抵抗性タバコの他の一例は、（ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする野生型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子、（ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列と９２％以上の配列同一性を有する機能的なｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする野生型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子、（ｃ）配列番号６に示す塩基配列からなるｍＲＮＡが生成される野生型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子、または（ｄ）配列番号６に示す塩基配列と９２％以上の配列同一性を有するｍＲＮＡが生成されるものであり、かつ機能的なｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする野生型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子において１つ以上の変異を有しており、Potyvirus属のウイルスに対する抵抗性を有する。
また、１つのｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子が複数の変異を有していてもよい。また、複数のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子における変異は、同じであってもよいし、互いに異なっていてもよい。
なお２組のうちの１組が元々（自然変異によって）機能を喪失している場合では、機能が喪失していない１組に変異を有していればよい。また２組のうち１組が完全に機能を喪失しているが、残り１組のうち一つは機能を喪失し、一つは機能を喪失していない、即ち４つのうち３つまでが機能を喪失した場合においても、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの発現量が十分低ければ、ウイルス抵抗性になり得る。またタバコ野生種（Nicotiana属）の場合で、もともとｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅを１組しか持たない場合では、１組のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅに変異が生じていればよい。
本発明に係るウイルス抵抗性タバコがコード領域に変異を有している場合、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質のアミノ酸配列に変異を有している。変異としては、置換、欠失および挿入等が挙げられる。変異がアミノ酸の置換である場合、置換されるアミノ酸および置換後のアミノ酸は、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をウイルスに対して非機能的なものにする限り特に限定されないが、例えば、非保存的置換（non-conservative substitutions）であることが好ましい。非保存的置換としては、アミノ酸を電荷または疎水性が異なる別のアミノ酸に置換すること（塩基性アミノ酸から酸性アミノ酸への置換、または極性アミノ酸から非極性アミノ酸への置換等）、および、あるアミノ酸を側鎖のかさが異なる別のアミノ酸に置換することが挙げられる。また、コード領域に変異を有している場合、フレームシフト変異またはナンセンス変異であってもよい。ナンセンス変異（ストップコドンになる変異）の場合、nonsense-mediated mRNA decay（文献：Brogna and Wen 2009, Nat. Structural Mol. Biol. 16: 107-113）が生じ、転写物が分解されることがある。この場合、ナンセンス変異の位置は、第１エキソン、第２エキソン、および／または第３エキソンにあることが好ましく、第１エキソンおよび／または第２キソンにあることがより好ましい。フレームシフト変異またはナンセンス変異の場合、当該変異の位置は遺伝子の５’末端側半分程度より５’末端側であることが好ましい。具体的には第１エキソン、第２エキソン、および／または第３エキソンに変異があることが好ましい。５’末端に近いほど、タンパク質における正常な部分が短くなるため、ウイルスに対して非機能的になる可能性が高くなる。タバコが有している全て（例えばN. tabacumでは４つ全て）のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のコード領域に変異を有している場合、ウイルスに対して機能的なｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質は全く生産されない。
本発明に係るウイルス抵抗性タバコが非コード領域に変異を有している場合、コードされるｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質のアミノ酸配列に影響を及ぼさないが、ＤＮＡもしくはｍＲＮＡの二次構造を変更させる、転写もしくは翻訳機構のための結合部位を変更させる、またはｔＲＮＡ結合効率を減少させ得る。それによって、転写レベルを減少させたり、翻訳レベルを減少させたりし得る。
あるいは、５’末端側の非コード領域に変異を有している場合において、その変異によって正しいフレームとは異なるフレームにＡＴＧ（開始コドン）が生じる場合、その誤ったフレームから翻訳が開始される可能性がある。このような場合においても正常なｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質は生産されない。例えば変異原が後述のエチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）の場合において、ＧＴＧのＧがＡに変異した場合またはＡＣＧのＣがＴに変異した場合、新たなＡＴＧが生じる。この場合においてフレームがずれた場合、正しいｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質が翻訳されない。
ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の転写が抑制されている場合、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の転写物の量は、野生型と比較して、好ましくは２０％以下、より好ましくは１５％以下、さらに好ましくは１０％以下である。また、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の翻訳が抑制されている場合、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の翻訳産物の量は、野生型と比較して、好ましくは２０％以下、より好ましくは１５％以下、さらに好ましくは１０％以下である。
また、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の変異によって、ＲＮＡのスプライシングが正常に機能しない場合もあり得る。例えば、イントロンの５’末端側のＧＴを含む前後１０塩基、好ましくは５塩基、より好ましくは１塩基、またはイントロンの３’末端側のＡＧを含む前後１０塩基、好ましくは５塩基、より好ましくは１塩基に、変異が生じている場合、イントロンの切り出しがうまくいかず、異常なｍＲＮＡが生じて、ウイルスに対して非機能的なｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質を生産するか、またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の翻訳が抑制され得る。
ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子に変異を生じさせる方法は特に限定されず、公知の方法を用いることができる。
変異原としては、例えば、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）、アジ化ナトリウム、エチジウムブロマイド、および亜硝酸等の化学薬剤を用いることができるが、タバコのゲノムＤＮＡに変異を生じさせる化学薬剤であればこれらに限定されない。また、変異原として、例えば、γ線、重イオンビーム、Ｘ線、中性子線、またはＵＶ等が挙げられるが、タバコのゲノムＤＮＡに変異を生じさせる放射線等であればこれらに限定されない。変異原として好ましくはＥＭＳである。
変異原処理されるタバコの組織または器官としては、種子、根、葉、および花等が挙げられ、植物体を再生できれば特にその種類は限定されないが、好ましくは種子である。変異誘発集団に関して、変異誘発性の化学薬剤または放射線の用量は、致死性または生殖不稔性に至る閾値レベルよりも低い変異頻度が得られるように、それぞれのタイプの植物組織に関して経験的に決定される。
また、変異原としてトランスポゾン（可動性遺伝因子）を用いることもできる。トランスポゾンがタバコゲノム上で転移し、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の機能を抑制することができる。このようなトランスポゾンの好ましい例として、タバコのレトロトランスポゾンtnt1が挙げられる。あるいは、他の植物のトランスポゾンをタバコに導入して使用することもできる。そのようなトランスポゾンとして、例えば、トウモロコシのトランスポゾンAc/Ds、Spm/dSpm、およびMu、イネのトランスポゾンnDart、ならびに金魚草のトランスポゾンtam等が挙げられるが、これらに限定されない。
さらに、アグロバクテリウムのＴｉプラスミドの中にあるＴ−ＤＮＡをタバコにat randomに挿入して、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の機能を抑制することも可能である。したがって、Ｔ−ＤＮＡを挿入したタバコ変異体集団（パネル）を作製し、その中からｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの塩基配列を指標に、その機能が抑制された個体を選抜することが可能である。
２組（４つ）のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子に変異を有するウイルス抵抗性タバコの作出方法の一例では、上述のようにタバコを変異原で処理し、タバコゲノム全体に変異を生じさせたタバコ変異体集団（パネル）を作製し、ゲノムＤＮＡを抽出する。遺伝子特異的プライマーを利用して、パネルのゲノムＤＮＡそれぞれから、またはそれらをプールしたものから、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子を増幅し、その産物の塩基配列を決定し、ホモ接合変異の入った系統を選抜する。まず、Ｓ型ゲノムにホモ接合変異の入った系統およびＴ型ゲノムにホモ接合変異の入った系統をそれぞれ取得し、それらを交配したＦ１を作製する。さらにその自殖後代（Ｆ２）を育成し、その中からＳ型ゲノムおよびＴ型ゲノムの両方にホモ接合変異の入った系統を取得する（二因子劣性ゆえ１／１６の確率で得られる）。このようにして得られたｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子がＳ型ゲノムおよびＴ型ゲノムの両方において変異した系統について、ウイルスアッセイを行って抵抗性を確認する。この際、定量ＰＣＲ等を用いてｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現解析を行い、転写量が低減したことを確認してもよい。
したがって、ウイルス抵抗性タバコ作出方法の一態様において、タバコゲノム全体に変異を生じさせたタバコ変異体集団（パネル）を作製する工程、ゲノムＤＮＡを抽出する工程、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の塩基配列を決定する工程、ホモ接合変異の入った系統を選抜する工程、およびウイルスアッセイを行って抵抗性を確認する工程のうちの少なくとも１つの工程を含んでいてもよい。
さらに、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子以外のＤＮＡの箇所に入った変異を取り除く目的で、変異処理をした系統を、変異処理をしていない系統と任意のタイミングで掛け合わせてもよい。
タバコ変異体からのゲノムＤＮＡの抽出は、公知の方法に基づいて行えばよく、市販の抽出キットを用いてもよい。また、ゲノムＤＮＡは、粗精製物であってもよいし、いくつかの精製工程を経た精製品であってもよい。
ポリヌクレオチドの増幅は、例えばＰＣＲ法によって行うことができるが、他の公知の遺伝子増幅方法、例えば、ＬＣＲ（ligase chain reaction）法またはＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法等によって行ってもよい。
各ポリヌクレオチドを増幅するためのプライマー配列は、例えば、配列番号７の塩基配列から、または配列番号８の塩基配列から設計することが可能である。配列番号７（Ｓ型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子）の塩基配列と配列番号８（Ｔ型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子）の塩基配列との相同性解析結果から、まずＳ型特異的な領域およびＴ型特異的な領域を見つける。その領域にプライマーを設計することで、Ｓ型とＴ型との混在するタバコゲノムから、Ｓ型およびＴ型の遺伝子をそれぞれ特異的に増幅することができる。設計する部位としては、Ｓ型またはＴ型特異的な領域から選択することができるが、好ましくはイントロン、５’非翻訳領域または３’非翻訳領域である。プライマーの長さは、好ましくは１５塩基〜３０塩基、特に好ましくは１７塩基〜２５塩基である。プライマー配列は、配列番号７の塩基配列に特異的な領域、または配列番号８の塩基配列に特異的な領域、または両塩基配列に共通する領域の配列に基づき設計してもよい。また、変異箇所を含む所定塩基数の配列を増幅するためのプライマーとして機能し得る限り、その配列において１またはそれ以上の置換、欠失、および／または付加を含んでいてもよい。また、プライマーは必要に応じて蛍光物質または放射性物質等で標識されていてもよい。
増幅する各ポリヌクレオチドの長さは、後述する各種検出方法が利用可能な長さであれば特に限定されないが、例えば、２０塩基〜５０００塩基、より好ましくは５０塩基〜２０００塩基、さらに好ましくは１００塩基〜７００塩基、よりさらに好ましくは１００塩基〜５００塩基である。
以下、変異を検出する方法として代表的なものを挙げるが、これらに限定されない。
（１）市販のシーケンサー等を利用し、各ポリヌクレオチドの塩基配列を直接読み取ることによって変異の有無を検出する方法。
（２）ＳＳＣＰ（Single Strand Conformation Polymorphism：一本鎖高次構造多型）法を用いて変異の有無を検出する方法。
（１）市販のシーケンサー等を利用し、各ポリヌクレオチドの塩基配列を直接読み取ることによって変異の有無を検出する方法。
（２）ＳＳＣＰ（Single Strand Conformation Polymorphism：一本鎖高次構造多型）法を用いて変異の有無を検出する方法。
上記方法によって変異の検出されたタバコ変異体から、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子特異的プライマーを利用して、増幅された（ＰＣＲ）産物の塩基配列を確認することで、変異が、ホモ接合変異かヘテロ接合変異か、あるいは、Ｓ型ゲノムに生じた変異かＴ型ゲノムに生じた変異かが判明し得る。
ＥＭＳ処理の場合、多くのＤＮＡの変異はＣ→ＴおよびＧ→Ａである。そのため、ＥＭＳ処理によって変異するとストップコドンになる（すなわち、ナンセンス変異の候補になる）コドンは、ＣＡＡ（最初のＣがＴに置換）、ＣＧＡ（最初のＣがＴに置換）、ＴＧＧ（２つ目のＧ、または３つ目のＧがＡに置換）、およびＣＡＧ（最初のＣがＴに置換）の４種類である。
例えば、配列番号７の場合、（１）２７０番目のＣがＴに置換、（２）２９５番目のＧがＡに置換、（３）２９６番目のＧがＡに置換、（４）３０４番目のＧがＡに置換、（５）３０５番目のＧがＡに置換、（６）３１５番目のＣがＴに置換、（７）３３０番目のＣがＴに置換、（８）３４３番目のＧがＡに置換、（９）３４４番目のＧがＡに置換、（１０）３５７番目のＣがＴに置換、（１１）３９４番目のＧがＡに置換、（１２）３９５番目のＧがＡに置換、（１３）１７４０番目のＣがＴに置換、（１４）１８１３番目のＧがＡに置換、（１５）１８１４番目のＧがＡに置換、（１６）１８４６番目のＧがＡに置換、（１７）１８４７番目のＧがＡに置換、（１８）１８８８番目のＧがＡに置換、（１９）１８８９番目のＧがＡに置換、（２０）２０５０番目のＣがＴに置換、（２１）２１０４番目のＣがＴに置換、（２２）２１２３番目のＧがＡに置換、（２３）２１２４番目のＧがＡに置換、（２４）２１５２番目のＣがＴに置換、（２５）４７４２番目のＧがＡに置換、（２６）４７４３番目のＧがＡに置換、または（２７）４９２６番目のＣがＴに置換されれば、終止コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧ、またはＴＧＡ）となる。そのため、ウイルス抵抗性タバコの好ましい一例では、変異は、ゲノムＤＮＡにおける、配列番号７に示す塩基配列からなるｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の上記（１）〜（２７）に示す１つ以上の変異である。これらのうち好ましくは、（１）〜（２６）の何れかに変異が起きる場合、より好ましくは、（１）〜（２４）の何れかに変異が起きる場合である。
例えば、配列番号８の場合、（１）２６４番目のＣがＴに置換、（２）２８９番目のＧがＡに置換、（３）２９０番目のＧがＡに置換、（４）２９８番目のＧがＡに置換、（５）２９９番目のＧがＡに置換、（６）３１５番目のＣがＴに置換、（７）３２８番目のＧがＡに置換、（８）３２９番目のＧがＡに置換、（９）３４２番目のＣがＴに置換、（１０）３７９番目のＧがＡに置換、（１１）３８０番目のＧがＡに置換、（１２）１６３０番目のＣがＴに置換、（１３）１７０３番目のＧがＡに置換、（１４）１７０４番目のＧがＡに置換、（１５）１７３６番目のＧがＡに置換、（１６）１７３７番目のＧがＡに置換、（１７）１７７８番目のＧがＡに置換、（１８）１７７９番目のＧがＡに置換、（１９）１９４０番目のＣがＴに置換、（２０）１９９４番目のＣがＴに置換、（２１）２０１３番目のＧがＡに置換、（２２）２０１４番目のＧがＡに置換、（２３）２０４２番目のＣがＴに置換、（２４）３２２４番目のＧがＡに置換、（２５）３２２５番目のＧがＡに置換、または（２６）３４０６番目のＣがＴに置換されれば、終止コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧ、またはＴＧＡ）となる。そのため、ウイルス抵抗性タバコの好ましい一例では、変異は、ゲノムＤＮＡにおける、配列番号８に示す塩基配列からなるｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の上記（１）〜（２６）に示す１つ以上の変異である。これらのうち好ましくは、（１）〜（２５）の何れかに変異が起きる場合、より好ましくは、（１）〜（２３）の何れかに変異が起きる場合である。
あるいは、変異は、（ａ）配列番号３もしくは配列番号４に示すアミノ酸配列と９２％以上の配列同一性を有する機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のエキソン、または（ｂ）配列番号５もしくは配列番号６に示す塩基配列と９２％以上の配列同一性を有するｍＲＮＡが生成されるものであり、かつ機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のエキソンにおける、下記（１）〜（４）に示す１つ以上の変異であってもよい；（１）コドンＣＡＡのＣがＴに置換、（２）コドンＣＧＡのＣがＴに置換、（３）コドンＣＡＧのＣがＴに置換、（４）コドンＴＧＧのＧ（２つのＧのうちの何れか一方または両方）がＡに置換。
ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子に変異を生じさせる別の手段として、遺伝子編集技術を用いることもできる。遺伝子編集技術とは、ゲノムの任意の領域に変異を導入する技術である。このような技術としては、例えば、ＴＡＬＥＮ（Transcription activator-like effector）、ＣＲＩＳＰＲ（Clustered regularly interspaced short palindromic repeat）／ＣＡＳ、ＯＤＭ（Oligonucleotide Directed Mutagenesis）、およびＺＦＮ（Zinc Finger Nuclease）等が挙げられる。
ＯＤＭおよびＺＦＮの定義は、文献：Lusser et al. (2012) Nature Biotechnology 30: 231-239に記載されている。また、ＯＤＭについては、例えば、文献：Zhu et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 8768-8773、および文献：Oh and May (2001) Current Opinion in Biotechnology 12:169-172.に植物への適用が記載されている。ＺＦＮについては、文献：Durai et al. (2005) Nucleic Acids Res 33: 5978-5990に植物への適用が記載されている。これらに記載された方法に従えば、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子に変異を導入することが可能である。
ＴＡＬＥＮについては次のとおりである。植物病原菌由来のＤＮＡ結合タンパクTranscription activator-like (TAL) effectorは、３４アミノ酸が繰り返された構造部分を有し、この繰り返し構造の１つ１つがそれぞれＤＮＡの１つの塩基を認識する。ＤＮＡには４種の塩基（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）があるが、TAL effectorの繰り返し構造の１３番目および１４番目の２つのアミノ酸によって、ＤＮＡ配列の結合特異性が決定される。すなわち、各繰り返し構造の１３〜１４番目のアミノ酸を選択することによって、人工的にTAL effectorを所望のＤＮＡ領域に結合させることができる。このTAL effectorに、二量体のときＤＮＡ切断活性を示す酵素ＦｏｋＩと融合させたものをTAL effector nuclease（ＴＡＬＥＮ）という。このＴＡＬＥＮを２つ近傍に結合させるように設計すると、Fok Iが二量体を形成し、２つのＴＡＬＥＮの間のＤＮＡを切断する。切断が起こった後、ＤＮＡの修復が行われるが、その際、切断部位が多少削れたり、新たに付加が入ったりすることがある。ＴＡＬＥＮは植物でも機能することが分っている（文献：Zhang et al. (2013) Plant Physiology 161: 20-27）。
例えば配列番号１または２のうち、好ましくはタンパク質コード領域において、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ特異的な、好ましくは１５塩基〜２５塩基、より好ましくは１８塩基〜２２塩基のヌクレオチド配列を設計する。さらにそこから好ましくは９塩基〜１５塩基離れた場所に同様にヌクレオチド配列を設計する。これら２つのヌクレオチドに挟まれた部分が後に切断されることになる。
設計したヌクレオチド配列がｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子特異的か否かを判断するために、設計したヌクレオチド配列を、例えばタバコ（Nicotiana tabacum）またはNicotianasylvestrisもしくはNicotiana tomentosiformisの公知の配列データベースに対して相同性検索することによって、配列そのものの他に、その配列を含め相同性の高い領域があるか否かを調べてもよい。配列データベースとしては、例えば、GenBank、EMBL（The European Molecular Biology Loboratory）、またはDDBJ（DNA Data Bank of Japan）等を利用することができる。配列分析アルゴリズムとしては、例えば、BLAST等を利用することができる。また、データベースの配列の種類としては、Nucleotide Collection(nr/nt)、Expressed Sequence Tags(EST)、Genomic survey sequences(GSS)、およびWhole genome shotgun contigs(WGS)等があるが、これらに限定されない。
設計した特異的ヌクレオチド配列を基に、ＴＡＬＥの遺伝子配列を設計する。複数の繰り返し構造の結合には、例えば、GoldenGateTALEN Kit（Addgene社）を用いることができるが、これに限定されない。ＴＡＬＥとＦｏｋＩとを融合させる際には、例えば、適当なリンカー配列を配置してもよい。なお、ＦｏｋＩ配列は公知データベースに収載されている。ＴＡＬＥ／ＦｏｋＩ融合遺伝子をタバコで発現させるためのプロモーターは高発現するものが好ましく、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ ＲＮＡ遺伝子のプロモーター、アクチン遺伝子のプロモーター、およびユビキチン遺伝子のプロモーター等の構成的発現プロモーター；Rubisco small subunit遺伝子のプロモーター、ＰＰＤＫ遺伝子プロモーター等の緑色組織特異的プロモーター；ならびにその他の器官または時期特異的プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。発現量を上げるために所望のイントロンをプロモーターとＴＡＬＥ／ＦｏｋＩとの間に配置してもよい。さらに発現量を上げるために、ＴＡＬＥ／ＦｏｋＩのコドンを植物（タバコ）のコドンに最適化してもよい。植物コドンは、例えばCodon Usage Database（http://www.kazusa.or.jp/codon/）等の公知のデータベースに記載されている。
ＴＡＬＥＮ発現カセットを植物に導入するためのベクターには、上記の他に、その発現カセットが導入された植物細胞を選抜するための薬剤耐性遺伝子（選抜マーカー）の発現カセットが組み込まれていてもよい。薬剤耐性遺伝子としては、タバコ細胞を選抜可能な薬剤の耐性遺伝子であればよく、例えばカナマイシン抵抗性遺伝子（ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ：ＮＰＴ−ＩＩ）、およびハイグロマイシン抵抗性遺伝子（ハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ：ＨＰＴ）等が挙げられるが、これらに限定されない。またプロモーターは構成的発現をするものであれば特に限定されない。
さらに、ＴＡＬＥＮ発現カセットを安定的に植物に導入する際にアグロバクテリウムを利用する場合は、ＴＡＬＥＮ発現カセットおよび選抜マーカー発現カセットがＴ−ＤＮＡに存在することが必要である。この場合、Ｔ−ＤＮＡの境界配列としてライトボーダー（ＲＢ）配列およびレフトボーダー（ＬＢ）配列がＴ−ＤＮＡの両端に配置される。
ＴＡＬＥＮ発現カセットを植物に導入するためのベクターであって、タバコに遺伝子を導入できるものとしては、例えば、pBI系、pSB系（文献：Komari et al. 2006 Methods in Mol. Biol. 343: 15-41.）、pLC系（文献：米国特許第８２９８８１９号明細書）、およびpGreen（文献：Hellens et al. 2000 Plant Mol. Biol. 42: 819-832.）等が挙げられるがこれらに限定されない。
ＴＡＬＥＮ発現カセットを植物に導入する方法は特に限定されず、上述のアグロバクテリウムを使用する方法、パーティクルガン法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法、またはアグロインフィルトレーション法等、当業者が通常使用する方法を用いればよい。また、導入されるタバコの組織または器官としては、植物体を再生できれば特にその種類は限定されず、例えば、種子、根、葉、および花等が挙げられる。
形質転換植物の選抜および育成は、当業者であれば容易に実施することが可能である。選抜に用いる薬剤としては、これらに限定されるわけではないが、カナマイシン、およびハイグロマイシン等が挙げられる。薬剤の濃度は、例えば２０ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬとすることができ、好ましくは５０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬである。植物培養物の育成用の培地は通常用いられるものでよく、無機塩の種類としてＭＳおよびＬＳ等が挙げられ、これに例えば、ショ糖、寒天、または植物ホルモン等を添加する。これらの使用濃度は、当業者が通常用いるプロトコールに従えばよい。
遺伝子導入を行う組織または器官として、上述に加えて、プロトプラストを使用ことができる。プロトプラストは細胞壁分解酵素を用いて常法に従い調製することができる。また、遺伝子導入法として、上述の安定形質転換法に加えて、トランジェント法を用いることも可能である。トランジェントアッセイは、エレクトロポレーション法、またはＰＥＧ法等の常法を用いて実施すればよい。また別のトランジェントアッセイ法として、Agro-infiltration、およびウイルスベクター等が挙げられる。ウイルスベクターとしては、ＡＬＳＶ（Apple latent spherical virus）またはＴＲＶ（Tobacco rattle virus）等を用いることができるが、これらに限定されない。
遺伝子を導入した細胞から再生した個体、または組織もしくは器官において、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子に変異が生じたか否かは、標的とした領域を挟む形で、プライマーを設計し、所望の植物組織からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ等によって当該領域を増幅し、その産物の塩基配列を調べることによって確認することができる。
遺伝子発現を解析する方法は、特に限定されず、ノーザンハイブリダイゼーション法または定量ＰＣＲ法等の公知の方法で行えばよい。ハイブリダイゼーションに使用するプローブは、配列番号１の塩基配列もしくはその一部（例えば配列番号９）、または配列番号２の塩基配列もしくはその一部、またはこれらに１もしくは複数の塩基の置換、欠失もしくは挿入がある塩基配列とすることができ、プローブの長さは例えば２０塩基〜配列全長とすることができる。
上記発現解析を行うためのＲＮＡの抽出は、グアニジン塩酸法またはＳＤＳ−フェノール法等、公知の方法で行えばよく、市販のキットを用いてもよい。また、総ＲＮＡからさらにｍＲＮＡ（ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡ）を精製してもよい。
定量ＰＣＲを実施するためのｃＤＮＡの合成は、逆転写酵素とオリゴｄＴプライマーまたは遺伝子特異的プライマーとを用いた公知の方法で行うことができ、市販のキットを用いてもよい。
また、定量ＰＣＲのためのプライマーは、配列番号１または配列番号２に基づき設計することができる。プライマーの長さとしては好ましくは１５塩基〜３０塩基、特に好ましくは１７塩基〜２５塩基である。一組のプライマーセットが標的とする増幅配列の長さは、特に限定されず、例えば４０塩基〜配列全長とすることができ、好ましくは５０塩基〜５００塩基である。
蛍光ＰＣＲ装置を用いた定量ＰＣＲを実施する際には、上記プライマーに加え、標的配列の中にプローブ配列を設定する。標的配列の長さは、好ましくは４０塩基〜２００塩基、さらに好ましくは５０塩基〜１５０塩基である。プライマーおよびプローブを標識するレポーター色素としてＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、およびＣｙａｎｉｎｅ５が挙げられ、クエンチャー色素としてＴＡＭＲＡ、およびＢＨＱ１等が挙げられるが、これらに限定されず、当業者が適宜選択して組合せることができる。定量ＰＣＲの内部標準として用いる遺伝子は、構成的発現遺伝子あれば特に限定されないが、好ましい遺伝子として、elongation factor遺伝子およびアクチン遺伝子等が挙げられる。
ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳについては次のとおりである。ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳシステムは、ＤＮＡ配列を認識するガイドＲＮＡと、ＣＡＳヌクレアーゼを使用する遺伝子編集技術であり、植物においても機能することが知られている（文献：Belhaj et al. (2013) Plant Methods 9:39）。この技術は、ゲノム上の所望の配列を有するＤＮＡを切断する技術であり、標的ゲノム配列の欠失、付加および挿入に関しては、ＴＡＬＥＮと同様に、宿主のＤＮＡ修復系のミスに頼るものである。
ＣＡＳ９を植物で発現させるためのプロモーターとしては、高発現するものが好ましく、例えば、上述の３５Ｓ ＲＮＡ遺伝子のプロモーター、ユビキチン遺伝子のプロモーター、およびＰＰＤＫ遺伝子プロモーター等が挙げられるが、これらに限定されない。発現量を上げるために所望のイントロンをプロモーターとＣＡＳ９との間に配置してもよい。なお、ＣＡＳ９の塩基配列は公知である。さらに発現量を上げるために、ＣＡＳ９のコドンを植物（タバコ）のコドンに最適化してもよい。また、ＣＡＳ９に核局在シグナルＮＬＳ（Nuclear localize Signal）を付加してもよい。
所望のゲノム配列および相補的なガイドＲＮＡを設計する。例えば配列番号１または２のうち、好ましくはタンパク質コード領域において、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ特異的な、好ましくは１９塩基〜２２塩基のヌクレオチド配列を決定する。この際、その配列の３’末端側にはprotospacer-adjacent motif（ＰＡＭ）と呼ばれるＮＧＧ配列が存在する必要がある。また、後述のプロモーターの種類がＵ６の場合、転写開始点（ガイドＲＮＡの５’末端）はＧ、Ｕ３プロモーターの場合はＡであることが必要である。
ガイドＲＮＡの配列がｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子特異的か否かを判断するために、設計した配列を、例えばタバコ（Nicotiana tabacum）またはNicotiana sylvestrisもしくはNicotiana tomentosiformisの配列データベースに対して相同性検索し、配列そのものの他に、その配列を含め相同性の高い領域があるか否かを調べることができる。配列データベースおよび分析アルゴリズムについては、上述と同様である。
ガイドＲＮＡを設計後、その３’末端側にｓｇＲＮＡ ｓｃａｆｆｏｌｄ配列を融合、ｓｇＲＮＡ（ガイド(g)RNA＋gRNA scaffold）とし、このｓｇＲＮＡを発現するためのコンストラクトを作製する。その際、プロモーターとして、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのＵ６またはＵ３等のプロモーターが使用できる。適当なベクターを用いて完成したコンストラクトをタバコに導入し、組換え体を選抜、再生する。なお、より確実に変異を生じさせるために、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ内部に複数のガイドＲＮＡを設計し、それらを発現するコンストラクトを同時にタバコに導入することもできる。この場合は、１つのＴ−ＤＮＡ上に複数のガイドＲＮＡ発現カセットおよびＣＡＳ９発現カセットを同時に配置させてもよい。
なお、ガイドＲＮＡおよびＣＡＳ９を発現させるカセットを植物に導入するためのベクター、ならびにタバコ形質転換の方法は、上述のＴＡＬＥＮにおける説明と同様である。
遺伝子導入を行う組織または器官として、上述に加えて、プロトプラストを使用することができる。プロトプラストは細胞壁分解酵素を用いて常法に従い調製することができる。また、遺伝子導入法として、上述の安定形質転換法に加えトランジェント法を用いることも可能である。トランジェントアッセイについては、上述のＴＡＬＥＮにおける説明と同様である。
遺伝子を導入した細胞から再生した個体、または組織もしくは器官において、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子に変異が生じたか否かは、上述のＴＡＬＥＮにおける説明と同様の方法で確認することできる。
ウイルスアッセイ方法としては、ウイルス溶液とカーボランダム等の固形粉体とを組み合わせた機械接種法、および、ウイルスを感染させたアブラムシを用いる接種法等が挙げられるが、これらに限定されない。また、用いるウイルスは、特に限定されず、ウイルス抵抗性タバコが抵抗性を示すウイルスとして上記に列挙したウイルスを用いることができる。
（ウイルス抵抗性タバコおよびその作出方法の態様２）
本発明に係るウイルス抵抗性タバコの別の一態様は、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現量が野生型と比較して２０％以下であるウイルス抵抗性タバコである。発現が抑制されたタバコのｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現量は、野生型の発現量を１００％とした場合、好ましくは１５％以下、より好ましくは１０％以下である。ここで、「野生型」とは、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現を抑制させる因子が導入されておらず、かつ、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子に変異を有していないタバコを指す。
本発明に係るウイルス抵抗性タバコの別の一態様は、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現量が野生型と比較して２０％以下であるウイルス抵抗性タバコである。発現が抑制されたタバコのｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現量は、野生型の発現量を１００％とした場合、好ましくは１５％以下、より好ましくは１０％以下である。ここで、「野生型」とは、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現を抑制させる因子が導入されておらず、かつ、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子に変異を有していないタバコを指す。
このようなウイルス抵抗性タバコの作出には、従来公知の方法が利用可能であり、例えば、アンチセンス、コサプレッション、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ＶＩＧＳ、リボザイム、相同組換え、およびドミナントネガティブ遺伝子産物の発現等を利用した方法が挙げられる。具体的には、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現量を野生型と比較して２０％以下、好ましくは１５％以下、より好ましくは１０％以下に抑制させる因子をタバコに導入することによって作出することができる。
ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの発現を抑制する方法として好ましくは、ＲＮＡｉである。具体的には、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の塩基配列（例えば配列番号１）もしくはその一部（例えば配列番号９）、または、例えば配列番号２の塩基配列またはその一部をトリガーとして用いたＲＮＡｉコンストラクトを作製し、植物で発現するプロモーターと融合し、ベクターを用いてこれをタバコに導入する。そして、ＲＮＡｉコンストラクトを発現させて、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現を抑制させたウイルス抵抗性タバコを得る。したがって、一態様におけるウイルス抵抗性タバコは、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現を抑制するためのＲＮＡｉコンストラクトを保持し得る。
トリガーの長さは、例えば２１塩基〜配列全長とすることができるが、好ましくは５０塩基以上、より好ましくは１００塩基以上である。トリガー配列には、１または複数の塩基の置換、欠失または挿入があってもよい。
ＲＮＡｉでは、トリガー配列を１つがセンス方向、もう１つがアンチセンス方向となるように機能的に連結させて、トリガー配列が逆位反復となる様なＲＮＡｉコンストラクトを作製する。その際、両トリガーの間にスペーサー配列を入れることが好ましい。そのようなスペーサー配列としては、タバコのゲノムに含まれない配列、またはイントロン配列等の成熟ｍＲＮＡに含まれない領域が好ましい。このような配列としては、例えば、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子ならびにpyruvate dehydrogenase kinase（ｐｄｋ）およびカタラーゼ（ｃａｔ）遺伝子等のイントロン配列が挙げられるが、これらに限定されない。
ＲＮＡｉコンストラクトを植物の中で転写させるためのプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ ＲＮＡ遺伝子のプロモーター、アクチン遺伝子のプロモーター、およびユビキチン遺伝子のプロモーター等の構成的発現プロモーター；Rubisco small subunit遺伝子のプロモーター、およびＰＰＤＫ遺伝子プロモーター等の緑色組織特異的プロモーター；ならびにその他の器官または時期特異的プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。上記プロモーターとして好ましくは、ウイルスの感染する組織で発現するプロモーターである。
また、ターミネーターとしては、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ ＲＮＡまたは１９Ｓ ＲＮＡ遺伝子のターミネーター、およびノパリンシンターゼ遺伝子のターミネーター等が挙げられるが、植物で機能するものであれば、これらに限定されない。
ＲＮＡｉ発現カセットを植物に導入するためのベクターには、上記の他に、その発現カセットが導入された植物細胞を選抜するための薬剤耐性遺伝子の発現カセットが組み込まれていてもよい。薬剤耐性遺伝子としては、タバコ細胞を選抜可能な薬剤の耐性遺伝子であればよく、例えばカナマイシン抵抗性遺伝子（ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ：ＮＰＴ−ＩＩ）、およびハイグロマイシン抵抗性遺伝子（ハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ：ＨＰＴ）等が挙げられるが、これらに限定されない。またプロモーターも構成的発現をするものであれば特に限定されない。
さらに、ＲＮＡｉ発現カセットを安定的に植物に導入する際にアグロバクテリウムを利用する場合は、ＲＮＡｉ発現カセットおよび選抜マーカー発現カセットが、Ｔ−ＤＮＡに存在することが必要である。この場合、Ｔ−ＤＮＡの境界配列として、ライトボーダー（ＲＢ）配列およびレフトボーダー（ＬＢ）配列がＴ−ＤＮＡの両端にそれぞれ配置される。
また、遺伝子発現を視覚的に予測するために、蛍光タンパク質の発現カセットをＴ−ＤＮＡの中に配置してもよい。蛍光タンパク質としては、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）および黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）等が挙げられるが、これらに限定されない。蛍光タンパク質として好ましくは、ＧＦＰである。蛍光はイメージアナライザーで観察することができる。
ＲＮＡｉ発現カセットを植物に導入するためのベクターであって、タバコに遺伝子を導入できるものとしては、例えば、pBI系、pSB系（文献：Komari et al. 2006 Methods in Mol. Biol. 343: 15-41.）、pLC系（文献：米国特許第８２９８８１９号明細書）、pGreen（文献：Hellens et al. 2000 Plant Mol. Biol. 42: 819-832.）、pHellsgate（文献：Wesley et al. 2001 Plant J 27: 581-590.）、およびpSP231（文献：国際公開第２０１１／１０２３９４号公報）等が挙げられるが、これらに限定されない。
ＲＮＡｉ発現カセットを植物に導入する方法は特に限定されず、上述のアグロバクテリウムを使用する方法、パーティクルガン法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法、またはアグロインフィルトレーション法等、当業者が通常使用する方法を用いればよい。また、導入されるタバコの組織または器官としては、植物体を再生できれば特にその種類は限定されず、例えば、種子、根、葉、および花等が挙げられる。
形質転換植物の選抜および育成は、当業者であれば容易に実施することが可能である。選抜に用いる薬剤としては、これらに限定されるわけではないが、カナマイシン、およびハイグロマイシン等が挙げられる。薬剤の濃度は、例えば２０ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬとすることができ、好ましくは５０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬである。植物培養物の育成用の培地は通常用いられるものでよく、無機塩の種類としてＭＳおよびＬＳ等が挙げられ、これに例えば、ショ糖、寒天、または植物ホルモン等を添加する。これらの使用濃度は、当業者が通常用いるプロトコールに従えばよい。
遺伝子発現を解析する方法およびウイルスアッセイ方法については、上述のとおりである。
〔２．タバコにウイルス抵抗性を付与する方法〕
本発明はまた、タバコにウイルス抵抗性を付与する方法を提供する。
本発明はまた、タバコにウイルス抵抗性を付与する方法を提供する。
当該方法の一態様では、ウイルスに対して非機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質を生産するか、または翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現を抑制する変異を翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子に導入することによって、タバコにウイルス抵抗性を付与する。そのような変異を導入する方法については、〔１．ウイルス抵抗性タバコおよびその作出方法〕欄に記載のとおりである。
また、当該方法の別の一態様では、翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現量を野生型と比較して２０％以下、好ましくは１５％以下、より好ましくは１０％以下に抑制させる因子を導入することによって、タバコにウイルス抵抗性を付与する。そのような因子を導入する方法については、〔１．ウイルス抵抗性タバコおよびその作出方法〕欄に記載のとおりである。
〔３．ＤＮＡマーカーおよびその利用〕
本発明では、タバコｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子上に生じた変異を利用してＤＮＡマーカーを開発することができ、それをマーカー育種に活用することができる。「ＤＮＡマーカー」とは、品種間または個体間におけるＤＮＡの塩基配列の違い（変異または多型）、またはその違いを検出するためのツールであり、品種または個体を識別するための目印となる塩基配列の違い（変異または多型）、またはその違いを検出するためのツールのことを指す。ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子における変異が確定し、その変異によってウイルスに抵抗性となることが確認された場合、その変異が生じたタバコ変異体を、当該ウイルス抵抗性の育種母本として利用することができる。その際、既に抵抗性に係る原因変異が分っているため、原因変異の識別に利用可能なマーカーをｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子上に設計することができる。当該変異とウイルス抵抗性との関係が遺伝的分離によって切れることがないため、精密なマーカー育種が可能となる。この変異の有無を検出すれば、交配等を繰り返した際に、一回一回ウイルス抵抗性を確認する必要がない。
本発明では、タバコｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子上に生じた変異を利用してＤＮＡマーカーを開発することができ、それをマーカー育種に活用することができる。「ＤＮＡマーカー」とは、品種間または個体間におけるＤＮＡの塩基配列の違い（変異または多型）、またはその違いを検出するためのツールであり、品種または個体を識別するための目印となる塩基配列の違い（変異または多型）、またはその違いを検出するためのツールのことを指す。ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子における変異が確定し、その変異によってウイルスに抵抗性となることが確認された場合、その変異が生じたタバコ変異体を、当該ウイルス抵抗性の育種母本として利用することができる。その際、既に抵抗性に係る原因変異が分っているため、原因変異の識別に利用可能なマーカーをｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子上に設計することができる。当該変異とウイルス抵抗性との関係が遺伝的分離によって切れることがないため、精密なマーカー育種が可能となる。この変異の有無を検出すれば、交配等を繰り返した際に、一回一回ウイルス抵抗性を確認する必要がない。
タバコからのゲノムＤＮＡの抽出は、常法に基づけばよく、市販の抽出キットを用いてもよいが、特に限定されない。また、ゲノムＤＮＡは、粗精製物であってもよいし、いくつかの精製工程を経た精製品であってもよい。変異の有無を検出する技術としては、例えばＲＦＬＰまたは一本鎖ＤＮＡをプローブに用いた核酸（「ポリヌクレオチド」ともいう）のハイブリダイゼーションを応用した技術、およびＰＣＲ等のようにポリヌクレオチドの増幅を伴う技術等があるが、変異を検出できるものであれば、特に限定されない。
ポリヌクレオチドを増幅する場合、例えばＰＣＲ法によって行うことができるが、他の公知の遺伝子増幅方法、例えば、ＬＣＲ法、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法、またはＬＡＭＰ法等によって行ってもよい。増幅する各ポリヌクレオチドの長さは、後述する各種検出方法が利用可能な長さであれば特に限定されないが、例えば、４０塩基〜５０００塩基であることが好ましく、１００塩基〜１０００塩基であることがより好ましく、１００塩基〜７００塩基であることがさらに好ましく、１００塩基〜５００塩基であることがよりさらに好ましい。
各ポリヌクレオチドを増幅するためのプライマー配列は、変異箇所を挟むか、もしくは含むように設計することが好ましいが、プライマー配列を設計する位置は特に限定されない。プライマーの長さは、好ましくは１５塩基〜３０塩基、特に好ましくは１７塩基〜２５塩基である。また、変異箇所を含む所定塩基数の配列を増幅するためのプライマーとして機能し得る限り、その配列において１またはそれ以上の置換、欠失、および／または付加を含んでいてもよい。また、プライマーは必要に応じて蛍光物質または放射性物質等で標識されていてもよい。
検出される変異は、ウイルスに対して非機能的なｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質を生産させるか、またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現を抑制する変異である。その具体例は、〔１．ウイルス抵抗性タバコおよびその作出方法〕欄に記載のとおりである。
以下、変異を検出する方法として代表的なものを挙げるが、こられに限定されない。
（１）市販のシーケンサー等を利用し、増幅したポリヌクレオチドの塩基配列を直接読み取ることによって変異の有無を検出する方法。
（２）ＳＳＣＰ（Single Strand Conformation Polymorphism）法を用いて、増幅したポリヌクレオチド上の変異の有無を検出する方法。
（３）増幅したポリヌクレオチドに対して、変異箇所の配列（変異前の配列または変異後の配列）を特異的に認識する制限酵素による処理後に、切断の有無により判定する方法（ＣＡＰＳ（Cleaved Amplified Polymorphic Sequence）法）。その他、意図的に設計したミスマッチプライマーを含むプライマーセットによって制限酵素認識部位を作製するｄＣＡＰＳ（derived CAPS）法を用いてもよい。そのようなプライマーセットとしては、例えば、配列番号７に示すＳ型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の塩基配列の３３０番目の塩基のＣ→Ｔ変異を検出するためのプライマーとして、配列番号４５に示す塩基配列からなる核酸および配列番号４６に示す塩基配列からなる核酸のセットが挙げられるが、これらに限定されない。また、配列番号４６に示す塩基配列のように、ミスマッチプライマーを使用した場合、増幅効率が良くない場合があるが、そのような場合、標的配列の外側の部位にミスマッチのないプライマーを設計し（上記の場合、例えば配列番号２５および２６に示す塩基配列からなる核酸プライマーのセット）、予めＰＣＲを一度行い、そのＰＣＲ産物の一部を鋳型に、ミスマッチプライマーで再増幅し、得られたＰＣＲ産物を制限酵素で処理することで変異を検出してもよい。
（１）市販のシーケンサー等を利用し、増幅したポリヌクレオチドの塩基配列を直接読み取ることによって変異の有無を検出する方法。
（２）ＳＳＣＰ（Single Strand Conformation Polymorphism）法を用いて、増幅したポリヌクレオチド上の変異の有無を検出する方法。
（３）増幅したポリヌクレオチドに対して、変異箇所の配列（変異前の配列または変異後の配列）を特異的に認識する制限酵素による処理後に、切断の有無により判定する方法（ＣＡＰＳ（Cleaved Amplified Polymorphic Sequence）法）。その他、意図的に設計したミスマッチプライマーを含むプライマーセットによって制限酵素認識部位を作製するｄＣＡＰＳ（derived CAPS）法を用いてもよい。そのようなプライマーセットとしては、例えば、配列番号７に示すＳ型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の塩基配列の３３０番目の塩基のＣ→Ｔ変異を検出するためのプライマーとして、配列番号４５に示す塩基配列からなる核酸および配列番号４６に示す塩基配列からなる核酸のセットが挙げられるが、これらに限定されない。また、配列番号４６に示す塩基配列のように、ミスマッチプライマーを使用した場合、増幅効率が良くない場合があるが、そのような場合、標的配列の外側の部位にミスマッチのないプライマーを設計し（上記の場合、例えば配列番号２５および２６に示す塩基配列からなる核酸プライマーのセット）、予めＰＣＲを一度行い、そのＰＣＲ産物の一部を鋳型に、ミスマッチプライマーで再増幅し、得られたＰＣＲ産物を制限酵素で処理することで変異を検出してもよい。
また、上記ミスマッチプライマーを含むプライマーセットとしては、例えば、配列番号８に示すＴ型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の塩基配列の２９９番目の塩基のＧ→Ａ変異を検出するためのプライマーとして、配列番号４７に示す塩基配列からなる核酸および配列番号４８に示す塩基配列からなる核酸のセットも挙げられるが、これらに限定されない。また、配列番号４８に示す塩基配列のように、ミスマッチプライマーを使用した場合、増幅効率が良くない場合があるが、そのような場合、標的配列の外側の部位にミスマッチのないプライマーを設計し（上記の場合、例えば配列番号３１および３２に示す塩基配列からなる核酸プライマーのセット）、予めＰＣＲを一度行い、そのＰＣＲ産物の一部を鋳型に、ミスマッチプライマーで再増幅し、得られたＰＣＲ産物を制限酵素で処理することで変異を検出してもよい。
なお、上記に例示した変異以外の変異を検出する場合においても、当業者であれば多大な労力を要することなく、プライマー配列を設計し、ＰＣＲを行い、所望の変異を検出することが可能である。例えば、プライマー配列の設計はウェブを介して行うことができる（文献：Neff et al. (2002) Web-based primer design for single nucleotide polymorphism analysis. TRENDS in Genetics 18: 613-615）。
なお、プライマーの３’末端付近にミスマッチを入れた場合、proofreading活性を持つＤＮＡポリメラーゼを使用してＰＣＲを行うと、ミスマッチが修正され、制限酵素で切断されなくなる可能性がある。したがって、ｄＣＡＰＳ法において、ミスマッチプライマーを用いる場合、proofreading活性を持たないＤＮＡポリメラーゼが好ましい。限定されるわけではないが、そのようなＤＮＡポリメラーゼとしてTaKaRa TaqTM（タカラバイオ社）が挙げられる。またプライマーの３’末端付近に制限酵素切断部位を入れた場合、切断の有無は、プライマーの長さ分の違いとして検出される。
（４）変異部分に特異的にハイブリダイズするプローブを設計し、ハイブリダイズさせることで変異の有無を確認する方法。
（４）変異部分に特異的にハイブリダイズするプローブを設計し、ハイブリダイズさせることで変異の有無を確認する方法。
解析手法は、特に限定はされないが、例えば、TaqMan（登録商標）プローブ法を用いたＰＣＲ、またはＴＯＦ−ＭＳを利用した測定技術であるMassARRAY（登録商標）解析等を用いることができる。
（５）変異箇所の配列（変異前の配列および／または変異後の配列）を一部に含ませてプライマー配列を設計し、ＰＣＲ法等によって増幅させることにより、増幅の有無によって変異の有無を検出する方法（アリル特異的ＰＣＲ法）。そのようなプライマーとしては、例えば、配列番号７に示すＳ型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の塩基配列の３３０番目の塩基のＣ→Ｔ変異を検出するためのプライマーとして、配列番号３７に示す塩基配列からなる核酸および配列番号３９示す塩基配列からなる核酸のセットが挙げられるが、これらに限定されない。この場合、コントロールとして、例えば変異前の塩基配列に特異的な配列番号３８に示す塩基配列からなる核酸プライマーを用いることができる。
（５）変異箇所の配列（変異前の配列および／または変異後の配列）を一部に含ませてプライマー配列を設計し、ＰＣＲ法等によって増幅させることにより、増幅の有無によって変異の有無を検出する方法（アリル特異的ＰＣＲ法）。そのようなプライマーとしては、例えば、配列番号７に示すＳ型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の塩基配列の３３０番目の塩基のＣ→Ｔ変異を検出するためのプライマーとして、配列番号３７に示す塩基配列からなる核酸および配列番号３９示す塩基配列からなる核酸のセットが挙げられるが、これらに限定されない。この場合、コントロールとして、例えば変異前の塩基配列に特異的な配列番号３８に示す塩基配列からなる核酸プライマーを用いることができる。
さらに、例えば、配列番号８に示すＴ型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の塩基配列の２９９番目の塩基のＧ→Ａ変異を検出するためのプライマーとして、配列番号４０に示す塩基配列からなる核酸および配列番号４２に示す塩基配列からなる核酸のセットが挙げられるが、これらに限定されない。この場合、コントロールとして、例えば変異前の塩基配列に特異的な配列番号４１に示す塩基配列からなる核酸プライマーを用いることができる。
なお、プライマーの３’末端付近に目的変異の塩基を入れる場合、その位置は、末端、もしくは末端から数塩基の間が好ましい。また、プライマーの３’末端付近に目的の変異を入れた場合においても、変異型の配列に加え、変異のない野生型の配列も併せて増幅することがある。このような場合、目的のミスマッチ以外のミスマッチを、変異型検出用プライマーと野生型検出用プライマーとで同じ位置に導入して（例えば配列番号３８、３９、４１および４２の小文字で示した塩基）、ＰＣＲを行い、変異型またはは野生型特異的な増幅を得てもよい。
また、必要に応じて、目的とする遺伝子用のプライマーの他に、ＰＣＲの内部標準となる遺伝子用のプライマー（例えば配列番号４３および４４に示す塩基配列からなる）を、ＰＣＲ反応液に加えてもよい。
なお、上記に例示した変異以外の変異を検出する場合においても、当業者であれば多大な労力を要することなく、プライマー配列を設計し、ＰＣＲを行い、所望の変異を検出することが可能である。
なお、遺伝子変異の検出技術は、以下の文献に詳細に記載されている：日本特許庁のウェブサイト<http://www.jpo.go.jp/shiryou/s_sonota/hyoujun_gijutsu/kakusan/0025.html>。また、遺伝子変異の検出および解析手法は、以下の文献に詳細に記載されている：日本特許庁のウェブサイト<http://www.jpo.go.jp/shiryou/s_sonota/hyoujun_gijutsu/kakusan/0028.html>。あるいは、文献：Agarwal et al. (2008) Advances in molecular marker techniques and their applications in plant sciences. Plant Cell Rep. 27:617-631.、Neff et al. (1998) dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics. Plant J. 14: 387-392.を参照してもよい。
したがって、本発明は、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子における変異を検出するためポリヌクレオチドを提供する。当該変異は、ウイルスに対して非機能的なｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質を生産させるか、またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現を抑制する変異である。その具体例は、〔１．ウイルス抵抗性タバコおよびその作出方法〕欄に記載のとおりである。
また、上記検出用ポリヌクレオチドの一形態は、核酸プライマーまたは核酸プライマーのセットである。核酸プライマーのセットは、上記変異を挟む核酸プライマーのセットであってもよいし、上記変異を含む連続した塩基配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドを含む核酸プライマーのセットであってもよい。上記検出用ポリヌクレオチドの別の一形態は、上記変異を含む連続した塩基配列またはその相補配列にハイブリダイズする核酸プローブである。
本発明はまた、タバコのゲノムＤＮＡにおいて、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子に上記変異が生じていることを、ウイルス抵抗性の指標とすることを特徴とする、ウイルスに対するタバコの抵抗性の判定方法を提供する。
本発明はまた、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子における上記変異を検出するための核酸プライマーのセットを備えていることを特徴とする、ウイルスに対するタバコの抵抗性の判定キットを提供する。
本発明はまた、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子における上記変異を含む連続した塩基配列またはその相補配列にハイブリダイズするプローブを備えていることを特徴とする、ウイルスに対するタバコの抵抗性の判定キットを提供する。
本発明はまた、上記判定方法を用いて、ウイルスに対して抵抗性のタバコを選抜する選抜工程を包含することを特徴とする、ウイルス抵抗性タバコの育種方法を提供する。
本発明はまた、タバコにおいて、ゲノムＤＮＡにおける上記変異の有無を、上記検出用ポリヌクレオチドを利用して検査する検査工程と、当該検査工程において上記変異が検出されたタバコをウイルス抵抗性タバコとして選抜する選抜工程とを含むことを特徴とする、ウイルス抵抗性タバコ選抜方法を提供する。検出用ポリヌクレオチドを利用した検査方法の詳細は、上述のとおりである。
本発明はまた、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子における上記変異を含む連続した塩基配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、ウイルスに対するタバコの抵抗性の判定用ＤＮＡマーカーを提供する。
〔４．葉たばこおよびたばこ製品〕
本発明のウイルス抵抗性タバコを栽培して生産される葉たばこは、当該ウイルス（例えば、Virgin A mutantのウイルス抵抗性を打破するPVY系統またはＴＢＴＶ）が引き起こす病気に罹患しない。そのため、特に当該病気が発生する環境下で栽培された場合において、ウイルス抵抗性でないタバコを栽培して生産される葉たばこと比較して、品質低下が軽減され高品質である。その結果、より高品質のたばこ製品を生産することができる。
本発明のウイルス抵抗性タバコを栽培して生産される葉たばこは、当該ウイルス（例えば、Virgin A mutantのウイルス抵抗性を打破するPVY系統またはＴＢＴＶ）が引き起こす病気に罹患しない。そのため、特に当該病気が発生する環境下で栽培された場合において、ウイルス抵抗性でないタバコを栽培して生産される葉たばこと比較して、品質低下が軽減され高品質である。その結果、より高品質のたばこ製品を生産することができる。
「葉たばこ」とは、タバコ植物の生葉を収穫後乾燥させたもので、たばこ製品の製造のための原料となるものを指す。「たばこ製品」とは、紙巻たばこ（フィルタ付、フィルタなし）（CIGARETTE）、シガー（CIGAR）、シガリロ（CIGARILLO）、スヌース（SNUS）、嗅ぎタバコ（SNUFF）、チューイングたばこ、および電子タバコ等を指す。
したがって、本発明は、上記ウイルス抵抗性タバコから生産される葉たばこを提供する。
本発明はまた、上記葉たばこを原料として含むたばこ製品を提供する。
〔５．まとめ〕
このように、課題を解決するために、本願発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、タバコにおいてｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの機能を抑制することにより、そのタバコがPVY-breaking系統およびＴＢＴＶに抵抗性となることを初めて見出した。さらに、タバコゲノムに存在する２組のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の片方が、PVY-breaking系統に対する抵抗性に関係し、もう片方がＴＢＴＶに対する抵抗性に関係することを解明し、それら片側の遺伝子の機能を抑制することで、それぞれのウイルスに対する抵抗性を付与できることを見出した。また、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ機能抑制タバコには生育阻害が起きないことを確認し本発明を完成した。
このように、課題を解決するために、本願発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、タバコにおいてｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの機能を抑制することにより、そのタバコがPVY-breaking系統およびＴＢＴＶに抵抗性となることを初めて見出した。さらに、タバコゲノムに存在する２組のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の片方が、PVY-breaking系統に対する抵抗性に関係し、もう片方がＴＢＴＶに対する抵抗性に関係することを解明し、それら片側の遺伝子の機能を抑制することで、それぞれのウイルスに対する抵抗性を付与できることを見出した。また、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ機能抑制タバコには生育阻害が起きないことを確認し本発明を完成した。
本発明に係るウイルス抵抗性タバコの一態様は、翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子に変異を有しており、それによって、ウイルスに対して非機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質を生産するか、または翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現が抑制されていることを特徴とする。
本発明に係るウイルス抵抗性タバコの一態様では、上記変異はナンセンス変異であることが好ましい。
本発明に係るウイルス抵抗性タバコの一態様では、上記変異は、（ａ）配列番号３もしくは配列番号４に示すアミノ酸配列からなる翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のエキソン、（ｂ）配列番号３もしくは配列番号４に示すアミノ酸配列と９２％以上の配列同一性を有する機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のエキソン、（ｃ）配列番号５もしくは配列番号６に示す塩基配列からなるｍＲＮＡが生成される野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のエキソン、または（ｄ）配列番号５もしくは配列番号６に示す塩基配列と９２％以上の配列同一性を有するｍＲＮＡが生成されるものであり、かつ機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のエキソンにおける、下記（１）〜（４）に示す１つ以上の変異であってもよい；（１）コドンＣＡＡのＣがＴに置換、（２）コドンＣＧＡのＣがＴに置換、（３）コドンＣＡＧのＣがＴに置換、（４）コドンＴＧＧのＧ（２つのＧのうちの何れか一方または両方）がＡに置換。
本発明に係るウイルス抵抗性タバコの一態様では、上記変異は、ゲノムＤＮＡにおける、配列番号７に示す塩基配列からなる翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の下記（１）〜（２７）に示す１つ以上の変異であってもよい；（１）２７０番目のＣがＴに置換、（２）２９５番目のＧがＡに置換、（３）２９６番目のＧがＡに置換、（４）３０４番目のＧがＡに置換、（５）３０５番目のＧがＡに置換、（６）３１５番目のＣがＴに置換、（７）３３０番目のＣがＴに置換、（８）３４３番目のＧがＡに置換、（９）３４４番目のＧがＡに置換、（１０）３５７番目のＣがＴに置換、（１１）３９４番目のＧがＡに置換、（１２）３９５番目のＧがＡに置換、（１３）１７４０番目のＣがＴに置換、（１４）１８１３番目のＧがＡに置換、（１５）１８１４番目のＧがＡに置換、（１６）１８４６番目のＧがＡに置換、（１７）１８４７番目のＧがＡに置換、（１８）１８８８番目のＧがＡに置換、（１９）１８８９番目のＧがＡに置換、（２０）２０５０番目のＣがＴに置換、（２１）２１０４番目のＣがＴに置換、（２２）２１２３番目のＧがＡに置換、（２３）２１２４番目のＧがＡに置換、（２４）２１５２番目のＣがＴに置換、（２５）４７４２番目のＧがＡに置換、（２６）４７４３番目のＧがＡに置換、（２７）４９２６番目のＣがＴに置換。
本発明に係るウイルス抵抗性タバコの一態様では、上記変異は、ゲノムＤＮＡにおける、配列番号８に示す塩基配列からなる翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の下記（１）〜（２６）に示す１つ以上の変異であってもよい；（１）２６４番目のＣがＴに置換、（２）２８９番目のＧがＡに置換、（３）２９０番目のＧがＡに置換、（４）２９８番目のＧがＡに置換、（５）２９９番目のＧがＡに置換、（６）３１５番目のＣがＴに置換、（７）３２８番目のＧがＡに置換、（８）３２９番目のＧがＡに置換、（９）３４２番目のＣがＴに置換、（１０）３７９番目のＧがＡに置換、（１１）３８０番目のＧがＡに置換、（１２）１６３０番目のＣがＴに置換、（１３）１７０３番目のＧがＡに置換、（１４）１７０４番目のＧがＡに置換、（１５）１７３６番目のＧがＡに置換、（１６）１７３７番目のＧがＡに置換、（１７）１７７８番目のＧがＡに置換、（１８）１７７９番目のＧがＡに置換、（１９）１９４０番目のＣがＴに置換、（２０）１９９４番目のＣがＴに置換、（２１）２０１３番目のＧがＡに置換、（２２）２０１４番目のＧがＡに置換、（２３）２０４２番目のＣがＴに置換、（２４）３２２４番目のＧがＡに置換、（２５）３２２５番目のＧがＡに置換、（２６）３４０６番目のＣがＴに置換。
本発明に係るウイルス抵抗性タバコの一態様では、上記変異は、（ａ）配列番号３に示すアミノ酸配列からなる翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子、（ｂ）配列番号３に示すアミノ酸配列と９２％以上の配列同一性を有する機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子、（ｃ）配列番号５に示す塩基配列からなるｍＲＮＡが生成される野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子、または（ｄ）配列番号５に示す塩基配列と９２％以上の配列同一性を有するｍＲＮＡが生成されるものであり、かつ機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子における１つ以上の変異であり、上記ウイルスは、Umbravirus属のウイルスであってもよい。
本発明に係るウイルス抵抗性タバコの一態様では、上記Umbravirus属のウイルスは、Tobacco bushy top virusであることが好ましい。
本発明に係るウイルス抵抗性タバコの一態様では、上記変異は、（ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなる翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子、（ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列と９２％以上の配列同一性を有する機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子、（ｃ）配列番号６に示す塩基配列からなるｍＲＮＡが生成される野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子、または（ｄ）配列番号６に示す塩基配列と９２％以上の配列同一性を有するｍＲＮＡが生成されるものであり、かつ機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子における１つ以上の変異であり、上記ウイルスは、Potyvirus属のウイルスであってもよい。
上記Potyvirus属のウイルスは、Potato virus Yの一系統であって、タバコのVirgin A mutantのウイルス抵抗性を打破する系統であることが好ましい。
本発明に係るウイルス抵抗性タバコの別の一態様は、翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現量が野生型と比較して２０％以下であることを特徴とする。
本発明に係るウイルス抵抗性タバコの別の一態様では、上記発現量は野生型と比較して１０％以下であることがさらに好ましい。
本発明に係るウイルス抵抗性タバコの別の一態様では、翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現を抑制するためのＲＮＡｉコンストラクトを保持していてもよい。
本発明に係るウイルス抵抗性タバコ作出方法の一態様は、ウイルスに対して非機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質を生産するか、または翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現を抑制する変異を翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子に導入することによって、ウイルスに対して抵抗性を有するタバコを作出することを特徴とする。
本発明に係るウイルス抵抗性タバコ作出方法の一態様では、上記変異はナンセンス変異であることが好ましい。
本発明に係るウイルス抵抗性タバコ作出方法の一態様では、エチルメタンスルホン酸によって上記変異を生じさせることが好ましい。
本発明に係るウイルス抵抗性タバコ作出方法の一態様では、上記変異は、（ａ）配列番号３もしくは配列番号４に示すアミノ酸配列からなる翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のエキソン、（ｂ）配列番号３もしくは配列番号４に示すアミノ酸配列と９２％以上の配列同一性を有する機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のエキソン、（ｃ）配列番号５もしくは配列番号６に示す塩基配列からなるｍＲＮＡが生成される野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のエキソン、または（ｄ）配列番号５もしくは配列番号６に示す塩基配列と９２％以上の配列同一性を有するｍＲＮＡが生成されるものであり、かつ機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のエキソンにおける、下記（１）〜（４）に示す１つ以上の変異であってもよい；（１）コドンＣＡＡのＣがＴに置換、（２）コドンＣＧＡのＣがＴに置換、（３）コドンＣＡＧのＣがＴに置換、（４）コドンＴＧＧのＧ（２つのＧのうちの何れか一方または両方）がＡに置換。
本発明に係るウイルス抵抗性タバコ作出方法の一態様では、上記変異は、ゲノムＤＮＡにおける、配列番号７に示す塩基配列からなる翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の下記（１）〜（２７）に示す１つ以上の変異であってもよい；（１）２７０番目のＣがＴに置換、（２）２９５番目のＧがＡに置換、（３）２９６番目のＧがＡに置換、（４）３０４番目のＧがＡに置換、（５）３０５番目のＧがＡに置換、（６）３１５番目のＣがＴに置換、（７）３３０番目のＣがＴに置換、（８）３４３番目のＧがＡに置換、（９）３４４番目のＧがＡに置換、（１０）３５７番目のＣがＴに置換、（１１）３９４番目のＧがＡに置換、（１２）３９５番目のＧがＡに置換、（１３）１７４０番目のＣがＴに置換、（１４）１８１３番目のＧがＡに置換、（１５）１８１４番目のＧがＡに置換、（１６）１８４６番目のＧがＡに置換、（１７）１８４７番目のＧがＡに置換、（１８）１８８８番目のＧがＡに置換、（１９）１８８９番目のＧがＡに置換、（２０）２０５０番目のＣがＴに置換、（２１）２１０４番目のＣがＴに置換、（２２）２１２３番目のＧがＡに置換、（２３）２１２４番目のＧがＡに置換、（２４）２１５２番目のＣがＴに置換、（２５）４７４２番目のＧがＡに置換、（２６）４７４３番目のＧがＡに置換、（２７）４９２６番目のＣがＴに置換。
本発明に係るウイルス抵抗性タバコ作出方法の一態様では、上記変異は、ゲノムＤＮＡにおける、配列番号８に示す塩基配列からなる翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の下記（１）〜（２６）に示す１つ以上の変異であってもよい；（１）２６４番目のＣがＴに置換、（２）２８９番目のＧがＡに置換、（３）２９０番目のＧがＡに置換、（４）２９８番目のＧがＡに置換、（５）２９９番目のＧがＡに置換、（６）３１５番目のＣがＴに置換、（７）３２８番目のＧがＡに置換、（８）３２９番目のＧがＡに置換、（９）３４２番目のCがTに置換、（１０）３７９番目のＧがＡに置換、（１１）３８０番目のＧがＡに置換、（１２）１６３０番目のＣがＴに置換、（１３）１７０３番目のＧがＡに置換、（１４）１７０４番目のＧがＡに置換、（１５）１７３６番目のＧがＡに置換、（１６）１７３７番目のＧがＡに置換、（１７）１７７８番目のＧがＡに置換、（１８）１７７９番目のＧがＡに置換、（１９）１９４０番目のＣがＴに置換、（２０）１９９４番目のＣがＴに置換、（２１）２０１３番目のＧがＡに置換、（２２）２０１４番目のＧがＡに置換、（２３）２０４２番目のＣがＴに置換、（２４）３２２４番目のＧがＡに置換、（２５）３２２５番目のＧがＡに置換、（２６）３４０６番目のＣがＴに置換。
本発明に係るウイルス抵抗性タバコ作出方法の別の一態様は、翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現量を野生型と比較して２０％以下に抑制させる因子を導入することによって、ウイルスに対して抵抗性を有するタバコを作出することを特徴とする。
本発明に係るウイルス抵抗性タバコ作出方法の別の一態様では、上記発現量を野生型と比較して１０％以下に抑制させる因子をタバコに導入することがさらに好ましい。
本発明に係るウイルス抵抗性タバコ作出方法の別の一態様では、上記因子はＲＮＡｉコンストラクトであることが好ましい。
本発明に係るウイルス抵抗性タバコ作出方法では、上記ウイルスは、Potyvirus属のウイルスであることが好ましい。
本発明に係るウイルス抵抗性タバコ作出方法では、上記Potyvirus属のウイルスは、Potato virus Yであることがより好ましい。
本発明に係るウイルス抵抗性タバコ作出方法では、上記Potyvirus属のウイルスは、Potato virus Yの一系統であって、タバコのVirgin A mutant（VAMタバコ）のウイルス抵抗性を打破する系統であることがより好ましい。
本発明に係るウイルス抵抗性タバコ作出方法では、上記ウイルスは、Umbravirus属のウイルスであることが好ましい。
本発明に係るウイルス抵抗性タバコ作出方法では、上記Umbravirus属のウイルスは、Tobacco bushy top virusであることがより好ましい。
本発明に係る検出用ポリヌクレオチドの一態様は、タバコの翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子における変異を検出するためのポリヌクレオチドであって、当該変異は、ウイルスに対して非機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質を生産するか、または翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現を抑制する変異であることを特徴とする。
本発明に係る検出用ポリヌクレオチドの一態様では、上記変異はナンセンス変異であることが好ましい。
本発明に係る検出用ポリヌクレオチドの一態様では、上記変異は、（ａ）配列番号３もしくは配列番号４に示すアミノ酸配列からなる翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のエキソン、（ｂ）配列番号３もしくは配列番号４に示すアミノ酸配列と９２％以上の配列同一性を有する機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のエキソン、（ｃ）配列番号５もしくは配列番号６に示す塩基配列からなるｍＲＮＡが生成される野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のエキソン、または（ｄ）配列番号５もしくは配列番号６に示す塩基配列と９２％以上の配列同一性を有するｍＲＮＡが生成されるものであり、かつ機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のエキソンにおける、下記（１）〜（４）に示す１つ以上の変異であってもよい；（１）コドンＣＡＡのＣがＴに置換、（２）コドンＣＧＡのＣがＴに置換、（３）コドンＣＡＧのＣがＴに置換、（４）コドンＴＧＧのＧ（２つのＧのうちの何れか一方または両方）がＡに置換。
本発明に係る検出用ポリヌクレオチドの一態様では、上記変異は、ゲノムＤＮＡにおける、配列番号７に示す塩基配列からなる翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の下記（１）〜（２７）に示す１つ以上の変異であってもよい；（１）２７０番目のＣがＴに置換、（２）２９５番目のＧがＡに置換、（３）２９６番目のＧがＡに置換、（４）３０４番目のＧがＡに置換、（５）３０５番目のＧがＡに置換、（６）３１５番目のＣがＴに置換、（７）３３０番目のＣがＴに置換、（８）３４３番目のＧがＡに置換、（９）３４４番目のＧがＡに置換、（１０）３５７番目のＣがＴに置換、（１１）３９４番目のＧがＡに置換、（１２）３９５番目のＧがＡに置換、（１３）１７４０番目のＣがＴに置換、（１４）１８１３番目のＧがＡに置換、（１５）１８１４番目のＧがＡに置換、（１６）１８４６番目のＧがＡに置換、（１７）１８４７番目のＧがＡに置換、（１８）１８８８番目のＧがＡに置換、（１９）１８８９番目のＧがＡに置換、（２０）２０５０番目のＣがＴに置換、（２１）２１０４番目のＣがＴに置換、（２２）２１２３番目のＧがＡに置換、（２３）２１２４番目のＧがＡに置換、（２４）２１５２番目のＣがＴに置換、（２５）４７４２番目のＧがＡに置換、（２６）４７４３番目のＧがＡに置換、（２７）４９２６番目のＣがＴに置換。
本発明に係る検出用ポリヌクレオチドの一態様では、上記変異は、ゲノムＤＮＡにおける、配列番号８に示す塩基配列からなる翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の下記（１）〜（２６）に示す１つ以上の変異であってもよい；（１）２６４番目のＣがＴに置換、（２）２８９番目のＧがＡに置換、（３）２９０番目のＧがＡに置換、（４）２９８番目のＧがＡに置換、（５）２９９番目のＧがＡに置換、（６）３１５番目のＣがＴに置換、（７）３２８番目のＧがＡに置換、（８）３２９番目のＧがＡに置換、（９）３４２番目のＣがＴに置換、（１０）３７９番目のＧがＡに置換、（１１）３８０番目のＧがＡに置換、（１２）１６３０番目のＣがＴに置換、（１３）１７０３番目のＧがＡに置換、（１４）１７０４番目のＧがＡに置換、（１５）１７３６番目のＧがＡに置換、（１６）１７３７番目のＧがＡに置換、（１７）１７７８番目のＧがＡに置換、（１８）１７７９番目のＧがＡに置換、（１９）１９４０番目のＣがＴに置換、（２０）１９９４番目のＣがＴに置換、（２１）２０１３番目のＧがＡに置換、（２２）２０１４番目のＧがＡに置換、（２３）２０４２番目のＣがＴに置換、（２４）３２２４番目のＧがＡに置換、（２５）３２２５番目のＧがＡに置換、（２６）３４０６番目のＣがＴに置換。
本発明に係る検出用ポリヌクレオチドの一態様は、上記変異を挟む核酸プライマーのセット、または、上記変異を含む連続した塩基配列もしくはその相補配列からなるポリヌクレオチドを含む核酸プライマーのセットである。
本発明に係るウイルス抵抗性タバコ選抜方法の一態様は、タバコにおいて、ゲノムＤＮＡにおける上記変異の有無を、請求項２７〜３２の何れか一項に記載の検出用ポリヌクレオチドを利用して検査する検査工程と、上記検査工程において上記変異が検出されたタバコをウイルス抵抗性タバコとして選抜する選抜工程とを含むことを特徴とする。
本発明に係るウイルスに対するタバコの抵抗性の判定用ＤＮＡマーカーの一態様は、翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子における変異を含む連続した塩基配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドを含んでおり、当該変異は、ウイルスに対して非機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質を生産するか、または翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現を抑制する変異であることを特徴とする。
なお、これまでどの植物においてもＰＶＹ抵抗性との関連性が指摘されていたのはｅＩＦ４Ｅであり、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅとの関連情報は開示されていなかった。ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの発現量を一定程度低下させたタバコの報告があるが、ウイルス抵抗性との関連は全く述べられていなかった。さらにタバコにおいては、ＰＶＹ抵抗性とｅＩＦ４Ｅとの関連性が指摘されている一方で、Potyvirus抵抗性とｅＩＦ４ＥまたはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの変異とは関連しないという報告もあり、状況は未だ混沌としていた。また、Umbravirus属のウイルスに関しては、それに対する抵抗性と翻訳開始因子との関連性は一切指摘されていなかった。しかも、ウイルス増殖に必要な宿主因子は、翻訳開始因子の他にも上述の様に、DEAD-box RNA helicase-like protein、VPg-interacting proteinおよびTranslation elongation factorなど他にも多数の候補があること、さらにタバコのｅＩＦ４Ｅファミリーには多くの遺伝子が存在するので、その中から効果のある遺伝子を見出すには多大な労力と時間を必要となることから、PVY-Breaking系統またはＴＢＴＶに対する抵抗性に関与するタバコ遺伝子を容易に推測することはできない状況にあった。
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。
〔実施例１〕
（遺伝子の取得）
公知データベースの検索を行い、タバコ（Nicotiana tabacum）の翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＹ７０２６５３）のｃＤＮＡ塩基配列（配列番号１０）、およびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＹ６９９６０９）のｃＤＮＡ塩基配列（配列番号１）を取得した。
（遺伝子の取得）
公知データベースの検索を行い、タバコ（Nicotiana tabacum）の翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＹ７０２６５３）のｃＤＮＡ塩基配列（配列番号１０）、およびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＹ６９９６０９）のｃＤＮＡ塩基配列（配列番号１）を取得した。
ＧｅｎＢａｎｋデータベースのＷＧＳ（Whole-genome shotgun contigs）を用いたＢＬＡＳＴ解析から、アクセッション番号がＡＹ６９９６０９であるｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅについては、Nicotiana sylvestris由来であることが判明した。また、Nicotiana tomentosiformis由来のタバコ（Nicotiana tabacum）ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅとして、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号がＥＢ６８３５７６（配列番号２）、およびＦＮ６６６４３４の２つを同定した。これら遺伝子またはその配列情報を以下の実験に供試した。ＦＮ６６６４３４はタバコ品種Samsun NN由来のＴ型のｅＩＦ（ｉｓｏ）4Ｅ遺伝子に由来する配列であり、上述のタバコ品種Ｋ３２６由来のＴ型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの配列（ＥＢ６８３５７６）との配列同一性は９７％であった。これら２つの遺伝子のコードするタンパク質のアミノ酸配列の同一性（identity）は９７％、類似性（similarity）は９９％であった。これらの配列の違いは由来する品種間の差異によるものと考えられた。また、Ｓ型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ（ＡＹ６９９６０９）とＴ型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ（ＥＢ６８３５７６）とのＤＮＡの配列同一性は９１％であった。さらに、Ｓ型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅのアミノ酸配列（配列番号３）とＴ型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅのアミノ酸配列（配列番号４）との同一性は９１％、類似性は９６％であった。なお、配列同一性等の解析には、核酸・アミノ酸配列解析ソフトGENETYX（登録商標）(ver.12)（ゼネティックス社）を用いた。
（ＲＮＡｉコンストラクトの構築）
ｅＩＦ４Ｅ１発現抑制タバコ、およびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ発現抑制タバコを作出するため、これら遺伝子の内部配列をトリガーとするＲＮＡｉコンストラクトを構築した。
ｅＩＦ４Ｅ１発現抑制タバコ、およびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ発現抑制タバコを作出するため、これら遺伝子の内部配列をトリガーとするＲＮＡｉコンストラクトを構築した。
まず、ｅＩＦ４Ｅ１のトリガー配列（配列番号１１）、およびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅのトリガー配列（配列番号９）を特異的に増幅するプライマーを作製した（表１）。それぞれの遺伝子のＦＷプライマーの５’末端には後述のクローニングに使用するためのＣＡＣＣ配列が付加されている。
作製したＲＮＡｉコンストラクトを、アグロバクテリウムＬＢＡ４４０４株にエレクトロポレーション法により導入した。
（タバコ形質転換）
タバコの形質転換は常法（リーフディスク法）で行った。タバコ品種はPetit Havana ＳＲ１を用いた。
タバコの形質転換は常法（リーフディスク法）で行った。タバコ品種はPetit Havana ＳＲ１を用いた。
タバコ子葉の四隅をカットし、カットされた葉をアグロバクテリウム溶液に１０分間浸漬させた。余分な液を拭ってから葉をＬＳ固形培地（３％ショ糖、０．８％寒天を含む）上に置いた。２５℃、３日間、暗黒下で培養することで、組換えアグロバクテリムをタバコに感染させ、各翻訳開始因子のＲＮＡｉコンストラクトをＳＲ１に導入した。葉切片を、２５０ｍｇ／ＬのＣｅｆｏｔａｘｉｍｅと、植物ホルモンである２−イソペンテニルアデニン（２ｉＰ）（１０ｍｇ／Ｌ）およびＩＡＡ（０．３ｍｇ／Ｌ）とを含むＬＳ固形培地上に４日間置いて、アグロバクテリウムを除菌した。組換え体の選抜は、上記の濃度でＣｅｆｏｔａｘｉｍｅおよび植物ホルモンを含むＬＳ培地にさらに５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含んだ培地上で行った。選抜された組換え体から再分化したシュートを発根培地（１．５％ショ糖、０．３％ゲランガム、ならびに上記濃度のCefotaximeおよびカナマイシンを含むＬＳ固形培地）に置いて発根させた。得られた組換えタバコを温室で育成した。
（形質転換当代の組換えタバコにおける翻訳開始因子の転写解析）
組換えタバコについて、ｅＩＦ４Ｅ１またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現を調査するため、各遺伝子の塩基配列に基づき、リアルタイムＰＣＲ用のプライマー／プローブを設計した（表２）。また各組換えタバコの葉よりＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（QIAGEN社）を用いてＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡからＰｒｉｍｅ Ｓｃｒｉｐｔ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社）を用いてｃＤＮＡを合成し、リアルタイムＰＣＲの鋳型とした。リアルタイムＰＣＲではＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（Life technologies社）を用いて増幅反応を行った。反応条件は５０℃ ２分間、９５℃ ２０秒間の後、９５℃ １秒、６０℃２０秒のサイクルを４０回とした。発現解析はＳｔｅｐＯｎｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ２．２（Life technologies社）を用いた。ＰＣＲの内部標準としてelongation factor1-alpha（ＥＦ１−α）遺伝子を使用し、この遺伝子の発現量との比較で、標的遺伝子の相対的な遺伝子発現量を算出した。対照として非組換えタバコ（ＳＲ１）を用いた。
組換えタバコについて、ｅＩＦ４Ｅ１またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現を調査するため、各遺伝子の塩基配列に基づき、リアルタイムＰＣＲ用のプライマー／プローブを設計した（表２）。また各組換えタバコの葉よりＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（QIAGEN社）を用いてＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡからＰｒｉｍｅ Ｓｃｒｉｐｔ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社）を用いてｃＤＮＡを合成し、リアルタイムＰＣＲの鋳型とした。リアルタイムＰＣＲではＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（Life technologies社）を用いて増幅反応を行った。反応条件は５０℃ ２分間、９５℃ ２０秒間の後、９５℃ １秒、６０℃２０秒のサイクルを４０回とした。発現解析はＳｔｅｐＯｎｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ２．２（Life technologies社）を用いた。ＰＣＲの内部標準としてelongation factor1-alpha（ＥＦ１−α）遺伝子を使用し、この遺伝子の発現量との比較で、標的遺伝子の相対的な遺伝子発現量を算出した。対照として非組換えタバコ（ＳＲ１）を用いた。
（形質転換次世代の組換えタバコの分離）
形質転換当代で転写抑制度合が高かったｅＩＦ４Ｅ１の５系統、およびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの３系統の種子を、ＬＳ固形培地（３％ショ糖、０．８％寒天を含む）上に無菌的に播種した。発芽、生育した幼植物体のＧＦＰ蛍光をＦｌｕｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ５９５（Molecular Dynamics社）を用いて測定した。上述の通り、コンストラクト導入に用いているｐＳＰ２３１はＴ−ＤＮＡ領域上のＲＮＡｉ発現カセットの隣に、３５Ｓプロモーター−ＧＦＰ発現カセットが配置されている。幼植物体において、強いＧＦＰ蛍光を発するものをＲＮＡｉコンストラクトについてホモ接合系統、全く蛍光がないものをＲＮＡｉコンストラクトについてヌル分離系統（ＲＮＡｉコンストラクトが存在しない）、弱い蛍光を発するものをＲＮＡｉコンストラクトについてヘミ接合系統と判断した。播種後３週の植物を温室に移し、培土に植え替え、育成した。
形質転換当代で転写抑制度合が高かったｅＩＦ４Ｅ１の５系統、およびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの３系統の種子を、ＬＳ固形培地（３％ショ糖、０．８％寒天を含む）上に無菌的に播種した。発芽、生育した幼植物体のＧＦＰ蛍光をＦｌｕｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ５９５（Molecular Dynamics社）を用いて測定した。上述の通り、コンストラクト導入に用いているｐＳＰ２３１はＴ−ＤＮＡ領域上のＲＮＡｉ発現カセットの隣に、３５Ｓプロモーター−ＧＦＰ発現カセットが配置されている。幼植物体において、強いＧＦＰ蛍光を発するものをＲＮＡｉコンストラクトについてホモ接合系統、全く蛍光がないものをＲＮＡｉコンストラクトについてヌル分離系統（ＲＮＡｉコンストラクトが存在しない）、弱い蛍光を発するものをＲＮＡｉコンストラクトについてヘミ接合系統と判断した。播種後３週の植物を温室に移し、培土に植え替え、育成した。
（形質転換次世代の組換えタバコにおける翻訳開始因子の転写解析）
各組換えタバコ系統の次世代におけるｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現を調査するため、上述のようにして組換えタバコの葉よりＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを合成し、リアルタイムＰＣＲの鋳型とした。リアルタイムＰＣＲも上述の通り行い、内部標準としてＥＦ１−α遺伝子を用い、対照植物として非組換えタバコ（ＳＲ１）を用いた。
各組換えタバコ系統の次世代におけるｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現を調査するため、上述のようにして組換えタバコの葉よりＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを合成し、リアルタイムＰＣＲの鋳型とした。リアルタイムＰＣＲも上述の通り行い、内部標準としてＥＦ１−α遺伝子を用い、対照植物として非組換えタバコ（ＳＲ１）を用いた。
リアルタイムＰＣＲによるｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの遺伝子発現解析の結果（図１）から、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ発現抑制系統＃１、＃７、および＃１５のホモ接合系統は、それぞれ非組換え系統（ＳＲ１）の８％、６％、６％程度にまで発現が抑制されていたことが確認された。またｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅのヌル分離系統の３系統では発現抑制が起きていないことが確認された。
（翻訳開始因子の転写が抑制された組換えタバコ植物のウイルス接種試験）
培土への移植後１０日の個体に、ＰＶＹ（ＰＶＹ−Ｎ）、ＰＶＹ−Ｂ、またはＴＢＴＶ（Tobacco bushy top virus）を接種した。ＰＶＹ−Ｂは日本たばこ産業株式会社葉たばこ研究所で分離されたウイルス系統で、ＰＶＹ抵抗性であるタバコ既存品種Ｖｉｒｇｉｎ Ａ ｍｕｔａｎｔに壊疽症状を発生させるVAM breaking系統である。ＴＢＴＶは、Umbravirus属のウイルスで、タバコの葉にモットリング症状を引き起こす。接種源には、各ウイルスが感染し発病した黄色種つくば１号の罹病葉を使用した。品種つくば１号は、ＰＶＹ、ＰＶＹ−Ｂ、およびＴＢＴＶに罹病性の品種であり、接種により明瞭な病徴を示す。採種した罹病葉を乳鉢中で０．０１Ｎリン酸緩衝液とともに磨砕した。その磨砕液を移植１週間後のタバコ苗の最大葉（下から４枚目または５枚目）の半葉にカーボランダムを用いて塗抹接種した。その後、温室内で栽培し、適時病徴を観察した。
培土への移植後１０日の個体に、ＰＶＹ（ＰＶＹ−Ｎ）、ＰＶＹ−Ｂ、またはＴＢＴＶ（Tobacco bushy top virus）を接種した。ＰＶＹ−Ｂは日本たばこ産業株式会社葉たばこ研究所で分離されたウイルス系統で、ＰＶＹ抵抗性であるタバコ既存品種Ｖｉｒｇｉｎ Ａ ｍｕｔａｎｔに壊疽症状を発生させるVAM breaking系統である。ＴＢＴＶは、Umbravirus属のウイルスで、タバコの葉にモットリング症状を引き起こす。接種源には、各ウイルスが感染し発病した黄色種つくば１号の罹病葉を使用した。品種つくば１号は、ＰＶＹ、ＰＶＹ−Ｂ、およびＴＢＴＶに罹病性の品種であり、接種により明瞭な病徴を示す。採種した罹病葉を乳鉢中で０．０１Ｎリン酸緩衝液とともに磨砕した。その磨砕液を移植１週間後のタバコ苗の最大葉（下から４枚目または５枚目）の半葉にカーボランダムを用いて塗抹接種した。その後、温室内で栽培し、適時病徴を観察した。
その結果、ｅＩＦ４Ｅ１機能抑制タバコ系統（ｅＩＦ４Ｅ１の＃１、＃２、＃３、＃７、＃８）に関しては、殆どの個体でＰＶＹおよびＰＶＹ−Ｂ両方のウイルス、さらにＴＢＴＶによる発病が見られ、対照品種およびヌル分離系統と差がなく感受性であった。
ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ機能抑制タバコのウイルス接種試験結果を表３に示す。
ＰＶＹ−Ｂ接種後７日目の病徴評価において、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ機能抑制タバコ（ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの＃１、＃７、＃１５）のホモ接合系統は、３系統（計９個体）ともに発病が見られた個体はなかった。ｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥのＲＮＡｉコンストラクトを持たないヌル分離系統、および対照品種のＳＲ１は、全ての個体で発病が確認された。このことから、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ機能抑制タバコはＰＶＹ−Ｂに抵抗性であることが明らかとなった。ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ機能抑制タバコ（ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの転写物の量が低下したタバコ）においては、ウイルスの増殖または細胞間移行が阻害されたと考えられた。一方、ＰＶＹに関しては、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ機能抑制タバコのホモ接合系統は、３系統９個体中５個体で発病が見られたが、４個体は発病が見られなかった。なお、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ機能抑制タバコに生育阻害は一切見られなかった。
ＴＢＴＶ接種後９日目の病徴評価において、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ機能抑制タバコ（ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの＃１、＃７、＃１５）のホモ接合系統は、３系統（計９個体）ともに発病が見られた個体はなかった。一方、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥのＲＮＡｉコンストラクトを持たないヌル分離系統、および対照品種のＳＲ１は、全ての個体で発病が確認された。このことから、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ機能抑制タバコはＴＢＴＶに抵抗性であることが明らかとなった。
以上のことから、タバコの翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの機能を抑制することによって、ＰＶＹ−ＢおよびＴＢＴＶに対する抵抗性を付与できることが示された。
（ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタバコ変異体の選抜）
Ｓ型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ（ＡＹ６９９６０９）とＴ型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ（ＥＢ６８３５７６）のｍＲＮＡ配列を用いて、GenBankデータベースのNicotiana tabacumのWhole Genome Shotgun Contigsを検索した結果、イントロン領域以外のタンパクコード領域において１００％の配列同一性を示すゲノム配列が取得された（Ｓ型のアクセッション番号はＡＷＯＪ０１４１２２８８、Ｔ型のアクセッション番号はＡＷＯＪ０１０５４５４２）。これらの配列のうち、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子部分の配列を、配列番号７（Ｓ型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のゲノム配列）および配列番号８（Ｔ型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のゲノム配列）に示した。両配列はタバコ品種Ｋ３２６由来のゲノム配列である。
また、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子は５つのエキソンおよび４つのイントロンからなることが判明した。図２にはＳ型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のエキソン／イントロン構造の模式図を示した。図３にはＴ型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のエキソン／イントロン構造の模式図を示した。なお、図２および図３において、下部に記載の数字はＥＭＳ処理によって生じるＧからＡへの変異またはＣからＴへの変異によって生じ得るナンセンス変異の候補箇所の数を示し、矢印は実施例におけるプライマーの位置を示す。ＥＭＳ処理によって生じるＧからＡへの変異またはＣからＴへの変異によってストップコドンになり得る塩基は、Ｓ型ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの場合、第１エキソンには１２個（配列番号７の２７０番目のＣ、２９５番目のＧ、２９６番目のＧ、３０４番目のＧ、３０５番目のＧ、３１５番目のＣ、３３０番目のＣ、３４３番目のＧ、３４４番目のＧ、３５７番目のＣ、３９４番目のＧ、３９５番目のＧ）、第２エキソンには７個（１７４０番目のＣ、１８１３番目のＧ、１８１４番目のＧ、１８４６番目のＧ、１８４７番目のＧ、１８８８番目のＧ、１８８９番目のＧ）、第３エキソンには５個（２０５０番目のＣ、２１０４番目のＣ、２１２３番目のＧ、２１２４番目のＧ、２１５２番目のＣ）、第４エキソンには２個（４７４２番目のＧ、４７４３番目のＧ）、第５エキソンには１個（４９２６番目のＣ）であった。
一方、Ｔ型ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの場合、第１エキソンには１１個（配列番号８の２６４番眼のＣ、２８９番目のＧ、２９０番目のＧ、２９８番目のＧ、２９９番目のＧ、３１５番目のＣ、３２８番目のＧ、３２９番目のＧ、３４２番目のＣ、３７９番目のＧ、３８０番目のＧ）、第２エキソンには７個（１６３０番目のＣ、１７０３番目のＧ、１７０４番目のＧ、１７３６番目のＧ、１７３７番目のＧ、１７７８番目のＧ、１７７９番目のＧ）、第３エキソンには５個（１９４０番目のＣ、１９９４番目のＣ、２０１３番目のＧ、２０１４番目のＧ、２０４２番目のＣ）、第４エキソンには２個（３２２４番目のＧ、３２２５番目のＧ）、第５エキソンには１個（３４０６番目のＣ）であった。
第１エキソン、ならびに第２エキソンおよび第３エキソンについて、エキソンとエキソン／イントロン境界部位とを含む領域を増幅するプライマーを設計した（表４）。なお、表中「Ｓ型ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ」とは、Nicotiana sylvestris由来のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ（Nicotiana tabacum配列）であり、「Ｔ型ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ」とは、Nicotianatomentosiformis由来のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ（Nicotiana tabacum配列）である。
ＥＭＳ処理による変異を有する個体からゲノムＤＮＡを抽出し、上記プライマーを用いたＰＣＲにより、Ｓ型特異的、およびＴ型特異的なｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子領域を増幅し、増幅産物の塩基配列を確認することにより、第１エキソン、第２エキソンまたは第３エキソン内でストップコドンが生じているｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタバコ変異体を選抜した。
具体的には、田島ら（文献：平成23年度日本植物病理学会大会、P234、タバコ変異体パネルの作出）によって作製されたタバコ変異体パネルを選抜した。このパネルは、タバコ品種つくば１号の種子（数千個）に対して、変異原処理としてＥＭＳ処理を行い、育成した個体（Ｍ１世代）ごとに得られた変異体自殖後代種子（Ｍ２バルク種子）のセットと、これらＭ２種子を播種し、育成した各系統８個体の幼苗から抽出したバルクＤＮＡのセットからなる。
（ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のＳ型変異体の選抜）
上記ＤＮＡサンプル（１９７４系統分のＤＮＡサンプル）を鋳型に、表４のプライマーのうち、Ｓ型ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｅｘｏｎ １ 組合せ１（配列番号２５および２６）、およびＳ型ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｅｘｏｎ ２＆３ 組合せ１（配列番号２８および２９）を使ってＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物の塩基配列を決定したところ、Ｅｘｏｎ １では５８サンプル（５０か所）、Ｅｘｏｎ ２とＥｘｏｎ ３では計５８サンプル（４５か所）で変異が検出された。変異はいずれもヘテロ接合であった。ナンセンス変異（ストップコドンが生じた変異）が検出されたサンプルは、Ｅｘｏｎ １で４サンプル（配列番号７の２９５、３９４または３９５番目のＧがＡに変異、３３０番目のＣがＴに変異）、Ｅｘｏｎ ２とＥｘｏｎ ３で１サンプル（配列番号７の１８１４番目のＧがＡに変異）であった。これらのうち、３３０番目のＣがＴに変異した系統（Ｍ２）を播種し、２４個体からＤＮＡを抽出し、塩基配列を決定した結果、目的の変異をホモ接合で有する個体（ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿Ｓ型変異ホモ個体）が１１個体得られた。
上記ＤＮＡサンプル（１９７４系統分のＤＮＡサンプル）を鋳型に、表４のプライマーのうち、Ｓ型ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｅｘｏｎ １ 組合せ１（配列番号２５および２６）、およびＳ型ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｅｘｏｎ ２＆３ 組合せ１（配列番号２８および２９）を使ってＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物の塩基配列を決定したところ、Ｅｘｏｎ １では５８サンプル（５０か所）、Ｅｘｏｎ ２とＥｘｏｎ ３では計５８サンプル（４５か所）で変異が検出された。変異はいずれもヘテロ接合であった。ナンセンス変異（ストップコドンが生じた変異）が検出されたサンプルは、Ｅｘｏｎ １で４サンプル（配列番号７の２９５、３９４または３９５番目のＧがＡに変異、３３０番目のＣがＴに変異）、Ｅｘｏｎ ２とＥｘｏｎ ３で１サンプル（配列番号７の１８１４番目のＧがＡに変異）であった。これらのうち、３３０番目のＣがＴに変異した系統（Ｍ２）を播種し、２４個体からＤＮＡを抽出し、塩基配列を決定した結果、目的の変異をホモ接合で有する個体（ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿Ｓ型変異ホモ個体）が１１個体得られた。
（ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のＴ型変異体の選抜）
上記ＤＮＡサンプル（１９７４系統分のＤＮＡサンプル）を鋳型に、表４のプライマーのうち、Ｔ型ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｅｘｏｎ １ 組合せ１（配列番号３１および３２）、およびＴ型ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｅｘｏｎ ２＆３ 組合せ２（配列番号３４および３６）を使ってＰＣＲを行った。上記と同様に、得られたＰＣＲ産物の塩基配列を決定したところ、Ｅｘｏｎ １では４３サンプル（３８か所）、Ｅｘｏｎ ２とＥｘｏｎ ３では計６６サンプル（５５か所）で変異が検出された。変異はいずれもヘテロ接合であった。ナンセンス変異が検出されたサンプルは、Ｅｘｏｎ １で５サンプル（配列番号８の２８９、２９９、３２８、３２９または３８０番目のＧがＡに変異）、Ｅｘｏｎ ２とＥｘｏｎ３で４サンプル（配列番号８の１７０４番目のＧがＡに変異したものが３つ、１７３７番目のＧがＡに変異したものが１つ）であった。これらのうち、２９９番目のＧがＡに変異した系統（Ｍ２）について２４個体からＤＮＡを抽出し、塩基配列を決定した結果、目的の変異をホモ接合で有する個体（ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿Ｔ型変異ホモ個体）が８個体得られた。
上記ＤＮＡサンプル（１９７４系統分のＤＮＡサンプル）を鋳型に、表４のプライマーのうち、Ｔ型ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｅｘｏｎ １ 組合せ１（配列番号３１および３２）、およびＴ型ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｅｘｏｎ ２＆３ 組合せ２（配列番号３４および３６）を使ってＰＣＲを行った。上記と同様に、得られたＰＣＲ産物の塩基配列を決定したところ、Ｅｘｏｎ １では４３サンプル（３８か所）、Ｅｘｏｎ ２とＥｘｏｎ ３では計６６サンプル（５５か所）で変異が検出された。変異はいずれもヘテロ接合であった。ナンセンス変異が検出されたサンプルは、Ｅｘｏｎ １で５サンプル（配列番号８の２８９、２９９、３２８、３２９または３８０番目のＧがＡに変異）、Ｅｘｏｎ ２とＥｘｏｎ３で４サンプル（配列番号８の１７０４番目のＧがＡに変異したものが３つ、１７３７番目のＧがＡに変異したものが１つ）であった。これらのうち、２９９番目のＧがＡに変異した系統（Ｍ２）について２４個体からＤＮＡを抽出し、塩基配列を決定した結果、目的の変異をホモ接合で有する個体（ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿Ｔ型変異ホモ個体）が８個体得られた。
（ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿ＳＴ両ホモ変異体の育成と選抜）
上記ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿Ｓ型変異ホモ個体とｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿Ｔ型変異ホモ個体とを交配した。この交配によって、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥのＳ側の遺伝子座およびＴ側の遺伝子座の両方において、野生型（変異がない）と変異型とをヘテロ接合で保有するＦ１系統を作出した。Ｆ１系統を自家受粉（自殖）させ、Ｆ２系統を得た。このＦ２系統においては、Ｓ型とＴ型の両方について変異をホモに持つ個体の割合の理論値は１／１６である。Ｆ２系統を播種し、７００個体からＤＮＡを抽出した。
上記ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿Ｓ型変異ホモ個体とｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿Ｔ型変異ホモ個体とを交配した。この交配によって、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥのＳ側の遺伝子座およびＴ側の遺伝子座の両方において、野生型（変異がない）と変異型とをヘテロ接合で保有するＦ１系統を作出した。Ｆ１系統を自家受粉（自殖）させ、Ｆ２系統を得た。このＦ２系統においては、Ｓ型とＴ型の両方について変異をホモに持つ個体の割合の理論値は１／１６である。Ｆ２系統を播種し、７００個体からＤＮＡを抽出した。
ＤＮＡ抽出は以下のように行った。タバコ葉サンプル（１ｃｍ×１ｃｍ）を２ｍＬチューブに入れ、４００μＬの抽出液（組成は、２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），２５０ｍＭ ＮａＣｌ，２５ｍＭ ＥＤＴＡ，０．５％ ＳＤＳ）および２００μＬのＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を加えた後、メタルコーンを加えて破砕し、１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清３００μＬを新しい１．５ｍＬチューブに移し、８００μＬの１００％エタノールを加えて転倒混和した。１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上清を完全に取り除いた。ペレットが乾燥したことを確認した後、ＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭ ＥＤＴＡ）を５０μＬ加えた。
ＰＣＲ用のマーカーとして、ＡＳＰ（Allele Specific primer）マーカーを設計した。ＡＳＰマーカーは、プライマー配列の３’末端側に一塩基多型（ＳＮＰ）が配置したプライマーを設計して、特定の多型を持つサンプルのみからＰＣＲ産物が得られ、それ以外のサンプルからはミスマッチによりＰＣＲ産物が得られないことを利用したマーカーである。作製したプライマーは表５の通りである。
結果の一部を図４に示した。まず対照として用いたＮｉａ２遺伝子の増幅を確認した（図４の上部の４４１ｂｐのバンド）。野生型のＷＴ検出用プライマーミックスでは、Ｓ側もＴ側もＷＴを検出し、変異型のＭｕｔ検出用プライマーミックスでは、Ｓ側もＴ側もＭｕｔを検出する。したがって変異の型は、ＷＴおよびＭｕｔの両方の結果から判断した。例えば、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿Ｓ＿ＷＴプライマーでは増幅産物が見られず、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿Ｔ＿ＷＴでは増幅産物が検出され、かつｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿Ｓ＿Ｍｕｔでは増幅産物が検出され、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿Ｔ＿Ｍｕｔでは検出されなかった場合には、Ｓ側のみが変異型である遺伝子型ｓｓＴＴと判断した。さらに例えば、２つのＷＴプライマーではともにＰＣＲ産物が検出されず、２つのＭｕｔプライマーではともにＰＣＲ産物が検出された場合にはＳ側およびＴ側の両方が変異型である遺伝子型ｓｓｔｔと判断した。なお、図４の右端のレーン（Ｍｕｔ検出用、ＳＳＴＴ）に見られるフェイントバンドはアーティファクトと考えられた。
このようにしてＦ２系統の中から、ＤＮＡマーカーを用いた多型解析により、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿ＳＴ両ホモ変異体（Ｓ／Ｔ両側変異型ホモ個体であり、遺伝子型はｓｓｔｔ）、および対照のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿野生型個体（Ｓ／Ｔ両側野生型個体であり、遺伝子型はＳＳＴＴ）を得た。選抜した個体のＰＣＲ産物のＤＮＡ配列を解読し、変異を確認して、ＤＮＡマーカー選抜の結果が正確であることを確認した。
（ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿Ｓ型変異体およびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿Ｔ型変異体の増殖）
上述のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿Ｓ型変異体（Ｓ型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子にホモ型の変異を有する。遺伝子型はｓｓＴＴ）、またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿Ｔ型変異体（Ｔ型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子にホモ型の変異を有する。遺伝子型はＳＳｔｔ）を育成し、自殖後代を得ることで種子の増殖を行った。得られた後代種子については一部を育成し、上記のようにＤＮＡを抽出して、ＤＮＡマーカーを用いた多型解析を実施し、Ｓ側またはＴ側の変異をそれぞれホモで有することを確認した。
上述のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿Ｓ型変異体（Ｓ型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子にホモ型の変異を有する。遺伝子型はｓｓＴＴ）、またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿Ｔ型変異体（Ｔ型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子にホモ型の変異を有する。遺伝子型はＳＳｔｔ）を育成し、自殖後代を得ることで種子の増殖を行った。得られた後代種子については一部を育成し、上記のようにＤＮＡを抽出して、ＤＮＡマーカーを用いた多型解析を実施し、Ｓ側またはＴ側の変異をそれぞれホモで有することを確認した。
なお、変異の確認されたこれらの種子はｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿Ｓ型変異体がＮｔＳ１、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿Ｔ型変異体がＮｔＴ１として、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター（日本国 〒２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２０号室）に寄託した。受託番号はそれぞれFERM BP-22284（受託日：２０１５年２月２５日）およびFERM BP-22285（受託日：２０１５年２月２５日）である。
（変異体の遺伝子型を識別するｄＣＡＰＳマーカーの開発）
ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の多型を検出するための、より検出の確度が高いＤＮＡマーカーとして、ｄＣＡＰＳマーカーを開発した。制限酵素の認識配列に多型が存在する場合には、制限酵素処理後の断片長の違いを検出することによって多型を判別することができるが、これをＣＡＰＳマーカー、ＰＣＲ−ＲＦＬＰマーカーと呼ぶ。ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子に生じた今回の変異（Ｓ型では配列番号７の３３０番目のＣがＴに変異、Ｔ型では配列番号８の２９９番目のＧがＡに変異）の場合、ＳＮＰ周辺の配列が制限酵素の認識配列を含まなかった。そのため、ＰＣＲで用いるプライマーを設計する際に、ＳＮＰ（一塩基多型）近傍に人工的に制限酵素サイトを導入した。今回利用した変異においては、変異型遺伝子では制限サイト（Ｓ型ではNla III：CATG、Ｔ型ではMbo I：GATC）となるには二塩基の変異が必要であった一方で、野生型遺伝子では制限サイトとなるには一塩基の変異で足りた。したがって、本実施例では、一塩基変異導入することで、野生型では制限酵素で切れて、変異型では切れないような、ｄＣＡＰＳマーカーを作製した。なおこの場合、断片長の差はプライマーの長さ分の差として検出される。作製したプライマーは表６の通りである。
ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の多型を検出するための、より検出の確度が高いＤＮＡマーカーとして、ｄＣＡＰＳマーカーを開発した。制限酵素の認識配列に多型が存在する場合には、制限酵素処理後の断片長の違いを検出することによって多型を判別することができるが、これをＣＡＰＳマーカー、ＰＣＲ−ＲＦＬＰマーカーと呼ぶ。ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子に生じた今回の変異（Ｓ型では配列番号７の３３０番目のＣがＴに変異、Ｔ型では配列番号８の２９９番目のＧがＡに変異）の場合、ＳＮＰ周辺の配列が制限酵素の認識配列を含まなかった。そのため、ＰＣＲで用いるプライマーを設計する際に、ＳＮＰ（一塩基多型）近傍に人工的に制限酵素サイトを導入した。今回利用した変異においては、変異型遺伝子では制限サイト（Ｓ型ではNla III：CATG、Ｔ型ではMbo I：GATC）となるには二塩基の変異が必要であった一方で、野生型遺伝子では制限サイトとなるには一塩基の変異で足りた。したがって、本実施例では、一塩基変異導入することで、野生型では制限酵素で切れて、変異型では切れないような、ｄＣＡＰＳマーカーを作製した。なおこの場合、断片長の差はプライマーの長さ分の差として検出される。作製したプライマーは表６の通りである。
例えば配列番号４６の場合、３’末端側のＣａＴの次の塩基は、野生型の鋳型ＤＮＡではＧとなり、Nla III部位（ＣＡＴＧ）となるが、変異型の鋳型ＤＮＡではＡとなり、制限サイトにはならない。また配列番号４８の場合、３’末端側のＧＡｔの次の塩基は、野生型の鋳型ＤＮＡではＣとなり、Mbo I部位（ＧＡＴＣ）となるが、変異型の鋳型ＤＮＡではＴとなり、制限サイトにはならない。
プライマーの３’末端付近にミスマッチを入れた場合、proofreading活性を持つＤＮＡポリメラーゼを使用してＰＣＲを行うと、プライマーのミスマッチが修正され、制限酵素で切断されなくなる可能性がある。実際、proofreading活性を有するTks GflexTM DNA Polymerase（タカラバイオ社製）を用いてゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、制限酵素処理を行った産物では多型が検出されなかった。一方、proofreading活性を持たないTaKaRa TaqTM（タカラバイオ社）を用いてゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行った場合には、十分な増幅が得られなかった。そこで、ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行い、Tks GflexTM DNA Polymerase（Proof Reading機能を有する）を用いた１ｓｔ ＰＣＲでＳＮＰ領域を含む周辺領域を特異的に増幅した後、TaKaRa TaqTM（Proof Reading機能を有さない）を用いた２ｎｄＰＣＲで制限酵素の認識部位を作出した。
まず、Tks GflexTM DNA Polymeraseを用いて１ｓｔ ＰＣＲを行った。ゲノムＤＮＡ約５ｎｇを鋳型とし、プライマー濃度は１μＭとなるように調製し、バッファーは酵素に添付されたものを用いた。ＰＣＲは、９４℃ １分を１回、９８℃ １０秒、６０℃ １５秒、および６８℃ ３０秒のサイクルを３０回、６８℃ ９０秒を１回行った。その後、１ｓｔ ＰＣＲの産物を１００倍に希釈し、１μＬを鋳型としてTaKaRa TaqTMで２ｎｄ ＰＣＲを行った。１ｓｔＰＣＲと同様に、プライマー濃度は１μＭとなるように調製し、バッファーは酵素に添付されたものを用いた。ＰＣＲは、９４℃ ２分を１回、９４℃ ３０秒、５２℃ ３０秒、および７２℃ ３０秒のサイクルを４０回、７２℃ ９０秒を１回行った。ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿Ｓの２ｎｄ ＰＣＲ産物は、Nla III（New England Biolabs社）で処理した。ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿Ｔの２ｎｄＰＣＲ産物は、Mbo I（タカラバイオ社）で処理した。
結果を図５に示した。ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿Ｓプライマーで増幅した産物を制限酵素処理した場合に、切断が見られないサンプルの遺伝子型はｓｓと判断でき、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿Ｔプライマーで増幅した産物を制限酵素処理した場合に、切断が見られないサンプルの遺伝子型はｔｔと判断できた。例えば、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿Ｓプライマーで切断が生じず且つｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿Ｔプライマーで切断が生じたサンプルの遺伝子型はｓｓＴＴであり、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿Ｓプライマーで切断が生じ且つｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿Ｔプライマーで切断が生じないサンプルの遺伝子型はＳＳｔｔであり、両プライマーともに切断が生じたサンプルの遺伝子型はＳＳＴＴであり、両プライマーともに切断が生じないサンプルの遺伝子型はｓｓｔｔであり、両プライマーともに切断が生じたものと生じないものとが現れるサンプルの遺伝子型はＳｓＴｔであると容易に判断が可能であった。したがって、本ｄＣＡＰＳマーカーも上記のＡＳＰマーカーと同様に、タバコｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子に変異が生じた個体の遺伝子型の識別に活用できることが示された。
（ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタバコ変異体の発現解析）
各種ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタバコ変異体について、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の転写解析を行った。ＤＮＡマーカーで選抜された、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿Ｓ型変異体（ｓｓＴＴ）、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿Ｔ型変異体（ＳＳｔｔ）、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿ＳＴ両ホモ変異体（ｓｓｔｔ）、およびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿野生型系統（ＳＳＴＴ）から、上述と同様にＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成して、定量ＰＣＲを行った。プライマー／プローブセットは、Ｓ型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子用には、表２に示した配列番号１９、２０および２１を用いた。また、Ｔ型ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子用には、表６に示した配列番号４９、５０および５１を新たに設計し、実験に供試した。
各種ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタバコ変異体について、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の転写解析を行った。ＤＮＡマーカーで選抜された、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿Ｓ型変異体（ｓｓＴＴ）、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿Ｔ型変異体（ＳＳｔｔ）、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿ＳＴ両ホモ変異体（ｓｓｔｔ）、およびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿野生型系統（ＳＳＴＴ）から、上述と同様にＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成して、定量ＰＣＲを行った。プライマー／プローブセットは、Ｓ型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子用には、表２に示した配列番号１９、２０および２１を用いた。また、Ｔ型ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子用には、表６に示した配列番号４９、５０および５１を新たに設計し、実験に供試した。
なお、ナンセンス変異によって転写が抑制された原因として、Nonsense-mediated mRNA decay (NMD)（文献：Baker and Parker 2004、Current Opinion in Cell Biology 16: 293-299）が考えられた。
（ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタバコ変異体へのウイルス接種試験）
培土への移植後２週間の個体に、ＰＶＹ−Ｂ（Potato virus Y のVAM breaking系統）、またはＴＢＴＶ（Tobacco bushy top virus）を接種した。ウイルス接種源の作製およびタバコへの接種方法は、実施例１と同様の方法で実施した。接種後、温室内で栽培し、適宜病徴を観察した。ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ機能欠損変異体タバコのウイルス接種試験結果を表８および表９に示す。
培土への移植後２週間の個体に、ＰＶＹ−Ｂ（Potato virus Y のVAM breaking系統）、またはＴＢＴＶ（Tobacco bushy top virus）を接種した。ウイルス接種源の作製およびタバコへの接種方法は、実施例１と同様の方法で実施した。接種後、温室内で栽培し、適宜病徴を観察した。ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ機能欠損変異体タバコのウイルス接種試験結果を表８および表９に示す。
ＰＶＹ−Ｂ接種後１０日目までの病徴評価において、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿ＳＴ両ホモ変異体系統（ＳＴ両側変異型ホモ系統であり、遺伝子型はｓｓｔｔ）に発病が見られた個体はなかった。一方、ＰＶＹ−Ｂ接種後８日日目の病徴評価において、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿野生型系統（ＳＴ両側野生型ホモ系統であり、遺伝子型はＳＳＴＴ）、および栽培品種のＴＮ９０は、全ての個体で発病が確認された。このことから、Ｓ型とＴ型の両方のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ機能欠損変異体タバコはＰＶＹ−Ｂに抵抗性であることが明らかとなった。さらに、Ｔ型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅのみ機能欠損させた系統（ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿Ｔ型変異体系統であり、Ｔ型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子についてホモ型の変異。遺伝子型はＳＳｔｔ）は、ＰＶＹ−Ｂ接種後１０日目までの病徴評価において、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿野生型系統、栽培品種ＴＮ９０およびＳ型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅのみ機能欠損させた系統（ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿Ｓ型変異体系統であり、Ｓ型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子についてホモ型の変異を有する。遺伝子型はｓｓＴＴ）と比較して大幅に発病を抑制した。このことから、ＰＶＹ−Ｂは主にその増殖、細胞間移行等の病徴発現にＴ型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅを利用していると推察され、発病抑制は、Ｔ型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの発現を抑制することにより可能であると考えられた。
ＴＢＴＶ接種後１２日目までの病徴評価において、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿ＳＴ両ホモ変異体系統（ｓｓｔｔ）に発病が見られた個体はなかった。一方、ＴＢＴＶ接種後１０日日目の病徴評価において、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿野生型系統（ＳＳＴＴ）、および栽培品種のＴＮ９０は、半分以上の個体で発病が確認された。このことから、Ｓ型およびＴ型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ機能欠損変異体タバコはＴＢＴＶに抵抗性であることが明らかとなった。さらに、Ｓ型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅのみ機能欠損させた系統（ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿Ｓ型変異体系統、ｓｓＴＴ）は、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿野生型系統（ＳＳＴＴ）、栽培品種ＴＮ９０およびＴ型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅのみ機能欠損させた系統（ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿Ｔ型変異体系統。ＳＳｔｔ）と比較して大幅に発病を抑制した。このことから、ＴＢＴＶは主にその増殖および細胞間移行等の病徴発現にＳ型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅを利用していると推察され、発病抑制は、Ｓ型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの発現を抑制することにより可能であると考えられた。
なお、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ機能抑制タバコに、生育阻害は一切見られなかった。
なお、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ機能抑制タバコに、生育阻害は一切見られなかった。
以上のことから、ＰＶＹ−Ｂの抵抗性の付与には、タバコの翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの機能を抑制すればよく、さらに、Ｔ型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅのみの抑制で可能であることが示された。また、ＴＢＴＶの抵抗性の付与には、タバコの翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの機能を抑制すればよく、さらに、Ｓ型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅのみの抑制で可能であることが示された。
本発明は、タバコの育種に利用することができる。
FERM BP-22284
FERM BP-22285
FERM BP-22285
Claims (34)
- 翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子に変異を有しており、それによって、ウイルスに対して非機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質を生産するか、または翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現が抑制されていることを特徴とする、ウイルス抵抗性タバコ。
- 上記変異はナンセンス変異であることを特徴とする、請求項１に記載のウイルス抵抗性タバコ。
- 上記変異は、（ａ）配列番号３もしくは配列番号４に示すアミノ酸配列からなる翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のエキソン、（ｂ）配列番号３もしくは配列番号４に示すアミノ酸配列と９２％以上の配列同一性を有する機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のエキソン、（ｃ）配列番号５もしくは配列番号６に示す塩基配列からなるｍＲＮＡが生成される野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のエキソン、または（ｄ）配列番号５もしくは配列番号６に示す塩基配列と９２％以上の配列同一性を有するｍＲＮＡが生成されるものであり、かつ機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のエキソンにおける、下記（１）〜（４）に示す１つ以上の変異であることを特徴とする、請求項１または２に記載のウイルス抵抗性タバコ；
（１）コドンＣＡＡのＣがＴに置換、（２）コドンＣＧＡのＣがＴに置換、（３）コドンＣＡＧのＣがＴに置換、（４）コドンＴＧＧのＧ（２つのＧのうちの何れか一方または両方）がＡに置換。 - 上記変異は、ゲノムＤＮＡにおける、配列番号７に示す塩基配列からなる翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の下記（１）〜（２７）に示す１つ以上の変異であることを特徴とする、請求項１〜３の何れか一項に記載のウイルス抵抗性タバコ；
（１）２７０番目のＣがＴに置換、（２）２９５番目のＧがＡに置換、（３）２９６番目のＧがＡに置換、（４）３０４番目のＧがＡに置換、（５）３０５番目のＧがＡに置換、（６）３１５番目のＣがＴに置換、（７）３３０番目のＣがＴに置換、（８）３４３番目のＧがＡに置換、（９）３４４番目のＧがＡに置換、（１０）３５７番目のＣがＴに置換、（１１）３９４番目のＧがＡに置換、（１２）３９５番目のＧがＡに置換、（１３）１７４０番目のＣがＴに置換、（１４）１８１３番目のＧがＡに置換、（１５）１８１４番目のＧがＡに置換、（１６）１８４６番目のＧがＡに置換、（１７）１８４７番目のＧがＡに置換、（１８）１８８８番目のＧがＡに置換、（１９）１８８９番目のＧがＡに置換、（２０）２０５０番目のＣがＴに置換、（２１）２１０４番目のＣがＴに置換、（２２）２１２３番目のＧがＡに置換、（２３）２１２４番目のＧがＡに置換、（２４）２１５２番目のＣがＴに置換、（２５）４７４２番目のＧがＡに置換、（２６）４７４３番目のＧがＡに置換、（２７）４９２６番目のＣがＴに置換。 - 上記変異は、ゲノムＤＮＡにおける、配列番号８に示す塩基配列からなる翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の下記（１）〜（２６）に示す１つ以上の変異であることを特徴とする、請求項１〜３の何れか一項に記載のウイルス抵抗性タバコ；
（１）２６４番目のＣがＴに置換、（２）２８９番目のＧがＡに置換、（３）２９０番目のＧがＡに置換、（４）２９８番目のＧがＡに置換、（５）２９９番目のＧがＡに置換、（６）３１５番目のＣがＴに置換、（７）３２８番目のＧがＡに置換、（８）３２９番目のＧがＡに置換、（９）３４２番目のＣがＴに置換、（１０）３７９番目のＧがＡに置換、（１１）３８０番目のＧがＡに置換、（１２）１６３０番目のＣがＴに置換、（１３）１７０３番目のＧがＡに置換、（１４）１７０４番目のＧがＡに置換、（１５）１７３６番目のＧがＡに置換、（１６）１７３７番目のＧがＡに置換、（１７）１７７８番目のＧがＡに置換、（１８）１７７９番目のＧがＡに置換、（１９）１９４０番目のＣがＴに置換、（２０）１９９４番目のＣがＴに置換、（２１）２０１３番目のＧがＡに置換、（２２）２０１４番目のＧがＡに置換、（２３）２０４２番目のＣがＴに置換、（２４）３２２４番目のＧがＡに置換、（２５）３２２５番目のＧがＡに置換、（２６）３４０６番目のＣがＴに置換。 - 上記変異は、（ａ）配列番号３に示すアミノ酸配列からなる翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子、（ｂ）配列番号３に示すアミノ酸配列と９２％以上の配列同一性を有する機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子、（ｃ）配列番号５に示す塩基配列からなるｍＲＮＡが生成される野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子、または（ｄ）配列番号５に示す塩基配列と９２％以上の配列同一性を有するｍＲＮＡが生成されるものであり、かつ機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子における１つ以上の変異であり、
上記ウイルスは、Umbravirus属のウイルスであることを特徴とする、請求項１〜４の何れか一項に記載のウイルス抵抗性タバコ。 - 上記Umbravirus属のウイルスは、Tobacco bushy top virusであることを特徴とする、請求項６に記載のウイルス抵抗性タバコ。
- 上記変異は、（ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなる翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子、（ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列と９２％以上の配列同一性を有する機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子、（ｃ）配列番号６に示す塩基配列からなるｍＲＮＡが生成される野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子、または（ｄ）配列番号６に示す塩基配列と９２％以上の配列同一性を有するｍＲＮＡが生成されるものであり、かつ機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子における１つ以上の変異であり、
上記ウイルスは、Potyvirus属のウイルスであることを特徴とする、請求項１〜３および５の何れか一項に記載のウイルス抵抗性タバコ。 - 上記Potyvirus属のウイルスは、Potato virus Yの一系統であって、タバコのVirgin A mutantのウイルス抵抗性を打破する系統であることを特徴とする、請求項８に記載のウイルス抵抗性タバコ。
- 翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現量が野生型と比較して２０％以下であることを特徴とする、ウイルス抵抗性タバコ。
- 上記発現量は野生型と比較して１０％以下であることを特徴とする、請求項１０に記載のウイルス抵抗性タバコ。
- 翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現を抑制するためのＲＮＡｉコンストラクトを保持することを特徴とする、請求項１０または１１に記載のウイルス抵抗性タバコ。
- ウイルスに対して非機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質を生産するか、または翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現を抑制する変異を翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子に導入することによって、ウイルスに対して抵抗性を有するタバコを作出することを特徴とする、ウイルス抵抗性タバコ作出方法。
- 上記変異はナンセンス変異であることを特徴とする、請求項１３に記載のウイルス抵抗性タバコ作出方法。
- エチルメタンスルホン酸によって上記変異を生じさせることを特徴とする、請求項１３または１４に記載のウイルス抵抗性タバコ作出方法。
- 上記変異は、（ａ）配列番号３もしくは配列番号４に示すアミノ酸配列からなる翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のエキソン、（ｂ）配列番号３もしくは配列番号４に示すアミノ酸配列と９２％以上の配列同一性を有する機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のエキソン、（ｃ）配列番号５もしくは配列番号６に示す塩基配列からなるｍＲＮＡが生成される野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のエキソン、または（ｄ）配列番号５もしくは配列番号６に示す塩基配列と９２％以上の配列同一性を有するｍＲＮＡが生成されるものであり、かつ機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のエキソンにおける、下記（１）〜（４）に示す１つ以上の変異であることを特徴とする、請求項１３〜１５の何れか一項に記載のウイルス抵抗性タバコ作出方法；
（１）コドンＣＡＡのＣがＴに置換、（２）コドンＣＧＡのＣがＴに置換、（３）コドンＣＡＧのＣがＴに置換、（４）コドンＴＧＧのＧ（２つのＧのうちの何れか一方または両方）がＡに置換。 - 上記変異は、ゲノムＤＮＡにおける、配列番号７に示す塩基配列からなる翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の下記（１）〜（２７）に示す１つ以上の変異であることを特徴とする、請求項１３〜１６の何れか一項に記載のウイルス抵抗性タバコ作出方法；
（１）２７０番目のＣがＴに置換、（２）２９５番目のＧがＡに置換、（３）２９６番目のＧがＡに置換、（４）３０４番目のＧがＡに置換、（５）３０５番目のＧがＡに置換、（６）３１５番目のＣがＴに置換、（７）３３０番目のＣがＴに置換、（８）３４３番目のＧがＡに置換、（９）３４４番目のＧがＡに置換、（１０）３５７番目のＣがＴに置換、（１１）３９４番目のＧがＡに置換、（１２）３９５番目のＧがＡに置換、（１３）１７４０番目のＣがＴに置換、（１４）１８１３番目のＧがＡに置換、（１５）１８１４番目のＧがＡに置換、（１６）１８４６番目のＧがＡに置換、（１７）１８４７番目のＧがＡに置換、（１８）１８８８番目のＧがＡに置換、（１９）１８８９番目のＧがＡに置換、（２０）２０５０番目のＣがＴに置換、（２１）２１０４番目のＣがＴに置換、（２２）２１２３番目のＧがＡに置換、（２３）２１２４番目のＧがＡに置換、（２４）２１５２番目のＣがＴに置換、（２５）４７４２番目のＧがＡに置換、（２６）４７４３番目のＧがＡに置換、（２７）４９２６番目のＣがＴに置換。 - 上記変異は、ゲノムＤＮＡにおける、配列番号８に示す塩基配列からなる翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の下記（１）〜（２６）に示す１つ以上の変異であることを特徴とする、請求項１３〜１６の何れか一項に記載のウイルス抵抗性タバコ作出方法；
（１）２６４番目のＣがＴに置換、（２）２８９番目のＧがＡに置換、（３）２９０番目のＧがＡに置換、（４）２９８番目のＧがＡに置換、（５）２９９番目のＧがＡに置換、（６）３１５番目のＣがＴに置換、（７）３２８番目のＧがＡに置換、（８）３２９番目のＧがＡに置換、（９）３４２番目のＣがＴに置換、（１０）３７９番目のＧがＡに置換、（１１）３８０番目のＧがＡに置換、（１２）１６３０番目のＣがＴに置換、（１３）１７０３番目のＧがＡに置換、（１４）１７０４番目のＧがＡに置換、（１５）１７３６番目のＧがＡに置換、（１６）１７３７番目のＧがＡに置換、（１７）１７７８番目のＧがＡに置換、（１８）１７７９番目のＧがＡに置換、（１９）１９４０番目のＣがＴに置換、（２０）１９９４番目のＣがＴに置換、（２１）２０１３番目のＧがＡに置換、（２２）２０１４番目のＧがＡに置換、（２３）２０４２番目のＣがＴに置換、（２４）３２２４番目のＧがＡに置換、（２５）３２２５番目のＧがＡに置換、（２６）３４０６番目のＣがＴに置換。 - 翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現量を野生型と比較して２０％以下に抑制させる因子を導入することによって、ウイルスに対して抵抗性を有するタバコを作出することを特徴とする、ウイルス抵抗性タバコ作出方法。
- 上記発現量を野生型と比較して１０％以下に抑制させる因子をタバコに導入することを特徴とする、請求項１９に記載のウイルス抵抗性タバコ作出方法。
- 上記因子はＲＮＡｉコンストラクトであることを特徴とする、請求項１９または２０に記載のウイルス抵抗性タバコ作出方法。
- 上記ウイルスは、Potyvirus属のウイルスであることを特徴とする、請求項１３〜２１の何れか一項に記載のウイルス抵抗性タバコ作出方法。
- 上記Potyvirus属のウイルスは、Potato virus Yであることを特徴とする、請求項２２に記載のウイルス抵抗性タバコ作出方法。
- 上記Potyvirus属のウイルスは、Potato virus Yの一系統であって、タバコのVirgin A mutantのウイルス抵抗性を打破する系統であることを特徴とする、請求項２２に記載のウイルス抵抗性タバコ作出方法。
- 上記ウイルスは、Umbravirus属のウイルスであることを特徴とする、請求項１３〜２１の何れか一項に記載のウイルス抵抗性タバコ作出方法。
- 上記Umbravirus属のウイルスは、Tobacco bushy top virusであることを特徴とする、請求項２５に記載のウイルス抵抗性タバコ作出方法。
- タバコの翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子における変異を検出するためのポリヌクレオチドであって、当該変異は、ウイルスに対して非機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質を生産するか、または翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現を抑制する変異であることを特徴とする、検出用ポリヌクレオチド。
- 上記変異はナンセンス変異であることを特徴とする、請求項２７に記載の検出用ポリヌクレオチド。
- 上記変異は、（ａ）配列番号３もしくは配列番号４に示すアミノ酸配列からなる翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のエキソン、（ｂ）配列番号３もしくは配列番号４に示すアミノ酸配列と９２％以上の配列同一性を有する機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のエキソン、（ｃ）配列番号５もしくは配列番号６に示す塩基配列からなるｍＲＮＡが生成される野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のエキソン、または（ｄ）配列番号５もしくは配列番号６に示す塩基配列と９２％以上の配列同一性を有するｍＲＮＡが生成されるものであり、かつ機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のエキソンにおける、下記（１）〜（４）に示す１つ以上の変異であることを特徴とする、請求項２７または２８に記載の検出用ポリヌクレオチド；
（１）コドンＣＡＡのＣがＴに置換、（２）コドンＣＧＡのＣがＴに置換、（３）コドンＣＡＧのＣがＴに置換、（４）コドンＴＧＧのＧ（２つのＧのうちの何れか一方または両方）がＡに置換。 - 上記変異は、ゲノムＤＮＡにおける、配列番号７に示す塩基配列からなる翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の下記（１）〜（２７）に示す１つ以上の変異であることを特徴とする、請求項２７〜２９の何れか一項に記載の検出用ポリヌクレオチド；
（１）２７０番目のＣがＴに置換、（２）２９５番目のＧがＡに置換、（３）２９６番目のＧがＡに置換、（４）３０４番目のＧがＡに置換、（５）３０５番目のＧがＡに置換、（６）３１５番目のＣがＴに置換、（７）３３０番目のＣがＴに置換、（８）３４３番目のＧがＡに置換、（９）３４４番目のＧがＡに置換、（１０）３５７番目のＣがＴに置換、（１１）３９４番目のＧがＡに置換、（１２）３９５番目のＧがＡに置換、（１３）１７４０番目のＣがＴに置換、（１４）１８１３番目のＧがＡに置換、（１５）１８１４番目のＧがＡに置換、（１６）１８４６番目のＧがＡに置換、（１７）１８４７番目のＧがＡに置換、（１８）１８８８番目のＧがＡに置換、（１９）１８８９番目のＧがＡに置換、（２０）２０５０番目のＣがＴに置換、（２１）２１０４番目のＣがＴに置換、（２２）２１２３番目のＧがＡに置換、（２３）２１２４番目のＧがＡに置換、（２４）２１５２番目のＣがＴに置換、（２５）４７４２番目のＧがＡに置換、（２６）４７４３番目のＧがＡに置換、（２７）４９２６番目のＣがＴに置換。 - 上記変異は、ゲノムＤＮＡにおける、配列番号８に示す塩基配列からなる翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の下記（１）〜（２６）に示す１つ以上の変異であることを特徴とする、請求項２７〜２９の何れか一項に記載の検出用ポリヌクレオチド；
（１）２６４番目のＣがＴに置換、（２）２８９番目のＧがＡに置換、（３）２９０番目のＧがＡに置換、（４）２９８番目のＧがＡに置換、（５）２９９番目のＧがＡに置換、（６）３１５番目のＣがＴに置換、（７）３２８番目のＧがＡに置換、（８）３２９番目のＧがＡに置換、（９）３４２番目のＣがＴに置換、（１０）３７９番目のＧがＡに置換、（１１）３８０番目のＧがＡに置換、（１２）１６３０番目のＣがＴに置換、（１３）１７０３番目のＧがＡに置換、（１４）１７０４番目のＧがＡに置換、（１５）１７３６番目のＧがＡに置換、（１６）１７３７番目のＧがＡに置換、（１７）１７７８番目のＧがＡに置換、（１８）１７７９番目のＧがＡに置換、（１９）１９４０番目のＣがＴに置換、（２０）１９９４番目のＣがＴに置換、（２１）２０１３番目のＧがＡに置換、（２２）２０１４番目のＧがＡに置換、（２３）２０４２番目のＣがＴに置換、（２４）３２２４番目のＧがＡに置換、（２５）３２２５番目のＧがＡに置換、（２６）３４０６番目のＣがＴに置換。 - 上記変異を挟む核酸プライマーのセット、または、上記変異を含む連続した塩基配列もしくはその相補配列からなるポリヌクレオチドを含む核酸プライマーのセットであることを特徴とする、請求項２７〜３１の何れか一項に記載の検出用ポリヌクレオチド。
- タバコにおいて、ゲノムＤＮＡにおける上記変異の有無を、請求項２７〜３２の何れか一項に記載の検出用ポリヌクレオチドを利用して検査する検査工程と、
上記検査工程において上記変異が検出されたタバコをウイルス抵抗性タバコとして選抜する選抜工程とを含むことを特徴とする、ウイルス抵抗性タバコ選抜方法。 - 翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子における変異を含む連続した塩基配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドを含んでおり、当該変異は、ウイルスに対して非機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質を生産するか、または翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現を抑制する変異であることを特徴とする、ウイルスに対するタバコの抵抗性の判定用ＤＮＡマーカー。
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| CHIKARA MASUTA ET AL.: "A Single Amino Acid Change in Viral Genome-Associated Protein of Potato Virus Y Correlates with Resi", PHYTOPATHOLOGY, vol. Vol. 89, No. 2, JPN6015038482, 1999, pages p. 118-123 * |
| JASON CAVATORTA: "Engineering virus resistance using a modified potato gene", PLANT BIOTECHNOLOGY JOURNAL, vol. Vol. 9, JPN6018021270, 2011, pages p. 1014-1021 * |
| JUNGSU JUNG AND INHWA YEAM: "Exploring natural variations in eIF4E and screening for potyviral resistance in diverse Nicotiana sp", HORTICULTURE, ENVIRONMENT, AND BIOTECHNOLOGY, vol. Vol. 54, No. 5, JPN6015038472, October 2013 (2013-10-01), pages p. 430-440 * |
| X. H. MO ET AL.: "Complete nucleotide sequence and genome organization of a Chinese isolate of tobacco bushy top virus", ARCHIVES OF VIROLOGY, vol. Vol. 148, No. 2, JPN6015038479, 2003, pages p. 389-397 * |
| XINHUA WANG ET AL.: "Silencing of the Host Factor eIF(iso)4E Gene Confers Plum Pox Virus Resistance in Plum", PLOS ONE, vol. Vol. 8, No. 1, JPN6015038475, 2013, pages e50627 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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