JPWO2015178444A1 - オートファジーの測定に好適な融合タンパク質、前記融合タンパク質をコードする核酸、及びそれらの利用 - Google Patents

オートファジーの測定に好適な融合タンパク質、前記融合タンパク質をコードする核酸、及びそれらの利用 Download PDF

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Abstract

本発明は、オートファジーの活性を正確、かつ定量的に測定できる簡便なオートファジーの測定方法を提供することを課題とする。第１のタグを含むＬＣ３タンパク質と、第２のタグを含むタンパク質とが融合されている融合タンパク質、前記融合タンパク質をコードする塩基配列を含む核酸、前記核酸を含むベクター、前記核酸及び前記ベクターの少なくともいずれかが導入された細胞又はトランスジェニック非ヒト生物、並びに、前記細胞又はトランスジェニック非ヒト生物を用いるオートファジーの測定方法を提供する。

Description

本発明は、オートファジーの測定に好適な融合タンパク質、前記融合タンパク質をコードする塩基配列を含む核酸、前記核酸を含むベクター、前記核酸及び前記ベクターの少なくともいずれかが導入された細胞又はトランスジェニック非ヒト生物、及びオートファジーの測定方法に関する。
オートファジーは、細胞内の代表的な分解システムであり、オートファゴソームに囲まれた細胞質成分が、リソソームへ運ばれて分解される。オートファジーには、細胞内の不良又は老廃物の処理、飢餓時の栄養素自給、胚発生、神経変性や癌の抑止、細胞内侵入細菌の分解などの多くの働きがある。また、最近では、オートファジー関連遺伝子の異常が、神経変性疾患の原因であることが判明し、オートファジーが創薬の対象としても注目されている。
オートファジーに関連する基礎及び応用研究では、オートファジーの活性を定量的に評価することは、必要かつ重要である。
しかし、従来の方法は、顕微鏡でオートファゴソームの数を数える、又はオートファジーに伴う分子修飾を検出するなど、煩雑で定量性に欠けるものが主であった。
また、オートファジーによって分解される基質の量を測定し、オートファジーの活性を測定する方法も提案されている（例えば、非特許文献１参照）。具体的には、基質であるＬＣ３タンパク質を蛍光タンパク質との融合タンパク質とし、フローサイトメトリーにより、前記融合タンパク質の総量を定量する方法である。前記提案によれば、融合タンパク質の総量が減少した場合には、オートファジーが活性化されたと判断することができる。
しかしながら、前記提案では、ＬＣ３タンパク質の合成量の変動が考慮されないという問題がある。即ち、オートファジーが活性化されたことにより、ＬＣ３タンパク質の量が減少したのか、ＬＣ３タンパク質の合成が抑制されたことにより、ＬＣ３タンパク質の量が減少したのかを判別できないという問題がある。前記問題は、オートファジーに対する薬のスクリーニングなど、長期間の測定が必要な場合には、顕著な問題となる。
また、２種類の細胞を用いてオートファジーの活性を測定する方法も提案されている（例えば、非特許文献２参照）。具体的には、オートファジーにより分解されるＬＣ３タンパク質をタグとの融合タンパク質として発現させた細胞と、オートファジーにより分解されないＬＣ３タンパク質変異体をタグとの融合タンパク質として発現させた細胞とを用い、両者について、タグの量を計測し、それらの差を計算してオートファジー活性を測定するものである。前記提案によれば、ＬＣ３タンパク質の合成量の変動を考慮した測定ができると考えられる。
しかしながら、前記提案では、２種類の細胞が必要であり、煩雑であることに加え、両細胞におけるタグの発現量が異なるため、正確な比較ができないという問題がある。
したがって、オートファジーの活性を正確、かつ定量的に測定できる簡便な測定方法は、未だ提供されておらず、その速やかな提供が強く求められているのが現状である。
Ｓｈｖｅｔｓ Ｅ， ｅｔ ａｌ．、 Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｔｏ ｍｏｎｉｔｏｒ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．、 Ａｕｔｏｐｈａｇｙ．、 ２００８ Ｊｕｌ; ４（５）:６２１−６２８ Ｆａｒｋａｓ Ｔ， ｅｔ ａｌ．、 Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｂｙ ａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ−ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ ｆｌｕｘ、 Ａｕｔｏｐｈａｇｙ．、 ２００９ Ｏｃｔ; ５（７）:１０１８−１０２５
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、オートファジーの活性を正確、かつ定量的に測定できる簡便なオートファジーの測定方法、オートファジーの測定に好適な融合タンパク質、前記融合タンパク質をコードする塩基配列を含む核酸、前記核酸を含むベクター、並びに前記核酸及び前記ベクターの少なくともいずれかが導入された細胞又はトランスジェニック非ヒト生物を提供することを目的とする。
前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ 第１のタグを含むＬＣ３タンパク質と、第２のタグを含むタンパク質とが融合されていることを特徴とする融合タンパク質である。
＜２＞ 前記＜１＞に記載の融合タンパク質をコードする塩基配列を含むことを特徴とする核酸である。
＜３＞ 前記＜２＞に記載の核酸を含むことを特徴とするベクターである。
＜４＞ 前記＜２＞に記載の核酸、及び前記＜３＞に記載のベクターの少なくともいずれかが導入されたことを特徴とする細胞である。
＜５＞ 前記＜２＞に記載の核酸、及び前記＜３＞に記載のベクターの少なくともいずれかが導入されたことを特徴とするトランスジェニック非ヒト生物である。
＜６＞ 前記＜４＞に記載の細胞、及び前記＜５＞に記載のトランスジェニック非ヒト生物の少なくともいずれかを用いることを特徴とするオートファジーの測定方法である。
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、オートファジーの活性を正確、かつ定量的に測定できる簡便なオートファジーの測定方法、オートファジーの測定に好適な融合タンパク質、前記融合タンパク質をコードする塩基配列を含む核酸、前記核酸を含むベクター、並びに前記核酸及び前記ベクターの少なくともいずれかが導入された細胞又はトランスジェニック非ヒト生物を提供することができる。
図１は、実施例２のウェスタンブロットの結果を示す図である。 図２Ａは、実施例３におけるＧＦＰの蛍光強度を測定し、解析した結果を示す図である。 図２Ｂは、実施例３におけるＲＦＰの蛍光強度を測定し、解析した結果を示す図である。 図２Ｃは、実施例３におけるＧＦＰの蛍光強度のＲＦＰの蛍光強度に対する割合を示した図である。 図３は、実施例４におけるＧＦＰ／ＲＦＰレシオイメージを示す図である。 図４Ａは、実施例５の受精５２時間後のゼブラフィッシュの全身像を撮影した結果を示す図である。 図４Ｂは、実施例５の受精２４時間後の尾部の拡大像であり、ＧＦＰ蛍光シグナルを撮影した結果を示す図である。 図４Ｃは、実施例５の受精２４時間後の尾部の拡大像であり、ＲＦＰ蛍光シグナルを撮影した結果を示す図である。 図４Ｄは、実施例５の受精２４時間後の尾部の拡大像であり、微分干渉像を撮影した結果を示す図である。 図４Ｅは、実施例５の受精２４時間後の尾部の拡大像であり、ＧＦＰ／ＲＦＰレシオイメージを示す図である。 図５は、実施例７におけるＧＦＰ／ＲＦＰレシオイメージを示す図である。 図６Ａは、実施例８で撮影したゼブラフィッシュ胚の部分を説明するための図である。 図６Ｂは、実施例８における受精２．４時間後以降のゼブラフィッシュ胚の同一視野の細胞塊と卵黄を１０分毎に撮影した結果を示す図である。 図６Ｃは、実施例８におけるＧＦＰ/ＲＦＰレシオを示すグラフである。 図７Ａは、実施例９において、第１のタグを含むＬＣ３タンパク質と、第２のタグを含み、ＬＣ３タンパク質のカルボキシル末端のグリシンが欠失したＬＣ３タンパク質変異体とが融合されている融合タンパク質を発現する線維芽細胞におけるＧＦＰの蛍光強度を測定した結果を示す図である。 図７Ｂは、実施例９において、第１のタグを含むＬＣ３タンパク質と、第２のタグを含み、ＬＣ３タンパク質のカルボキシル末端のグリシンが欠失したＬＣ３タンパク質変異体とが融合されている融合タンパク質を発現する線維芽細胞におけるＲＦＰの蛍光強度を測定した結果を示す図である。 図７Ｃは、実施例９において、第１のタグを含むＬＣ３タンパク質と、第２のタグを含み、ＬＣ３タンパク質のカルボキシル末端のグリシンが欠失したＬＣ３タンパク質変異体とが融合されている融合タンパク質を発現する線維芽細胞を富栄養条件下で培養した場合のＧＦＰの蛍光強度及びＲＦＰの蛍光強度を測定した結果を示す図である。 図７Ｄは、実施例９において、第１のタグを含むＬＣ３タンパク質と、第２のタグを含み、ＬＣ３タンパク質のカルボキシル末端のグリシンが欠失したＬＣ３タンパク質変異体とが融合されている融合タンパク質を発現する線維芽細胞を飢餓条件下で培養した場合のＧＦＰの蛍光強度及びＲＦＰの蛍光強度を測定した結果を示す図である。 図７Ｅは、実施例９において、第１のタグを含むＬＣ３タンパク質と、第２のタグとが融合されている融合タンパク質を発現する線維芽細胞におけるＧＦＰの蛍光強度を測定した結果を示す図である。 図７Ｆは、実施例９において、第１のタグを含むＬＣ３タンパク質と、第２のタグとが融合されている融合タンパク質を発現する線維芽細胞におけるＲＦＰの蛍光強度を測定した結果を示す図である。 図７Ｇは、実施例９において、第１のタグを含むＬＣ３タンパク質と、第２のタグとが融合されている融合タンパク質を発現する線維芽細胞を富栄養条件下で培養した場合のＧＦＰの蛍光強度及びＲＦＰの蛍光強度を測定した結果を示す図である。 図７Ｈは、実施例９において、第１のタグを含むＬＣ３タンパク質と、第２のタグとが融合されている融合タンパク質を発現する線維芽細胞を飢餓条件下で培養した場合のＧＦＰの蛍光強度及びＲＦＰの蛍光強度を測定した結果を示す図である。
（融合タンパク質）
本発明の融合タンパク質は、第１のタグを含むＬＣ３（（ＭＡＰ１ＬＣ３（Ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ３）と称することもある）タンパク質と、第２のタグを含むタンパク質とが融合されてなり、必要に応じて、更にその他のアミノ酸配列を含んでいてもよい。
前記融合タンパク質は、細胞内の内因性酵素であるＡＴＧ４によって、第１のタグを含むＬＣ３タンパク質と、第２のタグを含むタンパク質とに切断される。
前記ＡＴＧ４は、前記ＬＣ３タンパク質のカルボキシル末端のグリシンを認識し、前記グリシンとその後ろのアミノ酸との結合を切断する。そのため、前記融合タンパク質は、細胞内において、等分子数の第１のタグを含むＬＣ３タンパク質と、第２のタグを含むタンパク質とを作り出し得る。
＜第１のタグを含むＬＣ３タンパク質＞
前記第１のタグを含むＬＣ３タンパク質（以下、「オートファジーによって分解される基質」と称することがある）は、オートファゴソームに取り込まれ、オートファジーによって、選択的に分解される。
−ＬＣ３タンパク質−
前記ＬＣ３タンパク質は、オートファゴソームの形成に必要なタンパク質であり、オートファジーによって選択的に分解されるタンパク質であることが知られている。前記ＬＣ３タンパク質がオートファゴソームに取り込まれるためには、前記ＬＣ３タンパク質のカルボキシル末端に存在するグリシン残基が、ホスファチジルエタノールアミンと結合することが必要である。前記グリシン残基を欠くと、もはやオートファゴソームに結合できず、オートファジーによって分解されなくなる。
前記ＬＣ３タンパク質は、ファミリーの総称である。例えば、哺乳類におけるＬＣ３タンパク質としては、ＬＣ３Ａ、ＬＣ３Ｂ、ＬＣ３Ｂ２、ＬＣ３Ｃ、ＧＡＢＡＲＡＰ、ＧＡＢＡＲＡＰＬ１、ＧＡＢＡＲＡＰＬ２が知られている。また、酵母では、Ａｔｇ８が知られている。本発明におけるＬＣ３タンパク質には、これらのタンパク質が含まれる。
前記ＬＣ３タンパク質のアミノ酸配列や塩基配列情報は、ＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ）などの公共のデータベースを通じて容易に入手することができる。
例えば、ＧｅｎＢａｎｋでは、以下の番号で登録されている。
ラットＬＣ３Ａ・・・アミノ酸配列：ＮＰ＿９５５７９４．１、塩基配列：ＮＭ＿１９９５００．２
ヒトＬＣ３Ａ・・・アミノ酸配列：ＮＰ＿１１５９０３．１、塩基配列：ＮＭ＿０３２５１４
ラットＬＣ３Ｂ・・・アミノ酸配列：ＮＰ＿０７４０５８．２、塩基配列：ＮＣ＿００５１１８
ヒトＬＣ３Ｂ・・・アミノ酸配列：ＮＰ＿０７３７２９．１、塩基配列：ＮＧ＿０２９０３０
ヒトＬＣ３Ｂ２・・・アミノ酸配列：ＮＰ＿００１０７８９５０．１、塩基配列：ＮＭ＿００１０８５４８１．１
ヒトＬＣ３Ｃ・・・アミノ酸配列：ＮＰ＿００１００４３４３．１、塩基配列：ＮＭ＿００１００４３４３
ヒトＧＡＢＡＲＡＰ・・・アミノ酸配列：ＮＰ＿００９２０９．１、塩基配列：ＮＭ＿００７２７８．１
ヒトＧＡＢＡＲＡＰＬ１・・・アミノ酸配列：ＮＰ＿１１３６００．１、塩基配列：ＮＭ＿０３１４１２．２
ヒトＧＡＢＡＲＡＰＬ２・・・アミノ酸配列：ＮＰ＿００９２１６．１、塩基配列：ＮＭ＿００７２８５．６
酵母Ａｔｇ８・・・アミノ酸配列：ＮＰ＿００９４７５．１、塩基配列：ＮＭ＿００１１７８３１８．１
前記ＬＣ３タンパク質は、オートファゴソームに取り込まれる限り、そのアミノ配列の一部に変異を有していてもよい。前記変異としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、置換、挿入、欠失、付加などが挙げられる。
−第１のタグ−
前記第１のタグとしては、前記第２のタグと異なる限り、特に制限はなく、公知のタグを適宜選択することができる。
前記タグとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、ポリヒスチジン配列、Ｆｌａｇ配列などが挙げられる。
前記蛍光タンパク質の具体例としては、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質などが挙げられる。
前記ルシフェラーゼの具体例としては、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼなどが挙げられる。
前記第１のタグと、前記ＬＣ３タンパク質とは、直接連結していてもよいし、リンカーを介して連結していてもよい。前記リンカーの長さ、配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
＜第２のタグを含むタンパク質＞
前記第２のタグを含むタンパク質（以下、「オートファジーによって分解されない内部標準基質」と称することがある）は、オートファゴソームに取り込まれず、オートファジーによって、分解されない。
前記第２のタグを含むタンパク質は、第２のタグを含む限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記第２のタグを含むタンパク質は、第２のタグからなるタンパク質であってもよいし、第２のタグを含み、ＬＣ３タンパク質のカルボキシル末端のグリシンが欠失若しくは置換されたＬＣ３タンパク質変異体（以下、「第２のタグを含むＬＣ３タンパク質変異体」と称することがある）であってもよい。
−第２のタグ−
前記第２のタグとしては、前記第１のタグと異なる限り、特に制限はなく、公知のタグを適宜選択することができる。
前記タグとしては、前記第１のタグの項目に記載したものと同様のものが挙げられる。
前記第１のタグと、前記第２のタグとの組合せとしては、両者が異なる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、異なるアミノ酸配列の長さのタグの組合せ、異なる電気泳動度のタグの組合せ、異なる蛍光タンパク質のタグの組合せ、異なるルシフェラーゼのタグの組合せなどが挙げられる。具体例としては、緑色蛍光タンパク質と赤色蛍光タンパク質との組合せ、ホタルルシフェラーゼとウミシイタケルシフェラーゼとの組合せなどが挙げられる。
−第２のタグを含むＬＣ３タンパク質変異体−
前記第２のタグを含むＬＣ３タンパク質変異体における前記ＬＣ３タンパク質変異体としては、そのカルボキシル末端がグリシンでなければ、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記ＬＣ３タンパク質と最も性質が近い点で、ＬＣ３タンパク質のカルボキシル末端のグリシンが欠失したものが好ましい。
前記ＬＣ３タンパク質変異体は、カルボキシル末端にグリシン残基を有さないため、オートファジーによって分解されない。
前記ＬＣ３タンパク質変異体は、オートファゴソームに取り込まれない限り、ＬＣ３タンパク質のカルボキシル末端以外にも変異を有していてもよいが、前記ＬＣ３タンパク質と性質が近いものとする点で、カルボキシル末端以外の配列は、前記ＬＣ３タンパク質と揃えることが好ましい。
前記ＬＣ３タンパク質変異体の調製方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＬＣ３タンパク質のカルボキシル末端のグリシンをコードする塩基配列を終止コドン、又はグリシン以外のアミノ酸をコードする塩基配列に置換する方法などが挙げられる。
前記第２のタグと、前記ＬＣ３タンパク質変異体とは、直接連結していてもよいし、リンカーを介して連結していてもよい。前記リンカーの長さ、配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記第２のタグを含むＬＣ３タンパク質変異体は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、第２のタグと、ＬＣ３タンパク質のカルボキシル末端のグリシンが欠失若しくは置換されたＬＣ３タンパク質変異体とをこの順に含むことが好ましい。
＜その他のアミノ酸配列＞
前記その他のアミノ酸配列としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
＜態様＞
前記融合タンパク質の態様としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、アミノ末端からカルボキシル末端へ、第１のタグと、ＬＣ３タンパク質と、第２のタグを含むタンパク質とをこの順に含む態様が好ましい。
第１のタグとＬＣ３タンパク質との間、ＬＣ３タンパク質と第２のタグを含むタンパク質との間には、リンカーが含まれていてもよい。
前記アミノ末端からカルボキシル末端へ、第１のタグと、ＬＣ３タンパク質と、第２のタグと、ＬＣ３タンパク質のカルボキシル末端のグリシンが欠失若しくは置換されたＬＣ３タンパク質変異体とをこの順に含む態様の融合タンパク質をコードする塩基配列の具体例としては、例えば、配列番号：１で表されるものが挙げられる。
前記アミノ末端からカルボキシル末端へ、第１のタグと、ＬＣ３タンパク質と、第２のタグとをこの順に含む態様の融合タンパク質をコードする塩基配列の具体例としては、例えば、配列番号：２で表されるものが挙げられる。
前記融合タンパク質の製造方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、前記融合タンパク質をコードする塩基配列を含む核酸をベクターに挿入し、前記ベクターを細胞に導入することにより、前記融合タンパク質を発現させることができる。
本発明の融合タンパク質によれば、オートファジーによって分解される基質と、オートファジーによって分解されない内部標準基質とを常に等しい分子数で合成することができる。そのため、オートファジーによって分解される基質と、オートファジーによって分解されない内部標準基質との比は、合成の影響を受けず、純粋にオートファジーによる分解の活性を反映することとなる。即ち、前記第１のタグと、前記第２のタグとの残存比を定量して算出することにより、オートファジーの活性を推定することができる。
したがって、本発明の融合タンパク質は、従来困難であった、オートファジーの活性を正確かつ定量的に測定できる簡便なオートファジーの測定方法のプローブとして好適に用いることができる。
（核酸）
本発明の核酸は、本発明の融合タンパク質をコードする塩基配列を含み、必要に応じて更にその他の塩基配列を含む。
前記核酸としては、本発明の融合タンパク質をコードする塩基配列を含んでいれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記核酸は、ＤＮＡであってもよいし、ＲＮＡであってもよい。
前記その他の塩基配列としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記融合タンパク質をコードする核酸の上流に連結するプロモーター配列、前記融合タンパク質をコードする核酸の下流に連結するターミネーター配列などが挙げられる。
前記プロモーター配列及びターミネーター配列としては、特に制限はなく、公知の配列を目的に応じて適宜選択することができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列などが挙げられる。
前記核酸の調製方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、化学合成により調製する方法、ＰＣＲにより調製する方法などが挙げられる。
本発明の核酸は、後述する本発明の細胞、及びトランスジェニック非ヒト生物の作製に好適に用いることができる。
（ベクター）
本発明のベクターは、本発明の核酸を含み、必要に応じて更にその他の塩基配列を含む。
前記ベクターとしては、本発明の核酸を含んでいれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
本発明の核酸を挿入するベクターとしては、特に制限はなく、公知のベクターを適宜選択することができ、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクターなどが挙げられる。
前記ベクターの具体例としては、例えば、ｐＭＲＸ−ＩＰベクターなどが挙げられる。
前記その他の塩基配列としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記融合タンパク質をコードする核酸の上流に連結するプロモーター配列、前記融合タンパク質をコードする核酸の下流に連結するターミネーター配列などが挙げられる。
前記プロモーター配列及びターミネーター配列としては、特に制限はなく、公知の配列を目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＣＭＶプロモーター配列などが挙げられる。
前記ベクターに本発明の核酸を挿入する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、予め制限酵素で切断したベクターの切断部位に連結する方法などが挙げられる。
本発明のベクターは、後述する本発明の細胞、及びトランスジェニック非ヒト生物の作製に好適に用いることができる。
（細胞）
本発明の細胞は、本発明の核酸、及び本発明のベクターの少なくともいずれかが導入されてなる。
前記細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、線維芽細胞、ＨｅＬａ細胞などが挙げられる。
前記細胞に、本発明の核酸、及び本発明のベクターの少なくともいずれかを導入する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、市販のトランスフェクション試薬を用いて導入する方法などが挙げられる。
前記細胞に、前記核酸、及び前記ベクターの少なくともいずれかが導入されたことを確認する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、前記細胞における前記タグを検出する方法、前記細胞からＤＮＡを採取し、ＰＣＲ法により確認する方法などが挙げられる。
前記細胞は、シングルクローンであってもよいし、シングルクローンでなくてもよいが、シングルクローンが好ましい。
本発明の細胞は、本発明の融合タンパク質を発現するため、細胞におけるオートファジーの活性を客観的に定量することができる。したがって、本発明の細胞を用いることにより、オートファジーの活性に変動を与える細胞の状況を特定したり、オートファジー制御に関わる遺伝子を同定したり、オートファジーの活性を変動させる化合物を同定したりすることなどが可能となる。
（トランスジェニック非ヒト生物）
本発明のトランスジェニック非ヒト生物は、本発明の核酸、及び本発明のベクターの少なくともいずれかが導入されてなる。
前記トランスジェニック非ヒト生物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、動物、植物、菌類などが挙げられる。
前記動物としては、例えば、哺乳類、魚類などが挙げられる。前記哺乳類の具体例としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシなどが挙げられる。前記魚類の具体例としては、ゼブラフィッシュ、メダカ、金魚などが挙げられる。
前記植物としては、例えば、シロイヌナズナなどが挙げられる。
前記菌類としては、例えば、酵母などが挙げられる。
前記トランスジェニック非ヒト生物の作製方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
例えば、トランスジェニック非ヒト動物は、非ヒト動物の受精卵に前記核酸、及び前記ベクターの少なくともいずれかを導入し、前記受精卵を前記非ヒト動物のメスに着床させることにより作製することができる。前記導入の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、マイクロインジェクション法などが挙げられる。
また、前記植物に前記核酸、及び前記ベクターの少なくともいずれかを導入する方法としては、例えば、アグロバクテリウム属細菌を用いる方法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法などが挙げられる。前記菌類に前記核酸、及び前記ベクターの少なくともいずれかを導入する方法としては、例えば、スフェロプラスト法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
前記トランスジェニック非ヒト生物に、前記核酸、及び前記ベクターの少なくともいずれかが導入されたことを確認する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、前記トランスジェニック非ヒト生物における前記タグを検出する方法、前記トランスジェニック非ヒト生物からＤＮＡを採取し、ＰＣＲ法により確認する方法などが挙げられる。
前記トランスジェニック非ヒト生物は、全身に本発明の融合タンパク質を発現していることが好ましい。
本発明のトランスジェニック非ヒト生物は、本発明の融合タンパク質を発現するため、生物内でのオートファジーの活性を評価することが可能となる。したがって、本発明のトランスジェニック非ヒト生物を用いることにより、オートファジーの活性に変動を与える個体の状況を特定したり、オートファジー制御に関わる遺伝子を同定したり、オートファジーの活性を変動させる化合物を同定したりすることなどが可能となる。
（オートファジーの測定方法）
本発明のオートファジーの測定方法は、本発明の細胞、及び本発明のトランスジェニック非ヒト生物の少なくともいずれかを用いる。
前記オートファジーの測定方法では、前記第１のタグと、前記第２のタグとの残存比を定量して算出し、オートファジーの活性を推定する。本発明のオートファジーの測定方法によれば、従来困難であった、オートファジーの活性を、簡便に、正確かつ定量的に測定することができる。
前記第１のタグと、前記第２のタグとの残存比を定量する方法としては、特に制限はなく、前記タグに応じて公知の方法を適宜選択することができ、例えば、ウェスタンブロット法、フローサイトメトリー法、蛍光顕微鏡法、蛍光プレートリーダー法、デュアルルシフェラーゼアッセイ法などが挙げられる。
例えば、前記タグとして、長さが異なるタグを用いた場合には、ウェスタンブロット法により測定することができ、異なる蛍光タンパク質を用いた場合には、フローサイトメトリー法、蛍光顕微鏡法、蛍光プレートリーダー法により測定することができ、異なるルシフェラーゼを用いた場合には、デュアルルシフェラーゼアッセイ法により測定することができる。
前記第１のタグと、前記第２のタグとの残存比を定量する方法の中でも、前記蛍光プレートリーダー法が、従来の方法では区別することができなかった、ある薬剤の投与により細胞が死んだのか、又は蛍光タンパク質が分解されたのかを簡便に区別することができる点で好ましい。
また、前記蛍光顕微鏡法によれば、イメージングにより、経時的なオートファジーの活性の変化や、細胞や組織ごとのオーファジーの活性の変化をも測定することができる。
前記オートファジーの測定方法の測定対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、通常の状態の本発明の細胞又はトランスジェニック非ヒト生物、オートファジーを誘導した状態の本発明の細胞又はトランスジェニック非ヒト生物などが挙げられる。
前記オートファジーを誘導する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記細胞又は前記トランスジェニック非ヒト生物を飢餓状態とする方法が挙げられる。
前記飢餓状態とする方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、飢餓培地で培養するなどが挙げられる。
前記各状態の本発明の細胞又はトランスジェニック非ヒト生物は、被験物質が投与されたり、環境条件が変えたりされてもよい。
前記被験物質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、薬剤などが挙げられる。
前記環境条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、播種する細胞密度、温度などが挙げられる。
例えば、（１）通常の状態の本発明の細胞又はトランスジェニック非ヒト生物におけるオートファジーの活性と、オートファジーを誘導した状態の本発明の細胞又はトランスジェニック非ヒト生物におけるオートファジーの活性とを比較したり、（２）通常の状態の本発明の細胞又はトランスジェニック非ヒト生物におけるオートファジーの活性と、被験物質の投与若しくは環境条件を変化させた以外は通常の状態と同様とした本発明の細胞又はトランスジェニック非ヒト生物におけるオートファジーの活性とを比較したり、（３）オートファジーを誘導した状態の本発明の細胞又はトランスジェニック非ヒト生物におけるオートファジーの活性と、被験物質の投与若しくは環境条件を変化させた以外はオートファジーを誘導した状態と同様とした本発明の細胞又はトランスジェニック非ヒト生物におけるオートファジーの活性とを比較したりすることにより、オートファジーの活性に変動を与える物質や環境条件を同定したり、オートファジー制御に関わる遺伝子を同定したりすることが可能となる。
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
（実施例１：線維芽細胞株の樹立；クローニングあり）
第１のタグを含むＬＣ３タンパク質と、第２のタグを含み、ＬＣ３タンパク質のカルボキシル末端のグリシンが欠失したＬＣ３タンパク質とが融合されている融合タンパク質を発現する線維芽細胞株を以下のようにして樹立した。
前記第１のタグ、ＬＣ３タンパク質、第２のタグ、及びＬＣタンパク質のカルボキシル末端のグリシンが欠失したＬＣ３タンパク質をコードする核酸としては、それぞれ以下のものを用いた。
−第１のタグ−
緑色蛍光タンパク質（以下、「ＥＧＦＰ」、又は「ＧＦＰ」と称することがある）遺伝子。
−ＬＣ３タンパク質−
ラットＬＣ３ＢのｃＤＮＡ（１塩基〜３６０塩基）。
−第２のタグ−
単量体赤色蛍光タンパク質（以下、「ｍＲＦＰ」、又は「ＲＦＰ」と称することがある）遺伝子。
−ＬＣ３タンパク質のカルボキシル末端のグリシンが欠失したＬＣ３タンパク質−
ラットＬＣ３ＢのｃＤＮＡ（１塩基〜３６０塩基）の３５８塩基〜３６０塩基の「ｇｇｇ」を「ｔａａ（終始コドン）」に置換したもの。
前記第１のタグ、ＬＣ３タンパク質、第２のタグ、及びＬＣタンパク質のカルボキシル末端のグリシンが欠失したＬＣ３タンパク質をコードする核酸をこの順に、レトロウイルスベクターであるｐＭＲＸ−ＩＰベクター（Ｓａｉｔｏｈ， Ｈ．， Ｎａｋａｎｏ， Ｈ．， Ｙａｍａｍｏｔｏ， Ｎ． ａｎｄ Ｙａｍａｏｋａ， Ｓ．： ＮＥＭＯ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＮＦ−ｋＢ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ Ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ−ｂｅｔａ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ５３２， ４５−５１， ２００２）のＢａｍＨＩサイトに挿入した。
なお、前記第１のタグ、ＬＣ３タンパク質、第２のタグ、及びＬＣタンパク質のカルボキシル末端のグリシンが欠失したＬＣ３タンパク質をコードする核酸をこの順に有する核酸の塩基配列は、配列番号：１に記載の通りである。配列番号：１中、１番目〜７１７番目の塩基は前記第１のタグをコードする塩基配列であり、７８１番目〜１，１４０番目の塩基は前記ＬＣ３タンパク質をコードする塩基配列であり、１，１４７番目〜１，８２１番目の塩基は第２のタグをコードする塩基配列であり、１，８４０番目〜２，１９９番目の塩基は前記ＬＣタンパク質のカルボキシル末端のグリシンが欠失したＬＣ３タンパク質をコードする塩基配列である。なお、配列番号：１中、７１８番目〜７８０番目、１，１４１番目〜１，１４６番目、１，８２２番目〜１，８３９番目は、リンカーとなるアミノ酸をコードする塩基配列である。
前記ｐＭＲＸ−ＩＰベクターを、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標） ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いてＰｌａｔ−Ｅ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの３日後、培養上清に放出されたウイルス粒子を回収した。前記ウイルス粒子を含む上清と、８μｇ／ｍＬのポリブレンとを線維芽細胞（野生型マウスより樹立）に添加し、一晩インキュベートすることで、線維芽細胞に遺伝子を導入した。
遺伝子発現細胞は、ピューロマイシンを用いて選択し、後にシングルクローンを単離し、第１のタグを含むＬＣ３タンパク質と、第２のタグを含み、ＬＣ３タンパク質のカルボキシル末端のグリシンが欠失したＬＣ３タンパク質変異体とが融合されている融合タンパク質を発現する線維芽細胞株を得た。
（実施例２：ウェスタンブロット法）
前記実施例１で得られた線維芽細胞を飢餓培地であるアミノ酸非含有ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で０時間、１時間、２時間、６時間、又は１２時間培養し、オートファジーを誘導させた。
前記飢餓培地で所定時間培養した後の細胞を溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００、１０ｍＭ ＮａＦ、０．４ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ
ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、プロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ）（Ｒｏｃｈｅ社製））で溶解し、１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心した後に上清を回収した。前記上清に、６分の１の体積の６×サンプルバッファー（２８０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
６．８）、３０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１０％ ＳＤＳ、９．３％ ＤＴＴ、０．１％
ＢＰＢ）を添加し、５分間ボイルした。次に、サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に転写した。その後、抗ＬＣ３抗体（Ｑｕｙ ｅｔ
ａｌ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２８８：１１２５−３４， ２０１３．）及びＨＲＰ結合抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社製）でウェスタンブロットを行った後、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｗｅｓｔｅｒｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて発光させ、ＬＡＳ−３０００ｍｉｎｉ（富士フイルム株式会社製）でシグナルを検出した。結果を図１に示す。
図１中、０、１、２、６、及び１２は、飢餓培地での培養時間を表し、ＲＦＰ−ＬＣ３ΔＧは、前記第２のタグを含み、ＬＣ３タンパク質のカルボキシル末端のグリシンが欠失したＬＣ３タンパク質変異体のシグナルを表し、ＧＦＰ−ＬＣ３は、前記第１のタグを含むＬＣ３タンパク質のシグナルを表す。
図１の結果から、第１のタグを含むＬＣ３タンパク質と、第２のタグを含み、ＬＣ３タンパク質のカルボキシル末端のグリシンが欠失したＬＣ３タンパク質変異体とが融合された融合タンパク質は、細胞内において、第１のタグを含むＬＣ３タンパク質と、第２のタグを含み、ＬＣ３タンパク質のカルボキシル末端のグリシンが欠失したＬＣ３タンパク質変異体とに切断されていることが確認された。
また、ＲＦＰ−ＬＣ３ΔＧは安定に存在しているのに対し、ＧＦＰ−ＬＣ３はオートファジーの誘導とともに分解され、その量が減少することが確認された。
（実施例３：フローサイトメトリー法）
前記実施例１で得られた線維芽細胞をＰＢＳで洗浄した後、通常培地（１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ社製）、富栄養条件）、又は飢餓培地（アミノ酸非含有ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、飢餓条件）で６時間培養した。
前記培養後、０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡで回収した細胞を遠心分離法で回収し、４％パラホルムアルデヒドを加えて懸濁し、氷上で１０分間インキュベートした。その後、固定した細胞を冷したＰＢＳで洗浄し、遠心して上清を除き、再度冷やしたＰＢＳで懸濁した。
セルアナライザー（ＥＣ８００、Ｓｏｎｙ社製）で各細胞の蛍光強度を測定し、解析ソフトウェア（Ｋａｌｕｚａ， Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いてデータ解析を行った。ＧＦＰ、ＲＦＰ解析には、４８８ｎｍ， ５６１ｎｍレーザーをそれぞれ使用した。結果を図２Ａ〜図２Ｃに示す。
図２Ａは、前記第１のタグであるＧＦＰの蛍光強度を測定し、解析した結果を示し、図２Ｂは、前記第２のタグであるＲＦＰの蛍光強度を測定し、解析した結果を示す。図２Ａ及び図２Ｂにおける横軸は蛍光強度を表し、縦軸はイベント数を表す。
図２Ａの結果から、ＧＦＰの蛍光強度は、飢餓条件において減少しており、オートファジーが誘導されていることが確認された。一方、図２Ｂの結果から、ＲＦＰの蛍光強度は、飢餓条件でも変化していないことが確認された。
図２Ｃは、前記ＧＦＰの蛍光強度の前記ＲＦＰの蛍光強度に対する割合（ＧＦＰ／ＲＦＰ）を表し、富栄養条件が１００％となるように規格化した結果を示す。
図２Ｃに示すように、飢餓条件下では、富栄養条件下と比べて、ＧＦＰ／ＲＦＰが８０％程度減少していた。図２Ｃの結果から、本願発明の融合タンパク質を発現する細胞を用いることにより、オートファジーの活性を定量的に測定することができることが示された。
（実施例４：蛍光顕微鏡法）
６ウェルプレートで培養した前記実施例１で得られた線維芽細胞を、通常培地（１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ社製）、富栄養条件）、又は飢餓培地（ＥＢＳＳ培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）、飢餓条件）で６時間培養した後、４％パラホルムアルデヒドを用い、室温で１０分間固定した。
蛍光顕微鏡（オリンパスＩＸ８１、オリンパス株式会社製）、対物レンズ（１０×、オリンパス株式会社製）、冷却型ＣＣＤカメラ（ＣｏｏｌＳＮＡＰＨＱ２、株式会社日本ローパー製）を使用し、同一視野のＧＦＰ蛍光シグナル、及びＲＦＰ蛍光シグナルを、露光時間５００ｍｓ、ｂｉｎｎｉｎｇ ２×の条件で撮影した。
画像処理ソフトウェア ＭｅｔａＭｏｒｐｈ ｖｅｒ． ７（モレキュラーデバイス ジャパン株式会社製）を用いて、ＧＦＰ／ＲＦＰレシオイメージを作製した。蛍光顕微鏡法によれば、ＧＦＰ／ＲＦＰレシオを擬似カラーで表示することができ、その色から、オートファジー活性を測定することができる。結果を図３に示す。
図３中、左側は富栄養条件におけるＧＦＰ／ＲＦＰレシオイメージを示し、右側は飢餓条件におけるＧＦＰ／ＲＦＰレシオイメージを示す。なお、ＧＦＰ／ＲＦＰレシオが低いほど、オートファジー活性が高いことを示す。
図３の結果から、第２のタグとしてＲＦＰを付加したＬＣ３タンパク質のカルボキシル末端のグリシンが欠失したＬＣ３タンパク質変異体は安定して存在するのに対し、第１のタグとしてＧＦＰを付加したＬＣ３タンパク質はオートファジーの誘導とともに分解され、その量が減少することが確認された。
（実施例５：トランスジェニックゼブラフィッシュの作製）
第１のタグを含むＬＣ３タンパク質と、第２のタグを含み、ＬＣ３タンパク質のカルボキシル末端のグリシンが欠失したＬＣ３タンパク質とが融合されている融合タンパク質を発現するゼブラフィッシュを以下のようにして作製した。
前記第１のタグ、ＬＣ３タンパク質、第２のタグ、及びＬＣタンパク質のカルボキシル末端のグリシンが欠失したＬＣ３タンパク質をコードする核酸は、実施例１と同様のものを用いた。
前記第１のタグ、ＬＣ３タンパク質、第２のタグ、及びＬＣタンパク質のカルボキシル末端のグリシンが欠失したＬＣ３タンパク質をコードする核酸をこの順にｐＣＳ２ベクター（Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅｓ ｄｅｖ． ８： １４３４−１４４７，
１９９４）のＸｈｏＩサイトに挿入した。前記ｐＣＳ２ベクターをＮｏｔＩで直鎖化した後、フェノールクロロホルム処理及びエタノール沈殿で精製した。前記精製物を鋳型とし、ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ（登録商標） ＳＰ６ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社製）及びｐｏｌｙ（Ａ） ｔａｉｌｉｎｇ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社製）を用いて、前記第１のタグ、ＬＣ３タンパク質、第２のタグ、及びＬＣタンパク質のカルボキシル末端のグリシンが欠失したＬＣ３タンパク質をコードする核酸のｍＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写合成し、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてｍＲＮＡを精製した。
ゼブラフィッシュ（理化学研究所 ＲＷ株、明期１４時間、暗期１０時間、２８℃で飼育）を交配させて受精卵を準備し、１細胞期の胚に約１００ｐｇの前記ｍＲＮＡをフェムトジェット（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製）及びフェムトチップＩＩ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製）を用いて実体顕微鏡下でマイクロインジェクションし、２８℃のインキュベーターで飼育した。
受精２４時間後、卵殻を除去した胚をガラスボトムディッシュ（Ｉｗａｋｉ社製）に移し、０．０２％ トリカイン（Ｓｉｇｍａ社製）麻酔下で、共焦点顕微鏡（オリンパスＦＶ１０００−ＩＸ８１、オリンパス株式会社製）、対物レンズ（１０×、又は３０×、オリンパス株式会社製）、レーザー（４７３ｎｍ、５５９ｎｍ）を使用し、同一視野のＧＦＰ蛍光シグナル、ＲＦＰ蛍光シグナル、及び微分干渉像を撮影した。また、画像処理ソフトウェア ＭｅｔａＭｏｒｐｈ ｖｅｒ． ７（モレキュラーデバイス ジャパン株式会社製）を用いて、ＧＦＰ／ＲＦＰレシオイメージを作製した。
また、受精５２時間後のゼブラフィッシュの全身像についても、同一視野のＧＦＰ蛍光シグナル、ＲＦＰ蛍光シグナル、及び微分干渉像を撮影した。
結果を図４Ａから図４Ｅに示す。
図４Ａは、受精５２時間後のゼブラフィッシュの全身像を撮影した結果を示す図であり、ＧＦＰ−ＬＣ３はＧＦＰ蛍光シグナルを撮影した結果を示し、ＲＦＰ−ＬＣ３ΔＧはＲＦＰ蛍光シグナルを撮影した結果を示し、Ｍｅｒｇｅ＋ＤＩＣは微分干渉像を撮影した結果を示す。
図４Ｂ〜図４Ｅは、受精２４時間後の尾部の拡大像であり、それぞれ、ＧＦＰ蛍光シグナルを撮影した結果、ＲＦＰ蛍光シグナルを撮影した結果、微分干渉像を撮影した結果、ＧＦＰ／ＲＦＰレシオイメージを示す。なお、ＧＦＰ／ＲＦＰレシオが低いほど、オートファジー活性が高いことを示す。
図４Ａ〜図４Ｅの結果から、第１のタグを含むＬＣ３タンパク質と、第２のタグを含み、ＬＣ３タンパク質のカルボキシル末端のグリシンが欠失したＬＣ３タンパク質とが融合されている融合タンパク質を発現させることにより、ゼブラフィッシュにおけるオートファジーの活性を測定できることが示された。また、実施例５では、脊髄神経に比べて骨格筋のオートファジーの活性が高いことが示唆された。
（実施例６：ＨｅＬａ細胞株の樹立）
第１のタグを含むＬＣ３タンパク質と、第２のタグを含み、ＬＣ３タンパク質のカルボキシル末端のグリシンが欠失したＬＣ３タンパク質とが融合されている融合タンパク質を発現するＨｅＬａ細胞株を以下のようにして樹立した。
前記第１のタグ、ＬＣ３タンパク質、第２のタグ、及びＬＣタンパク質のカルボキシル末端のグリシンが欠失したＬＣ３タンパク質をコードする核酸は、実施例１と同じものを使用した。また、前記第１のタグ、ＬＣ３タンパク質、第２のタグ、及びＬＣタンパク質のカルボキシル末端のグリシンが欠失したＬＣ３タンパク質をコードする核酸をこの順に挿入したｐＭＲＸ−ＩＰベクターも実施例１と同様にして調製した。
前記ｐＭＲＸ−ＩＰベクターを、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標） ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いてｐＣＧ−ＶＳＶ−Ｇ及びＰＣＧ−ｇａｇ−ｐｏｌと共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの３日後、培養上清に放出されたウイルス粒子を回収した。前記ウイルス粒子を含む上清と、８μｇ／ｍＬのポリブレンとをＨｅＬａ細胞に添加し、一晩インキュベートすることで、ＨｅＬａ細胞に遺伝子を導入した。
遺伝子発現細胞は、ピューロマイシンを用いて選択し、第１のタグを含むＬＣ３タンパク質と、第２のタグを含み、ＬＣ３タンパク質のカルボキシル末端のグリシンが欠失したＬＣ３タンパク質変異体とが融合されている融合タンパク質を発現するＨｅＬａ細胞株を得た。
（実施例７：蛍光顕微鏡法）
９６ウェルプレートで培養した前記実施例６で得られたＨｅＬａ細胞を、通常培地（１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ社製）、富栄養条件）、又は飢餓培地(アミノ酸非含有ＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、飢餓条件）で６時間培養した後、４％パラホルムアルデヒドを用い、室温で１０分間固定した。
蛍光顕微鏡（オリンパスＩＸ８１、オリンパス株式会社製）、対物レンズ（４×、オリンパス株式会社製）、冷却型ＣＣＤカメラ（ＣｏｏｌＳＮＡＰＨＱ２、株式会社日本ローパー製）を使用し、同一視野のＧＦＰ蛍光シグナル、及びＲＦＰ蛍光シグナルを、露光時間１０００ｍｓ、ｂｉｎｎｉｎｇ １×の条件で撮影した。
画像処理ソフトウェア ＭｅｔａＭｏｒｐｈ ｖｅｒ． ７（モレキュラーデバイス ジャパン株式会社製）を用いて、ＧＦＰ／ＲＦＰレシオイメージを作製した。蛍光顕微鏡法によれば、ＧＦＰ／ＲＦＰレシオを擬似カラーで表示することができ、その色から、オートファジー活性を測定することができる。結果を図５示す。
図５中、左側は富栄養条件におけるＧＦＰ／ＲＦＰレシオイメージを示し、右側は飢餓条件におけるＧＦＰ／ＲＦＰレシオイメージを示す。なお、ＧＦＰ／ＲＦＰレシオが低いほど、オートファジー活性が高いことを示す。
図５の結果から、第２のタグとしてＲＦＰを付加したＬＣ３タンパク質のカルボキシル末端のグリシンが欠失したＬＣ３タンパク質変異体は安定して存在するのに対し、第１のタグとしてＧＦＰを付加したＬＣ３タンパク質はオートファジーの誘導とともに分解され、その量が減少することが確認された。
（実施例８：トランスジェニックゼブラフィッシュの受精卵の作製）
第１のタグを含むＬＣ３タンパク質と、第２のタグを含み、ＬＣ３タンパク質のカルボキシル末端のグリシンが欠失したＬＣ３タンパク質とが融合されている融合タンパク質を発現するゼブラフィッシュを以下のようにして作製した。
前記第１のタグ、ＬＣ３タンパク質、第２のタグ、及びＬＣタンパク質のカルボキシル末端のグリシンが欠失したＬＣ３タンパク質をコードする核酸は、実施例１と同様のものを用いた。
前記第１のタグ、ＬＣ３タンパク質、第２のタグ、及びＬＣタンパク質のカルボキシル末端のグリシンが欠失したＬＣ３タンパク質をコードする核酸をこの順にｐＴ２ＡＬ２００Ｒ１５０Ｇベクター（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ． ２００６ Ｏｃｔ；１７４（２）：６３９−４９． ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｍｃ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ＰＭＣ１６０２０６７／）のＢａｍＨＩサイトに挿入した（以下、「ｐＴ２ＡＬ２００Ｒ１５０Ｇ−ＧＦＰ−ＬＣ３−ＲＦＰ−ＬＣ３ΔＧベクター」と称することがある）。
ｐＣＳ２−Ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅベクター（Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ． ２００４ Ｊｕｌ；７（１）：１３３−４４． ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ／１５２３９９６１）を鋳型とし、ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ（登録商標） ＳＰ６ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社製）を用いて、トランスポザーゼのｍＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写合成し、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてｍＲＮＡを精製した。
ゼブラフィッシュ（理化学研究所 ＲＷ株、明期１４時間、暗期１０時間、２８℃で飼育）を交配させて受精卵を準備し、１細胞期の胚に約１００ｐｇの前記ｐＴ２ＡＬ２００Ｒ１５０Ｇ−ＧＦＰ−ＬＣ３−ＲＦＰ−ＬＣ３ΔＧベクターと、約１００ｐｇの前記トランスポザーゼのｍＲＮＡとを、フェムトジェット（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製）及びフェムトチップＩＩ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製）を用いて実体顕微鏡下でマイクロインジェクションし、２８℃のインキュベーターで飼育した。
その後、約３ヶ月間にわたってブラインシュリンプ及び人工餌（ひかりラボ１３０、ひかりラボ４５０（ＭＥＩＴＯ ｓｙｓｔｅｍ）を与えて飼育した。
トランスジェニック候補ゼブラフィッシュの成魚を野生型ゼブラフィッシュ（理化学研究所 ＲＷ株）と交配し、受精後２４時間後の胚をガラスボトムディッシュに移し、０．０２％ トリカイン（Ｓｉｇｍａ社製）麻酔下で、共焦点顕微鏡（オリンパスＦＶ１０００−ＩＸ８１、オリンパス株式会社製）、対物レンズ（１０×、又は３０×、オリンパス株式会社製）、レーザー（４７３ｎｍ、５５９ｎｍ）を用いて観察し、ＧＦＰシグナル及びＲＦＰシグナルの両方を認めた場合、その親を第１のタグを含むＬＣ３タンパク質と、第２のタグを含み、ＬＣ３タンパク質のカルボキシル末端のグリシンが欠失したＬＣ３タンパク質とが融合されている融合タンパク質を発現するトランスジェニックゼブラフィッシュ（以下、「ＧＦＰ−ＬＣ３−ＲＦＰ−ＬＣ３ΔＧトランスジェニックゼブラフィッシュ」と称することがある）と判定した。
＜受精卵の観察＞
前記ＧＦＰ−ＬＣ３−ＲＦＰ−ＬＣ３ΔＧトランスジェニックゼブラフィッシュのメスと、野生型ゼブラフィッシュのオス（理化学研究所 ＲＷ株）とを交配させて受精卵を準備し、受精２．４時間後、卵殻を残した状態の胚をガラスボトムディッシュに移し、１０分毎に同一視野のＧＦＰ蛍光シグナル、ＲＦＰ蛍光シグナルを撮影した。また、画像処理ソフトウェアＩｍａｇｅＪ（フリーソフトウェア）を用いて細胞塊領域のシグナルを定量し、ＧＦＰ／ＲＦＰレシオを求め、測定開始時のレシオを１とした場合の各時間における比率をグラフ化した。結果を図６Ａ〜図６Ｃに示す。
図６Ａは、図６Ｂに示された撮影した部分の説明するための図であり、図６Ａ中の四角で囲んだ部分が撮影した部分である。
図６Ｂは、受精２．４時間後以降のゼブラフィッシュ胚の同一視野の細胞塊と卵黄を１０分毎に撮影した結果を示す図であり、ＧＦＰ−ＬＣ３はＧＦＰ蛍光シグナルを撮影した結果を示し、ＲＦＰ−ＬＣ３ΔＧはＲＦＰ蛍光シグナルを撮影した結果を示す。ＭｅｒｇｅはＧＦＰ蛍光シグナルと、ＲＦＰ蛍光シグナルとを重ねた結果を示す。
図６Ｃは、細胞塊領域のＧＦＰシグナルとＲＦＰシグナルとのＧＦＰ/ＲＦＰレシオを示す。なお、ＧＦＰ／ＲＦＰレシオが低いほど、オートファジー活性が高いことを示す。
図６Ｂ〜図６Ｃの結果から、ＧＦＰ−ＬＣ３−ＲＦＰ−ＬＣ３ΔＧトランスジェニックゼブラフィッシュのメスを用いることで、受精後に生理的に誘導されるオートファジーの活性を測定出来ることが示された。
（実施例９：フローサイトメトリー法；未クローニング）
フローサイトメトリー法を用い、（１）第１のタグを含むＬＣ３タンパク質と、第２のタグを含み、ＬＣ３タンパク質のカルボキシル末端のグリシンが欠失したＬＣ３タンパク質とが融合されている融合タンパク質と、（２）第１のタグを含むＬＣ３タンパク質と、第２のタグとが融合されている融合タンパク質とを以下のようにして比較した。
＜（１）第１のタグを含むＬＣ３タンパク質と、第２のタグを含み、ＬＣ３タンパク質のカルボキシル末端のグリシンが欠失したＬＣ３タンパク質変異体とが融合されている融合タンパク質を発現する線維芽細胞の調製＞
前記実施例１において、シングルクローンの単離を行わなかった以外は、実施例１と同様にして、第１のタグを含むＬＣ３タンパク質と、第２のタグを含み、ＬＣ３タンパク質のカルボキシル末端のグリシンが欠失したＬＣ３タンパク質変異体とが融合されている融合タンパク質を発現する線維芽細胞（未クローン）を調製した。
＜（２）第１のタグを含むＬＣ３タンパク質と、第２のタグとが融合されている融合タンパク質を発現する線維芽細胞の調製＞
前記実施例１において、核酸を以下の核酸に代え、シングルクローンの単離を行わなかった以外は、実施例１と同様にして、第１のタグを含むＬＣ３タンパク質と、第２のタグとが融合されている融合タンパク質を発現する線維芽細胞（未クローン）を調製した。
［核酸］
−第１のタグ−
緑色蛍光タンパク質（以下、「ＥＧＦＰ」、又は「ＧＦＰ」と称することがある）遺伝子。
−ＬＣ３タンパク質−
ラットＬＣ３ＢのｃＤＮＡ（１塩基〜３６０塩基）。
−第２のタグ−
単量体赤色蛍光タンパク質（以下、「ｍＲＦＰ」、又は「ＲＦＰ」と称することがある）遺伝子。
前記第１のタグ、ＬＣ３タンパク質、及び第２のタグをコードする核酸は、この順に、レトロウイルスベクターであるｐＭＲＸ−ＩＰベクターのＢａｍＨＩサイトに挿入した。
なお、前記第１のタグ、ＬＣ３タンパク質、及び第２のタグをコードする核酸をこの順に有する核酸の塩基配列は、配列番号：２に記載の通りである。配列番号：２中、１番目〜７１７番目の塩基は前記第１のタグをコードする塩基配列であり、７８１番目〜１，１４０番目の塩基は前記ＬＣ３タンパク質をコードする塩基配列であり、１，１４１番目〜１，８１８番目の塩基は第２のタグをコードする塩基配列である。なお、配列番号：２中、７１８番目〜７８０番目は、リンカーとなるアミノ酸をコードする塩基配列である。
＜フローサイトメトリー＞
前記（１）第１のタグを含むＬＣ３タンパク質と、第２のタグを含み、ＬＣ３タンパク質のカルボキシル末端のグリシンが欠失したＬＣ３タンパク質変異体とが融合されている融合タンパク質を発現する線維芽細胞、及び（２）第１のタグを含むＬＣ３タンパク質と、第２のタグとが融合されている融合タンパク質を発現する線維芽細胞のそれぞれについて、ＰＢＳで洗浄した後、通常培地（１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ社製）、富栄養条件）、又は飢餓培地（アミノ酸非含有ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、飢餓条件）で１２時間培養した。
前記培養後、０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡで回収した細胞を遠心分離法で回収し、４％パラホルムアルデヒドを加えて懸濁し、氷上で１０分間インキュベートした。その後、固定した細胞を冷したＰＢＳで洗浄し、遠心して上清を除き、再度冷やしたＰＢＳで懸濁した。
セルアナライザー（ＥＣ８００、Ｓｏｎｙ社製）で各細胞の蛍光強度を測定し、解析ソフトウェア（Ｋａｌｕｚａ， Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いてデータ解析を行った。ＧＦＰ、ＲＦＰ解析には、４８８ｎｍ、及び５６１ｎｍレーザーをそれぞれ使用した。結果を図７Ａ〜図７Ｈに示す。
図７Ａ〜図７Ｄは、前記（１）第１のタグを含むＬＣ３タンパク質と、第２のタグを含み、ＬＣ３タンパク質のカルボキシル末端のグリシンが欠失したＬＣ３タンパク質変異体とが融合されている融合タンパク質を発現する線維芽細胞について測定した結果を表し、図７Ｅ〜図７Ｈは、前記（２）第１のタグを含むＬＣ３タンパク質と、第２のタグとが融合されている融合タンパク質を発現する線維芽細胞について測定した結果を示す。
図７Ａ及び図７Ｅは、ＧＦＰの蛍光強度を測定し、解析した結果を示し、図７Ｂ及び図７Ｆは、ＲＦＰの蛍光強度を測定し、解析した結果を示す。図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｅ、及び図７Ｆにおける横軸は蛍光強度を表し、縦軸はイベント数を表す。
図７Ｃ及び図７Ｇは、富栄養条件で培養した場合の結果を示し、図７Ｄ及び図７Ｈは、飢餓条件で培養した場合の結果を示す。図７Ｃ、図７Ｄ、図７Ｇ、及び図７Ｈにおける横軸はＲＦＰの蛍光強度を表し、縦軸はＧＦＰの蛍光強度を表す。
図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｅ、及び図７Ｆの結果から、ＧＦＰの蛍光強度は、飢餓条件において減少していたが、ＲＦＰの蛍光強度は、飢餓条件でも変化していないことが確認された。
また、図７Ｇ及び図７Ｈの結果から、前記（２）第１のタグを含むＬＣ３タンパク質と、第２のタグとが融合されている融合タンパク質を発現する線維芽細胞では、全ての細胞でＧＦＰの蛍光の選択的な減少が観察された。一方、図７Ｃ及び図７Ｄの結果から、前記（１）第１のタグを含むＬＣ３タンパク質と、第２のタグを含み、ＬＣ３タンパク質のカルボキシル末端のグリシンが欠失したＬＣ３タンパク質変異体とが融合されている融合タンパク質を発現する線維芽細胞では、２つのＬＣ３タンパク質の配列間の相同組換えによって生じた「ＧＦＰ−ＬＣ３タンパク質変異体」を含む集団が観察され（図７Ｄの点線で囲んだ部分）、相同組換えの起こっていない細胞をクローン化した方がより好ましいことが判明した。
したがって、前記（２）第１のタグを含むＬＣ３タンパク質と、第２のタグとが融合されている融合タンパク質のほうが、前記（１）第１のタグを含むＬＣ３タンパク質と、第２のタグを含み、ＬＣ３タンパク質のカルボキシル末端のグリシンが欠失したＬＣ３タンパク質変異体とが融合されている融合タンパク質よりも利便性が高いことが示された。
以上の結果から、第１のタグと第２のタグとの残存比によって、ＬＣ３タンパク質の合成量の変動の影響を受けずに、簡便にオートファジーの活性を正確、かつ定量的に測定できることが示された。
本発明の融合タンパク質、核酸、ベクター、細胞、及びトランスジェニック非ヒト生物は、オートファジーの活性測定キットやオートファジー関連創薬におけるスクリーニング方法の手段として好適に利用可能である。
本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
＜１＞ 第１のタグを含むＬＣ３タンパク質と、第２のタグを含むタンパク質とが融合されていることを特徴とする融合タンパク質である。
＜２＞ 細胞内の内因性酵素であるＡＴＧ４によって、第１のタグを含むＬＣ３タンパク質と、第２のタグを含むタンパク質とに切断される前記＜１＞に記載の融合タンパク質である。
＜３＞ アミノ末端からカルボキシル末端へ、第１のタグと、ＬＣ３タンパク質と、第２のタグを含むタンパク質とをこの順に含む前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の融合タンパク質である。
＜４＞ 第２のタグを含むタンパク質が、第２のタグからなる前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の融合タンパク質である。
＜５＞ 第２のタグを含むタンパク質が、第２のタグを含み、ＬＣ３タンパク質のカルボキシル末端のグリシンが欠失若しくは置換されたＬＣ３タンパク質変異体である前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の融合タンパク質である。
＜６＞ アミノ末端からカルボキシル末端へ、第２のタグと、ＬＣ３タンパク質のカルボキシル末端のグリシンが欠失若しくは置換されたＬＣ３タンパク質変異体とをこの順に含む前記＜５＞に記載の融合タンパク質である。
＜７＞ 前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする塩基配列を含むことを特徴とする核酸である。
＜８＞ 前記＜７＞に記載の核酸を含むことを特徴とするベクターである。
＜９＞ 前記＜７＞に記載の核酸、及び前記＜８＞に記載のベクターの少なくともいずれかが導入されたことを特徴とする細胞である。
＜１０＞ 前記＜７＞に記載の核酸、及び前記＜８＞に記載のベクターの少なくともいずれかが導入されたことを特徴とするトランスジェニック非ヒト生物である。
＜１１＞ 前記＜９＞に記載の細胞、及び前記＜１０＞に記載のトランスジェニック非ヒト生物の少なくともいずれかを用いることを特徴とするオートファジーの測定方法である。

Claims (11)

  1. 第１のタグを含むＬＣ３タンパク質と、第２のタグを含むタンパク質とが融合されていることを特徴とする融合タンパク質。
  2. 細胞内の内因性酵素であるＡＴＧ４によって、第１のタグを含むＬＣ３タンパク質と、第２のタグを含むタンパク質とに切断される請求項１に記載の融合タンパク質。
  3. アミノ末端からカルボキシル末端へ、第１のタグと、ＬＣ３タンパク質と、第２のタグを含むタンパク質とをこの順に含む請求項１から２のいずれかに記載の融合タンパク質。
  4. 第２のタグを含むタンパク質が、第２のタグからなる請求項１から３のいずれかに記載の融合タンパク質。
  5. 第２のタグを含むタンパク質が、第２のタグを含み、ＬＣ３タンパク質のカルボキシル末端のグリシンが欠失若しくは置換されたＬＣ３タンパク質変異体である請求項１から３のいずれかに記載の融合タンパク質。
  6. アミノ末端からカルボキシル末端へ、第２のタグと、ＬＣ３タンパク質のカルボキシル末端のグリシンが欠失若しくは置換されたＬＣ３タンパク質変異体とをこの順に含む請求項５に記載の融合タンパク質。
  7. 請求項１から６のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする塩基配列を含むことを特徴とする核酸。
  8. 請求項７に記載の核酸を含むことを特徴とするベクター。
  9. 請求項７に記載の核酸、及び請求項８に記載のベクターの少なくともいずれかが導入されたことを特徴とする細胞。
  10. 請求項７に記載の核酸、及び請求項８に記載のベクターの少なくともいずれかが導入されたことを特徴とするトランスジェニック非ヒト生物。
  11. 請求項９に記載の細胞、及び請求項１０に記載のトランスジェニック非ヒト生物の少なくともいずれかを用いることを特徴とするオートファジーの測定方法。
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