KR101680819B1 - 핵 단백질을 특이적으로 분해하는 조성물 및 그 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 핵 단백질을 특이적으로 분해하는 조성물 및 그 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 본 발명의 Ab-SPOP 라이게이즈는 GFP 또는 GFP 유도체를 가지는 인-프레임 융합 단백질을 포함하는 모든 녹-인-생물체의 핵에서 선택적으로 단백질을 파괴하는데 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 핵 단백질을 특이적으로 분해하는 조성물 및 그 방법에 관한 것이다.
단백질 발현을 조작하는 대부분의 방법은 DNA 또는 RNA 레벨에서 작동한다. 트랜스진 발현 이외에, 코딩 또는 조절 유전자를 돌연변이하거나 결손시키는 방법들이 통상적으로 세포 단백질 레벨을 변경하는데 사용된다. mRNA 전사체는 RNAi(RNA interference) 또는 Morpholino-modified 올리고뉴크레오타이드에 의하여 타겟될 수 있다[Fire, A. et al. Nature 391, 806-811 (1998);Summerton, J. & Weller, D. Antisense & nucleic acid drug development 7, 187-195 (1997)].
이러한 기술들은 유전자 변형없이 단백질 발현을 감소시키지만 오프-타겟 효과, 즉시 가역성의 결핍, 장수 단백질(long-lived protein)을 파괴하는데 비효율성에 의하여 제한된다[Jackson, A.L. & Linsley, P.S. Nature reviews. Drug discovery 9, 57-67 (2010);Kok, F.O. et al. Developmental cell (2014)].
*이러한 한계를 극복하기 위하여, 여러 방법이 특정 단백질들을 직접적으로 분해하기 위하여 개발되었다. 이 방법들은 태그된 단백질의 분해를 유도하는 여러 불안정화 도메인의 부가를 포함하고 약제나 빛의 적용을 수반한다[Renicke, C., Schuster, D., Usherenko, S., Essen, L.O. & Taxis, C. A Chem Biol 20, 619-626 (2013);Bonger, K.M., Chen, L.C., Liu, C.W. & Wandless, T.J. Nat Chem Biol 7, 531-537 (2011);Banaszynski, L.A., Sellmyer, M.A., Contag, C.H., Wandless, T.J. & Thorne, S.H. Nature medicine 14, 1123-1127 (2008)]. 또는, Ubiquitin- 의존적인 프로테오좀은 특정 E3 ubiquitin 인지 도메인을 가지고 태그된 특정 단백질 타겟을 분해하는데 이용될 수 있다[Armenti, S.T., Lohmer, L.L., Sherwood, D.R. & Nance, J. Development 141, 4640-4647 (2014);Holland, A.J., Fachinetti, D., Han, J.S. & Cleveland, D.W. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109, E3350-3357 (2012)].
이 방법들은 모두 태깅 도메인을 도입하기 위하여 타겟 단백질의 유전적 조작을 요한다.
[선행 특허 문헌]
대한민국공개특허 10-2015-0010935호
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 타겟 특히 핵 단백질을 특이적으로 분해하는 새로운 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 나노바디(nanobody)를 유비퀴틴(ubiquitin) 라이게이즈(ligase) 복합체의 어댑터 단백질인 SPOP(Speckle-type POZ protein)에 융합하여 세포에서 핵 단백질을 특이적으로 파괴하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 나노바디는 녹색 형광 단백질(GFP)에 대한 항체인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 나노바디는 SPOP(Speckle-type POZ protein) 단백질의 167번에서 374번 잔기의 단백질 절편과 융합되는 것이 바람직하고, 상기 절편은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 SPOP(Speckle-type POZ protein)은 기질 결합 단백질과 상호작용하기 위하여 필요한 도메인이 결손되고, Cullin에 결합하기 위한 도메인을 보존된 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 방법은 나노바디와 SPOP(Speckle-type POZ protein) 단백질의 융합체를 발현하는 벡터를 세포에 주입하여 수행하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 나노바디(nanobody)를 유비퀴틴(ubiquitin) 라이게이즈(ligase) 복합체의 어댑터 단백질인 SPOP(Speckle-type POZ protein)에 융합한 융합체를 유효성분으로 하는 핵 단백질을 특이적으로 파괴하는 조성물을 제공한다.
본 발명에서 나노바디란 싱글-도메인 항체로 싱글 모노머 가변 항체 도메인으로 구성된 항체 절편으로(Gibbs, W. Wayt (August 2005). "Nanobodies". Scientific American Magazine), 전체 항체와 같이 그들은 특정 항원에 선택적으로 결합할 수 있다. 단지 12-15 kDa의 분자량을 가지고 있어서, 통상적인 항체(150-160 kDa) 및 심지어는 Fab 절편(~50 kDa, 하나의 경쇄 및 절반의 중쇄) 및 scFv[single-chain variable fragments;~25 kDa, 두 가변 도메인, 하나는 경쇄 하나는 중쇄 유래]보다 더 작다.
나노바디 생산과 관련하여서는 Arbabi Ghahroudi, M.; Desmyter, A.; Wyns, L.; Hamers, R.; Muyldermans, S. (1997). "Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies". FEBS Letters 414 (3): 521-526. doi:10.1016/S0014-5793(97)01062-4. PMID 9323027. ;Saerens, D.; Ghassabeh, G.; Muyldermans, S. (2008). "Single-domain antibodies as building blocks for novel therapeutics". Current Opinion in Pharmacology 8 (5): 600-608. doi:10.1016/j.coph.2008.07.006. PMID 18691671; Holt, L. J.; Herring, C.; Jespers, L. S.; Woolven, B. P.; Tomlinson, I. M. (2003). "Domain antibodies: proteins for therapy". Trends in Biotechnology 21 (11): 484-490. doi:10.1016/j.tibtech.2003.08.007. PMID 14573361. 등을 참조.
SPOP(Speckle-type POZ protein)는 타겟 단백질의 유비퀴틴화를 매개하는 cullin-RING-기반 BCR (BTB-CUL3-RBX1) E3 ubiquitin-protein ligase 복합체의 구성요소로 그들의 프로테오좀 분해를 유발한다. CUL3와 복합체에서, BRMS1, DAXX, PDX1/IPF1, GLI2 및 GLI3의 유비퀴틴화 및 프로테오좀 분해에 관여한다[Furukawa M., He Y.J., Borchers C., Xiong Y.Nat. Cell Biol. 5:1001-1007(2002)]
이하 본 발명을 설명한다.
타겟된 단백질 분해는 특정 단백질 또는 단백질 복합체의 기능을 결정하는 강력한 방법이다. 본 발명자들은 나노바디(nanobodies)를 Cullin-RING E3 ubiquitin 리게이즈 복합체의 어댑터 단백질인 SPOP에 융합하여 포유류 세포 및 제브라피쉬 배아에서 특정 핵 단백질의 신속한 파괴를 야기하였다. 이러한 방법은 용이하게 변형이 가능하고, 항체 도메인에 의하여 부여되는 기질 특이성으로 단백질을 타겟하기 위해서 채택될 수 있다.
본 발명자들은 E3 ubiquitin ligase 어댑터 단백질 SPOP의 기질 특이성을 변형하여 타겟 핵 단백질을 분해하는 새로운 방법을 기재하고 그것이 deGradFP 시스템보다 더 효율적이라는 것을 기재한다.
본 발명자들은 deGradFP 방법이 histone H2B (H2B)-GFP를 발현하는 안정한 세포주에서 빈약하게 작동하는 것을 발견하였고(도 1), 그래서 본 발명자들은 몇 종 신규 인공 E3 ligases를 고안하고 GFP 분해에 대해 이것을 테스트하였다(도 4). Cullin-RING E3 ubiquitin ligase (이하, 'CRL'이라 함) 복합체를 그들이 200 멤버 이상을 가지는 가장 큰 E3 ligases 패밀리이고 3차원 구조 및 기능 도메인이 잘 규명되었고 직접적으로 타겟 단백질에 E2 효소로부터 유비퀴틴을 전달하기 때문에 인공적인 라이게이즈를 고안하기 위한 골격으로 선택하였다. Cullin의 C-말단 부위는 RING 단백질에 결합하고 N-말단 부위는 어댑터 단백질(Cul1에 대해 Skp1, Cul2/5에 대해 Elongin B/C, Cul3에 대해 BTB, 및 Cul4에 대해 DDB1)과 링크한다.
본 발명의 인공 라이게이즈에서 E3 활성을 증가시키기 위하여, GFP 나노바디(nanobody)를 기질 결합 단백질과 상호작용하기 위하여 필요한 도메인이 결손된 그러나 Cullin에 결합하기 위한 도메인을 그러하지 않은 트런케이트된 어댑터 단백질과 융합하였다(도 4). 따라서 천연 E3 라이게이즈에서 기질 인지 기능은 본 발명의 인공 라이게이즈에서 GFP 나노바디로 완전하게 대체되었다.
트랜지언트 트랜스펙션 실험에서 후보 라이게이즈를 발현하는 세포를 동정하기 위하여, 본 발명자들은 먼저 세포막상에 Myc 에피토프를 발현하는 인공 단백질(Myc10-TM) 또는 후보 라이게이즈 및 TagRFP 모두를 발현하는 테트라사이클린 처리된 것으로부터 양방향 프로모터를 포함하는 벡터를 구축하였다 (도 5). 본 발명자들은 H2B-GFP를 발현하는 293TetOn세포에 트랜스팩션 24시간 후 유동세포분석에 의하여 핵 H2B-GFP 형광을 측정하였고, 단지 인공 라이게이즈 vhhGFP4-SPOP (Ab-SPOP)로 트랜스팩션만이 Myc10-TM를 발현하는 세포에서 GFP 신호가 크게 감소(100배)한 것을 발견하였다(도 1a). 다른 후보 라이게이즈 중에서, NSlimb-vhhGFP4, deGradFP에서 개발된 인공 라이게이즈가 핵 H2B-GFP 신호가 약간 감소하였다(3 - 5 배), 그러나 단지 크게 발현된 Myc10-TM 양 방향 프로모터에서만 다른 인공 라이게이즈는 효과가 없었다. Ab-SPOP ligase, 또한 형광 현미경에 의하여 측정된 때 U2OS 세포에서 효과적으로 H2B-GFP를 파괴하였다(도 1b).
Ab-SPOP ligase는 테스트된 여섯 GFP 융합 단백질 모두를 분해하였다: cMyc-GFP (78 kDa), Pin1-GFP (46 kDa), Cdk4-GFP (61 kDa), Elf3-GFP (69 kDa), 및 GFP (27 kDa). 흥미롭게도, GFP는 세포 핵에서만 파괴된다; 핵 이외의 GFP는 영향이 없다 (도 6 및 7). 네 다른 GFP 나노바디 GBP1, 2, 6 및 7;GFP에서 다른 에피토프를 인지하는 것으로 알려짐(Tang, J.C. et al. Cell 154, 928-939 (2013))는 vhhGFP4의 위치에 Ab-SPOP ligases에 사용된 대 핵으로부터 H2B-GFP 및 GFP를 파괴하는데 효율적이다(도 8 및 9). 모든 경우에, Ab-SPOP ligase는 GFP 및 GFP 융합 단백질의 파괴를 doxycycline-유도된 발현 3시간 이내에 촉진하고 TagRFP 전에 epifluorescence 하에서 검출될 수 있었다(도 6-10). 따라서 Ab-SPOP는 여러 광범위한 스펙트럼의 크기의 GFP-융합 단백질들을 분해할 수 있다; 나노바디 도메인은 또한 변경될 수 있고 이것은 이 방법이 다른 타겟에 용이하게 적용할 수 있다는 것을 시사한다.
다음 본 발명자들은 표준 RNAi 방법으로 Ab-SPOP-매개된 타겟된 단백질 분해의 효율성을 비교하였다(도 2). 본 발명자들은 먼저 tetracycline-유도, 양방향 프로모터의 조절하에서 Ab-SPOP/TagRFP 뿐 아니라 CMV 프로모터로부터 H2B-GFP를 발현하는 안정한 세포주를 생성하였다. H2B-GFP 강도를 doxycycline으로 Ab-SPOP 발현을 유도하거나 GFP에 대한 siRNA의 처리 후 유동 세포분석법에 의하여 측정하였다. 본 발명자들은 GFP 발현을 저해하기 위하여 광범위하게 사용되는 siRNA 서열을 선택하였다[Caplen, N.J., Parrish, S., Imani, F., Fire, A. & Morgan, R.A. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98, 9742-9747 (2001)]. 예상한 것과 같이, RNAi 처리는 H2B-GFP 발현을 5 -10 배 넉다운하는데 72시간 이상이 소요되었다. 반면, Ab-SPOP 유도는 GFP 신호를 50배 이상 적용 12시간 이내에 감소시켰다(도 2). Ab-SPOP가 트랜지언트 트랜스팩션에 의하여 크게 발현될 때, H2B-GFP 레벨은 유도 3시간 후에 육안적으로 파괴되었다(도 10). 배지로부터 tetracycline를 회수한 후, H2B-GFP 형광 신호는 48시간 후 부분적으로 회복되었고 이것은 Ab-SPOP가 약 2일간 E3 ligase로 기능을 유지한다는 것을 시사한다(도 11).
Ab-SPOP가 E3 ubiquitin ligase로 작용하는 것을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 in vivo ubiquitination 어세이를 수행하였다. 동시면역침전은 Ab-SPOP 트랜스팩션이 그것의 분해를 야기하는 H2B-GFP에 폴리유비퀴틴의 부착을 야기한다는 것을 나타내었다(도 12a). 이것을 지지하여, Cullin과 SPOP 상호작용에 관여하는 3-박스 모티프의 결손(Ab-SPOP3 -box mutation)은 Ab-SPOP 활성을 파괴한다(도 13). 흥미롭게도, Ab-SPOP로부터 핵 위치 신호(NLS)의 제거는 H2B-GFP의 유비퀴틴화 및 핵 H2B-GFP의 파괴를 저해하지 아니하였고 (도 1b 및 도 12a), 이것은 Ab-SPOP가 내생적인 SPOP와 헤테로다이머를 형성하여 활성 E3 ligase 복합체를 형성한다는 것을 시사한다. 다음, Ab-SPOP 다이머화 도메인의 돌연변이(Ab-SPOPDDmutation)는 SPOP와 상호작용 및 H2B-GFP 분해를 저해한다( 도 12b 및 13). 최종적으로, NSL이 결손된 Ab-SPOP는 원형질에서가 아니라 세포 핵에서 여전히 타겟 단백질을 파괴한다 (도 6 -8).
Ab-SPOP가 인 비트로에서 신속하게 타겟 단백질을 파괴하기 때문에, 본 발명자들은 그것은 초기 배발생 동안 타겟 단백질을 파괴할 수 있다고 가정하였다. 본 발명자들은 인 비보에서 Ab-SPOP의 효과를 테스트하기 위하여 제브라피쉬 HMGA2-Citrine 넉-인 주 ct29a를 사용하였다. 호모지니어스 ct29a/ct29a 배아에 1-cell stage에서 Ab-SPOP mRNA (n= 251 배아, 7 독립적 실험)의 마이크로인젝션은 HMGA2-Citrine를 파괴하였으나, Abmutation-SPOP mRNA (n= 361 배아, 10 독립적 실험)는 그러하지 않았고(주사: 100 pg Ab-SPOP RNA; 10 pg TagRFP RNA) 초기 배발생에서 여러 결손을 야기하였다(도 3 및 표 1). 89%의 Ab-SPOP 처리된 배아들은 8-cell stage에서 난할에 손상을 가졌고(수정 후 1.25 시간 후, 모계 효과의 단계), 지연되거나 손상된 세포 이동에 의한 피포(epiboly) 및 낭배형성(gastrulation)에서 손상을 가지고, 배아의 전후 (anterior-posterior) 길이의 감축을 야기하였다(도 3). 심한 경우에, Ab-SPOP는 피포 동안 배아 사망을 야기하였다(도 3). 야생형 AB 배아로 Ab-SPOP (n = 137 배아, 3 독립적인 실험) 또는 Abmutation-SPOP mRNA (n = 317 배아, 6 독립적 실험)의 마이크로인젝션(주사: 100 pg Ab-SPOP RNA;10 pg TagRFP RNA/1-cell stage 배아)은 손상을 야기하지 않았다 (도 3 및 도 14). 이 실험들은 Ab-SPOP가 인 비보에서 GFP 융합 단백질들을 신속하게 파괴하고 제브라피쉬 발생 동안에 독성이 없다는 것을 시사한다.
표 1은 야생형 및 HMGA2:Citrine 넉-인 zebrafish 배아로 Ab-SPOP 및 Abmutation-SPOP RNAs의 주입과 관련된 표이다.
*110 pg의 capped mRNA (10 pg의 TagRFP mRNA 및 100 pg의 Ab-SPOP 또는 Abmut-SPOP mRNA)를 1 세포 스테이지에서 각 배아에 주사하였음; TagRFP 배아에서 110 pg의 mRNA를 주사함.
*표현형은 배발생 동안 스코어하였고 % 비정상 배아로 나타내었다. 발생 손상은 주로 낭배형성 동안 세포 이동, 피포 및 난할 동안 관찰되었다. 배아들은 후기 단계의 발생 문제를 평가하기 위하여 낭배형성 2일 후에 관찰하였다.
본 발명의 Ab-SPOP 라이게이즈는 GFP 또는 GFP 유도체를 가지는 인-프레임 융합 단백질을 포함하는 모든 녹-인-생물체의 핵에서 선택적으로 단백질을 파괴하는데 사용될 수 있다.
도 1은 인공 E3 ligase 후보들의 트랜지언트 트랜스팩션 후 H2B-GFP 발현의 FACS 및 현미경 분석을 나타낸 그림. (a) 여러 인공 E3 ligase 후보들로 트랜지언트 트랜스팩션된 H2B-GFP/293TetOn 안정 세포주의 FACS분석. 트랜스팩션 후, Myc10-TM 및 각 후보 라이게이즈가 doxycycline 처리를 수반하는 양방향 TRE(tetracycline response element) 프로모터로부터 동시적으로 발현되었다(도 5). vhhGFP4는 GFP에 대한 싱글 도메인 항체 절편인 나노바디이다(Ries J, Kaplan C, Platonova E, Eghlidi H, Ewers H. Nat Methods. 2012;9:582-4 ). NSnoFbox는 Skp1-Cullin1-F-box E3 ubiquitin 라이게이즈 복합체에서 어댑터 단백질에 결합하는데 필요한 F-박스 도메인을 결손하여 NSlimb 로부터 유도하였다. '-'는 후보 E3 라이게이즈 없는 Myc10-TM의 발현을 나타낸다. 단지 vhhGFP4-SPOP E3 라이게이즈만이 Myc10-TM를 발현하는 세포에서 H2B-GFP를 크게 파괴한다. (b) 인공 E3 ligase 후보들로 트랜지언트 트랜스팩션된 H2B-GFP/U2OS 안정 세포주의 현미경 분석. Doxycycline (1 ug/ml)를 각 라이게이즈 후보 및 TagRFP의 발현을 촉진하기 위하여 24시간 동안 처리하였다. 각 패널은 명시야, TagRFP (적색), H2B-GFP (녹색)를 나타내고, TagRFP 및 H2B-GFP 모두의 이미지를 통합하였다. 단지 vhhGFP4-SPOP 또는 vhhGFP4-SPOP△NLS만이 Myc10-TM를 발현하는 세포에서 H2B-GFP 파괴 때문에 합쳐진 이미지에서 노란 핵 이미지가 없었다.
도 2는 RNAi 및 Ab-SPOP E3 라이게이즈 매개된 H2B-GFP 파괴의 비교. 양방향 TRE 프로모터로부터 Ab-SPOP/TagRFP 및 CMV 프로모터로부터 H2B-GFP를 발현하는 293TetOn 세포주를 실험에 사용하였다. doxycycline 부존재에서 0, 8, 12, 48, 72, 및 96 시간 동안 GFP siRNA (40 nM) 처리 후 , 세포를 FACS에 의하여 H2B-GFP 발현에 대해서 분석하였다. Doxycycline (1 ug/ml)를 H2B-GFP 발현의 FACS 분석을 위하여 0, 4, 8, 12 시간 동안 첨가하였다.
도 3은 zebrafish 배아에서 HMGA2-Citrine의 타겟된 파괴를 나타냄. (a) 야생형 Ab-SPOP 또는 돌연변이 Ab(mut)-SPOP (vhhGFP4 나노바디의 CDR3 부위의 결손)의 mRNA를 HMGA2-citrine 단백질(homozygous ct29a/ct29a)를 발현하는 1-세포 단계 제브라피쉬 배아에 주사하였다. Tag-RFP mRNA를 주사 대조군으로 동시에 주입하였다. Ab-SPOP 발현은 HMGA2-Citrine를 파괴하고, 난할 동안 비정상적인 세포 분열,피포 동안 연기된 세포 이동 및 긍극적으로 배아 사망과 같은 발생학적 손상을 야기하였다 . 반면, Ab(mut)-SPOP mRNA로 주사된 배아는 HMGA2-Citrine 레벨에 영향이 없었고 배아 발생을 손상시키지 않았고 이것은 Ab-SPOP 활성이 발생학적 표현형을 야기하는 HMGA2-Citrine 단백질의 분해를 직접적으로 촉진한다는 것을 시사한다. (b) Ab-SPOP의 독성을 야생형 배아에 Ab-SPOP mRNA를 주사하여 테스트하였다. 배아 발생은 Supplementary 도11에 나타낸 것과 같이 정상적이었다. 주사된 AB 및 ct29a/ct29a의 표현형을 표 1에 요약하였다. 'n'은 수회의 주사 실험으로부터 전체 배아 수를 나타낸다.
도 4는 인공 E3 ubiquitin ligase 후보들의 고안. deGradFP 프로토콜에서, anti GFP 나노바디(vhhGFP4)를 CRL1 E3 ligase 복합체의 NSlimb와 융합하였다. 본 발명자들은 anti-GFP 나노바디(nanobody)를 어댑터 단백질에 융합하여 인공 E3 ubiquitin ligase 후보들을 제조하였다: CRL1에 대해 Skp 1; CRL2/5에 대해 Elongin C;CRL3에 대해 Keap1 및 SPOP ; 및 CRL4에 대해 DDB1. 각 라이게이즈 후보에서, 기질 결합 단백질과 상호작용에 필요한 도메인을 나노바디로 대체하였음.
도 5는 양방향 doxycycline-inducible 프로모터가 인공 E3 ligases 및 Myc10-TM의 동시 발현을 가능하게 하는 것을 나타낸 그림. (a) 각 벡터는 양방향 TRE(tetracycline response element) 프로모터, rtTA3(tetracycline repressor A3), 및 TagRFP 또는 Myc10-TM 트래이서(Myc 에피토프-막횡단 도메인의 10 탠덤 리피트)를 포함. (b) doxycycline 처리 후, Myc10-TM는 anti-Myc 1차 항체(9E10) 및 Alexa568-컨쥬게이트된 항-마우스 2차 항체로 면역염색 후 형광 현미경에 의하여 세포막에서 검출됨.
도 6은 Ab-SPOP에 의한 원형질이 아니라 핵에서 GFP의 파괴를 나타낸 그림. GFP를 발현하는 293TetOn 세포를 양방향 TRE 프로모터 유래 Ab-SPOP△ NLS 또는 Abmutation-SPOP△NLS 를 발현하는 벡터로 트랜스팩션함. '-'는 트랜스팩션되지 않은 세포를 나타냄. TagRFP의 발현 및 GFP의 파괴는 배지에 doxycycline (1 ug/ml)를 첨가한 후에 측정함. TagRFP를 doxycycline에 의한 TRE 프로모터의 유도 약 8시간 후에 먼저 검출됨. 황색 화살표는 GFP가 원형질이 아니라 핵에서 파괴된 세포를 나타냄. GFP의 핵 파괴는 TRE 프로모터의 활성화 3시간 후에 시작하여 Ab-SPOP로 트랜스팩션된 세포에서만 관찰됨.
도 7은 Ab-SPOP에 의한 핵에서 GFP-융합 단백질의 선택적인 파괴를 나타낸 그림. Cdk4-GFP, Elf3-GFP, cMyc-GFP, 또는 Pin1-GFP를 발현하는 293TetOn 세포를 양방향 TRE 프로모터 유래 Ab-SPOP△ NLS 또는 Abmutation-SPOP△ NLS 양방향 TRE 프로모터를 발현하는 벡터로 트랜스팩션함. '-'는 트랜스팩션되지 않은 세포를 나타냄. TagRFP의 발현 및 GFP의 파괴는 배지에 doxycycline (1 ug/ml)를 첨가한 후에 측정함. 원형질이 아니라 핵에서 선택적인 GFP의 파괴는 Ab-SPOP로 트랜스팩션된 세포에서만 관찰됨.
도 8은 GFP에 대한 다른 나노바디로 제조된 에 의한 Ab-SPOP E3 라이게이즈에 의한 핵 GFP의 선택적 파괴를 나타낸 그림. GFP를 발현하는 293TetOn 세포를 양방향 TRE 프로모터 유래 네 다른 Ab-SPOP△ NLS 라이게이즈(GBP1-SPOP, GBP2-SPOP, GBP6-SPOP, 및 GBP7-SPOP)를 발현하는 벡터로 트랜스팩션하였다. TagRFP의 발현 및 GFP의 파괴는 배지에 doxycycline (1 ug/ml)를 첨가한 후 8시간 후에 측정함. 원형질이 아니라 핵 GFP가 파괴되는 세포를 황색 화살표로 나타냄.
도 9는 대체 GFP 나노바디로 제조된 Ab-SPOP E3 라이게이즈에 의한 H2B-GFP 파괴를 나타낸 그림. H2B-GFP를 발현하는 293TetOn 세포를 양방향 TRE 프로모터 유래 네 다른 Ab-SPOP△ NLS 라이게이즈(GBP1-SPOP, GBP2-SPOP, GBP6-SPOP, 및 GBP7-SPOP)를 발현하는 벡터로 트랜스팩션하였다. TagRFP의 발현 및 H2B-GFP의 파괴는 배지에 doxycycline (1 ug/ml)를 첨가한 후 8시간 후에 측정함. 원형질이 아니라 핵 GFP가 파괴되는 세포를 황색 화살표로 나타냄.
합쳐진 Hoechst/H2B-GFP 패널에서 청색 신호는 파괴된 핵 H2B-GFP를 가지는 세포를 나타냄. TagRFP를 발현하는 모든 세포는 파괴된 H2B-GFP를 가졌으나, 파괴된 H2B-GFP를 가지는 일부 세포들은 TagRFP를 발현하지 않았고, 이것은 TRE 프로모터 활성 3시간 후에 핵 파괴가 시작된다는 결과와 일치.
도 10은 Ab-SPOP에 의한 H2B-GFP 파괴의 시간 경과를 나타낸 그림. H2B-GFP를 발현하는 293TetOn 세포를 양방향 TRE 프로모터 유래 Ab-SPOP 라이게이즈(vhhGFP4-SPOP) 또는 Abmutation-SPOP를 발현하는 벡터로 트랜스팩션함. TagRFP의 발현 및 H2B-GFP의 파괴는 배지에 doxycycline (1 ug/ml)를 첨가한 후 측정함. H2B-GFP의 파괴를 가지는 핵을 황색 화살표로 나타냄.
TagRFP는 먼저 doxycycline-매개된 TRE 프로모터 활성화 약 8시간 후에 검출된다. 핵 H2B-GFP의 파괴는 TRE 프로모터 활성화 3시간 후에 시작하고 Abmutation-SPOP가 아니라 Ab-SPOP로 트랜스팩션된 세포에서 관찰됨.
도 11은 Ab-SPOP의 가역성을 나타냄. 양방향 TRE 프로모터 유래 Ab-SPOP/TagRFP 및 CMV 프로모터 유래 H2B-GFP를 발현하는 293TetOn 세포는 doxycycline 회수 후 H2B-GFP 신호를 회복함. (a) doxycycline없는 배지에서 60시간 성장한 세포. (b) doxycycline (1 ug/ml) 함유한 배지에서 60시간 성장한 세포. 배지를 24시간 마다 교체. (c) 세포를 doxycycline (1 ug/ml)로 12시간 처리한 후 doxycycline없는 배지로 교체함. 배지를 24시간 마다 교체. doxycycline없는 배지에서 48시간 후, H2B-GFP 신호를 부분적으로 회복함.
도 12는 SPOP/Ab-SPOP 다이머에 의한 H2B-GFP의 유비퀴틴화. (a) (i) CMV 프로모터 유래 H2B-GFP (ii) CMV 프로모터 유래 H2B-GFP 및 TRE 프로모터 유래 FLAG-Ab-SPOP (iii) CMV 프로모터 유래 H2B-GFP 및 TRE 프로모터 유래 FLAG-Ab-SPOP△NLS를 발현하는 293TetOn 세포. 모두를 HA-ubiquitin 플라즈미드로 트랜지언트하게 트랜스팩션시킨 후, TRE 프로모터를 doxycycline 처리로 활성화시켰다. 조 세포 추출물을 조제하고 anti-GFP 및 액틴 항체로 웨스턴 블럿팅 분석을 하여 Ab-SPOPs에 의한 H2B-GFP의 분해를 측정하였다. 동일한 추출물을 anti-GFP 항체로 면역침전을 하고 anti-HA로 웨스틴 블럿팅을 하여 인 비보 H2B-GFP 유비퀴틴화 어세이에 사용하였다. (b) Ab-SPOP로 SPOP의 동시면역침전. Myc 에피토프로 태그된 SPOP(Myc-SPOP)를 FLAG-Ab-SPOP 또는 FLAG-Ab-SPOPDD mutation으로 HEK 293T 세포에서 동시트랜스팩션하였다. DDmutation은 SPOP를 호모다이머 형성하는 것을 저해한다. anti-Myc 항체로 면역침전 후, 웨스턴 블럿팅을 anti-Myc 및 FLAG 항체로 수행하였다. 블럿은 Ab-SPOP가 SPOP와 DD 도메인을 통하여 상호작용을 한다는 것을 나타냄.
도 13은 Ab-SPOPDDmutation 및 Ab-SPOP3 -box mutation은 핵 H2B-GFP를 파괴하지 않는다는 것을 나타낸 그림. H2B-GFP를 발현하는 293TetOn 세포를 양방향 TRE 프로모터 유래 Ab-SPOP, Ab-SPOPDDmutation, 및 Ab-SPOP3 -box mutation 를 발현하는 벡터로 트랜스팩션함. (a) Ab-SPOP는 TagRFP를 발현하는 세포에서 핵 H2B-GFP의 파괴를 야기함(황색 화살표). (b) Ab-SPOPDDmutation은 TagRFP를 발현하는 세포에서 핵 H2B-GFP의 파괴를 야기하지 않음(황색 화살표). 이것은 Ab-SPOP 다이머화 도메인이 H2B-GFP의 파괴에 필수적이라는 것을 시사함. (c) Ab-SPOP3 -box mutation은 TagRFP를 발현하는 세포에서 핵 H2B-GFP의 파괴를 야기하지 않음(황색 화살표). 이것은 Ab-SPOP 3-box 도메인이 H2B-GFP의 파괴에 필수적이라는 것을 시사함. 그 3-box 도메인은 CRL3 E3 ligase 복합체에서 Cul3과 결합에 필요하고, Ab-SPOP가 E3 ubiquitin 라이게이즈 활성을 위하여 Cul3 단백질과 상호작용을 한다는 것을 시사함.
도 14는 Ab-SPOP mRNA로 주입된 AB 야생형 배아의 정상 발생을 나타낸 그림. Ab-SPOP 및 Abmut-SPOP mRNAs의 주입은 초기 배아발생 동안에 손상을 야기하지 아니한다. 데이터는 도 3 및 표 1에 요약.
도 2는 RNAi 및 Ab-SPOP E3 라이게이즈 매개된 H2B-GFP 파괴의 비교. 양방향 TRE 프로모터로부터 Ab-SPOP/TagRFP 및 CMV 프로모터로부터 H2B-GFP를 발현하는 293TetOn 세포주를 실험에 사용하였다. doxycycline 부존재에서 0, 8, 12, 48, 72, 및 96 시간 동안 GFP siRNA (40 nM) 처리 후 , 세포를 FACS에 의하여 H2B-GFP 발현에 대해서 분석하였다. Doxycycline (1 ug/ml)를 H2B-GFP 발현의 FACS 분석을 위하여 0, 4, 8, 12 시간 동안 첨가하였다.
도 3은 zebrafish 배아에서 HMGA2-Citrine의 타겟된 파괴를 나타냄. (a) 야생형 Ab-SPOP 또는 돌연변이 Ab(mut)-SPOP (vhhGFP4 나노바디의 CDR3 부위의 결손)의 mRNA를 HMGA2-citrine 단백질(homozygous ct29a/ct29a)를 발현하는 1-세포 단계 제브라피쉬 배아에 주사하였다. Tag-RFP mRNA를 주사 대조군으로 동시에 주입하였다. Ab-SPOP 발현은 HMGA2-Citrine를 파괴하고, 난할 동안 비정상적인 세포 분열,피포 동안 연기된 세포 이동 및 긍극적으로 배아 사망과 같은 발생학적 손상을 야기하였다 . 반면, Ab(mut)-SPOP mRNA로 주사된 배아는 HMGA2-Citrine 레벨에 영향이 없었고 배아 발생을 손상시키지 않았고 이것은 Ab-SPOP 활성이 발생학적 표현형을 야기하는 HMGA2-Citrine 단백질의 분해를 직접적으로 촉진한다는 것을 시사한다. (b) Ab-SPOP의 독성을 야생형 배아에 Ab-SPOP mRNA를 주사하여 테스트하였다. 배아 발생은 Supplementary 도11에 나타낸 것과 같이 정상적이었다. 주사된 AB 및 ct29a/ct29a의 표현형을 표 1에 요약하였다. 'n'은 수회의 주사 실험으로부터 전체 배아 수를 나타낸다.
도 4는 인공 E3 ubiquitin ligase 후보들의 고안. deGradFP 프로토콜에서, anti GFP 나노바디(vhhGFP4)를 CRL1 E3 ligase 복합체의 NSlimb와 융합하였다. 본 발명자들은 anti-GFP 나노바디(nanobody)를 어댑터 단백질에 융합하여 인공 E3 ubiquitin ligase 후보들을 제조하였다: CRL1에 대해 Skp 1; CRL2/5에 대해 Elongin C;CRL3에 대해 Keap1 및 SPOP ; 및 CRL4에 대해 DDB1. 각 라이게이즈 후보에서, 기질 결합 단백질과 상호작용에 필요한 도메인을 나노바디로 대체하였음.
도 5는 양방향 doxycycline-inducible 프로모터가 인공 E3 ligases 및 Myc10-TM의 동시 발현을 가능하게 하는 것을 나타낸 그림. (a) 각 벡터는 양방향 TRE(tetracycline response element) 프로모터, rtTA3(tetracycline repressor A3), 및 TagRFP 또는 Myc10-TM 트래이서(Myc 에피토프-막횡단 도메인의 10 탠덤 리피트)를 포함. (b) doxycycline 처리 후, Myc10-TM는 anti-Myc 1차 항체(9E10) 및 Alexa568-컨쥬게이트된 항-마우스 2차 항체로 면역염색 후 형광 현미경에 의하여 세포막에서 검출됨.
도 6은 Ab-SPOP에 의한 원형질이 아니라 핵에서 GFP의 파괴를 나타낸 그림. GFP를 발현하는 293TetOn 세포를 양방향 TRE 프로모터 유래 Ab-SPOP△ NLS 또는 Abmutation-SPOP△NLS 를 발현하는 벡터로 트랜스팩션함. '-'는 트랜스팩션되지 않은 세포를 나타냄. TagRFP의 발현 및 GFP의 파괴는 배지에 doxycycline (1 ug/ml)를 첨가한 후에 측정함. TagRFP를 doxycycline에 의한 TRE 프로모터의 유도 약 8시간 후에 먼저 검출됨. 황색 화살표는 GFP가 원형질이 아니라 핵에서 파괴된 세포를 나타냄. GFP의 핵 파괴는 TRE 프로모터의 활성화 3시간 후에 시작하여 Ab-SPOP로 트랜스팩션된 세포에서만 관찰됨.
도 7은 Ab-SPOP에 의한 핵에서 GFP-융합 단백질의 선택적인 파괴를 나타낸 그림. Cdk4-GFP, Elf3-GFP, cMyc-GFP, 또는 Pin1-GFP를 발현하는 293TetOn 세포를 양방향 TRE 프로모터 유래 Ab-SPOP△ NLS 또는 Abmutation-SPOP△ NLS 양방향 TRE 프로모터를 발현하는 벡터로 트랜스팩션함. '-'는 트랜스팩션되지 않은 세포를 나타냄. TagRFP의 발현 및 GFP의 파괴는 배지에 doxycycline (1 ug/ml)를 첨가한 후에 측정함. 원형질이 아니라 핵에서 선택적인 GFP의 파괴는 Ab-SPOP로 트랜스팩션된 세포에서만 관찰됨.
도 8은 GFP에 대한 다른 나노바디로 제조된 에 의한 Ab-SPOP E3 라이게이즈에 의한 핵 GFP의 선택적 파괴를 나타낸 그림. GFP를 발현하는 293TetOn 세포를 양방향 TRE 프로모터 유래 네 다른 Ab-SPOP△ NLS 라이게이즈(GBP1-SPOP, GBP2-SPOP, GBP6-SPOP, 및 GBP7-SPOP)를 발현하는 벡터로 트랜스팩션하였다. TagRFP의 발현 및 GFP의 파괴는 배지에 doxycycline (1 ug/ml)를 첨가한 후 8시간 후에 측정함. 원형질이 아니라 핵 GFP가 파괴되는 세포를 황색 화살표로 나타냄.
도 9는 대체 GFP 나노바디로 제조된 Ab-SPOP E3 라이게이즈에 의한 H2B-GFP 파괴를 나타낸 그림. H2B-GFP를 발현하는 293TetOn 세포를 양방향 TRE 프로모터 유래 네 다른 Ab-SPOP△ NLS 라이게이즈(GBP1-SPOP, GBP2-SPOP, GBP6-SPOP, 및 GBP7-SPOP)를 발현하는 벡터로 트랜스팩션하였다. TagRFP의 발현 및 H2B-GFP의 파괴는 배지에 doxycycline (1 ug/ml)를 첨가한 후 8시간 후에 측정함. 원형질이 아니라 핵 GFP가 파괴되는 세포를 황색 화살표로 나타냄.
합쳐진 Hoechst/H2B-GFP 패널에서 청색 신호는 파괴된 핵 H2B-GFP를 가지는 세포를 나타냄. TagRFP를 발현하는 모든 세포는 파괴된 H2B-GFP를 가졌으나, 파괴된 H2B-GFP를 가지는 일부 세포들은 TagRFP를 발현하지 않았고, 이것은 TRE 프로모터 활성 3시간 후에 핵 파괴가 시작된다는 결과와 일치.
도 10은 Ab-SPOP에 의한 H2B-GFP 파괴의 시간 경과를 나타낸 그림. H2B-GFP를 발현하는 293TetOn 세포를 양방향 TRE 프로모터 유래 Ab-SPOP 라이게이즈(vhhGFP4-SPOP) 또는 Abmutation-SPOP를 발현하는 벡터로 트랜스팩션함. TagRFP의 발현 및 H2B-GFP의 파괴는 배지에 doxycycline (1 ug/ml)를 첨가한 후 측정함. H2B-GFP의 파괴를 가지는 핵을 황색 화살표로 나타냄.
TagRFP는 먼저 doxycycline-매개된 TRE 프로모터 활성화 약 8시간 후에 검출된다. 핵 H2B-GFP의 파괴는 TRE 프로모터 활성화 3시간 후에 시작하고 Abmutation-SPOP가 아니라 Ab-SPOP로 트랜스팩션된 세포에서 관찰됨.
도 11은 Ab-SPOP의 가역성을 나타냄. 양방향 TRE 프로모터 유래 Ab-SPOP/TagRFP 및 CMV 프로모터 유래 H2B-GFP를 발현하는 293TetOn 세포는 doxycycline 회수 후 H2B-GFP 신호를 회복함. (a) doxycycline없는 배지에서 60시간 성장한 세포. (b) doxycycline (1 ug/ml) 함유한 배지에서 60시간 성장한 세포. 배지를 24시간 마다 교체. (c) 세포를 doxycycline (1 ug/ml)로 12시간 처리한 후 doxycycline없는 배지로 교체함. 배지를 24시간 마다 교체. doxycycline없는 배지에서 48시간 후, H2B-GFP 신호를 부분적으로 회복함.
도 12는 SPOP/Ab-SPOP 다이머에 의한 H2B-GFP의 유비퀴틴화. (a) (i) CMV 프로모터 유래 H2B-GFP (ii) CMV 프로모터 유래 H2B-GFP 및 TRE 프로모터 유래 FLAG-Ab-SPOP (iii) CMV 프로모터 유래 H2B-GFP 및 TRE 프로모터 유래 FLAG-Ab-SPOP△NLS를 발현하는 293TetOn 세포. 모두를 HA-ubiquitin 플라즈미드로 트랜지언트하게 트랜스팩션시킨 후, TRE 프로모터를 doxycycline 처리로 활성화시켰다. 조 세포 추출물을 조제하고 anti-GFP 및 액틴 항체로 웨스턴 블럿팅 분석을 하여 Ab-SPOPs에 의한 H2B-GFP의 분해를 측정하였다. 동일한 추출물을 anti-GFP 항체로 면역침전을 하고 anti-HA로 웨스틴 블럿팅을 하여 인 비보 H2B-GFP 유비퀴틴화 어세이에 사용하였다. (b) Ab-SPOP로 SPOP의 동시면역침전. Myc 에피토프로 태그된 SPOP(Myc-SPOP)를 FLAG-Ab-SPOP 또는 FLAG-Ab-SPOPDD mutation으로 HEK 293T 세포에서 동시트랜스팩션하였다. DDmutation은 SPOP를 호모다이머 형성하는 것을 저해한다. anti-Myc 항체로 면역침전 후, 웨스턴 블럿팅을 anti-Myc 및 FLAG 항체로 수행하였다. 블럿은 Ab-SPOP가 SPOP와 DD 도메인을 통하여 상호작용을 한다는 것을 나타냄.
도 13은 Ab-SPOPDDmutation 및 Ab-SPOP3 -box mutation은 핵 H2B-GFP를 파괴하지 않는다는 것을 나타낸 그림. H2B-GFP를 발현하는 293TetOn 세포를 양방향 TRE 프로모터 유래 Ab-SPOP, Ab-SPOPDDmutation, 및 Ab-SPOP3 -box mutation 를 발현하는 벡터로 트랜스팩션함. (a) Ab-SPOP는 TagRFP를 발현하는 세포에서 핵 H2B-GFP의 파괴를 야기함(황색 화살표). (b) Ab-SPOPDDmutation은 TagRFP를 발현하는 세포에서 핵 H2B-GFP의 파괴를 야기하지 않음(황색 화살표). 이것은 Ab-SPOP 다이머화 도메인이 H2B-GFP의 파괴에 필수적이라는 것을 시사함. (c) Ab-SPOP3 -box mutation은 TagRFP를 발현하는 세포에서 핵 H2B-GFP의 파괴를 야기하지 않음(황색 화살표). 이것은 Ab-SPOP 3-box 도메인이 H2B-GFP의 파괴에 필수적이라는 것을 시사함. 그 3-box 도메인은 CRL3 E3 ligase 복합체에서 Cul3과 결합에 필요하고, Ab-SPOP가 E3 ubiquitin 라이게이즈 활성을 위하여 Cul3 단백질과 상호작용을 한다는 것을 시사함.
도 14는 Ab-SPOP mRNA로 주입된 AB 야생형 배아의 정상 발생을 나타낸 그림. Ab-SPOP 및 Abmut-SPOP mRNAs의 주입은 초기 배아발생 동안에 손상을 야기하지 아니한다. 데이터는 도 3 및 표 1에 요약.
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재한 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
실시예 1:세포 배양
HEK293T, 293TetOn, 및 U2OSTetOn 세포를 ATCC 및 Clontech으로부터 구입하였다. 그 세포들을 10% FBS 및 1% penicillin/streptomycin이 보충된 DMEM에서 배양하였다. 그들을 제조업자의 지시에 따라서 PEI(Polyethylenimine) 또는 JetPRIME PolyPlus (PolyPlus-transfection.com)으로 트랜지언트하게 트랜스팩션하였다. 6-well 세포 배양 플레이트에서 2ml 배지에 배양된 세포를 안정한 tetracycline 아나로그 doxycycline 2ug으로 처리하였다. doxycycline으로 24시간 이상 처리한 경우, doxycycline (1ug/ml)를 포함한 신선한 배지를 24시간 마다 첨가하였다.
GFP 또는 GFP 융합 단백질을 발현하는 안정한 세포주를 제조하기 위하여, PolyPlus를 사용하여 세포를 트랜스팩션하고 2ug/ml puromycin를 포함하는 배지에서 선택하였다. 필요한 경우, GFP를 발현하는 안정한 세포를 형광 활성화된 세포 분류법(FACS)로 정제하였다. Ab-SPOP를 발현하는 안정한 세포주를 100ug/ml hygromycin B를 포함하는 배지에서 선택하였다.
실시예 2: 플라즈미드
하기 벡터를 Addgene로부터 구입하였다: pbabe-cyclinD1+CDK4R24C (11129), pRK5-HA-Ubiquitin-WT (17608), GST-Pin1 (19027), pcDNA3-FLAG-DDB1 (19918), T7-Elongin C-pcDNA (19998), TetO-FUW-cMyc (20324), pDisplay-AP-CFP-TM (20861), pIRES-puro-ELF3 (25728), FLAG-Keap1 (28023), pACAGW-H2B-PAGFP-AAV (33000), pcDNA3_NSlimb-vhhGFP4 (35579), pcDNA3_NSnoFbox-vhhGFP4 (35580), pCAG-GBP1-10gly-Ga4DBD (49438), pCAG-Gal4DBD-GBP2 (49439), pCAG-p65AD-GBP6 (49440), pCAG-GBP7-p65AD (49441). Skp1 (MHS1011-7509413) 및 SPOP (MHS1010-57540) cDNAs를 포함하는 플라즈미드는 Open Biosystems으로부터 구입하였다.
실시예 3: 플라즈미드 구축
세포막 상에 10 카피의 Myc 에피토프를 발현하는 벡터(Myc10-TM)를 PCR 산물의 연속적인 라이게이션 및 그 라이게이션 혼합물의 re-PCR 증폭에 의하여 제조하였다. 요약하면, 신호 펩타이드(SP), Myc10 에피토프 및 막횡단 도메인(TM)의 PCR절편을 각각 제조하였다. 세 PCR 절편들을 라이게이션에 의하여 결합하고 re-PCR 증폭 후, 최종 PCR 절편을 인공 E3 ubiquitin 라이게이즈를 동시 발현하는 플라즈미드에서 tetracycline-유도가능한 양방향 프로모터 하에서 클로닝하였다(도 5).
후보 인공 E3 ubiquitin 라이게이즈의 하기 PCR 산물을 tetracycline-inducible, 양방향 프로모터 유래 인공 SP-Myc10-TM 단백질 및 TagRFP를 동시발현하는 벡터에 클로닝하였다: vhhGFP4-DDB1354 -1140, Elongin C1-87-vhhGFP4, Keap11 -134-vhhGFP4, Skp11 -127-vhhGFP4, NSlimb-vhhGFP4, NSnoFbox-vhhGFP4, vhhGFP4-SPOP167 -374, GBP1-SPOP167-374, GBP2-SPOP167 -374, GBP6-SPOP167 -374, GBP7-SPOP167 -374. NLS (vhhGFP4-SPOP167-368)이 결손된 Ab-SPOP는 그것의 C-말단부에 6 아미노산이 결손되었다. Ab-SPOP 유래 vhhGFP4의 결손 및 vhhGFP4 유래 CDR 3 부위의 결손은 Abmutation-SPOP 벡터의 생성을 야기한다. Ab-SPOPDDmutation 및 Ab-SPOP3 -box mutation 구축물은 SPOP에 PCR-기반 돌연변이화를 통하여 해당 돌연변이를 소개하여 제조하였다[Zhuang, M. et al. Mol Cell 36, 39-50 (2009)].
GFP 및 GFP 융합 단백질(H2B, Cdk4, Pin1, Elf3, 및 cMyc)의 PCR 산물을 pPuro-CMV 벡터에서 CMV 프로모터 하에서 클로닝하였다. 모든 구축물의 서열을 제한 효소 및 DNA 시퀀싱으로 맵핑하여 확인하였다.
실시예 4: 현미경법
이미지들을 pE-2 LED 형광원을 구비한 Olympus IX71 inverted 현미경, HBO 100W/2 수은 형광 램프를 구비한 Leica DM IL LED inverted 현미경,U-LH100HGAPO 103W/2 수은 형광 램프 또는 HBO100 103W/2 수은 형광 램프를 가지는 Zeiss upright Imager.A2를 갖는 Olympus SZX16 stereoscope를 사용하여 얻었다. IX71 및 DM IL LED에 대해, 사진을 Andor Clara CCD 카메라 및 MetaMorph 소프트웨어를 사용하여 촬영하였다. AxioCam HRc 카메라 및 Zen 소프트웨어를 Imager A2 현미경과 사용하였다. TUCSEN TCH-5.0ICE CCD 카메라 및 ISCapture 소프트웨어를 SZX16 stereoscope에 사용하였다. GFP 및 RFP 형광을 Chroma High Q 필터를 사용하여 관찰하였다.
세포막 상에 Myc10-TM의 발현을 보기 위해서, 하기에서 기재된 염색 프로토콜과 동일한 프로토콜에 따라 a-Myc 항체(9E10) 및 Alexa Fluor-568 컨쥬게이트된 a-mouse IgG 항체를 사용하였다.
실시예
5: 유동 세포 형광 분석(Flow
cytometric
fluorescence analysis)
세포막 상에 Myc10-TM의 발현을 정량화하기 위하여, 세포를 세척 버퍼(0.5% BSA 및 2 mM EDTA를 가지는 1x PBS)로 세척하고, 100 ml의 세척버퍼에서 a-Myc antibodies (9E10, 2 mg/ml, x500 희석)로 4oC에서 30분간 배양하였다. 세척 버퍼로 2회 세척하여 미결합 1차 항체를 제거한 후, Cy5-컨쥬게이트된 a-mouse IgG 2차 항체(Molecular probe, 2 mg/ml, x500 희석)를 100 ul에 첨가하였다. 4oC에서 30분간 배양한 후, 세포를 1x PBS로 2회 세척하였다.
Moflo XDP flow cytometer (Beckman Coulter)를 분석에 사용하였다. 장치 세팅을 다음과 같다: 440 V에서 log forward scatter (FSC) 및 log side scatter (SSC). 400 V에서 log FL1 형광, 및 450 V에서 log FL10 형광. Cy5를 633 nm에서 GFP를 488 nm에서 여기함. Cy5 형광을 FL10 채널 상에서 670/30-nm 밴드패스 필터를 통하여 수집하고, GFP 형광은 FL1 채널 상에서 529/28-nm 밴드패스 필터를 통하여 수집하였다. singlet 세포군을 FSC 및 SSC 상에 게이트하였다. 전형적인 샘플링 속도는 초당 500 세포이었고, 전형적인 샘플 크기는 다른 언급이 없으면 측정 당 50,000 세포이었다. 데이터를 Kaluza 소프트웨어(Beckman Coulter)로 분석하였다.
실시예 6: 항체
Myc 및 HA 태그에 대한 단클론 항체 및 그들의 HRP-부착된 2차 항체는 Roche Applied Science로부터 구입하였다. FLAG (M2)에 대한 단클론 항체는 Sigma-Aldrich로부터 Anti-actin 및 anti-GFP 항체는 각각 Santa Cruz Biotechnology 및 Invitrogen/Molecular probe로부터 구입하였다. 면역블럿팅을 위하여, 세포를 라이시스 버퍼에서 파쇄하였다. 원심분리 후, 상등액을 SDS-PAGE를 수행하고, polyvinylidene difluoride 막에 트랜스퍼하였다. 단백질 밴드들을 ECL(enhanced chemiluminescence)로 검출하였다.
실시예 7: 동시 면역침전법
HEK293T 세포를 FLAG-tagged Ab-SPOP 및 Myc-tagged SPOP를 발현하는 플라즈미드로 트랜스팩션하였다. 24시간 후, 세포를 라이시스 버퍼로 파쇄하고, anti-Myc 항체로 면역침전한 후,anti-Myc 및 anti-FLAG 항체로 면역블럿팅을 수행하였다.
실시예 8: 인 비보 유비퀴틴화 어세이
인 비보 H2B-GFP 유비퀴틴화는 tetracycline-inducible, 양방향 프로모터 유래 FLAG-Ab-SPOP 및 TagRFP 뿐만 아니라 CMV 프로모터 유래 H2B-GFP를 발현하는 293TetOn 안정한 세포주로 HA-ubiquitin 플라즈미드를 트랜스팩션하여 검출하였다. doxycycline로 24시간 처리하여 양방향 프로모터를 유도한 후, 세포를 파쇄하고 anti-GFP 항체로 면역침전하였다. H2B-GFP의 유비퀴틴화는 anti-HA 항체로 면역블럿팅하여 분석하였다.
실시예 9: siRNA(Small interfering RNA)
GFP-특이 siRNA (5'-GCAAGCUGACCCUGAAGUUC-3')를 Dharmacon로부터 구입하였다. H2B-GFP를 발현하는 293TetOn 안정화 세포를 JetPRIME PolyPlus를 사용하여 제조업자의 지시에 따라서 siRNA (40 nM)로 트랜스팩션하였다.
실시예 10: 제브라피쉬 husbandry
야생형 AB 균주 및 형질전환 FlipTrap 주, ct29a (hmga2:citrine) Zebrafish (Danio rerio)를 27.5℃에서 14/10 시간 명/암 주기로 balanced salt water에서 유지하였다. 배아를 28.5℃에서 양육하고 표준 방법(Kimmel, C.B., Ballard, W.W., Kimmel, S.R., Ullmann, B. & Schilling, T.F. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists 203, 253-310 (1995))에 따라 스테이지하였다. homozygous ct29a/ct29a 주를 확립하기 위하여, 세 heterozygous 수컷 피쉬를 다섯 heterozygous 암컷과 메이팅하고, 그것은 Citrine을 약하게 발현하였다. 메이팅 후, Citrine을 강하게 발현하는 10 F1 배아(3 수컷 및 7 암컷)를 성체로 성장시켰다. 다음 각 F1 성체를 반대 성별의 AB 야생형과 역교배시키고 각 메이팅으로부터 Citrine 발현을 40 배아 이상 동안 측정하였다. F1 성체를 ct29a/ct29a homozygotes로 그들의 역교배된 배아 모두가 Citrine를 발현할 때 간주하였다.
실시예 11:zebrafish 배아 마운팅 및 이미징
Zebrafish 배아를 이미징을 위하여 선택하여 E3 배지(5mM NaCl, 0.17mM KCl, 0.33mM CaCl2, 및 0.33mM MgSO4)에서 1% 아가로스 베드(Biosesang 9012-36-6) 내에 만들어진 홀에 위치시켰다. 살아있는 이미징을 위하여, AB 및 형질전환 배아의 명시아 및 형광 이미지를 Tucsen Sony 5.0 MP Cooled CCD 카메라가 구비된 Olympus stereomicroscope SZX9를 사용하여 얻었다.
실시예 12:mRNA 미세주입법
전장 capped sense mRNA를 제조하기 위하여, pCS2- TagRFP , pCS2- Ab - SPOP, 또는 pCS2- Ab mutation - SPOP was의 플라즈미드 DNA를 Not I로 리니어로 만들고, RNA를 SP6 mMESSAGE mMACHINE 키트(Ambion)를 사용하여 인 비트로 전사에 의하여 합성하였다. 100 pg의 SPOP mRNA를 1 세포 스테이지에서 10 pg의 TagRFP mRNA로 AB 야생형 또는 ct29a homozygous 돌연변이체의 각 배아에 동시주입하였다.
zebrafish와 관련된 모든 실험은 미래창조과학부에 의한 허가를 받은 동물 생육시설에서 수행하고 강원대 동물실험윤리 위원회의 가이드라인 및 표준을 준수하였다.
<110> KNU-Industry Cooperation Foundation
<120> A composition for specifically degrading nuclear proteins and a
method using the same
<130> P16-0082HS
<160> 1
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 208
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Ser Val Asn Ile Ser Gly Gln Asn Thr Met Asn Met Val Lys Val Pro
1 5 10 15
Glu Cys Arg Leu Ala Asp Glu Leu Gly Gly Leu Trp Glu Asn Ser Arg
20 25 30
Phe Thr Asp Cys Cys Leu Cys Val Ala Gly Gln Glu Phe Gln Ala His
35 40 45
Lys Ala Ile Leu Ala Ala Arg Ser Pro Val Phe Ser Ala Met Phe Glu
50 55 60
His Glu Met Glu Glu Ser Lys Lys Asn Arg Val Glu Ile Asn Asp Val
65 70 75 80
Glu Pro Glu Val Phe Lys Glu Met Met Cys Phe Ile Tyr Thr Gly Lys
85 90 95
Ala Pro Asn Leu Asp Lys Met Ala Asp Asp Leu Leu Ala Ala Ala Asp
100 105 110
Lys Tyr Ala Leu Glu Arg Leu Lys Val Met Cys Glu Asp Ala Leu Cys
115 120 125
Ser Asn Leu Ser Val Glu Asn Ala Ala Glu Ile Leu Ile Leu Ala Asp
130 135 140
Leu His Ser Ala Asp Gln Leu Lys Thr Gln Ala Val Asp Phe Ile Asn
145 150 155 160
Tyr His Ala Ser Asp Val Leu Glu Thr Ser Gly Trp Lys Ser Met Val
165 170 175
Val Ser His Pro His Leu Val Ala Glu Ala Tyr Arg Ser Leu Ala Ser
180 185 190
Ala Gln Cys Pro Phe Leu Gly Pro Pro Arg Lys Arg Leu Lys Gln Ser
195 200 205
Claims (4)
- 녹색 형광 단백질(GFP)에 대한 항체인 나노바디(nanobody)를 유비퀴틴(ubiquitin) 라이게이즈(ligase) 복합체의 어댑터 단백질인 SPOP(Speckle-type POZ protein)에 융합하여 인 비트로 세포에서, 히스톤 단백질 H2B 핵 단백질을 특이적으로 분해하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 히스톤 단백질 H2B는 녹색 형광 단백질(GFP)과 융합된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 SPOP(Speckle-type POZ protein)은 기질 결합 단백질과 상호작용하기 위하여 필요한 도메인이 결손되고, Cullin에 결합하기 위한 도메인을 보존된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 3항에 있어서, 상기 SPOP(Speckle-type POZ protein)의 167번에서 374번 잔기의 단백질 절편은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
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|---|---|---|---|
| KR1020150054577 Division | 2015-04-17 |
Publications (2)
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- 2016-08-23 KR KR1020160107161A patent/KR101680819B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (3)
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|---|
| Caussinus E. et al., npg 19(1):pp.117-122 (2011.12.11.).* |
| Nagai Y. et al, FEBS Letters 418:pp.23-26 (1997.) |
| Zhuang M. et al., Molecular cell 36:pp.39-50 (2009.10. 9.).* |
Also Published As
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|---|---|
| KR20160124042A (ko) | 2016-10-26 |
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