JPWO2015159995A1 - ハイドロゲルの製造方法、包括対象物の包括方法、および包括対象物の放出方法 - Google Patents
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Abstract
低いペルオキシダーゼ濃度条件、生理条件下においてポリエチレングリコールのハイドロゲルを作製することが可能なハイドロゲルの製造方法を提供する。２つ以上のチオール基を有するポリエチレングリコールを、フェノール化合物の存在下でペルオキシダーゼを用いて架橋させるハイドロゲルの製造方法である。
Description
本発明は、ハイドロゲルの製造方法に関する。また、本発明は、そのように作製したハイドロゲルを利用して、細胞、薬剤等の包括対象物を包括する包括方法およびその包括した包括対象物を放出する方法に関する。
生体や細胞に対して穏和な条件下において作製可能なハイドロゲルは、医療分野において魅力的な材料であると言える。このようなハイドロゲルを得るための手法として注目されているのが酵素反応を経る方法である。中でも西洋わさび由来ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の触媒反応を高分子間の架橋反応に利用した材料の開発が多く報告されている。
ＨＲＰは過酸化水素を基質とし、フェノール、アニリン、チオール間の酸化カップリング反応を触媒する酵素である。一般的に反応進行に必要な過酸化水素は、過酸化水素水の添加により供給されてきた。しかしながらこのような手法では、系中において一時的に過酸化水素が高濃度になるため、ＨＲＰが失活し、架橋反応が十分に進行しないことが報告されている（非特許文献１）。さらに、ハイドロゲル内部に細胞やタンパク質を包括する際、高濃度の過酸化水素がそれらに影響を及ぼすことも考えられる。
そこで近年、過酸化水素水を添加することなく、ＨＲＰ触媒サイクルを回し、ハイドロゲルを作製するという新たな手法が報告されている（非特許文献２，３）。非特許文献２では、グルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）を利用し、ＧＯｘがグルコースを酸化する際に生じる過酸化水素でＨＲＰの触媒サイクルを回し、フェノール性水酸基導入高分子水溶液をゲル化させることに成功している。この手法では、系中において過酸化水素が徐々に発生するため、ＨＲＰの失活を最小限に抑えることが可能である。また作製したハイドロゲルは架橋密度が増加するため、従来の過酸化水素水を添加する方法で作製したハイドロゲルに比べ、すぐれた力学特性を有することが報告されている。
非特許文献３では、チオール基（ＳＨ）修飾ポリマとＨＲＰを混合するだけといった非常に簡便な方法でハイドロゲルが作製可能であることが報告されている。これは始めにＳＨの自己酸化の際に生じる過酸化水素を利用することで、ＨＲＰの触媒サイクルを回し、ハイドロゲルを作製するというものである。また、ＨＲＰのＳＨ触媒サイクル中においても過酸化水素が生成されるため、過酸化水素を系中に添加する必要はなく、非常にシンプルなゲル作製法であると考えられる。しかしながら、非特許文献３の方法では、生理条件下であるｐＨ７．４ではハイドロゲルを作製することができず、ｐＨ８．５でないとハイドロゲルを作製することができない。また、高濃度のＨＲＰ（＞１．４×１０３Ｕ／ｍＬ）、長いゲル化時間（＞２ｈ）が必要であるという問題点がある。
この原因は、ＨＲＰの触媒サイクルが効率よく進行しないためであると考えられる。図１に、非特許文献４に記載されている、ＨＲＰがＳＨを酸化する際の触媒サイクルを示す。図１中の反応３（ＨＲＰ（ＣＯＭＰ ＩＩ）＋ＲＳＨ→ＨＲＰ（Ｆｅ３＋）＋ＲＳ・）の速度定数は＜３００Ｍ−１ｓ−１と非常に低く、これが上記問題点の原因であると考えられる。
非特許文献４では、ＨＲＰのＳＨ触媒サイクル中にホモバニリン酸を添加することでＳＨの酸化が促進されることが報告されている。非特許文献４ではこの結果を、系中において生成したフェノキシラジカルからチオールへのラジカル転位反応（Ｐｈ−Ｏ・＋ＲＳＨ→Ｐｈ−ＯＨ＋ＲＳ・）により、チオールラジカルの生成が促進されたためであると考察している。
さらに、非特許文献５では、フェノール誘導体としてチロシン、チオール誘導体としてグルタチオン（ＧＳＨ）を用いた系において、フェノキシラジカルからチオールへのラジカル転位反応の速度定数が約２×１０６Ｍ−１ｓ−１であることが報告されている。また、活性化されたＨＲＰ（ＨＲＰ（ＣＯＭＰ ＩＩ）がフェノールを認識する（ＨＲＰ（ＣＯＭＰ ＩＩ）＋Ｐｈ−ＯＨ→ＨＲＰ（Ｆｅ３＋）＋Ｐｈ−Ｏ・）際の速度定数は１０４〜１０６Ｍ−１ｓ−１程度であり、これら２つの反応における速度定数が、ＨＲＰ（ＣＯＭＰ ＩＩ）が直接ＳＨを酸化する反応（図１中の反応３）の速度定数に比べて非常に大きいことがわかる。
一方、特許文献１には、ヒアルロン酸等の多糖と重合性化合物との縮合体の重合体である多糖ハイドロゲル、および多糖に縮合剤を用いて重合性化合物を結合させた後、酵素にて処理することにより重合硬化させる多糖ハイドロゲルの製造方法が記載されている。
ＨＲＰは過酸化水素を基質とし、フェノール、アニリン、チオール間の酸化カップリング反応を触媒する酵素である。一般的に反応進行に必要な過酸化水素は、過酸化水素水の添加により供給されてきた。しかしながらこのような手法では、系中において一時的に過酸化水素が高濃度になるため、ＨＲＰが失活し、架橋反応が十分に進行しないことが報告されている（非特許文献１）。さらに、ハイドロゲル内部に細胞やタンパク質を包括する際、高濃度の過酸化水素がそれらに影響を及ぼすことも考えられる。
そこで近年、過酸化水素水を添加することなく、ＨＲＰ触媒サイクルを回し、ハイドロゲルを作製するという新たな手法が報告されている（非特許文献２，３）。非特許文献２では、グルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）を利用し、ＧＯｘがグルコースを酸化する際に生じる過酸化水素でＨＲＰの触媒サイクルを回し、フェノール性水酸基導入高分子水溶液をゲル化させることに成功している。この手法では、系中において過酸化水素が徐々に発生するため、ＨＲＰの失活を最小限に抑えることが可能である。また作製したハイドロゲルは架橋密度が増加するため、従来の過酸化水素水を添加する方法で作製したハイドロゲルに比べ、すぐれた力学特性を有することが報告されている。
非特許文献３では、チオール基（ＳＨ）修飾ポリマとＨＲＰを混合するだけといった非常に簡便な方法でハイドロゲルが作製可能であることが報告されている。これは始めにＳＨの自己酸化の際に生じる過酸化水素を利用することで、ＨＲＰの触媒サイクルを回し、ハイドロゲルを作製するというものである。また、ＨＲＰのＳＨ触媒サイクル中においても過酸化水素が生成されるため、過酸化水素を系中に添加する必要はなく、非常にシンプルなゲル作製法であると考えられる。しかしながら、非特許文献３の方法では、生理条件下であるｐＨ７．４ではハイドロゲルを作製することができず、ｐＨ８．５でないとハイドロゲルを作製することができない。また、高濃度のＨＲＰ（＞１．４×１０３Ｕ／ｍＬ）、長いゲル化時間（＞２ｈ）が必要であるという問題点がある。
この原因は、ＨＲＰの触媒サイクルが効率よく進行しないためであると考えられる。図１に、非特許文献４に記載されている、ＨＲＰがＳＨを酸化する際の触媒サイクルを示す。図１中の反応３（ＨＲＰ（ＣＯＭＰ ＩＩ）＋ＲＳＨ→ＨＲＰ（Ｆｅ３＋）＋ＲＳ・）の速度定数は＜３００Ｍ−１ｓ−１と非常に低く、これが上記問題点の原因であると考えられる。
非特許文献４では、ＨＲＰのＳＨ触媒サイクル中にホモバニリン酸を添加することでＳＨの酸化が促進されることが報告されている。非特許文献４ではこの結果を、系中において生成したフェノキシラジカルからチオールへのラジカル転位反応（Ｐｈ−Ｏ・＋ＲＳＨ→Ｐｈ−ＯＨ＋ＲＳ・）により、チオールラジカルの生成が促進されたためであると考察している。
さらに、非特許文献５では、フェノール誘導体としてチロシン、チオール誘導体としてグルタチオン（ＧＳＨ）を用いた系において、フェノキシラジカルからチオールへのラジカル転位反応の速度定数が約２×１０６Ｍ−１ｓ−１であることが報告されている。また、活性化されたＨＲＰ（ＨＲＰ（ＣＯＭＰ ＩＩ）がフェノールを認識する（ＨＲＰ（ＣＯＭＰ ＩＩ）＋Ｐｈ−ＯＨ→ＨＲＰ（Ｆｅ３＋）＋Ｐｈ−Ｏ・）際の速度定数は１０４〜１０６Ｍ−１ｓ−１程度であり、これら２つの反応における速度定数が、ＨＲＰ（ＣＯＭＰ ＩＩ）が直接ＳＨを酸化する反応（図１中の反応３）の速度定数に比べて非常に大きいことがわかる。
一方、特許文献１には、ヒアルロン酸等の多糖と重合性化合物との縮合体の重合体である多糖ハイドロゲル、および多糖に縮合剤を用いて重合性化合物を結合させた後、酵素にて処理することにより重合硬化させる多糖ハイドロゲルの製造方法が記載されている。
Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｒｕｉｚ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２００１，３５４，ｐ１０７
Ｓａｋａｉ ｅｔ ａｌ．，ＲＳＣ Ａｄｖ．，２０１２，２，ｐ１５０２
Ｇｒｏｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２０１３，５２，ｐ１
Ｏｂｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｎ，１９９７，３７，ｐ２１９．
Ｆｏｌｋｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２０１１，５０６，ｐ２４２．
本発明の目的は、低いぺルオキシダーゼ濃度条件、生理条件下においてポリエチレングリコールのハイドロゲルを作製することが可能なハイドロゲルの製造方法を提供することにある。
本発明の目的は、そのように作製したハイドロゲルを利用して、細胞、薬剤等の包括対象物を包括する包括方法およびその包括した包括対象物を放出する方法を提供することにある。
本発明の目的は、そのように作製したハイドロゲルを利用して、細胞、薬剤等の包括対象物を包括する包括方法およびその包括した包括対象物を放出する方法を提供することにある。
本発明は、２つ以上のチオール基を有するポリエチレングリコールを、フェノール化合物の存在下でペルオキシダーゼを用いて架橋させるハイドロゲルの製造方法である。好ましくは、２つ以上のチオール基を有するポリエチレングリコールを、過酸化水素を添加せずに、フェノール化合物の存在下でペルオキシダーゼを用いて架橋させるハイドロゲルの製造方法である。
前記ハイドロゲルの製造方法において、前記ペルオキシダーゼが、西洋わさび由来ペルオキシダーゼであることが好ましい。
前記ハイドロゲルの製造方法において、前記フェノール化合物が、チラミン塩酸塩、フェノール、Ｎ−グリシル−Ｌ−チロシン、ヒドロキノン、レゾルシノール、カテコール、およびセロトニンのうちの少なくとも１つであることが好ましい。
前記ハイドロゲルの製造方法において、前記２つ以上のチオール基を有するポリエチレングリコールおよび１つ以上のチオール基を有するチオール化合物を、前記フェノール化合物の存在下で前記ペルオキシダーゼを用いて架橋させてもよい。
前記ハイドロゲルの製造方法において、前記２つ以上のチオール基を有するポリエチレングリコールおよび１つ以上のチオール基を有するフェノール化合物を、前記ペルオキシダーゼを用いて架橋させてもよい。
また、本発明は、包括対象物の存在下で、２つ以上のチオール基を有するポリエチレングリコールを、フェノール化合物の存在下でペルオキシダーゼを用いて架橋させてハイドロゲルを生成させ、前記包括対象物を前記ハイドロゲルで包括する、包括対象物の包括方法である。
また、本発明は、包括対象物の存在下で、２つ以上のチオール基を有するポリエチレングリコールを、フェノール化合物の存在下でペルオキシダーゼを用いて架橋させてハイドロゲルを生成させ、前記ハイドロゲルで包括した包括対象物について、還元剤を用いて前記ハイドロゲルを溶解させて前記包括対象物を放出する、包括対象物の放出方法である。
前記ハイドロゲルの製造方法において、前記ペルオキシダーゼが、西洋わさび由来ペルオキシダーゼであることが好ましい。
前記ハイドロゲルの製造方法において、前記フェノール化合物が、チラミン塩酸塩、フェノール、Ｎ−グリシル−Ｌ−チロシン、ヒドロキノン、レゾルシノール、カテコール、およびセロトニンのうちの少なくとも１つであることが好ましい。
前記ハイドロゲルの製造方法において、前記２つ以上のチオール基を有するポリエチレングリコールおよび１つ以上のチオール基を有するチオール化合物を、前記フェノール化合物の存在下で前記ペルオキシダーゼを用いて架橋させてもよい。
前記ハイドロゲルの製造方法において、前記２つ以上のチオール基を有するポリエチレングリコールおよび１つ以上のチオール基を有するフェノール化合物を、前記ペルオキシダーゼを用いて架橋させてもよい。
また、本発明は、包括対象物の存在下で、２つ以上のチオール基を有するポリエチレングリコールを、フェノール化合物の存在下でペルオキシダーゼを用いて架橋させてハイドロゲルを生成させ、前記包括対象物を前記ハイドロゲルで包括する、包括対象物の包括方法である。
また、本発明は、包括対象物の存在下で、２つ以上のチオール基を有するポリエチレングリコールを、フェノール化合物の存在下でペルオキシダーゼを用いて架橋させてハイドロゲルを生成させ、前記ハイドロゲルで包括した包括対象物について、還元剤を用いて前記ハイドロゲルを溶解させて前記包括対象物を放出する、包括対象物の放出方法である。
本発明では、低いペルオキシダーゼ濃度条件、生理条件下においてポリエチレングリコールのハイドロゲルを作製することが可能となる。
また、本発明では、そのように作製したハイドロゲルを利用して、細胞、薬剤等の包括対象物を包括する包括方法およびその包括した包括対象物を放出する方法を提供することができる。
また、本発明では、そのように作製したハイドロゲルを利用して、細胞、薬剤等の包括対象物を包括する包括方法およびその包括した包括対象物を放出する方法を提供することができる。
図１は、ＨＲＰがＳＨを酸化する際の触媒サイクルを示す図である（非特許文献４からの引用）。
図２は、（Ａ）チラミン塩酸塩あり（実施例１−１）、（Ｂ）チラミン塩酸塩なし（比較例１）の４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨとＨＲＰとの混合溶液（ｐＨ７．４）の写真である。
図３は、実施例１−１で作製したハイドロゲルをジチオスレイトール（ＤＴＴ）水溶液に浸漬させた直後（左側）および１５ｍｉｎ後（右側）の様子を示す写真である。
図４は、フェノール化合物として、（Ａ）フェノール（実施例１−２）、（Ｂ）Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（実施例１−３）、（Ｃ）ヒドロキノン（実施例１−４）、（Ｄ）レゾルシノール（実施例１−５）、（Ｅ）カテコール（実施例１−６）、（Ｆ）セロトニン（実施例１−７）を用いた場合の４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨとＨＲＰとの混合溶液（ｐＨ７．４）の写真である。
図５は、実施例２における、（Ａ）カタラーゼなし、（Ｂ）カタラーゼありの４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨとＨＲＰとチラミン塩酸塩との混合溶液（ｐＨ７．４）の写真である。
図６は、実施例３における、ＨＲＰの濃度およびチラミン塩酸塩の濃度のゲル化時間への影響を示す図である。
図７は、実施例５における、ＰＥＧ−ＳＨハイドロゲルを０，１，５，１０ｍＭのシステイン溶液（ｉｎ ＰＢＳ）に浸漬させた場合のハイドロゲル重量の経時変化を示す図である。
図８は、実施例６における、ＰＥＧ−ＳＨハイドロゲルへ包括させたＬ９２９線維芽細胞の３ｈ後（左側）、２４ｈ後（右側）の顕微鏡写真である。
図９は、実施例６における、Ｌ９２９線維芽細胞のディッシュへ播種４時間後（左側）、４８時間後（右側）の顕微鏡写真である。
図１０は、実施例７における、４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨの濃度に対するハイドロゲルの貯蔵弾性率（Ｇ’）を示す図である（●：１５ｗｔ％，■：１０ｗｔ％，▲：５ｗｔ％）。
図１１は、実施例９における、Ｌ９２９線維芽細胞の４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ表面上播種２４時間後のＲＧＤペプチドあり（左側）、ＲＧＤペプチドなし（右側）の顕微鏡写真である。
図１２は、実施例１１における、Ｃ−ＳＡ−Ｙを添加した条件（左側）、Ｃ−ＳＡを添加した条件（右側）の４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨとＨＲＰの混合溶液（ｐＨ８．０）の写真である。
図１３は、実施例１１における、精製したナノゲルを共焦点顕微鏡によって観察した顕微鏡写真である。
図１４は、実施例１２における、（ＰＥＧ−ＳＨ）−（Ｇｅｌａ−ＳＨ）ハイドロゲルの貯蔵弾性率（Ｇ’）を示す図である。
図１５は、実施例１２における、Ｌ９２９線維芽細胞の（Ａ）Ｐ５Ｇ０、（Ｂ）Ｐ５Ｇ０．０１、（Ｃ）Ｐ５Ｇ０．１、（Ｄ）Ｐ２．５Ｇ０．１、（Ｅ）Ｐ１０Ｇ０．１、（Ｆ）ゼラチンコートディッシュ上、播種４時間後の顕微鏡写真である。写真上のラインは１００μｍを示す。
図１６は、実施例１２における、Ｌ９２９線維芽細胞の５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ−ＳＨおよび０．１％（ｗ／ｖ）ゼラチンから調製したハイドロゲル上、播種４時間後の顕微鏡写真である。写真上のラインは１００μｍを示す。
図１７は、実施例１２における、Ｌ９２９線維芽細胞の（ＰＥＧ−ＳＨ）−（Ｇｅｌａ−ＳＨ）ハイドロゲル上、（Ａ）細胞接着率、（Ｂ）細胞数を示す図である。エラーバーは、標準偏差（ＳＤ）（（Ａ）：ｎ＝６、（Ｂ）：ｎ＝３（＊ｐ＜０．０５および＊＊＊ｐ＜０．００１））を示す。
図１８は、実施例１２における、Ｌ９２９線維芽細胞の（Ａ，Ｂ）Ｐ５Ｇ０．０１、（Ｃ，Ｄ）Ｐ５Ｇ０．１、（Ｅ，Ｆ）Ｐ２．５Ｇ０．１、（Ｇ，Ｈ）Ｐ１０Ｇ０．１、（Ｉ，Ｊ）ゼラチンコートディッシュ上、播種（Ａ，Ｃ，Ｅ，Ｇ，Ｉ）３日後、（Ｂ，Ｄ，Ｆ，Ｈ，Ｊ）５日後の顕微鏡写真である。写真上のラインは１００μｍを示す。
図１９は、実施例１２における、Ｌ９２９線維芽細胞シートの顕微鏡写真である。（Ａ）および（Ｂ）は、システイン溶液添加後３０分の（ＰＥＧ−ＳＨ）−（Ｇｅｌａ−ＳＨ）ハイドロゲルからはがした細胞シートであり、（Ｃ）−（Ｆ）は、ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈに移して２４時間後細胞シートである。（Ａ）−（Ｃ），（Ｅ）は、明視野像であり、（Ｄ），（Ｆ）は、染色後の蛍光顕微鏡写真である。写真上のラインは（Ａ），（Ｃ），（Ｄ）は５００μｍ、（Ｂ），（Ｅ），（Ｆ）は２００μｍを示す。
図２０は、実施例１２における、ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈ上、再播種２４時間後のＬ９２９線維芽細胞シートの顕微鏡写真である。（Ａ）は、明視野像であり、（Ｂ）は、染色後の蛍光顕微鏡写真である。写真上のラインは２００μｍを示す。
図２は、（Ａ）チラミン塩酸塩あり（実施例１−１）、（Ｂ）チラミン塩酸塩なし（比較例１）の４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨとＨＲＰとの混合溶液（ｐＨ７．４）の写真である。
図３は、実施例１−１で作製したハイドロゲルをジチオスレイトール（ＤＴＴ）水溶液に浸漬させた直後（左側）および１５ｍｉｎ後（右側）の様子を示す写真である。
図４は、フェノール化合物として、（Ａ）フェノール（実施例１−２）、（Ｂ）Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（実施例１−３）、（Ｃ）ヒドロキノン（実施例１−４）、（Ｄ）レゾルシノール（実施例１−５）、（Ｅ）カテコール（実施例１−６）、（Ｆ）セロトニン（実施例１−７）を用いた場合の４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨとＨＲＰとの混合溶液（ｐＨ７．４）の写真である。
図５は、実施例２における、（Ａ）カタラーゼなし、（Ｂ）カタラーゼありの４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨとＨＲＰとチラミン塩酸塩との混合溶液（ｐＨ７．４）の写真である。
図６は、実施例３における、ＨＲＰの濃度およびチラミン塩酸塩の濃度のゲル化時間への影響を示す図である。
図７は、実施例５における、ＰＥＧ−ＳＨハイドロゲルを０，１，５，１０ｍＭのシステイン溶液（ｉｎ ＰＢＳ）に浸漬させた場合のハイドロゲル重量の経時変化を示す図である。
図８は、実施例６における、ＰＥＧ−ＳＨハイドロゲルへ包括させたＬ９２９線維芽細胞の３ｈ後（左側）、２４ｈ後（右側）の顕微鏡写真である。
図９は、実施例６における、Ｌ９２９線維芽細胞のディッシュへ播種４時間後（左側）、４８時間後（右側）の顕微鏡写真である。
図１０は、実施例７における、４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨの濃度に対するハイドロゲルの貯蔵弾性率（Ｇ’）を示す図である（●：１５ｗｔ％，■：１０ｗｔ％，▲：５ｗｔ％）。
図１１は、実施例９における、Ｌ９２９線維芽細胞の４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ表面上播種２４時間後のＲＧＤペプチドあり（左側）、ＲＧＤペプチドなし（右側）の顕微鏡写真である。
図１２は、実施例１１における、Ｃ−ＳＡ−Ｙを添加した条件（左側）、Ｃ−ＳＡを添加した条件（右側）の４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨとＨＲＰの混合溶液（ｐＨ８．０）の写真である。
図１３は、実施例１１における、精製したナノゲルを共焦点顕微鏡によって観察した顕微鏡写真である。
図１４は、実施例１２における、（ＰＥＧ−ＳＨ）−（Ｇｅｌａ−ＳＨ）ハイドロゲルの貯蔵弾性率（Ｇ’）を示す図である。
図１５は、実施例１２における、Ｌ９２９線維芽細胞の（Ａ）Ｐ５Ｇ０、（Ｂ）Ｐ５Ｇ０．０１、（Ｃ）Ｐ５Ｇ０．１、（Ｄ）Ｐ２．５Ｇ０．１、（Ｅ）Ｐ１０Ｇ０．１、（Ｆ）ゼラチンコートディッシュ上、播種４時間後の顕微鏡写真である。写真上のラインは１００μｍを示す。
図１６は、実施例１２における、Ｌ９２９線維芽細胞の５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ−ＳＨおよび０．１％（ｗ／ｖ）ゼラチンから調製したハイドロゲル上、播種４時間後の顕微鏡写真である。写真上のラインは１００μｍを示す。
図１７は、実施例１２における、Ｌ９２９線維芽細胞の（ＰＥＧ−ＳＨ）−（Ｇｅｌａ−ＳＨ）ハイドロゲル上、（Ａ）細胞接着率、（Ｂ）細胞数を示す図である。エラーバーは、標準偏差（ＳＤ）（（Ａ）：ｎ＝６、（Ｂ）：ｎ＝３（＊ｐ＜０．０５および＊＊＊ｐ＜０．００１））を示す。
図１８は、実施例１２における、Ｌ９２９線維芽細胞の（Ａ，Ｂ）Ｐ５Ｇ０．０１、（Ｃ，Ｄ）Ｐ５Ｇ０．１、（Ｅ，Ｆ）Ｐ２．５Ｇ０．１、（Ｇ，Ｈ）Ｐ１０Ｇ０．１、（Ｉ，Ｊ）ゼラチンコートディッシュ上、播種（Ａ，Ｃ，Ｅ，Ｇ，Ｉ）３日後、（Ｂ，Ｄ，Ｆ，Ｈ，Ｊ）５日後の顕微鏡写真である。写真上のラインは１００μｍを示す。
図１９は、実施例１２における、Ｌ９２９線維芽細胞シートの顕微鏡写真である。（Ａ）および（Ｂ）は、システイン溶液添加後３０分の（ＰＥＧ−ＳＨ）−（Ｇｅｌａ−ＳＨ）ハイドロゲルからはがした細胞シートであり、（Ｃ）−（Ｆ）は、ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈに移して２４時間後細胞シートである。（Ａ）−（Ｃ），（Ｅ）は、明視野像であり、（Ｄ），（Ｆ）は、染色後の蛍光顕微鏡写真である。写真上のラインは（Ａ），（Ｃ），（Ｄ）は５００μｍ、（Ｂ），（Ｅ），（Ｆ）は２００μｍを示す。
図２０は、実施例１２における、ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈ上、再播種２４時間後のＬ９２９線維芽細胞シートの顕微鏡写真である。（Ａ）は、明視野像であり、（Ｂ）は、染色後の蛍光顕微鏡写真である。写真上のラインは２００μｍを示す。
本発明の実施の形態について以下説明する。本実施形態は本発明を実施する一例であって、本発明は本実施形態に限定されるものではない。
本発明者らが鋭意検討した結果、２つ以上のチオール基を有するポリエチレングリコールを、フェノール化合物の存在下でペルオキシダーゼを用いて架橋させることにより、過酸化水素を添加しなくても、低いペルオキシダーゼ濃度条件、生理条件下においてポリエチレングリコールのハイドロゲルを作製することができることを見出した。
２つ以上のチオール基を有するポリエチレングリコールとしては、特に制限はないが、例えば、以下に示す２つ以上のチオール基が末端に修飾されたポリエチレングリコール等が挙げられる。これらは単独で用いても、２つ以上を併用してもよい。
（各ｎは同じであっても異なっていてもよく、１０〜１０００の範囲であり、ｍは２〜４の整数である。）
末端にＳＨが修飾された８ａｒｍポリエチレングリコール（８ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ）
（各ｎは同じであっても異なっていてもよく、１０〜１０００の範囲である。）
（各ｎは、１０〜１０００の範囲である。）
具体的には、例えば、以下に示す末端にＳＨが修飾された４ａｒｍポリエチレングリコール（４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ）等が挙げられる。
（各ｎは同じであっても異なっていてもよく、１０〜１０００の範囲である。）
フェノール化合物としては、フェノール骨格を有する化合物であればよく、特に制限はないが、例えば、フェノール性水酸基を１以上６以下有する、分子量５００以下の低分子フェノール化合物等が挙げられる。フェノール性水酸基を１以上６以下有する、分子量５００以下の低分子フェノール化合物としては、例えば、フェノール、１，２−ジヒドロキシベンゼン（カテコール）、１，３−ジヒドロキシベンゼン（レゾルシノール）、１，４−ジヒドロキシベンゼン（ヒドロキノン）、チラミンおよびその塩酸塩、セロトニン、Ｎ−グリシル−Ｌ−チロシン（Ｇｌｙ−Ｔｙｒ）、５−ヒドロキシインドール−３−酢酸、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸メチル、４−ヒドロキシフェニル酢酸、３−ヒドロキシフェニル酢酸、３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸、３−（４−ヒドロキシフェニル）−１−プロパノール、３−（２，４−ジヒドロキシフェニル）プロピオン酸、３，４−ジヒドロキシヒドロ桂皮酸、ｐ−クマル酸、カフェイン酸、ドーパミン、６−ヒドロキシドーパミン、ノルエピネフリン、ベンセラジド等が挙げられる。これらのうち、チラミン塩酸塩、フェノール、Ｎ−グリシル−Ｌ−チロシン、ヒドロキノン、レゾルシノール、カテコール、およびセロトニンのうちの少なくとも１つであることが好ましく、比較的短時間でゲル化が可能であるという点で、チラミン塩酸塩、フェノール、Ｎ−グリシル−Ｌ−チロシン、ヒドロキノン、レゾルシノール、およびセロトニンのうちの少なくとも１つであることがより好ましい。
フェノール化合物の添加量は、例えば、チオール基濃度に対して１／１００当量〜２０当量の範囲であり、１／１０当量〜１０当量の範囲が好ましい。フェノール化合物の添加量がチオール基濃度に対して１／１００当量未満であると、ゲル化に要する時間が長くなる場合があり、２０当量を超えると、フェノール化合物同士のカップリングが優先して進行する場合がある。
ペルオキシダーゼは過酸化水素を基質とし、フェノール、アニリン、チオール等の間の酸化カップリング反応を触媒する酵素である。ペルオキシダーゼの起源については、特に制限はないが、例えば、ウシ肝臓、ウマ血球、ヒト血球、Ｍ． ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ、西洋ワサビ、大豆、ダイコン、カブ、甲状腺、牛乳、腸、白血球、赤血球、酵母、Ｃａｌｄａｒｉｏｍｙｃｅｓ ｆｕｍａｇｏ、Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ等が挙げられる。この中で特に、反応性、安定性、入手のし易さ等の観点から、西洋わさび由来のものが好ましい。
ペルオキシダーゼの添加量は、例えば、系中の酵素濃度として０．１Ｕ／ｍＬ〜５０Ｕ／ｍＬの範囲であり、１Ｕ／ｍＬ〜１０Ｕ／ｍＬの範囲が好ましい。ペルオキシダーゼの添加量が０．１Ｕ／ｍＬ未満であると、ゲル化に要する時間が長くなる場合があり、５０Ｕ／ｍＬを超えると、系中のフェノール化合物の濃度に依存してゲル化に要する時間が長くなる場合がある。
反応溶媒としては、２つ以上のチオール基を有するポリエチレングリコール、フェノール化合物およびペルオキシダーゼが溶解するものであればよく、特に制限はないが、例えば、水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、細胞培養液等が挙げられる。
反応溶媒の量は、２つ以上のチオール基を有するポリエチレングリコール、フェノール化合物およびペルオキシダーゼが溶解する量であればよく、特に制限はないが、例えば、ゲル化反応溶液に対して７０〜９９重量％の範囲であり、８５〜９５重量％の範囲が好ましい。なお、最低限必要な溶媒量は、用いるポリエチレングリコールの溶解度に依存する。また、反応溶媒の量が９９重量％を超えると、ゲル形成が困難になる場合がある。
反応の際のｐＨは、例えば、４．０〜１１の範囲であり、生理条件のｐＨである６．８〜７．６の範囲が好ましい。反応の際のｐＨが４．０未満であると、ゲル化に要する時間が長くなる場合があり、１１を超えると、用いる生体サンプルに影響が生じる場合がある。
反応の際の温度は、特に制限はないが、例えば、４℃〜７０℃の範囲であり、１５℃〜４０℃の範囲が好ましい。反応の際の温度が４℃未満であると、ゲル化に要する時間が長くなる場合があり、７０℃を超えると、ペルオキシダーゼが失活する場合がある。
反応時間は、例えば、３０分〜１時間程度という非常に短時間でハイドロゲルの作製が可能である。なお、例えば、過酸化水素を微量（例えば、１ｍＭ程度）添加すると、数分（例えば、１０分以内）で同様のゲルを得ることができる。
反応は、例えば、２つ以上のチオール基を有するポリエチレングリコールの溶液と、フェノール化合物の溶液とを混合した後、その混合液にペルオキシダーゼの溶液を添加し、所定の温度で所定の時間、放置または撹拌すればよい。
本発明の実施形態に係るハイドロゲルの製造方法で得られるハイドロゲルは、２つ以上のチオール基を有するポリエチレングリコールがジスルフィド結合により架橋されたものである。得られるハイドロゲルのゲル分率（＝（ゲル形成に用いたポリマのうちハイドロゲル形成に関与しているポリマの重量割合）は、例えば、８０〜９６％の範囲である。
また、得られるハイドロゲルの貯蔵弾性率（Ｇ’）は、例えば、１０００〜１０００００パスカル程度、平衡膨潤率（ＱＭ）は、例えば３０〜４５％程度である。
本実施形態に係るハイドロゲルの製造方法において、２つ以上のチオール基を有するポリエチレングリコールおよび１つ以上のチオール基を有するチオール化合物を、フェノール化合物の存在下でペルオキシダーゼを用いて架橋させてもよい。これにより、例えば、細胞接着性、分化誘導能、増殖促進能、生分解性、生体分子に対する特異的親和性、電荷（静電的相互作用能）、疎水性等のうちの少なくとも１つの機能性を有するチオール化合物をゲルネットワークに組み込むことができ、機能性ハイドロゲルが作製可能となる。
１つ以上のチオール基を有するチオール化合物としては、特に制限はないが、システイン残基を有する細胞接着ペプチド等の機能性ペプチド、１つ以上のチオール基を有するκ−カゼイン等の天然生体高分子、１つ以上のチオール基を化学的に修飾したゼラチン、ヒアルロン酸、ヘパリン等の天然高分子等が挙げられる。例えば、２つ以上のチオール基を有するポリエチレングリコールおよびシステイン残基を有する細胞接着ペプチドを、フェノール化合物の存在下でペルオキシダーゼを用いて架橋させることより、生理不活性のＰＥＧハイドロゲルに細胞接着性を付与して、細胞接着性ハイドロゲルを得ることができる。
本実施形態に係るハイドロゲルの製造方法において、２つ以上のチオール基を有するポリエチレングリコールおよび１つ以上のチオール基を有するフェノール化合物を、ペルオキシダーゼを用いて架橋させてもよい。これにより、例えば、細胞接着性、分化誘導能、増殖促進能、生分解性、生体分子に対する特異的親和性、電荷（静電的相互作用能）、疎水性等のうちの少なくとも１つの機能性を有する、１つ以上のチオール基を有するフェノール化合物をゲルネットワークに組み込むことができ、機能性ハイドロゲルが作製可能となる。この場合、１つ以上のチオール基を有するフェノール化合物が、フェノール化合物としてチオール間のカップリングを促進すると考えられる。このような機能性ハイドロゲルを例えば界面活性剤を加えた溶媒中でエマルジョン化し、超音波処理等を行うことにより、例えば粒径２００ｎｍ〜５μｍ程度のナノゲルを作製することができる。また、このような機能性ハイドロゲルをドラッグデリバリシステム（ＤＤＳ）のキャリア等として利用することができる。
１つ以上のチオール基を有するフェノール化合物としては、特に制限はないが、例えば、分子内にチロシンとシステインを併せ持つストレプトアビジン等のタンパク質等が挙げられる。これにより、フェノール化合物の役割を持ちながら、ゲルネットワーク内に自発的に当該分子を組み込むことができる。なお、この場合、フェノール化合物は上記のような分子量５００以下の低分子フェノール化合物には該当しない場合もある。
本発明の実施形態に係る包括対象物の包括方法は、包括対象物の存在下で、２つ以上のチオール基を有するポリエチレングリコールを、フェノール化合物の存在下でペルオキシダーゼを用いて架橋させてハイドロゲルを生成させ、前記包括対象物を前記ハイドロゲルで包括する方法である。
例えば、２つ以上のチオール基を有するポリエチレングリコールの溶液と、フェノール化合物の溶液と、包括対象物の溶液または懸濁液とを混合した後、その混合液にペルオキシダーゼの溶液を添加し、所定の温度で所定の時間、放置または撹拌することにより、過酸化水素を添加しなくても、低いペルオキシダーゼ濃度条件、生理条件下という穏和な条件で包括対象物をハイドロゲルで包括することができる。また、比較的短時間で包括することが可能である。
包括対象物に対するハイドロゲルの量は、包括対象物を十分に包括できるように、例えば、包括対象物の水溶液あるいは懸濁液に対して、ポリマ濃度が１〜３０重量％の範囲のハイドロゲルが生成するようにすればよい。
また、本発明の実施形態に係る包括対象物の放出方法は、包括対象物の存在下で、２つ以上のチオール基を有するポリエチレングリコールを、フェノール化合物の存在下でペルオキシダーゼを用いて架橋させてハイドロゲルを生成させ、前記ハイドロゲルで包括した包括対象物について、還元剤を用いて前記ハイドロゲルを溶解させて前記包括対象物を放出する包括対象物の放出方法である。
例えば、上記のようにハイドロゲル内への包括を行い、その後、系内へ還元剤を添加して、所定の温度で所定の時間、放置または撹拌することにより、簡便な方法でハイドロゲルを溶解させて包括対象物をハイドロゲルから放出することができる。
還元剤としては、ハイドロゲルの架橋点であるジスルフィド結合を還元することができるものであればよく、特に制限はないが、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、システイン、還元型グルタチオン、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＴＣＥＰ（Ｔｒｉｓ（２−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ）、２−メルカプトエタノール、水素化ホウ素ナトリウム等の還元剤が挙げられる。これらのうち、生体適合性等の点から、システイン等の天然物由来の還元剤が好ましい。
用いる還元剤の量は、例えば、ゲル中のジスルフィド（Ｓ−Ｓ結合）量に対して、１〜３０当量の範囲とすればよい。
還元の際の温度は、包括物質に影響を与えない温度であればよく、特に制限はないが、例えば、４℃〜７０℃の範囲であり、２０℃〜４０℃の範囲が好ましい。
本実施形態に係る包括対象物の包括方法および放出方法は、細胞等の包括対象物に対して非常に穏和な条件で進行するため、細胞の３次元培養用足場材料や、細胞輸送用の担体の作製、薬剤輸送用の担体の作製等に適していると考えられる。
包括対象物としては、特に制限はないが、例えば、細胞、タンパク質、核酸、糖質、薬剤、合成高分子、ナノカーボン材料、金属ナノ粒子等が挙げられる。
本発明者らが鋭意検討した結果、２つ以上のチオール基を有するポリエチレングリコールを、フェノール化合物の存在下でペルオキシダーゼを用いて架橋させることにより、過酸化水素を添加しなくても、低いペルオキシダーゼ濃度条件、生理条件下においてポリエチレングリコールのハイドロゲルを作製することができることを見出した。
２つ以上のチオール基を有するポリエチレングリコールとしては、特に制限はないが、例えば、以下に示す２つ以上のチオール基が末端に修飾されたポリエチレングリコール等が挙げられる。これらは単独で用いても、２つ以上を併用してもよい。
（各ｎは同じであっても異なっていてもよく、１０〜１０００の範囲であり、ｍは２〜４の整数である。）
末端にＳＨが修飾された８ａｒｍポリエチレングリコール（８ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ）
（各ｎは同じであっても異なっていてもよく、１０〜１０００の範囲である。）
（各ｎは、１０〜１０００の範囲である。）
具体的には、例えば、以下に示す末端にＳＨが修飾された４ａｒｍポリエチレングリコール（４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ）等が挙げられる。
（各ｎは同じであっても異なっていてもよく、１０〜１０００の範囲である。）
フェノール化合物としては、フェノール骨格を有する化合物であればよく、特に制限はないが、例えば、フェノール性水酸基を１以上６以下有する、分子量５００以下の低分子フェノール化合物等が挙げられる。フェノール性水酸基を１以上６以下有する、分子量５００以下の低分子フェノール化合物としては、例えば、フェノール、１，２−ジヒドロキシベンゼン（カテコール）、１，３−ジヒドロキシベンゼン（レゾルシノール）、１，４−ジヒドロキシベンゼン（ヒドロキノン）、チラミンおよびその塩酸塩、セロトニン、Ｎ−グリシル−Ｌ−チロシン（Ｇｌｙ−Ｔｙｒ）、５−ヒドロキシインドール−３−酢酸、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸メチル、４−ヒドロキシフェニル酢酸、３−ヒドロキシフェニル酢酸、３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸、３−（４−ヒドロキシフェニル）−１−プロパノール、３−（２，４−ジヒドロキシフェニル）プロピオン酸、３，４−ジヒドロキシヒドロ桂皮酸、ｐ−クマル酸、カフェイン酸、ドーパミン、６−ヒドロキシドーパミン、ノルエピネフリン、ベンセラジド等が挙げられる。これらのうち、チラミン塩酸塩、フェノール、Ｎ−グリシル−Ｌ−チロシン、ヒドロキノン、レゾルシノール、カテコール、およびセロトニンのうちの少なくとも１つであることが好ましく、比較的短時間でゲル化が可能であるという点で、チラミン塩酸塩、フェノール、Ｎ−グリシル−Ｌ−チロシン、ヒドロキノン、レゾルシノール、およびセロトニンのうちの少なくとも１つであることがより好ましい。
フェノール化合物の添加量は、例えば、チオール基濃度に対して１／１００当量〜２０当量の範囲であり、１／１０当量〜１０当量の範囲が好ましい。フェノール化合物の添加量がチオール基濃度に対して１／１００当量未満であると、ゲル化に要する時間が長くなる場合があり、２０当量を超えると、フェノール化合物同士のカップリングが優先して進行する場合がある。
ペルオキシダーゼは過酸化水素を基質とし、フェノール、アニリン、チオール等の間の酸化カップリング反応を触媒する酵素である。ペルオキシダーゼの起源については、特に制限はないが、例えば、ウシ肝臓、ウマ血球、ヒト血球、Ｍ． ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ、西洋ワサビ、大豆、ダイコン、カブ、甲状腺、牛乳、腸、白血球、赤血球、酵母、Ｃａｌｄａｒｉｏｍｙｃｅｓ ｆｕｍａｇｏ、Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ等が挙げられる。この中で特に、反応性、安定性、入手のし易さ等の観点から、西洋わさび由来のものが好ましい。
ペルオキシダーゼの添加量は、例えば、系中の酵素濃度として０．１Ｕ／ｍＬ〜５０Ｕ／ｍＬの範囲であり、１Ｕ／ｍＬ〜１０Ｕ／ｍＬの範囲が好ましい。ペルオキシダーゼの添加量が０．１Ｕ／ｍＬ未満であると、ゲル化に要する時間が長くなる場合があり、５０Ｕ／ｍＬを超えると、系中のフェノール化合物の濃度に依存してゲル化に要する時間が長くなる場合がある。
反応溶媒としては、２つ以上のチオール基を有するポリエチレングリコール、フェノール化合物およびペルオキシダーゼが溶解するものであればよく、特に制限はないが、例えば、水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、細胞培養液等が挙げられる。
反応溶媒の量は、２つ以上のチオール基を有するポリエチレングリコール、フェノール化合物およびペルオキシダーゼが溶解する量であればよく、特に制限はないが、例えば、ゲル化反応溶液に対して７０〜９９重量％の範囲であり、８５〜９５重量％の範囲が好ましい。なお、最低限必要な溶媒量は、用いるポリエチレングリコールの溶解度に依存する。また、反応溶媒の量が９９重量％を超えると、ゲル形成が困難になる場合がある。
反応の際のｐＨは、例えば、４．０〜１１の範囲であり、生理条件のｐＨである６．８〜７．６の範囲が好ましい。反応の際のｐＨが４．０未満であると、ゲル化に要する時間が長くなる場合があり、１１を超えると、用いる生体サンプルに影響が生じる場合がある。
反応の際の温度は、特に制限はないが、例えば、４℃〜７０℃の範囲であり、１５℃〜４０℃の範囲が好ましい。反応の際の温度が４℃未満であると、ゲル化に要する時間が長くなる場合があり、７０℃を超えると、ペルオキシダーゼが失活する場合がある。
反応時間は、例えば、３０分〜１時間程度という非常に短時間でハイドロゲルの作製が可能である。なお、例えば、過酸化水素を微量（例えば、１ｍＭ程度）添加すると、数分（例えば、１０分以内）で同様のゲルを得ることができる。
反応は、例えば、２つ以上のチオール基を有するポリエチレングリコールの溶液と、フェノール化合物の溶液とを混合した後、その混合液にペルオキシダーゼの溶液を添加し、所定の温度で所定の時間、放置または撹拌すればよい。
本発明の実施形態に係るハイドロゲルの製造方法で得られるハイドロゲルは、２つ以上のチオール基を有するポリエチレングリコールがジスルフィド結合により架橋されたものである。得られるハイドロゲルのゲル分率（＝（ゲル形成に用いたポリマのうちハイドロゲル形成に関与しているポリマの重量割合）は、例えば、８０〜９６％の範囲である。
また、得られるハイドロゲルの貯蔵弾性率（Ｇ’）は、例えば、１０００〜１０００００パスカル程度、平衡膨潤率（ＱＭ）は、例えば３０〜４５％程度である。
本実施形態に係るハイドロゲルの製造方法において、２つ以上のチオール基を有するポリエチレングリコールおよび１つ以上のチオール基を有するチオール化合物を、フェノール化合物の存在下でペルオキシダーゼを用いて架橋させてもよい。これにより、例えば、細胞接着性、分化誘導能、増殖促進能、生分解性、生体分子に対する特異的親和性、電荷（静電的相互作用能）、疎水性等のうちの少なくとも１つの機能性を有するチオール化合物をゲルネットワークに組み込むことができ、機能性ハイドロゲルが作製可能となる。
１つ以上のチオール基を有するチオール化合物としては、特に制限はないが、システイン残基を有する細胞接着ペプチド等の機能性ペプチド、１つ以上のチオール基を有するκ−カゼイン等の天然生体高分子、１つ以上のチオール基を化学的に修飾したゼラチン、ヒアルロン酸、ヘパリン等の天然高分子等が挙げられる。例えば、２つ以上のチオール基を有するポリエチレングリコールおよびシステイン残基を有する細胞接着ペプチドを、フェノール化合物の存在下でペルオキシダーゼを用いて架橋させることより、生理不活性のＰＥＧハイドロゲルに細胞接着性を付与して、細胞接着性ハイドロゲルを得ることができる。
本実施形態に係るハイドロゲルの製造方法において、２つ以上のチオール基を有するポリエチレングリコールおよび１つ以上のチオール基を有するフェノール化合物を、ペルオキシダーゼを用いて架橋させてもよい。これにより、例えば、細胞接着性、分化誘導能、増殖促進能、生分解性、生体分子に対する特異的親和性、電荷（静電的相互作用能）、疎水性等のうちの少なくとも１つの機能性を有する、１つ以上のチオール基を有するフェノール化合物をゲルネットワークに組み込むことができ、機能性ハイドロゲルが作製可能となる。この場合、１つ以上のチオール基を有するフェノール化合物が、フェノール化合物としてチオール間のカップリングを促進すると考えられる。このような機能性ハイドロゲルを例えば界面活性剤を加えた溶媒中でエマルジョン化し、超音波処理等を行うことにより、例えば粒径２００ｎｍ〜５μｍ程度のナノゲルを作製することができる。また、このような機能性ハイドロゲルをドラッグデリバリシステム（ＤＤＳ）のキャリア等として利用することができる。
１つ以上のチオール基を有するフェノール化合物としては、特に制限はないが、例えば、分子内にチロシンとシステインを併せ持つストレプトアビジン等のタンパク質等が挙げられる。これにより、フェノール化合物の役割を持ちながら、ゲルネットワーク内に自発的に当該分子を組み込むことができる。なお、この場合、フェノール化合物は上記のような分子量５００以下の低分子フェノール化合物には該当しない場合もある。
本発明の実施形態に係る包括対象物の包括方法は、包括対象物の存在下で、２つ以上のチオール基を有するポリエチレングリコールを、フェノール化合物の存在下でペルオキシダーゼを用いて架橋させてハイドロゲルを生成させ、前記包括対象物を前記ハイドロゲルで包括する方法である。
例えば、２つ以上のチオール基を有するポリエチレングリコールの溶液と、フェノール化合物の溶液と、包括対象物の溶液または懸濁液とを混合した後、その混合液にペルオキシダーゼの溶液を添加し、所定の温度で所定の時間、放置または撹拌することにより、過酸化水素を添加しなくても、低いペルオキシダーゼ濃度条件、生理条件下という穏和な条件で包括対象物をハイドロゲルで包括することができる。また、比較的短時間で包括することが可能である。
包括対象物に対するハイドロゲルの量は、包括対象物を十分に包括できるように、例えば、包括対象物の水溶液あるいは懸濁液に対して、ポリマ濃度が１〜３０重量％の範囲のハイドロゲルが生成するようにすればよい。
また、本発明の実施形態に係る包括対象物の放出方法は、包括対象物の存在下で、２つ以上のチオール基を有するポリエチレングリコールを、フェノール化合物の存在下でペルオキシダーゼを用いて架橋させてハイドロゲルを生成させ、前記ハイドロゲルで包括した包括対象物について、還元剤を用いて前記ハイドロゲルを溶解させて前記包括対象物を放出する包括対象物の放出方法である。
例えば、上記のようにハイドロゲル内への包括を行い、その後、系内へ還元剤を添加して、所定の温度で所定の時間、放置または撹拌することにより、簡便な方法でハイドロゲルを溶解させて包括対象物をハイドロゲルから放出することができる。
還元剤としては、ハイドロゲルの架橋点であるジスルフィド結合を還元することができるものであればよく、特に制限はないが、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、システイン、還元型グルタチオン、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＴＣＥＰ（Ｔｒｉｓ（２−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ）、２−メルカプトエタノール、水素化ホウ素ナトリウム等の還元剤が挙げられる。これらのうち、生体適合性等の点から、システイン等の天然物由来の還元剤が好ましい。
用いる還元剤の量は、例えば、ゲル中のジスルフィド（Ｓ−Ｓ結合）量に対して、１〜３０当量の範囲とすればよい。
還元の際の温度は、包括物質に影響を与えない温度であればよく、特に制限はないが、例えば、４℃〜７０℃の範囲であり、２０℃〜４０℃の範囲が好ましい。
本実施形態に係る包括対象物の包括方法および放出方法は、細胞等の包括対象物に対して非常に穏和な条件で進行するため、細胞の３次元培養用足場材料や、細胞輸送用の担体の作製、薬剤輸送用の担体の作製等に適していると考えられる。
包括対象物としては、特に制限はないが、例えば、細胞、タンパク質、核酸、糖質、薬剤、合成高分子、ナノカーボン材料、金属ナノ粒子等が挙げられる。
以下、実施例および比較例を挙げ、本発明をより具体的に詳細に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
＜実施例１−１＞
［ＨＲＰ触媒反応によるハイドロゲルの作製］
（実験方法）
２つ以上のチオール基を有するポリエチレングリコールとして４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ（重量平均分子量２０，０００、ＮＯＦ（日油株式会社）製、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＰＴＥ−２００ＳＨ）、フェノール化合物としてチラミン塩酸塩をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）にそれぞれ溶解させた。得られた４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ水溶液（１５０μＬ，１０％（ｗ／ｖ））とフェノール化合物水溶液（７５μＬ，２０ｍＭ）を混合した後、ＨＲＰ水溶液（７５μＬ，２０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）を添加し、２２℃で放置した。４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ、フェノール化合物、ＨＲＰの最終濃度は、それぞれ５％（ｗ／ｖ）、５ｍＭ、５ｕｎｉｔｓ／ｍＬとした。
＜比較例１＞
フェノール化合物の影響を評価するため、フェノール化合物（チラミン塩酸塩）を添加しない以外は実施例１−１と同様にして実験を行った。
（結果）
実施例１−１の４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ、チラミン塩酸塩、ＨＲＰを添加した条件では３０ｍｉｎ後、ゲルの形成が確認された（図２（Ａ））が、比較例１のチラミン塩酸塩を添加しなかった条件では１週間後もゲルの形成は見られなかった（図２（Ｂ））。
実施例１−１では、非特許文献３の方法に比べて、非常に低濃度のＨＲＰ条件下でゲルが作製可能であった（約１／３００）。さらに生理条件下であるｐＨ７．４においてゲルが作製可能であった。非特許文献３では、ｐＨ７．４の条件下ではポリマ水溶液のゲル化は進行しないと報告されている。これはゲル化プロセスの初期における、ＳＨの自己酸化が進行する際に必要な脱プロトン化がほとんど進行しないためと考えられる。その結果、ＨＲＰの活性化に必要な過酸化水素が効率よく生成されず、水溶液のゲル化が進行しなかったと考えられる。また先述したように、ＨＲＰ（ＣＯＭＰ ＩＩ）が直接ＳＨを酸化する反応（図１中の反応３）の速度定数が極めて低いことも起因しているといえる。実施例１−１においてもＳＨの自己酸化はほとんど進行しないため、初期段階における系中の過酸化水素濃度は非常に低濃度であると予測されるが、フェノール化合物を系中へ添加することで、ＨＲＰ触媒サイクルの効率が増加し、チオール間のカップリングが促進されるとともに、触媒サイクル内における過酸化水素の生成も効率よく進行するため、過酸化水素を添加しなくても、低濃度のＨＲＰそしてｐＨ７．４という生理条件下においてゲルの形成が進行したと考えられる。
また、作製したハイドロゲルをジチオスレイトール（ＤＴＴ）水溶液（５０ｍＭ，１ｍＬ）を用い還元した結果、１５ｍｉｎ程度で溶解が観察された（図３参照）ことから、高分子間の架橋はジスルフィド結合によるものであることが示唆された。
＜実施例１−２〜１−７＞
フェノール化合物として、チラミン塩酸塩の代わりに、フェノール（実施例１−２）、Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（実施例１−３）、ヒドロキノン（実施例１−４）、レゾルシノール（実施例１−５）、カテコール（実施例１−６）、セロトニン（実施例１−７）をそれぞれ用いた以外は実施例１−１と同様にして実験を行った。
その他のフェノール化合物に関しても同様に、ゲルの形成が観察された（図４参照）。
＜実施例２＞
［カタラーゼの影響］
本検討では過酸化水素を酸素と水に分解するカタラーゼを系中に添加し、高分子水溶液のゲル化に及ぼす影響を確認した。系中で発生する過酸化水素がゲル化に関与しているのであれば、カタラーゼを添加することでゲル化時間が延長すると予測した。また本検討ではフェノール化合物としてチラミン塩酸塩を使用した。
（実験方法）
４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ、チラミン塩酸塩をＰＢＳ（ｐＨ７．４）にそれぞれ溶解させた。得られた４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ水溶液（１００μＬ，１５％（ｗ／ｖ））と、チラミン水溶液（１００μＬ，１５ｍＭ）とを混合した後、ＨＲＰ水溶液（５０μＬ，３０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）を添加した。最後にカタラーゼ水溶液（５０μＬ，０．２７ｍｇ／ｍＬ）を添加し、２２℃で放置した。４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ、チラミン塩酸塩、ＨＲＰ、カタラーゼの最終濃度は、それぞれ５％（ｗ／ｖ）、５ｍＭ、５ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、４．５×１０−２ｍｇ／ｍＬとした。同様にして、カタラーゼを添加していない条件で実験を行った。
（結果）
図５にゲル作製１時間後の写真を示す。カタラーゼを添加していない条件では、４０分程度でゲルの形成が確認された（図５（Ａ））が、カタラーゼを添加した条件では高分子水溶液のゲル化が抑制された（図５（Ｂ））。この結果から、系中で過酸化水素が発生しており、その過酸化水素が高分子水溶液のゲル化に関与していることが明らかとなった。
＜実施例３＞
［ゲル化時間の検討（フェノール化合物）］
使用したフェノール化合物が高分子水溶液のゲル化時間に及ぼす影響を検討した。
（実験方法）
４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ、フェノール化合物をそれぞれＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解させた。４８ウェル プレート ディッシュに、得られたＰＥＧ−ＳＨ水溶液１００μＬ（１０％（ｗ／ｖ））、フェノール化合物水溶液５０μＬ（２０ｍＭ）を加え、撹拌した（スターラ；長さ：１０ｍｍ／幅：３ｍｍ，撹拌速度；２００ｒｐｍ）。次いで、ＨＲＰ水溶液５０μＬ（２０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）をウェルに添加し、ゲル化するまでの時間を測定した。このとき、４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ、フェノール化合物、ＨＲＰの最終濃度がそれぞれ５％（ｗ／ｖ）、５ｍＭ、５ｕｎｉｔｓ／ｍＬとなるようにした。また、フェノール化合物としてチラミン塩酸塩を用い、その最終濃度を０．５，１，５，１０，５０，１００ｍＭと変化させ、チラミン濃度がゲル化時間に及ぼす影響を調べた。さらに、ＨＲＰの最終濃度を５，１０，５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬと変化させて同様に、ＨＲＰ濃度がゲル化時間に及ぼす影響を評価した。
本実験では、混合溶液の液面が隆起し、流動性がなくなった時をゲル化と判断した。
（結果）
それぞれのフェノール化合物を用いて評価した高分子水溶液のゲル化時間を表１に示す。各条件におけるゲル化時間は、チラミンが約３０ｍｉｎ程度と、最も速かったのに対し、カテコールでは１２ｈ以上を要するという結果が得られた。これはフェノール化合物の種がゲル化時間に大きな影響を及ぼすことを意味している。この原因は現段階では不明であるが、ＨＲＰの基質認識、および生成するフェノキシラジカルの安定性が関与していると考えられる。
次に各成分濃度がゲル化時間に及ぼす影響を検討した。高分子水溶液のゲル化時間はＨＲＰ濃度の増加と伴に増加する傾向を示した（図６参照）。これは系中におけるジチラミンの形成が、フェノールラジカルからチオールへのラジカル転位反応を阻害したためであると考えられる。ＨＲＰ濃度が増加することで、フェノールラジカルの生成速度が増加し、その結果、ジチラミンの形成が促進されたと考えられる。チラミン濃度に関しては、その濃度が増加すると伴に短縮する傾向を示した（図６参照）。これは系中におけるフェノールラジカルの生成速度の増加したためであると考えられる。
さらに、高濃度のチラミン条件下１００，２００ｍＭにおいてゲル化時間の測定を行った（その他の成分濃度はＰＥＧ−ＳＨ，５％（ｗ／ｖ）；ＨＲＰ，５ｕｎｉｔｓ／ｍＬとした）。その結果、ゲル化時間はそれぞれ２７．１±１．２ｍｉｎ、３４．８±１．１ｍｉｎと増加する傾向を示した。この増加は先述したように系中におけるジチラミンの形成がラジカル転位反応を阻害したことが一因と考えられる。
また、非特許文献３の結果では、ゲル化時間は最短で１１０ｍｉｎ程度であったことから、本ゲル化プロセスを利用することで４倍程度ゲル化時間を短縮することに成功した。また、本系では非特許文献３の系に比べ、ＨＲＰ濃度が非常に低い（約１／３００）ことから、優れた酸化還元応答性ハイドロゲルの作製法になる。
＜実施例４＞
［ゲル化時間の検討（ポリエチレングリコール）］
２つ以上のチオール基を有するポリエチレングリコールの濃度がゲル化時間に及ぼす影響を検討した。
（実験方法）
４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ、チラミン塩酸塩をＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解させた。４８ウェル プレート ディッシュに、得られたＰＥＧ−ＳＨ水溶液１００μＬ（１０％（ｗ／ｖ））、チラミン塩酸塩水溶液５０μＬ（２０ｍＭ）を加え、撹拌した（スターラ；長さ：１０ｍｍ／幅：３ｍｍ，撹拌速度；２００ｒｐｍ）。次いで、ＨＲＰ水溶液５０μＬ（２０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）をウェルに添加し、ゲル化するまでの時間を測定した。このとき、４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ、チラミン塩酸塩、ＨＲＰの最終濃度がそれぞれ５，１０，１５％（ｗ／ｖ）、５ｍＭ、５ｕｎｉｔｓ／ｍＬとなるようにした。
本実験では、混合溶液の液面が隆起し、流動性がなくなった時をゲル化と判断した。
（結果）
４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ濃度を変化させ評価したゲル化時間を表２に示す。高分子水溶液のゲル化時間は４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨの濃度に依存せず、同程度の値を示した（約３０ｍｉｎ）。この結果から、高分子間の反応ではなく、チオールラジカルができるまでの反応がゲル化の律速であることが示唆された。
＜実施例５＞
［還元剤を用いたハイドロゲルの溶解］
実施例で作製したＰＥＧ−ＳＨハイドロゲルは架橋点がジスルフィド結合であることから、還元することで容易に溶解させることが可能である。そこで本検討では還元剤を用いたゲルの溶解挙動を評価した。還元剤としては、穏和な条件下においてゲルの溶解が進行すると考えられる、システインを用いて評価した。また、フェノール化合物にはチラミン塩酸塩を使用した。
（実験方法）
４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ、チラミン塩酸塩をＰＢＳ（ｐＨ７．４）にそれぞれ溶解させた。得られた４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ水溶液（１５０μＬ，１０％（ｗ／ｖ））と、チラミン体水溶液（７５μＬ，２０ｍＭ）とを混合した後、モールドに加え、その後、ＨＲＰ水溶液（７５μＬ，２０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）を添加し、室温（２２℃）で１ｈ静置させることでディスク状のＰＥＧ−ＳＨハイドロゲルを作製した（径：約１５ｍＭ，厚さ：約２ｍＭ）。４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ、ＨＲＰ、チラミン塩酸塩の最終濃度はそれぞれ５％（ｗ／ｖ）、５ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、５ｍＭとした。作製したハイドロゲルを０，１，５，１０ｍＭのシステイン溶液（ｉｎ ＰＢＳ）（５ｍＬ）に浸漬させ、３７℃でインキュベートを行い、ゲル重量の経時変化を評価した。実験開始１時間後、溶解しなかったサンプルに関しては、システイン溶液を新鮮なシステイン溶液に交換し、さらに検討を行った。
（結果）
各条件におけるハイドロゲル重量の経時変化を図７に示す。システイン溶液に浸漬させたハイドロゲルのみが溶解し、ＰＢＳに浸漬させたハイドロゲルの溶解は観察されなかった。この結果から、システインを還元剤として利用することでゲルの溶解が可能であることが示された。また、ＰＢＳに浸漬させた条件におけるゲル重量の増加は、膨潤によるものと考えられる。システイン濃度の影響に関しては、その濃度が高いほど、溶解時間は短縮する傾向にあり、５ｍＭ以上の濃度では３０ｍｉｎ以内と、非常に迅速なゲルの溶解が可能であることが明らかとなった。
＜実施例６＞
［細胞包括実験および放出実験］
従来のＨＲＰ触媒反応を利用したゲル作製法では、系中へ過酸化水素水を直接添加する必要があるが、本実施例のゲル作製法では、基質である過酸化水素は系中で徐々に生成し、ＨＲＰによって迅速に消費されるため非常に穏和なゲル作製法であり、細胞包括担体の作製法に適していると考えられる。そこで本検討では、ＰＥＧ−ＳＨハイドロゲルへの細胞包括実験を行い、ゲル化プロセスが細胞の生存に及ぼす影響を評価した。さらに上記の検討において、アミノ酸の一種であるシステインを用いることで容易にゲルを溶解させることが可能であることが明らかとなっているため、包括細胞の放出実験も同時に行った。
（実験方法）
「細胞包括実験」
４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ、チラミン塩酸塩をＰＢＳ（ｐＨ７．４）にそれぞれ溶解させた。得られた４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ水溶液（２５０μＬ，１０％（ｗ／ｖ））、チラミン水溶液（１００μＬ，２５ｍＭ）およびＬ９２９線維芽細胞懸濁液（ｉｎ ＭＥＭ（１０％ＦＢＳ））（１００μＬ，２×１０６セル／ｍＬ）を混合した後、ＨＲＰ水溶液（５０μＬ，５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）を加え、６ウェル プレート ディッシュに添加し（５００μＬ）、インキュベータ内で１ｈ静置させることでゲルを作製した。４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ、チラミン塩酸塩、ＨＲＰの最終濃度は、それぞれ５％（ｗ／ｖ）、５ｍＭ、５ｕｎｉｔｓ／ｍＬとした。また、細胞播種数は２×１０５セル／ウェルとなるようにした。ゲル作製後、培地を５ｍＬ添加し、その１時間後および５時間後、新鮮培地２ｍＬと交換し、インキュベータ内で静置させた。３時間後および２４時間後、ＰＢＳ（５ｍＬ）でゲルを洗浄し（５回）、−Ｃｅｌｌｓｔａｉｎ−ＤｏｕｂｌｅＳｔａｉｎｉｎｇ Ｋｉｔを用い、生細胞と死細胞を染め分け（緑色が生存している細胞、赤色が死滅した細胞を示す）、蛍光顕微鏡で観察を行い、生細胞数および死細胞数から生存率を算出した。
「放出実験」
前述の操作に準じてゲル内への細胞包括を行い、２４ｈ培養を行った。その後、ＰＢＳ（５ｍＬ）でゲルを洗浄し（５回）、５ｍＬのシステイン溶液（５ｍＭ）を各ウェルに添加し、インキュベータ内で３０ｍｉｎ静置させた。３０ｍｉｎ後、ゲルが溶解していることを確認し、細胞を回収した後、２４ウェルディッシュへ播種した。播種４時間後および４８時間後、顕微鏡による観察を行った。
（結果）
本実施例におけるゲル作製法では系中で生成する過酸化水素がＨＲＰによって迅速に消費されるため、非常に穏和な環境下において高分子間の架橋反応が進行すると考えられる。したがって、実施例のゲル作製法は細胞の３次元培養用の足場材料や細胞固定化担体の作製に非常に適した方法であると考えられる。そこで、ＰＥＧ−ＳＨハイドロゲルへの細胞包括実験を試みた。３ｈ培養後の包括細胞は高い生存率を維持していた（生存率：９８．２±０．５％、図８左側参照）。また２４ｈ後の細胞生存率もほとんど低下していないことが明らかとなった（生存率：９８．９±０．１％、図８右側参照）。次に２４ｈ培養した包括細胞の回収を試みた。５ｍＭシステイン溶液を各ウェルに添加し、３０ｍｉｎインキュベートした後、上澄み溶液の回収、遠心操作を行った後、２４ウェル プレートへ細胞を再播種した。４ｈ後、播種した細胞はディッシュへ接着し、伸展している様子が観察された（図９左側参照）。この際、上澄みの培地から浮遊細胞（死細胞）はほとんど観察されず、また４８ｈ培養後、細胞が増殖している様子が観察されたことから（図９右側参照）、高分子水溶液のゲル化プロセスおよびシステイン溶液を用いたゲルの溶解操作が細胞の生存に対して、穏和であることが明らかとなった。以上の結果から、高い生存率を維持したまま細胞をゲル内へ包括し、放出することに成功した。
＜実施例７＞
［ハイドロゲルの物性評価］
（実験方法）
「レオロジー測定」
４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨの最終濃度を５，１０，１５％（ｗ／ｖ）と変化させ、レオメータ（Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ社）を用いて貯蔵弾性率（Ｇ’）を測定した。その際、周波数を０．１〜１０Ｈｚと変化させて評価を行った。また、チラミン塩酸塩、ＨＲＰの最終濃度はそれぞれ５ｍＭ、５ｕｎｉｔｓ／ｍＬとした。
「平衡膨潤率（ＱＭ）およびゲルコンテンツ評価」
４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ、チラミン塩酸塩、ＨＲＰをＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解させた。４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ水溶液１５０μＬ、チラミン塩酸塩水溶液を７５μＬおよびＨＲＰ水溶液７５μＬを混合した後、モールドに添加した。このとき、４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ、ＨＲＰおよびチラミン塩酸塩の最終濃度がそれぞれ５，１０，１５％（ｗ／ｖ）、５ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、５ｍＭとなるようにした。４時間後、作製したディスク状の４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨハイドロゲル（直径：約１５ｍｍ，厚さ：約２ｍｍ）を、３７℃環境下で１０ｍＬのＰＢＳに３日間浸漬させ、膨潤後のハイドロゲル重量（ＭＳ）を測定した。その後、ハイドロゲルを凍結乾燥させ、ハイドロゲルの乾燥重量（ＭＤ）を測定し、平衡膨潤率（ＱＭ＝Ｍｓ／ＭＤ）を算出した。
１５，３０，４５ｍｇ（Ｗｐ）の４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨをＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解させ、ディスク状の４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨハイドロゲルを作製した（直径：約１５ｍｍ，厚さ：約２ｍｍ）。このとき、４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ、ＨＲＰおよびチラミン塩酸塩の最終濃度がそれぞれ５，１０，１５％（ｗ／ｖ）、５ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、５ｍＭとなるようにした。作製したゲルを、３７℃環境下で１０ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水に３日間浸漬させ、塩および未架橋の４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨを除去した。その後、ハイドロゲルを乾燥させ、ハイドロゲルの乾燥重量（ＷＤ）を測定し、ゲルコンテンツ（ｇｅｌ ｃｏｎｔｅｎｔ＝（ＷＤ／Ｗｐ）×１００）を算出した。
（結果）
４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨの濃度を変化させて得られるハイドロゲルの物性評価を行った。ゲルの貯蔵弾性率（Ｇ’）は高分子濃度の増加とともに増加する傾向を示した（図１０参照）。一方で、ゲルの平衡膨潤率（ＱＭ）は高分子濃度の増加とともに減少する傾向を示した（表３参照）。これらの結果はゲルの架橋密度が関与していると考えられる。つまり、高分子濃度の増加に伴い架橋密度が増加することで上述のような結果になったと考えられる。また、ゲルコンテンツに関してはいずれの条件でも８０％以上を維持していた（表３参照）。
＜実施例８＞
［低チラミン濃度で作製した４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨハイドロゲルのゲルコンテンツ評価（ＨＲＰ濃度変化）］
（実験方法）
１５ｍｇ（Ｗｐ）の４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨをＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解させ、ディスク状の４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨハイドロゲルを作製した（直径：約１５ｍｍ，厚さ：約２ｍｍ）。このとき、４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ、ＨＲＰおよびチラミン塩酸塩の最終濃度がそれぞれ５％（ｗ／ｖ）、５ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、０．５ｍＭとなるようにした。８ｈ後、作製したゲルを３７℃環境下で１０ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水に３日間浸漬させ、塩および未架橋の４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨを除去した。その後、ハイドロゲルを乾燥させ、ハイドロゲルの乾燥重量（ＷＤ）を測定し、ゲルコンテンツ（ｇｅｌ ｃｏｎｔｅｎｔ＝（ＷＤ／Ｗｐ）×１００）を算出した。
（結果）
低チラミン濃度で作製した４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨゲルのゲルコンテンツはＨＲＰ濃度に依存せず、いずれの条件でも９０％の値を示した（表４参照）。この結果から、低チラミン濃度でも高い架橋密度を有するゲルが作製可能であることが明らかとなった。
＜実施例９＞
［細胞接着ペプチドを用いた４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨゲルの機能化］
（実験方法）
システイン残基（Ｃ）を含むペプチドを用い、４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨゲルの機能化を試みた。４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ、チラミン塩酸塩、細胞接着ペプチド（ＧＲＧＤＳＧＧＣ）およびＨＲＰをＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解させた。４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ水溶液（５０μＬ，３０％（ｗ／ｖ））、チラミン水溶液（５μＬ，１５０ｍＭ）およびＧＲＧＤＳＧＧＣ水溶液（９０μＬ，１６．６７ｍＭ）を混合した後、ＨＲＰ水溶液（５μＬ，１５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）を加え、４８ウェル プレート ディッシュに添加し（１５０μＬ）、ＲＧＤペプチド固定化ゲルを作製した。４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ、チラミン塩酸塩、ＨＲＰおよびＧＲＧＤＳＧＧＣの最終濃度は、それぞれ１０％（ｗ／ｖ）、５ｍＭ、５ｕｎｉｔｓ／ｍＬおよび１０ｍＭとした。作製したゲルをＰＢＳで３回、ＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ）で１回洗浄した。洗浄後、Ｌ９２９線維芽細胞が４×１０４セル／ウェルとなるように各ウェルに播種し、２４ｈ培養を行った。培養後、顕微鏡観察を行った。またコントロールとして接着ペプチドを含まないゲルでも同様の検討を行った。
（結果と考察）
培養２４ｈ後、接着ペプチドを固定化したゲルは細胞が接着し、伸展している様子が観察された（図１１左側）。一方で、接着ペプチドを含まないゲルではほとんどの細胞が接着せず、また伸展している様子も観察されなかった（図１１右側）。以上の結果から、システイン残基を含む接着ペプチドを用いることで、生理不活性のＰＥＧハイドロゲルに細胞接着性を付与することに成功した。また、この結果からＲＧＤペプチドだけでなく、その他のペプチドにシステイン残基を組み込むことで様々な機能性ハイドロゲルが作製可能であると考えられる。
＜実施例１０＞
［ハイドロゲルの作製］
８ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ（重量平均分子量２０，０００、ＮＯＦ（日油株式会社）製、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＨＧＥＯ−２００ＳＨ）、チラミン塩酸塩をＰＢＳ（ｐＨ７．４）にそれぞれ溶解させた。これら２種の水溶液を混合した後、ＨＲＰ水溶液を添加し、２２℃で放置した。８ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ、チラミン塩酸塩、ＨＲＰの最終濃度は、それぞれ５％（ｗ／ｖ）、５ｍＭ、５ｕｎｉｔｓ／ｍＬとした。その結果、８ａｒｍＰＥＧ−ＳＨも４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨと同様にＨＲＰ、チラミン塩酸塩を添加した条件でゲル形成が観察された。
以上のように、ＨＲＰ−ＳＨ修飾高分子混合溶液中にフェノール化合物を添加することで、酸化還元応答型ハイドロゲルを作製することが可能であった。本手法は従来の手法に比べ、１）非常に低いＨＲＰ濃度条件、そして２）生理条件下（ｐＨ７．４）においてゲルを作製することが可能、３）比較的速いゲル化時間、といった点が優位である。また、作製したハイドロゲルはシステイン溶液を用いることで容易に溶解させることが可能であった。さらに、材料のゲル化プロセスおよび溶解プロセスは細胞に対し非常に穏和であったことから、本実施例におけるゲル作製法は、細胞の３次元培養用足場材料や、細胞輸送用の担体の作製に適していると考えられる。また、機能性ハイドロゲルを作製することができた。
＜実施例１１＞
［ＳＡ組換体の調製］
ストレプトアビジン（ＳＡ）のＮ末端にＨＨＨＨＨＨＣを、Ｃ末端にＧＧＧＧＹを付加したＳＡ組換体（以下、Ｃ−ＳＡ−Ｙと略記、配列番号１）の発現プラスミドベクター（配列番号３）および、Ｎ末端にＨＨＨＨＨＨＣのみを付加したＳＡ組換体（以下、Ｃ−ＳＡと略記、配列番号２）の発現プラスミドベクター（配列番号４）を遺伝子工学的手法により構築した。各ＳＡ組換体の発現は、Ｔ７ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｉｑ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｈｉｇｈ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ Ｂｉｏｌａｂｓ社より購入）で行った。２５０ｍＬのＬＢ培地（１００ｍｇ／Ｌ Ａｍｐ）で本培養を行い、ＯＤ６００＝１．００に達した時点でＩｓｏｐｒｏｐｙｌ β−Ｄ−１−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を終濃度１ｍＭで添加し、３７℃、１３０ｒｐｍで９時間培養後、遠心分離によって集菌した。
得られた大腸菌のペレットを、バッファＡ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１００ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）に分散させ、リゾチーム１０ｍｇを添加し、４℃、３０ｍｉｎインキュベートした。その後、超音波破砕（３ｍｉｎ×３回）を行い、遠心分離によって、ＳＡ組換体を含む沈殿を得た。上清を捨て、バッファＢ（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １００，ｐＨ８．０）に沈殿を懸濁させ、遠心分離を再度行った。この操作を３回繰返し行い、沈殿の洗浄を行った後に、バッファＡを用いて同様に３回、洗浄を行い、最終的にＳＡ組換体の封入体を得た。
封入体を、６Ｍグアニジン塩酸塩溶液（ｐＨ１．５，１ｍＭ ＤＴＴ）に溶かし、Ｎｉ−ＮＴＡカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィによって精製を行った。精製後のＳＡ組換え体を含む溶液を、３ｍＭ ＤＴＴを含むＴＢＳ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．５）溶液中に、強撹拌しながら滴下し、リフォールディングを行った。リフォールディング後の溶液に対して、硫安沈殿を行い、ＳＡ組換体を沈殿させ、遠心分離によって回収した。得られたＳＡ組換体の沈殿を、３ｍＭ ＤＴＴを含むＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解させ、ゲルを作製する直前に、限外濾過膜を用いて濃縮およびＭｉｌｌｉ−Ｑ水へのバッファ交換を行った。ＳＡ組換体の濃度は、２８０ｎｍにおける吸光度（ε２８０ｎｍ＝１３８，０００Ｍ−１ｃｍ−１）から求めた。
［ＳＡ固定化ゲルの作製］
Ｃ−ＳＡ−ＹまたはＣ−ＳＡを、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ（重量平均分子量２０，０００、ＮＯＦ（日油株式会社）製、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＰＴＥ−２００ＭＡ）と表５の条件で混合し、十分にピペッティングした後に静置してゲル化の様子を観察した。反応はすべて１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファ（ｐＨ８．０）内で行い、室温（２２℃）で反応を進行させた。
その結果、Ｃ−ＳＡ−Ｙを添加した条件でのみ、９時間後にゲル化が観察された（図１２左側）。Ｃ−ＳＡでは、４８時間後もゲル化しなかった（図１２右側）ことから、ＳＡに導入したチロシン残基がＨＲＰに基質認識され、Ｓ−Ｓ結合の形成を促していることが示唆された。このように、チロシンとＨＲＰによる連鎖的Ｓ−Ｓ結合形成反応を介して、
ＳＡ固定化ハイドロゲルの作製に成功した。
［ＳＡ固定化ナノゲルの作製］
３．７４ｍＬのヘキサンに界面活性剤（７５ｍｇ Ｓｐａｎ８０，２５ｍｇ，Ｔｗｅｅｎ８０）を加えて十分に溶解させた。
（ａ）上記で作製したヘキサン溶液のうち３７４μＬを採取し、有機相とした。
（ｂ）内水相（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１．２５ｍＭ ４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ，１０Ｕ／ｍＬ ＨＲＰ，１００μＭ Ｃ−ＳＡ−Ｙ，ｐＨ８．０）を３０μＬ作製し、有機相に加えた。
（ｃ）超音波破砕機を用いて、上記の溶液に超音波処理を施し、ｗ／ｏエマルションを作製した（３０ｓｅｃ，Ｄｕｔｙ ｃｙｃｌｅ ３０，Ｏｕｔｐｕｔ３）。
（ｄ）スターラーバーを加えて激しく撹拌しながら室温（２２℃）で１２時間反応させた。
（ｅ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７−Ｃ２−Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ（終濃度３０μＭ）およびヨードアセトアミド（終濃度１ｍＭ）を加え、１５ｓｅｃ超音波照射を行った後に、強撹拌しながら、さらに室温（２２℃）で１時間反応させ、残存するチオール基をクエンチするとともにゲルに蛍光修飾を施した。
（ｆ）１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ３．０を１５０μＬ加えた後に、ボルテックスを用いて懸濁させた。この溶液を１００００ｒｐｍで３０分間遠心し、水相と有機相に分離させ、有機相を除いた。
（ｇ）水相内のナノゲルに６００μＬのヘキサンを加え、ボルテックスを用いて十分に懸濁させ、１００００ｒｐｍで５分間遠心した後に、上清のヘキサンを除いた。この操作を２回行った。
（ｈ）ヘキサン洗浄後のサンプルに６００μＬのＴＨＦを加えてボルテックスを用いて十分に懸濁させ、自然沈降によってＴＨＦ相と水相を分離した後に上清のＴＨＦ相を除いた。この操作を２回行った。２回目以降は、二相に分離しないため、ナノゲルが沈降するのを待った後に、上澄みのＴＨＦを取り除いた。
（ｉ）溶液を１５０μＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水で再懸濁し、透析を行うことで残存するＴＨＦを除いた。
（ｊ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８修飾ビオチン（ＳＡに対して０．５当量）を加え、４℃で１時間反応させた。その後に再度透析を行い、未反応のビオチンを除いた。
（ｋ）精製されたナノゲルを共焦点顕微鏡によって観察した（図１３）。
このように、ＨＲＰ酵素反応を利用したＳＡ固定化ゲルの微粒子化に成功し、そのビオチン結合能を確認した。
＜実施例１２＞
［チオール基修飾ゼラチンを用いた機能性ハイドロゲルの作製］
ゼラチンは、生体内に存在するコラーゲンを部分的に加水分解して得られるタンパク質である。ゼラチンは細胞の接着および増殖を促進するＲＧＤモチーフを有し、細胞適合性が高いことから、細胞培養基材として利用されている。本実施例ではゼラチンに対し、架橋点となるチオール基を修飾したチオール基修飾ゼラチン（Ｇｅｌａ−ＳＨ）を合成し、４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨと共架橋させることで、ＰＥＧゲルの機能化を試みた。また、作製した（ＰＥＧ−ＳＨ）−（Ｇｅｌａ−ＳＨ）ハイドロゲルの物理特性評価も行った。
（実験方法）
［チオール基修飾ゼラチン（Ｇｅｌａ−ＳＨ）の合成］
２．０ｇのゼラチンを１００ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水に溶解させ、その後、１．０ｇのシスタミンを添加した。シスタミンが溶解した後、１．０Ｍ ＨＣｌを用いて、混合溶液のｐＨを４．７５に調整した。その後、０．８６ｇの１−Ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＥＤＣ）を混合溶液に添加し、室温で２時間撹拌した。その際、ｐＨの上昇を防ぐため、１．０Ｍ ＨＣｌを用いてｐＨを４．７５に調節しながら反応を行った。２時間反応を行った後、１．０ＭのＮａＯＨを用いて混合溶液のｐＨを７．０に調節した。その後、還元剤として８．５ｇのＤｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（ＤＴＴ）を混合溶液に添加し、１．０ＭのＮａＯＨを用いてｐＨを８．５に調節し、一晩室温で撹拌した。その後、１．０Ｍ ＨＣｌを用いて混合溶液のｐＨを３．５に調節した後、分画分子量１００００の透析膜に入れ、ｐＨ３．５のＨＣｌ水溶液中で３日間透析することにより、未反応物およびＤＤＴを除去した。その後、凍結真空乾燥を行うことで、チオール基修飾ゼラチン（Ｇｅｌａ−ＳＨ）を得た。Ｅｌｌｍａｎ試薬を用いてチオール基の修飾率を見積もった結果、０．４５ｍｍｏｌ−ＳＨ／ｇ−ｇｅｌａｔｉｎであった。
［平衡膨潤率（ＱＭ）およびゲルコンテンツの評価］
４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ、チラミン塩酸塩およびＧｅｌａ−ＳＨをＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解させた。モールドに４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ水溶液１００μＬ、Ｇｅｌａ−ＳＨ水溶液１００μＬ、チラミン塩酸塩水溶液を５０μＬを加え、その後、５０μＬのＨＲＰ水溶液を添加し、４時間室温で静置させることで、（ＰＥＧ−ＳＨ）−（Ｇｅｌａ−ＳＨ）ハイドロゲルを作製した。作製したゲルを、３７℃環境下で１０ｍＬのＰＢＳ（０．１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム）に４日間浸漬させ、膨潤後のハイドロゲル重量（ＭＳ）を測定した。その後、ハイドロゲルを乾燥させ、ハイドロゲルの乾燥重量（ＭＤ）を測定し、平衡膨潤率（ＱＭ＝ＭＳ／ＭＤ）を算出した。また、各成分の最終濃度は表６となるようにゲルの作製を行った。
ゲルコンテンツとはゲル作製後に高分子がどの程度架橋しているかを示す指標である。まず始めに４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ、Ｇｅｌａ−ＳＨ（高分子重量：Ｗｐ）をＰＢＳに溶解させ、上述と同様の条件で（ＰＥＧ−ＳＨ）−（Ｇｅｌａ−ＳＨ）ハイドロゲルを作製した。作製したゲルを１０ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水に４日間浸漬させ、未架橋の高分子を除去した後、ゲルを乾燥させその重量（ＷＤ）を測定し、ゲルコンテンツ（ｇｅｌ ｃｏｎｔｅｎｔ＝（ＷＤ／Ｗｐ）×１００）を算出した。
［レオメーターを用いた力学特性評価］
レオメーター専用のアルミカップ内で（ＰＥＧ−ＳＨ）−（Ｇｅｌａ−ＳＨ）ハイドロゲルを作製した。周波数を０．１〜１０Ｈｚと変化させ、各ハイドロゲルの貯蔵弾性率（Ｇ’）を測定した。その際、ひずみは０．１％とした。また各成分濃度は実施例７と同様の条件で行った。
（結果と考察）
ハイドロゲルの平衡膨潤率（ＱＭ）を表７に、貯蔵弾性率（Ｇ’）を図１４に示す。ＰＥＧ−ＳＨの濃度が増加すると共にハイドロゲルの平衡膨潤率は減少し、貯蔵弾性率は増加した。一般的にこれらの物性は高分子間の架橋密度に起因しており、架橋密度が高いほど膨潤率は減少し、貯蔵弾性率は増加する。本実施例におけるゲルの作製条件では、ゲルコンテンツが全て８０％以上であることから、高分子間の架橋反応は十分に進行していることが示唆される。また、混合溶液中におけるチオール基濃度はＰＥＧ−ＳＨの濃度が増加するとともに増加し、それに起因して得られるハイドロゲルの架橋密度も増加することが予測される。従って上述のような結果になったと考えられる。
一方で、５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ−ＳＨの条件において作製したハイドロゲルの平衡膨潤率および貯蔵弾性率はＧｅｌａ−ＳＨの濃度に依存せず、同程度の値を示した（表７、図１４参照）。これは、作製したハイドロゲルの架橋密度がほとんど一定であることを意味している。実際に、本実施例ではＧｅｌａ−ＳＨ濃度をＰＥＧ−ＳＨ濃度に比べ、比較的低い値に設定しており、混合溶液中のチオール基の濃度はＧｅｌａ−ＳＨの濃度変化によって著しく変化しない（表８参照）。従って、Ｇｅｌａ−ＳＨが低濃度の条件では、得られるハイドロゲルの物性はＰＥＧ−ＳＨの濃度に依存しており、ＰＥＧ−ＳＨの濃度を変化させることで容易に物性制御が行えることが明らかとなった。
［細胞接着］
４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ、チラミン塩酸塩、ＨＲＰおよびＧｅｌａ−ＳＨ水溶液を混合した後、混合溶液５００μＬを１２ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ ｄｉｓｈに添加した。ゲル化後１ｍＬのＰＢＳで２回、ＭＥＭ培地で２回洗浄を行った。各ｗｅｌｌにＬ２９２線維芽細胞を２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種した。播種４時間後、各ゲルシートを洗浄し、上澄み液中の細胞を回収した。さらに各ｗｅｌｌにトリプシン溶液を５００μＬ添加し、接着細胞の剥離および回収を試みた。上澄み液およびトリプシン処理後の懸濁液中の細胞を計数し、それらの値から播種４時間後の細胞接着率を算出した。また、ポジティブコントロールとしてゼラチンコートディッシュを用いて同様の検討を行った。
［細胞増殖および細胞シートの作製］
上記と同様の手法で１２ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ ｄｉｓｈ内にゲルシートを作製した。各ｗｅｌｌにＬ２９２線維芽細胞を２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種した。播種３日後および５日後、各ゲルシートを洗浄し、各ｗｅｌｌにトリプシン溶液を５００μＬ添加した。接着細胞を回収した後、計数を行い各ｗｅｌｌ中の細胞数を算出した。また、本実施例でもポジティブコントロールとしてゼラチンコートディッシュを用いて同様の検討を行った。（ＰＥＧ−ＳＨ）−（Ｇｅｌａ−ＳＨ）ゲル上でコンフルエントになるまで細胞を培養し、その後、ｗｅｌｌに１０ｍＭのシステイン溶液５ｍＬを加え３０分間インキュベートを行った。
（結果と考察）
播種４時間後のＬ９２９の顕微鏡写真を図１５に示す。（ＰＥＧ−ＳＨ）−（Ｇｅｌａ−ＳＨ）ゲルシート上では細胞の接着および伸展が観察されたが、Ｇｅｌａ−ＳＨを混合していない条件では細胞の接着は見られなかった（図１５（Ａ）参照）。また、チオール基を修飾していないゼラチンでも同様の検討を行ったが、細胞の接着はほとんど観察されなかった（図１６参照）。これは、ＨＲＰ触媒反応によってＧｅｌａ−ＳＨがＰＥＧ−ＳＨネットワーク内に組み込まれたことを示す結果であり、その他の機能性分子（多糖やペプチド等）も同様の手法によってＰＥＧゲル内へ固定化可能であることが示唆された。上澄み溶液およびゲル上の細胞数から４時間後の細胞接着率を算出した結果、Ｇｅｌａ−ＳＨ濃度の増加と伴に接着率も増加する結果が得られた（図１７（Ａ）参照）。また、Ｇｅｌａ−ＳＨ濃度０．１％（ｗ／ｖ）の条件では播種細胞数の９５％以上が接着しており、ポジティブコントロールであるゼラチンコートディッシュと同程度の値を示した。また、５日間培養後のＰ５Ｇ０．１ハイドロゲル上における細胞数はＰ５Ｇ０．０１ハイドロゲル上における細胞数に比べ４０％増加した（図１７（Ｂ）参照）。これは、Ｐ５Ｇ０．１ハイドロゲル上での細胞の増殖速度がＰ５Ｇ０．０１ハイドロゲル上のものに比べて速いことを意味している。また、５日培養後の細胞の形態写真からもＰ５Ｇ０．１ハイドロゲル上の細胞密度が、Ｐ５Ｇ０．０１ハイドロゲル上のものに比べ高く（図１８（Ｂ），（Ｄ）参照）、Ｐ５Ｇ０．１ハイドロゲル上での細胞の増殖速度がＰ５Ｇ０．０１ハイドロゲル上のものに比べて速いことが示唆された。また、Ｐ５Ｇ０．１ハイドロゲル上での細胞の増殖速度および形態、ゼラチンコートディッシュと同程度であった。
また、ＰＥＧ−ＳＨ濃度を変化させた条件ではいずれも９０％以上の細胞が接着していた。しかしながら、２．５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ−ＳＨで作製したゲル上での細胞接着率はその他のゲルに比べ、わずかに低い値を示した（図１７（Ａ）参照）。これは、ゲルの強度が関与していると考えられる。線維芽細胞はより強度が高い基材への接着が促進すると報告されている。本実施例でもＰ２．５Ｇ０．１ハイドロゲルのＧ’は、Ｐ１０Ｇ０．１ハイドロゲルの１／１０程度であることから、基材の強度が接着に影響したのではないかと考えられる。しかしながら、増殖速度には大きな差は見られず、初期接着率のわずかな差は細胞の増殖速度に大きな影響を及ぼさないことが示唆された。
Ｐ５Ｇ０．１ゲルシート上においてコンフルエントになるまで細胞を培養した後、１０ｍＭシステイン溶液を添加した。その後、３０分間インキュベートを行った結果、図１９（Ａ），（Ｂ）に示すように細胞シートが得られた。さらに得られた細胞シートをｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈに移した。一晩培養を行った後、２重染色キットを用い、生細胞と死細胞をそれぞれ染め分けた（生細胞：緑、死細胞：赤）。図１９（Ｄ），（Ｆ）および図２０（Ｂ）は染色後の蛍光顕微鏡写真である。死細胞はほとんど観察されず、細胞シートの回収操作が細胞にとって非常に穏和であることが示された。
［配列表］
＜実施例１−１＞
［ＨＲＰ触媒反応によるハイドロゲルの作製］
（実験方法）
２つ以上のチオール基を有するポリエチレングリコールとして４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ（重量平均分子量２０，０００、ＮＯＦ（日油株式会社）製、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＰＴＥ−２００ＳＨ）、フェノール化合物としてチラミン塩酸塩をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）にそれぞれ溶解させた。得られた４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ水溶液（１５０μＬ，１０％（ｗ／ｖ））とフェノール化合物水溶液（７５μＬ，２０ｍＭ）を混合した後、ＨＲＰ水溶液（７５μＬ，２０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）を添加し、２２℃で放置した。４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ、フェノール化合物、ＨＲＰの最終濃度は、それぞれ５％（ｗ／ｖ）、５ｍＭ、５ｕｎｉｔｓ／ｍＬとした。
＜比較例１＞
フェノール化合物の影響を評価するため、フェノール化合物（チラミン塩酸塩）を添加しない以外は実施例１−１と同様にして実験を行った。
（結果）
実施例１−１の４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ、チラミン塩酸塩、ＨＲＰを添加した条件では３０ｍｉｎ後、ゲルの形成が確認された（図２（Ａ））が、比較例１のチラミン塩酸塩を添加しなかった条件では１週間後もゲルの形成は見られなかった（図２（Ｂ））。
実施例１−１では、非特許文献３の方法に比べて、非常に低濃度のＨＲＰ条件下でゲルが作製可能であった（約１／３００）。さらに生理条件下であるｐＨ７．４においてゲルが作製可能であった。非特許文献３では、ｐＨ７．４の条件下ではポリマ水溶液のゲル化は進行しないと報告されている。これはゲル化プロセスの初期における、ＳＨの自己酸化が進行する際に必要な脱プロトン化がほとんど進行しないためと考えられる。その結果、ＨＲＰの活性化に必要な過酸化水素が効率よく生成されず、水溶液のゲル化が進行しなかったと考えられる。また先述したように、ＨＲＰ（ＣＯＭＰ ＩＩ）が直接ＳＨを酸化する反応（図１中の反応３）の速度定数が極めて低いことも起因しているといえる。実施例１−１においてもＳＨの自己酸化はほとんど進行しないため、初期段階における系中の過酸化水素濃度は非常に低濃度であると予測されるが、フェノール化合物を系中へ添加することで、ＨＲＰ触媒サイクルの効率が増加し、チオール間のカップリングが促進されるとともに、触媒サイクル内における過酸化水素の生成も効率よく進行するため、過酸化水素を添加しなくても、低濃度のＨＲＰそしてｐＨ７．４という生理条件下においてゲルの形成が進行したと考えられる。
また、作製したハイドロゲルをジチオスレイトール（ＤＴＴ）水溶液（５０ｍＭ，１ｍＬ）を用い還元した結果、１５ｍｉｎ程度で溶解が観察された（図３参照）ことから、高分子間の架橋はジスルフィド結合によるものであることが示唆された。
＜実施例１−２〜１−７＞
フェノール化合物として、チラミン塩酸塩の代わりに、フェノール（実施例１−２）、Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（実施例１−３）、ヒドロキノン（実施例１−４）、レゾルシノール（実施例１−５）、カテコール（実施例１−６）、セロトニン（実施例１−７）をそれぞれ用いた以外は実施例１−１と同様にして実験を行った。
その他のフェノール化合物に関しても同様に、ゲルの形成が観察された（図４参照）。
＜実施例２＞
［カタラーゼの影響］
本検討では過酸化水素を酸素と水に分解するカタラーゼを系中に添加し、高分子水溶液のゲル化に及ぼす影響を確認した。系中で発生する過酸化水素がゲル化に関与しているのであれば、カタラーゼを添加することでゲル化時間が延長すると予測した。また本検討ではフェノール化合物としてチラミン塩酸塩を使用した。
（実験方法）
４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ、チラミン塩酸塩をＰＢＳ（ｐＨ７．４）にそれぞれ溶解させた。得られた４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ水溶液（１００μＬ，１５％（ｗ／ｖ））と、チラミン水溶液（１００μＬ，１５ｍＭ）とを混合した後、ＨＲＰ水溶液（５０μＬ，３０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）を添加した。最後にカタラーゼ水溶液（５０μＬ，０．２７ｍｇ／ｍＬ）を添加し、２２℃で放置した。４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ、チラミン塩酸塩、ＨＲＰ、カタラーゼの最終濃度は、それぞれ５％（ｗ／ｖ）、５ｍＭ、５ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、４．５×１０−２ｍｇ／ｍＬとした。同様にして、カタラーゼを添加していない条件で実験を行った。
（結果）
図５にゲル作製１時間後の写真を示す。カタラーゼを添加していない条件では、４０分程度でゲルの形成が確認された（図５（Ａ））が、カタラーゼを添加した条件では高分子水溶液のゲル化が抑制された（図５（Ｂ））。この結果から、系中で過酸化水素が発生しており、その過酸化水素が高分子水溶液のゲル化に関与していることが明らかとなった。
＜実施例３＞
［ゲル化時間の検討（フェノール化合物）］
使用したフェノール化合物が高分子水溶液のゲル化時間に及ぼす影響を検討した。
（実験方法）
４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ、フェノール化合物をそれぞれＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解させた。４８ウェル プレート ディッシュに、得られたＰＥＧ−ＳＨ水溶液１００μＬ（１０％（ｗ／ｖ））、フェノール化合物水溶液５０μＬ（２０ｍＭ）を加え、撹拌した（スターラ；長さ：１０ｍｍ／幅：３ｍｍ，撹拌速度；２００ｒｐｍ）。次いで、ＨＲＰ水溶液５０μＬ（２０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）をウェルに添加し、ゲル化するまでの時間を測定した。このとき、４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ、フェノール化合物、ＨＲＰの最終濃度がそれぞれ５％（ｗ／ｖ）、５ｍＭ、５ｕｎｉｔｓ／ｍＬとなるようにした。また、フェノール化合物としてチラミン塩酸塩を用い、その最終濃度を０．５，１，５，１０，５０，１００ｍＭと変化させ、チラミン濃度がゲル化時間に及ぼす影響を調べた。さらに、ＨＲＰの最終濃度を５，１０，５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬと変化させて同様に、ＨＲＰ濃度がゲル化時間に及ぼす影響を評価した。
本実験では、混合溶液の液面が隆起し、流動性がなくなった時をゲル化と判断した。
（結果）
それぞれのフェノール化合物を用いて評価した高分子水溶液のゲル化時間を表１に示す。各条件におけるゲル化時間は、チラミンが約３０ｍｉｎ程度と、最も速かったのに対し、カテコールでは１２ｈ以上を要するという結果が得られた。これはフェノール化合物の種がゲル化時間に大きな影響を及ぼすことを意味している。この原因は現段階では不明であるが、ＨＲＰの基質認識、および生成するフェノキシラジカルの安定性が関与していると考えられる。
さらに、高濃度のチラミン条件下１００，２００ｍＭにおいてゲル化時間の測定を行った（その他の成分濃度はＰＥＧ−ＳＨ，５％（ｗ／ｖ）；ＨＲＰ，５ｕｎｉｔｓ／ｍＬとした）。その結果、ゲル化時間はそれぞれ２７．１±１．２ｍｉｎ、３４．８±１．１ｍｉｎと増加する傾向を示した。この増加は先述したように系中におけるジチラミンの形成がラジカル転位反応を阻害したことが一因と考えられる。
また、非特許文献３の結果では、ゲル化時間は最短で１１０ｍｉｎ程度であったことから、本ゲル化プロセスを利用することで４倍程度ゲル化時間を短縮することに成功した。また、本系では非特許文献３の系に比べ、ＨＲＰ濃度が非常に低い（約１／３００）ことから、優れた酸化還元応答性ハイドロゲルの作製法になる。
＜実施例４＞
［ゲル化時間の検討（ポリエチレングリコール）］
２つ以上のチオール基を有するポリエチレングリコールの濃度がゲル化時間に及ぼす影響を検討した。
（実験方法）
４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ、チラミン塩酸塩をＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解させた。４８ウェル プレート ディッシュに、得られたＰＥＧ−ＳＨ水溶液１００μＬ（１０％（ｗ／ｖ））、チラミン塩酸塩水溶液５０μＬ（２０ｍＭ）を加え、撹拌した（スターラ；長さ：１０ｍｍ／幅：３ｍｍ，撹拌速度；２００ｒｐｍ）。次いで、ＨＲＰ水溶液５０μＬ（２０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）をウェルに添加し、ゲル化するまでの時間を測定した。このとき、４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ、チラミン塩酸塩、ＨＲＰの最終濃度がそれぞれ５，１０，１５％（ｗ／ｖ）、５ｍＭ、５ｕｎｉｔｓ／ｍＬとなるようにした。
本実験では、混合溶液の液面が隆起し、流動性がなくなった時をゲル化と判断した。
（結果）
４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ濃度を変化させ評価したゲル化時間を表２に示す。高分子水溶液のゲル化時間は４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨの濃度に依存せず、同程度の値を示した（約３０ｍｉｎ）。この結果から、高分子間の反応ではなく、チオールラジカルができるまでの反応がゲル化の律速であることが示唆された。
［還元剤を用いたハイドロゲルの溶解］
実施例で作製したＰＥＧ−ＳＨハイドロゲルは架橋点がジスルフィド結合であることから、還元することで容易に溶解させることが可能である。そこで本検討では還元剤を用いたゲルの溶解挙動を評価した。還元剤としては、穏和な条件下においてゲルの溶解が進行すると考えられる、システインを用いて評価した。また、フェノール化合物にはチラミン塩酸塩を使用した。
（実験方法）
４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ、チラミン塩酸塩をＰＢＳ（ｐＨ７．４）にそれぞれ溶解させた。得られた４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ水溶液（１５０μＬ，１０％（ｗ／ｖ））と、チラミン体水溶液（７５μＬ，２０ｍＭ）とを混合した後、モールドに加え、その後、ＨＲＰ水溶液（７５μＬ，２０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）を添加し、室温（２２℃）で１ｈ静置させることでディスク状のＰＥＧ−ＳＨハイドロゲルを作製した（径：約１５ｍＭ，厚さ：約２ｍＭ）。４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ、ＨＲＰ、チラミン塩酸塩の最終濃度はそれぞれ５％（ｗ／ｖ）、５ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、５ｍＭとした。作製したハイドロゲルを０，１，５，１０ｍＭのシステイン溶液（ｉｎ ＰＢＳ）（５ｍＬ）に浸漬させ、３７℃でインキュベートを行い、ゲル重量の経時変化を評価した。実験開始１時間後、溶解しなかったサンプルに関しては、システイン溶液を新鮮なシステイン溶液に交換し、さらに検討を行った。
（結果）
各条件におけるハイドロゲル重量の経時変化を図７に示す。システイン溶液に浸漬させたハイドロゲルのみが溶解し、ＰＢＳに浸漬させたハイドロゲルの溶解は観察されなかった。この結果から、システインを還元剤として利用することでゲルの溶解が可能であることが示された。また、ＰＢＳに浸漬させた条件におけるゲル重量の増加は、膨潤によるものと考えられる。システイン濃度の影響に関しては、その濃度が高いほど、溶解時間は短縮する傾向にあり、５ｍＭ以上の濃度では３０ｍｉｎ以内と、非常に迅速なゲルの溶解が可能であることが明らかとなった。
＜実施例６＞
［細胞包括実験および放出実験］
従来のＨＲＰ触媒反応を利用したゲル作製法では、系中へ過酸化水素水を直接添加する必要があるが、本実施例のゲル作製法では、基質である過酸化水素は系中で徐々に生成し、ＨＲＰによって迅速に消費されるため非常に穏和なゲル作製法であり、細胞包括担体の作製法に適していると考えられる。そこで本検討では、ＰＥＧ−ＳＨハイドロゲルへの細胞包括実験を行い、ゲル化プロセスが細胞の生存に及ぼす影響を評価した。さらに上記の検討において、アミノ酸の一種であるシステインを用いることで容易にゲルを溶解させることが可能であることが明らかとなっているため、包括細胞の放出実験も同時に行った。
（実験方法）
「細胞包括実験」
４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ、チラミン塩酸塩をＰＢＳ（ｐＨ７．４）にそれぞれ溶解させた。得られた４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ水溶液（２５０μＬ，１０％（ｗ／ｖ））、チラミン水溶液（１００μＬ，２５ｍＭ）およびＬ９２９線維芽細胞懸濁液（ｉｎ ＭＥＭ（１０％ＦＢＳ））（１００μＬ，２×１０６セル／ｍＬ）を混合した後、ＨＲＰ水溶液（５０μＬ，５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）を加え、６ウェル プレート ディッシュに添加し（５００μＬ）、インキュベータ内で１ｈ静置させることでゲルを作製した。４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ、チラミン塩酸塩、ＨＲＰの最終濃度は、それぞれ５％（ｗ／ｖ）、５ｍＭ、５ｕｎｉｔｓ／ｍＬとした。また、細胞播種数は２×１０５セル／ウェルとなるようにした。ゲル作製後、培地を５ｍＬ添加し、その１時間後および５時間後、新鮮培地２ｍＬと交換し、インキュベータ内で静置させた。３時間後および２４時間後、ＰＢＳ（５ｍＬ）でゲルを洗浄し（５回）、−Ｃｅｌｌｓｔａｉｎ−ＤｏｕｂｌｅＳｔａｉｎｉｎｇ Ｋｉｔを用い、生細胞と死細胞を染め分け（緑色が生存している細胞、赤色が死滅した細胞を示す）、蛍光顕微鏡で観察を行い、生細胞数および死細胞数から生存率を算出した。
「放出実験」
前述の操作に準じてゲル内への細胞包括を行い、２４ｈ培養を行った。その後、ＰＢＳ（５ｍＬ）でゲルを洗浄し（５回）、５ｍＬのシステイン溶液（５ｍＭ）を各ウェルに添加し、インキュベータ内で３０ｍｉｎ静置させた。３０ｍｉｎ後、ゲルが溶解していることを確認し、細胞を回収した後、２４ウェルディッシュへ播種した。播種４時間後および４８時間後、顕微鏡による観察を行った。
（結果）
本実施例におけるゲル作製法では系中で生成する過酸化水素がＨＲＰによって迅速に消費されるため、非常に穏和な環境下において高分子間の架橋反応が進行すると考えられる。したがって、実施例のゲル作製法は細胞の３次元培養用の足場材料や細胞固定化担体の作製に非常に適した方法であると考えられる。そこで、ＰＥＧ−ＳＨハイドロゲルへの細胞包括実験を試みた。３ｈ培養後の包括細胞は高い生存率を維持していた（生存率：９８．２±０．５％、図８左側参照）。また２４ｈ後の細胞生存率もほとんど低下していないことが明らかとなった（生存率：９８．９±０．１％、図８右側参照）。次に２４ｈ培養した包括細胞の回収を試みた。５ｍＭシステイン溶液を各ウェルに添加し、３０ｍｉｎインキュベートした後、上澄み溶液の回収、遠心操作を行った後、２４ウェル プレートへ細胞を再播種した。４ｈ後、播種した細胞はディッシュへ接着し、伸展している様子が観察された（図９左側参照）。この際、上澄みの培地から浮遊細胞（死細胞）はほとんど観察されず、また４８ｈ培養後、細胞が増殖している様子が観察されたことから（図９右側参照）、高分子水溶液のゲル化プロセスおよびシステイン溶液を用いたゲルの溶解操作が細胞の生存に対して、穏和であることが明らかとなった。以上の結果から、高い生存率を維持したまま細胞をゲル内へ包括し、放出することに成功した。
＜実施例７＞
［ハイドロゲルの物性評価］
（実験方法）
「レオロジー測定」
４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨの最終濃度を５，１０，１５％（ｗ／ｖ）と変化させ、レオメータ（Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ社）を用いて貯蔵弾性率（Ｇ’）を測定した。その際、周波数を０．１〜１０Ｈｚと変化させて評価を行った。また、チラミン塩酸塩、ＨＲＰの最終濃度はそれぞれ５ｍＭ、５ｕｎｉｔｓ／ｍＬとした。
「平衡膨潤率（ＱＭ）およびゲルコンテンツ評価」
４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ、チラミン塩酸塩、ＨＲＰをＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解させた。４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ水溶液１５０μＬ、チラミン塩酸塩水溶液を７５μＬおよびＨＲＰ水溶液７５μＬを混合した後、モールドに添加した。このとき、４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ、ＨＲＰおよびチラミン塩酸塩の最終濃度がそれぞれ５，１０，１５％（ｗ／ｖ）、５ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、５ｍＭとなるようにした。４時間後、作製したディスク状の４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨハイドロゲル（直径：約１５ｍｍ，厚さ：約２ｍｍ）を、３７℃環境下で１０ｍＬのＰＢＳに３日間浸漬させ、膨潤後のハイドロゲル重量（ＭＳ）を測定した。その後、ハイドロゲルを凍結乾燥させ、ハイドロゲルの乾燥重量（ＭＤ）を測定し、平衡膨潤率（ＱＭ＝Ｍｓ／ＭＤ）を算出した。
１５，３０，４５ｍｇ（Ｗｐ）の４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨをＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解させ、ディスク状の４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨハイドロゲルを作製した（直径：約１５ｍｍ，厚さ：約２ｍｍ）。このとき、４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ、ＨＲＰおよびチラミン塩酸塩の最終濃度がそれぞれ５，１０，１５％（ｗ／ｖ）、５ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、５ｍＭとなるようにした。作製したゲルを、３７℃環境下で１０ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水に３日間浸漬させ、塩および未架橋の４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨを除去した。その後、ハイドロゲルを乾燥させ、ハイドロゲルの乾燥重量（ＷＤ）を測定し、ゲルコンテンツ（ｇｅｌ ｃｏｎｔｅｎｔ＝（ＷＤ／Ｗｐ）×１００）を算出した。
（結果）
４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨの濃度を変化させて得られるハイドロゲルの物性評価を行った。ゲルの貯蔵弾性率（Ｇ’）は高分子濃度の増加とともに増加する傾向を示した（図１０参照）。一方で、ゲルの平衡膨潤率（ＱＭ）は高分子濃度の増加とともに減少する傾向を示した（表３参照）。これらの結果はゲルの架橋密度が関与していると考えられる。つまり、高分子濃度の増加に伴い架橋密度が増加することで上述のような結果になったと考えられる。また、ゲルコンテンツに関してはいずれの条件でも８０％以上を維持していた（表３参照）。
［低チラミン濃度で作製した４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨハイドロゲルのゲルコンテンツ評価（ＨＲＰ濃度変化）］
（実験方法）
１５ｍｇ（Ｗｐ）の４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨをＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解させ、ディスク状の４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨハイドロゲルを作製した（直径：約１５ｍｍ，厚さ：約２ｍｍ）。このとき、４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ、ＨＲＰおよびチラミン塩酸塩の最終濃度がそれぞれ５％（ｗ／ｖ）、５ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、０．５ｍＭとなるようにした。８ｈ後、作製したゲルを３７℃環境下で１０ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水に３日間浸漬させ、塩および未架橋の４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨを除去した。その後、ハイドロゲルを乾燥させ、ハイドロゲルの乾燥重量（ＷＤ）を測定し、ゲルコンテンツ（ｇｅｌ ｃｏｎｔｅｎｔ＝（ＷＤ／Ｗｐ）×１００）を算出した。
（結果）
低チラミン濃度で作製した４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨゲルのゲルコンテンツはＨＲＰ濃度に依存せず、いずれの条件でも９０％の値を示した（表４参照）。この結果から、低チラミン濃度でも高い架橋密度を有するゲルが作製可能であることが明らかとなった。
［細胞接着ペプチドを用いた４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨゲルの機能化］
（実験方法）
システイン残基（Ｃ）を含むペプチドを用い、４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨゲルの機能化を試みた。４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ、チラミン塩酸塩、細胞接着ペプチド（ＧＲＧＤＳＧＧＣ）およびＨＲＰをＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解させた。４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ水溶液（５０μＬ，３０％（ｗ／ｖ））、チラミン水溶液（５μＬ，１５０ｍＭ）およびＧＲＧＤＳＧＧＣ水溶液（９０μＬ，１６．６７ｍＭ）を混合した後、ＨＲＰ水溶液（５μＬ，１５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）を加え、４８ウェル プレート ディッシュに添加し（１５０μＬ）、ＲＧＤペプチド固定化ゲルを作製した。４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ、チラミン塩酸塩、ＨＲＰおよびＧＲＧＤＳＧＧＣの最終濃度は、それぞれ１０％（ｗ／ｖ）、５ｍＭ、５ｕｎｉｔｓ／ｍＬおよび１０ｍＭとした。作製したゲルをＰＢＳで３回、ＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ）で１回洗浄した。洗浄後、Ｌ９２９線維芽細胞が４×１０４セル／ウェルとなるように各ウェルに播種し、２４ｈ培養を行った。培養後、顕微鏡観察を行った。またコントロールとして接着ペプチドを含まないゲルでも同様の検討を行った。
（結果と考察）
培養２４ｈ後、接着ペプチドを固定化したゲルは細胞が接着し、伸展している様子が観察された（図１１左側）。一方で、接着ペプチドを含まないゲルではほとんどの細胞が接着せず、また伸展している様子も観察されなかった（図１１右側）。以上の結果から、システイン残基を含む接着ペプチドを用いることで、生理不活性のＰＥＧハイドロゲルに細胞接着性を付与することに成功した。また、この結果からＲＧＤペプチドだけでなく、その他のペプチドにシステイン残基を組み込むことで様々な機能性ハイドロゲルが作製可能であると考えられる。
＜実施例１０＞
［ハイドロゲルの作製］
８ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ（重量平均分子量２０，０００、ＮＯＦ（日油株式会社）製、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＨＧＥＯ−２００ＳＨ）、チラミン塩酸塩をＰＢＳ（ｐＨ７．４）にそれぞれ溶解させた。これら２種の水溶液を混合した後、ＨＲＰ水溶液を添加し、２２℃で放置した。８ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ、チラミン塩酸塩、ＨＲＰの最終濃度は、それぞれ５％（ｗ／ｖ）、５ｍＭ、５ｕｎｉｔｓ／ｍＬとした。その結果、８ａｒｍＰＥＧ−ＳＨも４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨと同様にＨＲＰ、チラミン塩酸塩を添加した条件でゲル形成が観察された。
以上のように、ＨＲＰ−ＳＨ修飾高分子混合溶液中にフェノール化合物を添加することで、酸化還元応答型ハイドロゲルを作製することが可能であった。本手法は従来の手法に比べ、１）非常に低いＨＲＰ濃度条件、そして２）生理条件下（ｐＨ７．４）においてゲルを作製することが可能、３）比較的速いゲル化時間、といった点が優位である。また、作製したハイドロゲルはシステイン溶液を用いることで容易に溶解させることが可能であった。さらに、材料のゲル化プロセスおよび溶解プロセスは細胞に対し非常に穏和であったことから、本実施例におけるゲル作製法は、細胞の３次元培養用足場材料や、細胞輸送用の担体の作製に適していると考えられる。また、機能性ハイドロゲルを作製することができた。
＜実施例１１＞
［ＳＡ組換体の調製］
ストレプトアビジン（ＳＡ）のＮ末端にＨＨＨＨＨＨＣを、Ｃ末端にＧＧＧＧＹを付加したＳＡ組換体（以下、Ｃ−ＳＡ−Ｙと略記、配列番号１）の発現プラスミドベクター（配列番号３）および、Ｎ末端にＨＨＨＨＨＨＣのみを付加したＳＡ組換体（以下、Ｃ−ＳＡと略記、配列番号２）の発現プラスミドベクター（配列番号４）を遺伝子工学的手法により構築した。各ＳＡ組換体の発現は、Ｔ７ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｉｑ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｈｉｇｈ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ Ｂｉｏｌａｂｓ社より購入）で行った。２５０ｍＬのＬＢ培地（１００ｍｇ／Ｌ Ａｍｐ）で本培養を行い、ＯＤ６００＝１．００に達した時点でＩｓｏｐｒｏｐｙｌ β−Ｄ−１−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を終濃度１ｍＭで添加し、３７℃、１３０ｒｐｍで９時間培養後、遠心分離によって集菌した。
得られた大腸菌のペレットを、バッファＡ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１００ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）に分散させ、リゾチーム１０ｍｇを添加し、４℃、３０ｍｉｎインキュベートした。その後、超音波破砕（３ｍｉｎ×３回）を行い、遠心分離によって、ＳＡ組換体を含む沈殿を得た。上清を捨て、バッファＢ（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １００，ｐＨ８．０）に沈殿を懸濁させ、遠心分離を再度行った。この操作を３回繰返し行い、沈殿の洗浄を行った後に、バッファＡを用いて同様に３回、洗浄を行い、最終的にＳＡ組換体の封入体を得た。
封入体を、６Ｍグアニジン塩酸塩溶液（ｐＨ１．５，１ｍＭ ＤＴＴ）に溶かし、Ｎｉ−ＮＴＡカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィによって精製を行った。精製後のＳＡ組換え体を含む溶液を、３ｍＭ ＤＴＴを含むＴＢＳ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．５）溶液中に、強撹拌しながら滴下し、リフォールディングを行った。リフォールディング後の溶液に対して、硫安沈殿を行い、ＳＡ組換体を沈殿させ、遠心分離によって回収した。得られたＳＡ組換体の沈殿を、３ｍＭ ＤＴＴを含むＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解させ、ゲルを作製する直前に、限外濾過膜を用いて濃縮およびＭｉｌｌｉ−Ｑ水へのバッファ交換を行った。ＳＡ組換体の濃度は、２８０ｎｍにおける吸光度（ε２８０ｎｍ＝１３８，０００Ｍ−１ｃｍ−１）から求めた。
［ＳＡ固定化ゲルの作製］
Ｃ−ＳＡ−ＹまたはＣ−ＳＡを、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ（重量平均分子量２０，０００、ＮＯＦ（日油株式会社）製、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＰＴＥ−２００ＭＡ）と表５の条件で混合し、十分にピペッティングした後に静置してゲル化の様子を観察した。反応はすべて１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファ（ｐＨ８．０）内で行い、室温（２２℃）で反応を進行させた。
ＳＡ固定化ハイドロゲルの作製に成功した。
［ＳＡ固定化ナノゲルの作製］
３．７４ｍＬのヘキサンに界面活性剤（７５ｍｇ Ｓｐａｎ８０，２５ｍｇ，Ｔｗｅｅｎ８０）を加えて十分に溶解させた。
（ａ）上記で作製したヘキサン溶液のうち３７４μＬを採取し、有機相とした。
（ｂ）内水相（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１．２５ｍＭ ４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ，１０Ｕ／ｍＬ ＨＲＰ，１００μＭ Ｃ−ＳＡ−Ｙ，ｐＨ８．０）を３０μＬ作製し、有機相に加えた。
（ｃ）超音波破砕機を用いて、上記の溶液に超音波処理を施し、ｗ／ｏエマルションを作製した（３０ｓｅｃ，Ｄｕｔｙ ｃｙｃｌｅ ３０，Ｏｕｔｐｕｔ３）。
（ｄ）スターラーバーを加えて激しく撹拌しながら室温（２２℃）で１２時間反応させた。
（ｅ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７−Ｃ２−Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ（終濃度３０μＭ）およびヨードアセトアミド（終濃度１ｍＭ）を加え、１５ｓｅｃ超音波照射を行った後に、強撹拌しながら、さらに室温（２２℃）で１時間反応させ、残存するチオール基をクエンチするとともにゲルに蛍光修飾を施した。
（ｆ）１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ３．０を１５０μＬ加えた後に、ボルテックスを用いて懸濁させた。この溶液を１００００ｒｐｍで３０分間遠心し、水相と有機相に分離させ、有機相を除いた。
（ｇ）水相内のナノゲルに６００μＬのヘキサンを加え、ボルテックスを用いて十分に懸濁させ、１００００ｒｐｍで５分間遠心した後に、上清のヘキサンを除いた。この操作を２回行った。
（ｈ）ヘキサン洗浄後のサンプルに６００μＬのＴＨＦを加えてボルテックスを用いて十分に懸濁させ、自然沈降によってＴＨＦ相と水相を分離した後に上清のＴＨＦ相を除いた。この操作を２回行った。２回目以降は、二相に分離しないため、ナノゲルが沈降するのを待った後に、上澄みのＴＨＦを取り除いた。
（ｉ）溶液を１５０μＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水で再懸濁し、透析を行うことで残存するＴＨＦを除いた。
（ｊ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８修飾ビオチン（ＳＡに対して０．５当量）を加え、４℃で１時間反応させた。その後に再度透析を行い、未反応のビオチンを除いた。
（ｋ）精製されたナノゲルを共焦点顕微鏡によって観察した（図１３）。
このように、ＨＲＰ酵素反応を利用したＳＡ固定化ゲルの微粒子化に成功し、そのビオチン結合能を確認した。
＜実施例１２＞
［チオール基修飾ゼラチンを用いた機能性ハイドロゲルの作製］
ゼラチンは、生体内に存在するコラーゲンを部分的に加水分解して得られるタンパク質である。ゼラチンは細胞の接着および増殖を促進するＲＧＤモチーフを有し、細胞適合性が高いことから、細胞培養基材として利用されている。本実施例ではゼラチンに対し、架橋点となるチオール基を修飾したチオール基修飾ゼラチン（Ｇｅｌａ−ＳＨ）を合成し、４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨと共架橋させることで、ＰＥＧゲルの機能化を試みた。また、作製した（ＰＥＧ−ＳＨ）−（Ｇｅｌａ−ＳＨ）ハイドロゲルの物理特性評価も行った。
（実験方法）
［チオール基修飾ゼラチン（Ｇｅｌａ−ＳＨ）の合成］
２．０ｇのゼラチンを１００ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水に溶解させ、その後、１．０ｇのシスタミンを添加した。シスタミンが溶解した後、１．０Ｍ ＨＣｌを用いて、混合溶液のｐＨを４．７５に調整した。その後、０．８６ｇの１−Ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＥＤＣ）を混合溶液に添加し、室温で２時間撹拌した。その際、ｐＨの上昇を防ぐため、１．０Ｍ ＨＣｌを用いてｐＨを４．７５に調節しながら反応を行った。２時間反応を行った後、１．０ＭのＮａＯＨを用いて混合溶液のｐＨを７．０に調節した。その後、還元剤として８．５ｇのＤｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（ＤＴＴ）を混合溶液に添加し、１．０ＭのＮａＯＨを用いてｐＨを８．５に調節し、一晩室温で撹拌した。その後、１．０Ｍ ＨＣｌを用いて混合溶液のｐＨを３．５に調節した後、分画分子量１００００の透析膜に入れ、ｐＨ３．５のＨＣｌ水溶液中で３日間透析することにより、未反応物およびＤＤＴを除去した。その後、凍結真空乾燥を行うことで、チオール基修飾ゼラチン（Ｇｅｌａ−ＳＨ）を得た。Ｅｌｌｍａｎ試薬を用いてチオール基の修飾率を見積もった結果、０．４５ｍｍｏｌ−ＳＨ／ｇ−ｇｅｌａｔｉｎであった。
［平衡膨潤率（ＱＭ）およびゲルコンテンツの評価］
４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ、チラミン塩酸塩およびＧｅｌａ−ＳＨをＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解させた。モールドに４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ水溶液１００μＬ、Ｇｅｌａ−ＳＨ水溶液１００μＬ、チラミン塩酸塩水溶液を５０μＬを加え、その後、５０μＬのＨＲＰ水溶液を添加し、４時間室温で静置させることで、（ＰＥＧ−ＳＨ）−（Ｇｅｌａ−ＳＨ）ハイドロゲルを作製した。作製したゲルを、３７℃環境下で１０ｍＬのＰＢＳ（０．１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム）に４日間浸漬させ、膨潤後のハイドロゲル重量（ＭＳ）を測定した。その後、ハイドロゲルを乾燥させ、ハイドロゲルの乾燥重量（ＭＤ）を測定し、平衡膨潤率（ＱＭ＝ＭＳ／ＭＤ）を算出した。また、各成分の最終濃度は表６となるようにゲルの作製を行った。
［レオメーターを用いた力学特性評価］
レオメーター専用のアルミカップ内で（ＰＥＧ−ＳＨ）−（Ｇｅｌａ−ＳＨ）ハイドロゲルを作製した。周波数を０．１〜１０Ｈｚと変化させ、各ハイドロゲルの貯蔵弾性率（Ｇ’）を測定した。その際、ひずみは０．１％とした。また各成分濃度は実施例７と同様の条件で行った。
（結果と考察）
ハイドロゲルの平衡膨潤率（ＱＭ）を表７に、貯蔵弾性率（Ｇ’）を図１４に示す。ＰＥＧ−ＳＨの濃度が増加すると共にハイドロゲルの平衡膨潤率は減少し、貯蔵弾性率は増加した。一般的にこれらの物性は高分子間の架橋密度に起因しており、架橋密度が高いほど膨潤率は減少し、貯蔵弾性率は増加する。本実施例におけるゲルの作製条件では、ゲルコンテンツが全て８０％以上であることから、高分子間の架橋反応は十分に進行していることが示唆される。また、混合溶液中におけるチオール基濃度はＰＥＧ−ＳＨの濃度が増加するとともに増加し、それに起因して得られるハイドロゲルの架橋密度も増加することが予測される。従って上述のような結果になったと考えられる。
一方で、５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ−ＳＨの条件において作製したハイドロゲルの平衡膨潤率および貯蔵弾性率はＧｅｌａ−ＳＨの濃度に依存せず、同程度の値を示した（表７、図１４参照）。これは、作製したハイドロゲルの架橋密度がほとんど一定であることを意味している。実際に、本実施例ではＧｅｌａ−ＳＨ濃度をＰＥＧ−ＳＨ濃度に比べ、比較的低い値に設定しており、混合溶液中のチオール基の濃度はＧｅｌａ−ＳＨの濃度変化によって著しく変化しない（表８参照）。従って、Ｇｅｌａ−ＳＨが低濃度の条件では、得られるハイドロゲルの物性はＰＥＧ−ＳＨの濃度に依存しており、ＰＥＧ−ＳＨの濃度を変化させることで容易に物性制御が行えることが明らかとなった。
４ａｒｍＰＥＧ−ＳＨ、チラミン塩酸塩、ＨＲＰおよびＧｅｌａ−ＳＨ水溶液を混合した後、混合溶液５００μＬを１２ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ ｄｉｓｈに添加した。ゲル化後１ｍＬのＰＢＳで２回、ＭＥＭ培地で２回洗浄を行った。各ｗｅｌｌにＬ２９２線維芽細胞を２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種した。播種４時間後、各ゲルシートを洗浄し、上澄み液中の細胞を回収した。さらに各ｗｅｌｌにトリプシン溶液を５００μＬ添加し、接着細胞の剥離および回収を試みた。上澄み液およびトリプシン処理後の懸濁液中の細胞を計数し、それらの値から播種４時間後の細胞接着率を算出した。また、ポジティブコントロールとしてゼラチンコートディッシュを用いて同様の検討を行った。
［細胞増殖および細胞シートの作製］
上記と同様の手法で１２ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ ｄｉｓｈ内にゲルシートを作製した。各ｗｅｌｌにＬ２９２線維芽細胞を２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種した。播種３日後および５日後、各ゲルシートを洗浄し、各ｗｅｌｌにトリプシン溶液を５００μＬ添加した。接着細胞を回収した後、計数を行い各ｗｅｌｌ中の細胞数を算出した。また、本実施例でもポジティブコントロールとしてゼラチンコートディッシュを用いて同様の検討を行った。（ＰＥＧ−ＳＨ）−（Ｇｅｌａ−ＳＨ）ゲル上でコンフルエントになるまで細胞を培養し、その後、ｗｅｌｌに１０ｍＭのシステイン溶液５ｍＬを加え３０分間インキュベートを行った。
（結果と考察）
播種４時間後のＬ９２９の顕微鏡写真を図１５に示す。（ＰＥＧ−ＳＨ）−（Ｇｅｌａ−ＳＨ）ゲルシート上では細胞の接着および伸展が観察されたが、Ｇｅｌａ−ＳＨを混合していない条件では細胞の接着は見られなかった（図１５（Ａ）参照）。また、チオール基を修飾していないゼラチンでも同様の検討を行ったが、細胞の接着はほとんど観察されなかった（図１６参照）。これは、ＨＲＰ触媒反応によってＧｅｌａ−ＳＨがＰＥＧ−ＳＨネットワーク内に組み込まれたことを示す結果であり、その他の機能性分子（多糖やペプチド等）も同様の手法によってＰＥＧゲル内へ固定化可能であることが示唆された。上澄み溶液およびゲル上の細胞数から４時間後の細胞接着率を算出した結果、Ｇｅｌａ−ＳＨ濃度の増加と伴に接着率も増加する結果が得られた（図１７（Ａ）参照）。また、Ｇｅｌａ−ＳＨ濃度０．１％（ｗ／ｖ）の条件では播種細胞数の９５％以上が接着しており、ポジティブコントロールであるゼラチンコートディッシュと同程度の値を示した。また、５日間培養後のＰ５Ｇ０．１ハイドロゲル上における細胞数はＰ５Ｇ０．０１ハイドロゲル上における細胞数に比べ４０％増加した（図１７（Ｂ）参照）。これは、Ｐ５Ｇ０．１ハイドロゲル上での細胞の増殖速度がＰ５Ｇ０．０１ハイドロゲル上のものに比べて速いことを意味している。また、５日培養後の細胞の形態写真からもＰ５Ｇ０．１ハイドロゲル上の細胞密度が、Ｐ５Ｇ０．０１ハイドロゲル上のものに比べ高く（図１８（Ｂ），（Ｄ）参照）、Ｐ５Ｇ０．１ハイドロゲル上での細胞の増殖速度がＰ５Ｇ０．０１ハイドロゲル上のものに比べて速いことが示唆された。また、Ｐ５Ｇ０．１ハイドロゲル上での細胞の増殖速度および形態、ゼラチンコートディッシュと同程度であった。
また、ＰＥＧ−ＳＨ濃度を変化させた条件ではいずれも９０％以上の細胞が接着していた。しかしながら、２．５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ−ＳＨで作製したゲル上での細胞接着率はその他のゲルに比べ、わずかに低い値を示した（図１７（Ａ）参照）。これは、ゲルの強度が関与していると考えられる。線維芽細胞はより強度が高い基材への接着が促進すると報告されている。本実施例でもＰ２．５Ｇ０．１ハイドロゲルのＧ’は、Ｐ１０Ｇ０．１ハイドロゲルの１／１０程度であることから、基材の強度が接着に影響したのではないかと考えられる。しかしながら、増殖速度には大きな差は見られず、初期接着率のわずかな差は細胞の増殖速度に大きな影響を及ぼさないことが示唆された。
Ｐ５Ｇ０．１ゲルシート上においてコンフルエントになるまで細胞を培養した後、１０ｍＭシステイン溶液を添加した。その後、３０分間インキュベートを行った結果、図１９（Ａ），（Ｂ）に示すように細胞シートが得られた。さらに得られた細胞シートをｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈに移した。一晩培養を行った後、２重染色キットを用い、生細胞と死細胞をそれぞれ染め分けた（生細胞：緑、死細胞：赤）。図１９（Ｄ），（Ｆ）および図２０（Ｂ）は染色後の蛍光顕微鏡写真である。死細胞はほとんど観察されず、細胞シートの回収操作が細胞にとって非常に穏和であることが示された。
［配列表］
Claims (7)
- ２つ以上のチオール基を有するポリエチレングリコールを、フェノール化合物の存在下でペルオキシダーゼを用いて架橋させることを特徴とするハイドロゲルの製造方法。
- 請求項１に記載のハイドロゲルの製造方法であって、
前記ペルオキシダーゼが、西洋わさび由来ペルオキシダーゼであることを特徴とするハイドロゲルの製造方法。 - 請求項１または２に記載のハイドロゲルの製造方法であって、
前記フェノール化合物が、チラミン塩酸塩、フェノール、Ｎ−グリシル−Ｌ−チロシン、ヒドロキノン、レゾルシノール、カテコール、およびセロトニンのうちの少なくとも１つであることを特徴とするハイドロゲルの製造方法。 - 請求項１〜３のいずれか１項に記載のハイドロゲルの製造方法であって、
前記２つ以上のチオール基を有するポリエチレングリコールおよび１つ以上のチオール基を有するチオール化合物を、前記フェノール化合物の存在下で前記ペルオキシダーゼを用いて架橋させることを特徴とするハイドロゲルの製造方法。 - 請求項１〜３のいずれか１項に記載のハイドロゲルの製造方法であって、
前記２つ以上のチオール基を有するポリエチレングリコールおよび１つ以上のチオール基を有するフェノール化合物を、前記ペルオキシダーゼを用いて架橋させることを特徴とするハイドロゲルの製造方法。 - 包括対象物の存在下で、２つ以上のチオール基を有するポリエチレングリコールを、フェノール化合物の存在下でペルオキシダーゼを用いて架橋させてハイドロゲルを生成させ、前記包括対象物を前記ハイドロゲルで包括することを特徴とする包括対象物の包括方法。
- 包括対象物の存在下で、２つ以上のチオール基を有するポリエチレングリコールを、フェノール化合物の存在下でペルオキシダーゼを用いて架橋させてハイドロゲルを生成させ、前記ハイドロゲルで包括した包括対象物について、還元剤を用いて前記ハイドロゲルを溶解させて前記包括対象物を放出することを特徴とする包括対象物の放出方法。
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