JPWO2014188911A1 - 光分解性架橋剤、光分解性ゲル、細胞培養器具、細胞配列・分別装置、細胞配列方法、細胞分別方法、組織体形成方法および組織体 - Google Patents
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Abstract
Description
現在、細胞アッセイはハイスループットシステムの普及により、創薬スクリーニングの幅広い場面で利用されており、近年ではインクジェット方式などの液体ハンドリング技術が利用できるようになり、更なるハイスループット化が進んでいる。また、一度のアッセイでより多くの情報量を取得するハイコンテツ化へと技術のトレンドは移行してきている。
一方、一般的な細胞アッセイで利用されている単層培養においては、細胞周囲の環境が動物体内の環境と大きく異なっているため、培養細胞では本来体内で発現すべき機能の多くを喪失しているという問題があった。
次世代の細胞アッセイ技術では、生体内の三次元構造を模倣した組織体を人工的に再構成し、より機能の高い組織体を利用したより信頼性の高いアッセイを適用することで、より高いvivo−vitro相関が期待されている。
ハイドロゲルは、光分解性の基を分子内に組み込むことで光分解性が付与され、光による加工が可能な光分解性ゲルが開発されている。光分解性ゲルとしては、例えばポリエチレングリコールを主鎖とし、ニトロベンジル基を分子内に有するものがある(特許文献1及び非特許文献4)。このような構成を持った高分子モノマーから形成されるハイドロゲルの物性は、光照射によって時間的・空間的に制御可能であり(非特許文献5及び6)、光分解は生細胞との適合性が高い(非特許文献4及び7)。
しかし、これまでに報告されている光分解性ゲルは、ラジカル重合を利用してゲル化されるため、酸素の存在下で重合すると酸素の影響を受けて劣化することがある。また、ラジカルが細胞や生理活性物質にダメージを与えてしまう、また、主鎖として使用できる高分子化合物が、ラジカル重合できるモノマーの重合物に限定されるため、その利用が限定されてしまっている等の問題があった。
発明者らは、ラジカル重合を利用せず、高分子化合物と混合するだけで架橋反応が起こり、光分解性ゲルを形成可能な光分解性架橋剤の開発を行ってきた(特許文献2)。
また、前記光分解性架橋剤を有する光分解性ゲル、該光分解性ゲルを有する細胞培養器具、該細胞培養器具を使用する細胞配列・分別装置、並びに該細胞培養器具を用いる細胞配列法、及び細胞分別方法、並びに該光分解性ゲルを用いた組織体及び組織体形成方法の提供を課題とする。
[1]3以上の分岐鎖を有するポリエチレングリコール主鎖、及び前記分岐鎖を有するポリエチレングリコール主鎖の末端に配置された光分解性のベンジル基、を含み、
前記ベンジル基は、アミノ基又はヒドロキシル基に対する反応性を有する活性エステル基、及び、一つまたは複数のニトロ基を、当該ベンジル基のベンゼン環に有する、光分解性架橋剤。
[2]前記活性エステル基がN−ヒドロキシコハク酸イミドの誘導体である[1]に記載の光分解性架橋剤。
[3]前記分岐鎖におけるエチレングリコールの平均繰り返し数が20から500の範囲にある[1]又は[2]に記載の光分解性架橋剤。
[4]前記分岐鎖の数が4又は8である[1]〜[3]のいずれか一つに記載の光分解性架橋剤。
[5]前記ポリエチレングリコールの主鎖が、ネオペンチル骨格を有する[1]〜[4]のいずれか一つに記載の光分解性架橋剤。
[6][1]〜[5]のいずれか一つに記載の光分解性架橋剤、及び分子内に合計2以上のアミノ基又はヒドロキシル基を有する高分子化合物、を反応させて得られ、前記高分子化合物のアミノ基またはヒドロキシル基が、前記光分解性架橋剤の活性エステル基と縮合して架橋されていることを特徴とする光分解性ゲル。
[7]前記高分子化合物が、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、塩基性多糖類、タンパク質、およびこれらのうちいずれかの誘導体からなる群より選択される少なくとも1つである、[6]に記載の光分解性ゲル。
[8]前記高分子化合物が、分岐型のポリエチレングリコール誘導体である[6]又は[7]に記載の光分解性ゲル。
[9]前記高分子化合物が、ゼラチンである[6]又は[7]に記載の光分解性ゲル。
[10][6]〜[9]のいずれか一つに記載の光分解性ゲルからなる層が、細胞培養基材の表面に形成されている細胞培養器具。
[11]前記細胞培養基材の少なくとも表面が、スチレン系樹脂または細胞接着性材料からなる、[10]に記載の細胞培養器具。
[12][10]又は[11]に記載の細胞培養器具、及び該細胞培養器具に光を照射する照射部を備え、
前記照射部は、光源、及び前記光源からの光を該細胞培養器具の表面の任意の一部領域にのみ照射させる照射領域調整部、を有する細胞配列・分別装置。
[13][10]又は[11]に記載の細胞培養器具の一部領域にのみ光を照射し、前記一部領域の光分解性ゲルを選択的に分解することによって、前記一部領域の細胞、及び当該一部領域以外の領域にある細胞を分別する工程を有する、細胞分別方法。
[14][10]又は[11]に記載の細胞培養器具の一部領域にのみ光を照射し、前記一部領域の光分解性ゲルを選択的に分解することによって、前記一部領域に細胞を配列する工程を有する、細胞配列方法。
[15]
(I)[6]に記載の光分解性ゲルを形成する工程;
(II)光照射によって前記光分解性ゲルの形状を規定する工程;
(III)前記光分解性ゲルに細胞を播種する工程;及び
(IV)細胞を培養する工程
を含む、組織体形成方法。
[16]
(I)細胞を内包させた、[6]に記載の光分解性ゲルを形成する工程;
(II)光照射によって前記光分解性ゲルの構造を規定する工程;及び
(III)細胞を培養する工程
を含む、組織体形成方法。
[17][6]〜[9]のいずれか一つに記載の光分解性ゲル、及び細胞、
を含む組織体。
前記ベンジル基は、アミノ基又はヒドロキシル基に対する反応性を有する活性エステル基、及び、一つまたは複数のニトロ基を当該ベンジル基のベンゼン環に有する化合物である。
前記光分解性架橋剤としては、例えば、下記式一般式(1)で表される化合物が挙げられる。
Zは、光分解性のベンジル基を表し、前記ベンジル基は、アミノ基又はヒドロキシル基に対する反応性を有する活性エステル基、及び、一つまたは複数のニトロ基をベンゼン環に有する。
複数のA1は、連結基を表し、それぞれ独立に単結合、又は炭素原子数1〜20の直鎖状もしくは分岐鎖状のアルキル基を表し、
該アルキル基中の1個又は非隣接の2個以上の−CH2−はそれぞれ独立して−CH=CH−、−C≡C−、−O−、−CO−、−COO−、−OCO−、又はシクロへキシレン基によって置換されていてもよい。
pは1以上の整数を表し、複数存在するR2及びR4は同一でも異なっていてもよい。R1〜R4のうち少なくとも3つ以上のRがZを含み、2つ以上のRが−O(CH2CH2O)n−Zであることとする。
エチレングリコールの繰り返し数を上記範囲に設定することで、ゲルの水に対する溶解度を高めることができ、製造時および使用時において扱いの容易で、状態の均一な光分解性ゲルを得ることができる。
係るベンジル基としては、下記一般式(2)又は(3)で表される基が好ましい。
星印は、エチレングリコールの酸素原子との結合位置を表す。
R5は、水素もしくは炭素数1〜6の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基を表し、炭素数1〜6の直鎖状のアルキル基がより好ましく、メチル基が特に好ましい。R6は、炭素数1〜6の直鎖状もしくは分岐鎖状のアルキル基、又は炭素数1〜6の直鎖状もしくは分岐鎖状のアルコキシ基を表し、炭素数1〜6の直鎖状のアルコキシ基がより好ましく、メトキシ基が特に好ましい。R7は、アミノ基又はヒドロキシル基に対する反応性を有する活性エステル基を表し、N−ヒドロキシコハク酸イミド誘導体が好ましく、下記一般式(4)で表される誘導体がより好ましい。
前記一般式(1)で表される化合物において、該化合物は、具体的には下記一般式(7)及び(8)で表される化合物であることが好ましい。
前記一般式(9)で表される化合物は、具体的には下記一般式(10)又は(11)で表される化合物であることが好ましい。
4分岐又は8分岐型のポリエチレングリコール(または誘導体)は合成しやすく、また、入手も容易であることから、前記一般式(1)で表される化合物において、ポリエチレングリコールが4分岐又は8分岐(分岐鎖数が4つまたは8つ)であることが好ましい。
即ち、本発明の光分解性架橋剤としては、下記一般式(15)又は(16)で表される化合物がより好ましい。
図1および図2に示すように、主鎖2はポリエチレングリコール(PEG)である。ニトロベンジル基を含む基3は、アミド結合部5(―NHCO―)を介して主鎖2に結合している。
前記一般式(1)で表される化合物の製造方法について説明する。
前記一般式(1)で表される化合物は、3分岐以上の分岐鎖を有する、ポリエチレングリコール主鎖、及び前記分岐鎖の末端に配置された光分解性のベンジル基、を含み、前記ベンジル基は、アミノ基又はヒドロキシル基に対する反応性を有する活性エステル基、及び、一つまたは複数のニトロ基を当該ベンジル基のベンゼン環に有する化合物である。以下に、前記分岐の末端に前記光分解性のベンジル基を配置し、前記ベンジル基に活性エステル基を配置する反応を説明する。
本発明の光分解性ゲルは、本発明の光分解性架橋剤、及び分子内に合計2以上のアミノ基またはヒドロキシル基を有する高分子化合物、を反応させて得られ、前記高分子化合物のアミノ基またはヒドロキシル基が、前記光分解性架橋剤の活性エステル基と縮合して架橋されていることを特徴とする光分解性ゲルである。
高分子化合物は、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、塩基性多糖類、タンパク質、およびこれらのうちいずれかの誘導体からなる群より選択される少なくとも1つであることが好ましい。
ポリエチレングリコール(または誘導体)は、末端にアミノ基を有することが望ましい。
ポリエチレングリコール(または誘導体)の分子量は1万から4万の範囲にあることが好ましい。
ゼラチンの強度は特に制限されないが、200〜400ブルームが好ましく、250〜350ブルームがより好ましい。
前記アミノ基は光分解性架橋剤の活性エステル基とアミド結合を形成し、前記ヒドロキシル基は活性エステル基とエステル結合を形成する。これによって、網目構造が形成され、ゲル化が進行し、光分解性ゲルが生成する。
本発明では、架橋反応を促進させるための添加剤は特に必要ないため、高分子化合物と光分解性ゲルとを混合するだけで架橋反応が起こり、ゲル化が進行する。また、反応時の温度は常温でよい。
また、本発明における架橋反応は溶存酸素の影響を受けないため、薄膜状のゲルの形成が容易である。
高分子化合物の使用量は、例えば4分岐型のポリエチレングリコール(または誘導体)の場合、光分解性ゲル中に2.5重量%以上含有されるように設定することが好ましく、ゼラチンの場合、光分解性ゲル中に1.0重量%以上含有されるように設定することが好ましい。
高分子化合物6は、末端にアミノ基8を有する4分岐型のポリエチレングリコール誘導体である。
高分子化合物6と光分解性架橋剤1とを混合すると、高分子化合物6のアミノ基は、光分解性架橋剤1の活性エステル基4と縮合して架橋される。
これによって、高分子化合物6は、光分解性架橋剤1を介して他の高分子化合物6と結合し、網目構造を有する光分解性ゲル10が生成する。
高分子化合物7は、分子内にアミノ基8を有するゼラチンである。
高分子化合物7と光分解性架橋剤1とを混合すると、高分子化合物7のアミノ基は、光分解性架橋剤1の活性エステル基4と縮合して架橋される。
これによって、高分子化合物7は、光分解性架橋剤1を介して他の高分子化合物7と結合し、網目構造を有する光分解性ゲル10’が生成する。
図4Aは、光分解性架橋剤のニトロベンジル基の分解を示すものである。ニトロベンジル基を含む基3は、例えば波長330〜380nmの紫外線などの光の照射により、破線位置で分解可能である。
ニトロベンジル基を含む基3は、アミド結合部5のアミノ基との間の結合が切断され、ニトロベンジル基3’となる。なお、ニトロベンジル基の構造によっては、前記光照射によりニトロベンジル基を含む基3と活性エステル基4との結合が切断されることもある。
図4Bと図4Cは、それぞれ光分解性ゲル10と10’が、光の照射により分解される様子を模式的に示すものである。光分解性ゲルが分解されることにより、光分解性ゲルは水に溶解する。
ラジカル重合を利用してゲル化される従来の光応答性ゲルおよび光分解性ゲルの製造工程は、重合の際に酸素が存在すると重合反応を阻害し、ゲル化が進行しない。この現象は特に薄膜状のゲルを調製する際に顕著になる。一方、本発明の光分解性架橋剤では、架橋反応時に酸素の影響を全く受けないため、このような重合反応阻害は起こらない。
ラジカル重合反応を利用する場合も無酸素雰囲気条件で反応を行えば薄膜状のゲルを調製することが可能となるかもしれないが、その場合には無酸素条件下で重合反応を行わせるための設備が必要となり、製造工程が複雑になる。
一方、本発明の光分解性架橋剤を用いると、無酸素雰囲気条件が必要ないため、薄膜状のゲルの製造工程が簡略であり、効率的かつ低コストで光分解性ゲルを調製できる。
また、本発明では、架橋反応にラジカル重合を利用しないため、ラジカルによってダメージを受けやすい物質を混合した状態で光分解性ゲルを調製することが可能となる。従って、光分解性ゲルを広範な用途、例えば細胞や生理活性物質を固定化する用途にも使用できる。また、ラジカル重合に対応できないモノマーの重合物も高分子化合物として使用できることから、高分子化合物の選択範囲が広いという利点もある。
本発明の細胞培養器具は、本発明の光分解性ゲルからなる層が、細胞培養基材の表面に形成されていることを特徴とする細胞培養器具である。
光分解性ゲル層の厚さは、100nm〜100μmが好ましく、300nm〜30μmがさらに好ましく、1000nm〜10μmが特に好ましい。
プラスチックとして好適なものとしては、スチレン系樹脂(例えばポリスチレン(PS))、アクリル系樹脂(例えばポリメタクリル酸メチル樹脂(PMMA))、ポリビニルピリジン系樹脂(ポリ(4−ビニルピリジン)、4−ビニルピリジン−スチレン共重合体等)、シリコーン系樹脂(例えばポリジメチルシロキサン樹脂)、ポリオレフィン系樹脂(例えばポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリメチルペンテン樹脂)、ポリエステル樹脂(ポリエチレンテレフタレート樹脂(PET))、ポリカーボネート系樹脂、エポキシ系樹脂等がある。
細胞培養基材は、細胞培養に一般的に用いられる細胞培養ディッシュもしくはマイクロプレートと同様の構造の基材が好ましい。
細胞培養基材は、少なくとも表面が、ポリスチレンまたは細胞接着性材料からなることが好ましい。
細胞接着性タンパク質は、ファイブロネクチン、コラーゲン、ゼラチン、ラミニンからなる群から選択された少なくとも1つであることがより好ましく、ゼラチンが特に好ましい。細胞接着性ペプチドは、アルギニン‐グリシン‐アスパラギン酸というアミノ酸配列(RGD配列)を有することが好ましい。
図5は、本発明の細胞配列・分別装置の一例であって、細胞培養器具11を保持する保持台12と、細胞培養器具11に光を照射する照射部13を備えている。
照射部13は、光源(図示略)と、細胞培養器具11の任意の一部領域にのみ光照射する照射領域調整部14と、パソコンなどの制御部15とを有する。
照射領域調整部14は、所定のパターン16をなす光を細胞培養器具11に照射することができる。パターン16は表示装置17に表示される。
照射領域調整部14は、レンズ19、ミラー20、レンズ21を経て、細胞培養器具11の任意の領域に光18を照射できる。細胞培養器具11の任意形状の一部領域にのみ光18を照射することもできるし、全領域に光18を照射することもできる。
光源としては、光分解性架橋剤を分解させ得るものが選択され、例えば紫外線、可視光等の光を照射できるもの(例えば紫外線ランプ、可視光ランプ等)が使用できる。
光の波長域は、例えば200〜1000nmを例示できる。特に300〜600nm、なかでも350〜400nmは好適である。照射エネルギーは、通常は0.01〜1000J/cm2、好ましくは0.1〜100J/cm2、より好ましくは1〜10J/cm2である。
なお、光を細胞培養基材の一部領域にのみ照射させるための構成としては、DMDに限らず、液晶シャッターアレイ、光空間変調素子、所定形状のフォトマスク等も採用できる。
次に、本発明の細胞培養器具を使用し、該細胞培養器具の一部領域にのみ光を照射することにより前記一部領域の光分解性ゲルを選択的に分解することによって、前記一部領域の細胞とそれ(当該一部領域)以外の領域にある細胞とを分別する工程を有することを特徴とする細胞分別方法、及び、前記一部領域に細胞を配列する工程を有することを特徴とする細胞配列方法について説明する。
具体例としては、例えば、造血幹細胞、骨髄系幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞などの体性幹細胞や胚性幹細胞、人工多能性幹細胞がある。
また、好中球、好酸球、好塩基球、単球、リンパ球(T細胞、NK細胞、B細胞等)等の白血球や、血小板、赤血球、血管内皮細胞、リンパ系幹細胞、赤芽球、骨髄芽球、単芽球、巨核芽球および巨核球等の血液細胞、内皮系細胞、上皮系細胞、肝実質細胞、膵ラ島細胞等のほか、研究用に樹立された各種株化細胞も本発明の対象となり得る。
光を照射した部分に含まれる光分解性ゲル層は、全てのゲルを分解させてもよいし、すべてのゲルを分解させないで、Z軸方向への分解深度を任意に変化させることが可能である。
以下、図6Aを参照しつつ、第1の例の細胞配列方法を詳しく説明する。図6Aは細胞培養器具30の模式図である。
光分解性ゲル層32は、光分解性ゲルと前記細胞接着性材料とを混合した混合材料であってもよい。
細胞培養器具30に細胞34を播種すると、光分解性ゲル層32の表面33及び光照射によって新たに形成された光分解性ゲル層表面33’にのみ細胞34は付着する。
光分解性ゲル層32の表面33、33’に付着しなかった細胞34は、培地や緩衝液等により洗浄すること等によって細胞培養器具30から除去することができる。これによって、三次元的に加工された光分解性ゲル層32上に細胞34を選択的に配列することができる。
細胞培養基材41の表面に光分解性ゲル層42を形成する。細胞培養基材41の表面は細胞接着性が高い材料、例えばポリスチレンであることが好ましい。細胞培養基材41の表面が細胞接着性材料を含まない場合は、細胞培養基材41上に、細胞接着性材料からなるコート層を形成させてもよい。
光分解性ゲル層42は細胞接着性が低いことが好ましく、光分解性ゲル層42に含まれる本発明の光分解性架橋剤と架橋される高分子化合物は、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、塩基性多糖類、細胞接着性の低いタンパク質、およびこれらのうちいずれかの誘導体からなる群から選択された少なくとも1つであることが好ましく、分岐型のポリエチレングリコール誘導体が特に好ましい。
細胞培養器具40に細胞34を播種すると、光分解性ゲル層42が失われた領域A1の細胞培養基材41の表面にのみ細胞34は付着する。
細胞培養基材41表面に付着しなかった細胞34は、培地や緩衝液等により洗浄すること等によって細胞培養器具30から除去することができる。これによって、領域A1に細胞34を選択的に配列することができる。
次に、図7Aを参照しつつ、第1の例の細胞分別方法を詳しく説明する。図7Aは細胞培養器具50の模式図である。
細胞培養基材51の材料は特に制限されず、前記の材料を用いることができる。光分解性ゲル層32は、細胞接着性が高いことが好ましく、光分解性ゲル層32に含まれる本発明の光分解性架橋剤と架橋される高分子化合物が、前記細胞接着性タンパク質であることが好ましい。
光分解性ゲル層32は、光分解性ゲルと前記細胞接着性材料とを混合した混合材料であってもよい。
剥離した細胞34は、培地や緩衝液等により洗浄すること等によって細胞培養器具50から選択的に除去することができる。
これによって、領域A1の細胞34と、それ以外の細胞34を分別することができる。
細胞培養基材51の材料は特に制限されず、前記の材料を用いることができる。光分解性ゲル層62に含まれる本発明の光分解性架橋剤と架橋される高分子化合物は、分子内に合計2以上のアミノ基またはヒドロキシル基を有する高分子化合物であれば特に制限されず、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、塩基性多糖類、タンパク質、およびこれらのうちいずれかの誘導体からなる群から選択された少なくとも1つであることが好ましく、分岐型のポリエチレングリコール誘導体又はゼラチンであることがより好ましい。
剥離した細胞34は、培地や緩衝液等により洗浄すること等によって細胞培養器具60から選択的に除去することができる。
これによって、領域A1の細胞34と、それ以外の細胞34を分別することができる。
また、領域A1にのみの光照射によって細胞34の分別を行うため、目的の細胞を精度よく分別することができる。
本発明における組織体とは、細胞が三次元的に集合した状態を指し、細胞間に本発明の光分解性ゲルを含んでもよい。前記細胞は本発明の光分解性ゲルを用いて任意の期間培養され、増殖させたり、所望の組織を形成したり、所望の状態に分化されることが好ましい。
(I)本発明の光分解性ゲルを形成する工程;
(II)光照射によって前記光分解性ゲルの形状を規定する工程;
(III)前記光分解性ゲルに細胞を播種する工程;及び
(IV)細胞を培養する工程;
を含むことを特徴とする組織体形成方法について説明する。
細胞培養基材31および光分解性ゲル層32は、第1の例の細胞配列法と同様の構成を用いることができる。
細胞培養器具30に細胞34を播種すると、光分解性ゲル層32の表面33及び光照射によって新たに形成された光分解性ゲル層表面33’にのみ細胞34は付着する。
光分解性ゲル層32の表面33、33に付着しなかった細胞34は、培地や緩衝液等により洗浄すること等によって細胞培養器具30から除去することができる。これによって、三次元的に加工された光分解性ゲル層32上に細胞34を選択的に配列することができる。
その後、細胞34を培養すると、細胞34は加工された光分解性ゲル層32を足場として増殖でき、細胞培養器具30上で、三次元的に組織体を形成することができる。
細胞培養基材41の表面に光分解性ゲル層42を形成する。
細胞培養基材41および光分解性ゲル層42は、第2の例の細胞配列法と同様の構成を用いることができる。
細胞培養器具40に細胞34を播種すると、光分解性ゲル層42が失われた領域A1の細胞培養基材41表面にのみ細胞34は付着する。
細胞培養基材41表面に付着しなかった細胞34は、培地や緩衝液等により洗浄すること等によって細胞培養器具30から除去することができる。これによって、領域A1に細胞34を選択的に配列することができる。
その後、細胞34を培養すると、細胞34は加工された光分解性ゲル層42に規定された形状で増殖でき、細胞培養器具40上で、三次元的に組織体を形成することができる。
まず、細胞培養基材51の表面に光分解性ゲル層32を形成する。
細胞培養基材51および光分解性ゲル層32は、第1の例の細胞分別法と同様の構成を用いることができる。この場合、光分解性ゲル層32上に、光分解性ゲルと細胞接着性タンパクとを含むコート層を形成させることは適さない。
細胞培養器具50の光分解性ゲル層32の一部である領域A1に、フォトマスク35を通して光を照射し、領域A1の光分解性ゲルを分解させる。この領域A1の光分解性ゲルは可溶化し、洗浄により細胞培養基材51表面から除去され、光分解性ゲル層32は三次元的に加工される。また、領域A1の光分解性ゲルに付着した細胞34も細胞培養基材51表面から剥離する。
剥離した細胞34は、培地や緩衝液等により洗浄すること等によって細胞培養器具50から選択的に除去することができる。
これによって、領域A1の細胞34と、それ以外の細胞34を分別する。
その後、細胞34を培養すると、細胞34は加工された光分解性ゲル層32を足場として増殖でき、細胞培養器具50上で、三次元的に組織体を形成することができる。
まず、細胞培養基材51の表面に光分解性ゲル層32を形成する。
細胞培養基材51および光分解性ゲル層32は、第1の例の細胞分別法と同様の構成を用いることができる。この場合、光分解性ゲル層32上に、光分解性ゲルと細胞接着性タンパクとを含むコート層を形成させることは適さない。
その後、細胞34を培養し、細胞培養器具50上に細胞層を形成することができる。
さらに、細胞培養器具50の光分解性ゲル層32の一部である領域A1に、フォトマスク35を通して光を照射し、領域A1の光分解性ゲルを分解させる。この領域A1の光分解性ゲルは可溶化し、洗浄により細胞培養基材51表面から除去され、光分解性ゲル層32は三次元的に加工される。また、領域A1の光分解性ゲルに付着した細胞34も細胞培養基材51表面から剥離する。
剥離した細胞34は、培地や緩衝液等により洗浄すること等によって細胞培養器具50から選択的に除去することができる。
これによって、細胞培養器具50上の細胞層から細胞を選択的に除去することができる。
また、細胞34を加工後のゲル上でさらに培養させることで、細胞34は加工された光分解性ゲル層32を足場として増殖でき、細胞培養器具50上で、三次元的に組織体を形成することができる。
(I)細胞を内包させた前記光分解性ゲルを形成する工程;
(II)光照射によって前記光分解性ゲルの形状を規定する工程;
(III)細胞を培養する工程;
を含むことを特徴とする組織体形成方法について説明する。
細胞培養基材51の表面に、細胞34を内包した光分解性ゲル層62を形成する。
剥離した細胞34は、培地や緩衝液等により洗浄すること等によって細胞培養器具60から選択的に除去することができる。
これによって、領域A1の細胞34と、それ以外の細胞34を分別する。
その後、細胞34を培養すると、細胞34は加工された光分解性ゲル層62に規定された形状で増殖でき、細胞培養器具60上で、三次元的に組織体を形成することができる。
細胞培養基材51の表面に、細胞34が内包された光分解性ゲル層62を形成する。
その後、細胞34を培養し、細胞培養器具60上に三次元的に細胞塊を形成することができる。
細胞培養器具60の光分解性ゲル層62の一部である領域A1に、フォトマスク35を通して光を照射し、領域A1の光分解性ゲルを分解させる。この領域A1の光分解性ゲルは可溶化し、洗浄により細胞培養基材51表面から除去され、光分解性ゲル層62は三次元的に加工され、また、領域A1の光分解性ゲルに内包された細胞34も細胞培養基材51表面から剥離する。
剥離した細胞34は、培地や緩衝液等により洗浄すること等によって細胞培養器具60から選択的に除去することができる。
これによって、領域A1の細胞34と、それ以外の細胞34が分別され、細胞培養器具60上に三次元的に形成された細胞塊から細胞を取り除くことができる。その後、細胞34を培養すると、細胞34は加工された光分解性ゲル層62に規定された形状で増殖でき、細胞培養器具60上で、三次元的に組織体を形成することができる。
細胞培養基材51の表面に、細胞34が内包された光分解性ゲル層62を形成する。
剥離した細胞34は、培地や緩衝液等により洗浄すること等によって細胞培養器具60から選択的に除去することができる。
これによって、領域A1の細胞34と、それ以外の細胞34を分別する。
その後、光照射により露出した細胞培養基材51上又は光分解性ゲル層62上に、細胞34とは別の種類の細胞34’を内包した光分解性ゲル層72をさらに形成してもよい。
光分解性ゲル層62及び72は、例えば領域A1とは異なる領域B1へ、フォトマスク35を通して光照射することにより再度加工することができる。
その後、細胞34、34’を培養すると、細胞34、34’は加工された光分解性ゲル層62、72に規定された形状で増殖でき、細胞培養器具60上で、三次元的に組織体を形成することができる。
[光分解性架橋剤の合成]
以下は、光分解性架橋剤(NHS−PD−4armPEG)の合成方法である。
N,N−ジメチルスルホキシド(DMSO)洗浄した3−(1−piperazino)propyl functionalized silica gel(66 g)のDMSO(130 mL)溶液に4−{4−[1−(9−Fluorenylmethyloxycarbonylamino)ethyl]−2−methoxy−5−nitrophenoxy}butanoic acid(2.7 g)を加え、室温〜還流条件下で数十分〜24時間攪拌した。濾過後、濾取物をDMSOで洗浄し、減圧下、全量が約130 mLになるまでDMSOを留去した。得られた残留物にSUNBRIGHT PTE−100HS(日油株式会社製、9.6 g)のテトラヒドロフラン(THF)溶液を加え、室温〜還流条件下で数十分〜24時間攪拌した。反応混合物から減圧下にてTHFを留去後、残渣を氷冷したエーテルにゆっくり滴下し、数時間〜3日間静置後、析出物を濾取した。析出物を少量のTHFに溶解させ、氷冷したエーテルにゆっくり滴下し、1〜24時間静置後、析出物を濾取した(2回繰り返す)。減圧下、乾燥させた析出物をSephadex LH−20(MeOH)で分離精製し、得られた化合物のTHF溶液にN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)および1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル) カルボジイミド塩酸塩(EDC)を加え、室温〜還流条件下で数十分〜24時間攪拌した。反応混合物から減圧下にてTHFを留去後、ジクロロメタン(CH2Cl2)を加えて希釈した。得られたCH2Cl2溶液を5%塩酸水溶液および飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過後、減圧下溶媒を留去し、少量のTHFに溶解させた残渣をエーテルにゆっくり滴下し、1〜24時間時間静置後、析出物を濾取した(2回繰り返す)。析出物を減圧下乾燥後、目的化合物の光分解性架橋剤を9.80 g得た。
上記の過程と、得られた化合物を図10に示す。
得られた目的化合物についてNMRによる分析を行い、目的の化合物が得られたことを確認した。以下にNMRによる分析結果を示す。
1H−NMR(400MHz, CDCl3):1.35 (m, 2H), 1.53 (d, J = 7.09 Hz, 3H), 1.60 (m, 4H), 2.18 (br t, J = 7.21 Hz, 2H), 2.28 (tt, J = 7.33, 5.98 Hz, 2H), 2.85 (br s, 4H), 2.88 (t, J = 7.33 Hz, 2H),3.41 (s, 2H), 3.43 (t, J = 7.21 Hz, 2H), 3.47‐3.83 (m, O(CH2CH2O)n), 3.94 (s, 3H), 4.15 (t,J = 5.98 Hz, 2H), 5.49 (dq, J = 7.57, 7.09 Hz,1H), 6.39 (br d, J = 7.57 Hz, 1H), 6.91 (s, 1H), 7.56 (s, 1H).
[光分解性ゲルの製造](ゼラチン溶液)
ゼラチン(TypeA、300ブルーム、ブタ皮由来)(Geltin from Porcine skingel strength 300、Sigma Aldrich社)(5w/v%)
溶媒(リン酸緩衝液(DPBS):0.3mM HEPES=1:1、pH7)上記の分量で、ゼラチンと溶媒を37℃で撹拌混合した後、ゼラチン溶液を得た。
(光分解性架橋剤溶液)
光分解性架橋剤(実施例1で合成) 10mM (12.1w/v%)
溶媒(140mM NaCl、10mMフタル酸 水溶液)(光分解性ゲル溶液)ゼラチン溶液と光分解性架橋剤を等量で混合し、ゼラチンベースの光分解性ゲル溶液を得た。
[amino−4arm PEG溶液]
amino−4arm PEG(MW=10,000)(SUNBRIGHT PTE−100PA、日油株式会社製) 10mM (12.1w/v%)
溶媒(リン酸緩衝液(DPBS):0.3M HEPES=1:1、pH7)上記の分量で、PEGと溶媒を混合し、amino−4arm PEG溶液を得た。
[光分解性架橋剤溶液]
光分解性架橋剤(実施例1で合成) 10mM (12.1w/v%)
溶媒(140mM NaCl、10mMフタル酸 水溶液、pH4)(光分解性ゲル溶液)amino−4arm PEG溶液と光分解性架橋剤を等量で混合し、ポリエチレングリコールベースの光分解性ゲル溶液を得た。
実施例2のゼラチンベースの光分解性ゲル溶液(10〜30μL)をアミノコートされたスライドガラス(MASコートスライドガラス、松浪硝子工業株式会社)に塗布した後に、スライドガラスで覆い、光分解性ゲル層を形成させた。ゲル層の厚みは、スライドガラス(厚さ:150μm)またはペットフィルム(厚さ:25μm)により調節した。フォトリソグラフィー用のマスクは、パターンを300dpiの解像度でフィルム印刷し、作成した。
上記のマスクを照射装置とスライドガラスの間に配置することで、ゲルを選択的に露光させ、光分解を行った。照射エネルギーは7.2〜9.0J/cm2で、所望のパターンにゲルが分解されるまで光照射を行った。光源は350〜385nmで、30mW/cm2のものを使用した。光照射により分解されたゲルは、蒸留水中で洗浄除去を行った。
図11は、光照射によってパターン分解された、本発明のゼラチンベースの光分解性ゲルの写真である。本発明のゼラチンベースの光分解性ゲルは、領域A1への選択的な光照射により、直径20μmまで高分解能(XY平面)で分解することが確認された。
実施例3のポリエチレングリコールベースの光分解性ゲル溶液(10〜30μL)をアミノコートされたスライドガラス(MASコートスライドガラス、松浪硝子工業株式会社)に塗布した後に、スライドガラスで覆い、光分解性ゲル層を形成させた。ゲル層の厚みは、スライドガラス(厚さ:150μm)またはペットフィルム(厚さ:25μm)により調節した。
マスクの作製と、ゲルの光分解は実施例4と同様に行った。
図12は、光照射によってパターン分解された、本発明のポリエチレングリコールベースの光分解性ゲルの写真である。本発明のポリエチレングリコールベースの光分解性ゲルは、領域A1への光照射により、直径20μmまで高分解能(XY平面)で分解することが確認された。
図13Cには、0.9J/cm2、1.5J/cm2、3.0J/cm2および9.0J/cm2の照射エネルギーで領域A1への光照射を行い、光分解を行った後の、ゲル層平均深度の計測結果(n=4)を表す。本発明のポリエチレングリコールベースの光分解性ゲルは、照射エネルギーが大きいほど、領域A1でのZ軸方向への分解深度が深くなり、9.0J/cm2の照射エネルギーでは、ゲル内部216μmまで分解されていた。
これらの結果から、本発明の実施例4および実施例5の光分解性ゲルは、XYZのいずれの軸方向においても、光照射による微細加工が可能であることが確認された。
[光分解性ゲルへの細胞の包埋]
実施例3のamino−4arm PEG溶液に、細胞34(マウス線維芽細胞:NIH−3T3)を加え、実施例3と同様に光分解性架橋剤溶液を加え、細胞34を含んだ光分解性ゲル溶液を得た。その後、スライドグラス上に細胞34を内包したゲル層62を形成させ、領域A1への光照射によってパターン分解を行った。ゲル層の形成とゲルのパターン分解は実施例4と同様の方法により行った。
細胞34を内包し、光照射を行ったゲル層62に、LIVE/DEAD assay kit(0.5μLのエチジウムホモダイマー1、2.0μLのカルセインAMを使用(Molecular Probes製))を用いて染色し、細胞34の生死状態を調べた。
染色により、生細胞は緑色蛍光を発し、死細胞は赤色蛍光を発する。
染色後の様子を図14A〜Cに示す。図14Aは光照射前のゲル層62の蛍光観察画像である。図14Bは光照射後のパターン形成されたゲル層62の明視野観察の画像であり、図14Cは図14Bの蛍光観察画像である。光照射後のゲルにおいて、包埋された細胞34のうち、70%以上の細胞34が緑色の蛍光を示した。したがって本発明の光分解性ゲル内に細胞34を包埋し、光照射によってパターン形成を行った後であっても、細胞34が良好な状態で生存可能なことが明らかである。
以上の結果より、本発明の光分解性架橋剤を用いた本発明の光分解性ゲルは、細胞をゲル内で生存させたまま微細な三次元構造を形成可能であることがわかった。したがって、本発明の光分解性架橋剤を用いた本発明の光分解性ゲルは、複雑且つ微細な三次元組織体の形成に好適な、非常に有用性の高い組織工学材料である。
[光分解性ゲルの調製]
10mM amino−4arm PEG(MW=9617、NOF Corp.社製)、又は5%(w/w)ゼラチン(TypeA、300ブルーム、ブタ皮由来)を、リン酸緩衝液(PBS, Invitrogen社製)と0.3M HEPES緩衝液(和光純薬工業社製)(pH=7.0)の等量混液を用いて調整することで、ベースポリマー溶液とした。また、合成したNHS−PC−4armPEG架橋剤(10mM、12.1%w/v)を、10mM フタル酸緩衝液(pH4.0、和光純薬工業社製)により調整することで、架橋剤溶液とした。さらに調整した架橋剤溶液が、140mM NaCl(和光純薬工業社製)となるように調製した。なお、ゼラチン溶液は37℃、その他の溶液は室温にて調整を行った。
ベースポリマー溶液及び架橋剤溶液を調整した後に、等量混合した。アミノコートされたスライドガラス(MASコート、松浪硝子工業株式会社製)上に、光分解性ゲル溶液と架橋剤の混合溶液を、10−30μLの液量でスライドガラス上に塗布した後に、カバーガラスで覆い、光分解性ゲル層を形成させた。その際、ゲル層の厚みは、ポリエチレンテレフタレート(PET)フィルム(厚さ:25μm)又はカバーガラス(厚さ:150μm)で調節した。
[細胞培養]
次に、実施例7で調製した光分解性ゲル上における細胞挙動を評価するために、合成したゲル基剤上へヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)を播種した。本評価には、amino−4arm PEG又はゼラチンをベースポリマーとして調製した光分解性ゲルを用いた。また、HUVEC細胞の培養には、HuMedia EG-2培養液(クラボウ社製)(2%(v/v) ウシ胎仔血清、10ng/mLのヒト表皮成長因子、1.34μg/L ヘミコハク酸ヒドロコルチゾン、50μg/mL ゲンタマイシン、50ng/mL アンフォテリシンB、5ng/mL ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子、10μg/mL ヘパリン含有))を用いて、5%CO2、37℃環境下にて培養した。培養した細胞を0.1% トリプシン含有DPBS溶液へ5分間暴露した後に、細胞回収を行い、最終的な細胞濃度が1.0×107細胞/mLになるよう細胞懸濁液をHuMedia EG-2培養液にて調整した。
amino−4armPEG又はゼラチンで調製した光分解性ゲル上に、HUVEC細胞を播種した。光分解性ゲル上に35μLの細胞懸濁液を用いて播種を行い、ゲル表面全体に細胞を広げた後に、培養器内で静置した。培養開始1時間後、光分解性ゲル表面へ接着しなかった細胞と過剰な培養液をピペットにより吸引除去し、35mm2の培養皿に3mLの培養液を加え、再び培養器内へ静置した。
培養開始1日目、又は3日目に、倒立型顕微鏡にて画像観察を行った。さらに培養3日目の細胞生死判定を行うために、LIVE/DEAD assay kit(0.5μL エチジウムホモダイマー1、2.0μ LカルセインAM(Molecular Probes製))による細胞染色を行った。細胞染色液にて10分間染色を行い、培養細胞をDPBSにより洗浄した後に、倒立型顕微鏡により明視野画像観察及び蛍光画像観察を行った。
また、光照射時の光毒性と合成したゲル分解物の毒性評価を行うために、上述した手法を用いて、同様に細胞生死判定を行った。2.5%(w/v)ゼラチンベースした光分解性ゲル溶液と、1.0%(w/v)NHS−PC−4armPEG架橋剤溶液により合成した光分解性ゲル上でHUVEC細胞を3日間培養した後に、パターン光照射(365nm、125mW/cm2、8−24秒)を行い、さらに37℃で3時間培養することで、ゲル分解物へ細胞暴露試験を行った。試料への光照射は、PC制御型マイクロプロジェクションシステム(DESM−01、エンジニアリングシステム社製)により行った(非特許文献8を参照)。
本実施例では、光分解性ゲル上における細胞挙動を評価するために、モデル細胞としてHUVEC細胞による培養評価を行った。その結果、amino−4armPEGにより調製した光分解性ゲル表面上へは、ほとんどHUVEC細胞が接着しなかった(図15)。これはPEGが細胞非接着性の基材であるためで考えらえる(非特許文献9を参照)。それに対して、ゼラチンにより調製したゲル表面上へは、すべてのHUVEC細胞が接着することが明らかとなった(図16A及び図16B)。
図16A及び図16Bの右パネル及び中央パネルに示されるよう、2.5%(w/v)ゼラチン溶液と1.0%(w/v)又は3.0%(w/v)架橋剤により調製したゼラチンベースの光分解性ゲル上では、培養開始3日目に顕著な細胞増殖が確認され、5.0%(w/v)架橋剤濃度を使用したゲルと比較して、細胞増殖に顕著な違いがみられる。本検討結果より、合成した光分解ゲル上における細胞挙動(基材への細胞接着、基材上での細胞伸長、及び基材上での細胞増殖)の相違は、光分解性架橋剤の濃度に起因する可能性が示唆された。
また同様の手法にて、1.25%(w/v)ゼラチン溶液と0.5-2.5%(w/v)架橋剤により調製した光分解性ゲルでの細胞増殖を調べたところ、図17Bに示したように、2.5%(w/v)ゼラチン溶液を用いた結果と同様の傾向が観察されたため、細胞増殖はゼラチン濃度に依存しないことが明らかとなった。本検討結果より、ゼラチン溶液により合成した光分解性ゲル上における細胞接着は、架橋剤濃度にのみ依存して変化すると考えられる。すなわち、ゼラチン基材上の未反応アミノ残基が影響を受けずに存在しているので、未反応アミノ酸残基が細胞接着と細胞増殖に重要であると考えられる。
[HUVEC細胞のパターニング]
2.5%(w/v)ゼラチン溶液と1.0%(w/v)架橋剤により調製した光分解性ゲル上でのHUVEC細胞のパターニングを検証するため、実施例8と同様に光分解性ゲル上で培養したHUVEC細胞に対して、フォトマスクを介した光照射(1.0〜3.0J/cm2)を行った。さらに、光照射時の光毒性とゲル分解物の細胞毒性を評価するために、LIVE/DEAD assay kitによる細胞生死判定を行った。
(結果)
光照射後のゲルパターン分解により、HUVEC細胞はゲル孔内へ落下し、中心から周辺へと移動した(図18C及び図18D)。図に示される細胞のパターンは、ゲルの光分解によるものである。したがって、ゲル上における細胞制御をマイクロオーダーで実現できる可能性が示唆された。
さらにゲル上にて伸長した細胞に光照射を施した後に、細胞生死判定を行った結果、光照射領域上の細胞と非照射領域上における細胞で、細胞生死に大きな相違は確認されなかった(図18B-図18D)。すなわち、光照射とゲル分解は、細胞の生存へは影響しないことが明らかとなった。
[1]3以上の分岐鎖を有するポリエチレングリコール主鎖、及び前記分岐鎖を有するポリエチレングリコール主鎖の末端に配置された光分解性のベンジル基、を含み、
前記ベンジル基は、アミノ基又はヒドロキシル基に対する反応性を有する活性エステル基、及び、一つまたは複数のニトロ基を、当該ベンジル基のベンゼン環に有する、光分解性架橋剤。
[2]前記活性エステル基がN−ヒドロキシコハク酸イミドの誘導体である[1]に記載の光分解性架橋剤。
[3]前記分岐鎖におけるエチレングリコールの平均繰り返し数が20から500の範囲にある[1]又は[2]に記載の光分解性架橋剤。
[4]前記分岐鎖の数が4又は8である[1]〜[3]のいずれか一つに記載の光分解性架橋剤。
[5]前記ポリエチレングリコールの主鎖が、ネオペンチル骨格を有する[1]〜[4]のいずれか一つに記載の光分解性架橋剤。
[6][1]〜[5]のいずれか1つに記載の光分解性架橋剤、及び分子内に合計2以上のアミノ基又はヒドロキシル基を有する高分子化合物が、前記高分子化合物のアミノ基またはヒドロキシル基と前記光分解性架橋剤の活性エステル基と縮合してアミド結合又はエステル結合を形成していることを特徴とする光分解性ゲル。
[7]前記高分子化合物が、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、塩基性多糖類、タンパク質、およびこれらのうちいずれかの誘導体からなる群より選択される少なくとも1つである、[6]に記載の光分解性ゲル。
[8]前記高分子化合物が、分岐型のポリエチレングリコール誘導体である[6]又は[7]に記載の光分解性ゲル。
[9]前記高分子化合物が、ゼラチンである[6]又は[7]に記載の光分解性ゲル。
[10][6]〜[9]のいずれか一つに記載の光分解性ゲルからなる層が、細胞培養基材の表面に形成されている細胞培養器具。
[11]前記細胞培養基材の少なくとも表面が、スチレン系樹脂または細胞接着性材料からなる、[10]に記載の細胞培養器具。
[12][10]又は[11]に記載の細胞培養器具、及び該細胞培養器具に光を照射する照射部を備え、
前記照射部は、光源、及び前記光源からの光を該細胞培養器具の表面の任意の一部領域にのみ照射させる照射領域調整部、を有する細胞配列・分別装置。
[13][10]又は[11]に記載の細胞培養器具の一部領域にのみ光を照射し、前記一部領域の光分解性ゲルを選択的に分解することによって、前記一部領域の細胞、及び当該一部領域以外の領域にある細胞を分別する工程を有する、細胞分別方法。
[14][10]又は[11]に記載の細胞培養器具の一部領域にのみ光を照射し、前記一部領域の光分解性ゲルを選択的に分解することによって、前記一部領域に細胞を配列する工程を有する、細胞配列方法。
[15]
(I)[6]に記載の光分解性ゲルを形成する工程;
(II)光照射によって前記光分解性ゲルの形状を規定する工程;
(III)前記光分解性ゲルに細胞を播種する工程;及び
(IV)細胞を培養する工程
を含む、組織体形成方法。
[16]
(I)細胞を内包させた、[6]に記載の光分解性ゲルを形成する工程;
(II)光照射によって前記光分解性ゲルの構造を規定する工程;及び
(III)細胞を培養する工程
を含む、組織体形成方法。
[17][6]〜[9]のいずれか一つに記載の光分解性ゲル、及び細胞、
を含む組織体。
[1]ポリエチレングリコール鎖を含む分岐鎖状の鎖状構造を有し、前記鎖状構造の末端に配置された光分解性のベンジル基、を含み、前記末端の数が3以上であり、
前記ベンジル基は、アミノ基又はヒドロキシル基に対する反応性を有する活性エステル基、及び、一つまたは複数のニトロ基を、当該ベンジル基のベンゼン環に有する、光分解性架橋剤。
[2]前記活性エステル基がN−ヒドロキシコハク酸イミドの誘導体である[1]に記載の光分解性架橋剤。
[3]前記ポリエチレングリコール鎖のエチレングリコールの平均繰り返し数が20から500の範囲にある[1]又は[2]に記載の光分解性架橋剤。
[4]前記末端の数が4又は8である[1]〜[3]のいずれか一つに記載の光分解性架橋剤。
[5]前記ポリエチレングリコール鎖が、ネオペンチル骨格を有する[1]〜[4]のいずれか一つに記載の光分解性架橋剤。
[6]分子内に合計2以上のアミノ基又はヒドロキシル基を有する高分子化合物の前記アミノ基又は前記ヒドロキシル基と、前記[1]〜[5]のいずれか1つに記載の光分解性架橋剤の前記活性エステル基によるアミド結合又はエステル結合を有する光分解性ゲル。
[7]前記高分子化合物が、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、塩基性多糖類、タンパク質、およびこれらのうちいずれかの誘導体からなる群より選択される少なくとも1つである、[6]に記載の光分解性ゲル。
[8]前記高分子化合物が、分岐型のポリエチレングリコール誘導体である[6]又は[7]に記載の光分解性ゲル。
[9]前記高分子化合物が、ゼラチンである[6]又は[7]に記載の光分解性ゲル。
[10][6]〜[9]のいずれか一つに記載の光分解性ゲルからなる層が、細胞培養基材の表面に形成されている細胞培養器具。
[11]前記細胞培養基材の少なくとも表面が、スチレン系樹脂または細胞接着性材料からなる、[10]に記載の細胞培養器具。
[12][10]又は[11]に記載の細胞培養器具、及び該細胞培養器具に光を照射する照射部を備え、
前記照射部は、光源、及び前記光源からの光を該細胞培養器具の表面の任意の一部領域にのみ照射させる照射領域調整部、を有する細胞配列・分別装置。
[13][10]又は[11]に記載の細胞培養器具の一部領域にのみ光を照射し、前記一部領域の光分解性ゲルを選択的に分解することによって、前記一部領域の細胞、及び当該一部領域以外の領域にある細胞を分別する工程を有する、細胞分別方法。
[14][10]又は[11]に記載の細胞培養器具の一部領域にのみ光を照射し、前記一部領域の光分解性ゲルを選択的に分解することによって、前記一部領域に細胞を配列する工程を有する、細胞配列方法。
[15]
(I)[6]に記載の光分解性ゲルを形成する工程;
(II)光照射によって前記光分解性ゲルの形状を規定する工程;
(III)前記光分解性ゲルに細胞を播種する工程;及び
(IV)細胞を培養する工程
を含む、組織体形成方法。
[16]
(I)細胞を内包させた、[6]に記載の光分解性ゲルを形成する工程;
(II)光照射によって前記光分解性ゲルの構造を規定する工程;及び
(III)細胞を培養する工程
を含む、組織体形成方法。
[17][6]〜[9]のいずれか一つに記載の光分解性ゲル、及び細胞、
を含む組織体。
[1]下記一般式(1)で表される化合物である光分解性架橋剤。
Zは、光分解性のベンジル基を含み、前記ベンジル基は、アミノ基又はヒドロキシル基と縮合反応可能な活性エステル基、及び、一つまたは複数のニトロ基を前記ベンジル基のベンゼン環に有し、前記活性エステル基がN−ヒドロキシコハク酸イミドの誘導体であり、
複数のA 1 は、連結基を表し、それぞれ独立に単結合、又は炭素原子数1〜20の直鎖状もしくは分岐鎖状のアルキレン基を表し、
該アルキレン基中の1個又は非隣接の2個以上の−CH 2 −はそれぞれ独立して−CH=CH−、−C≡C−、−O−、−CO−、−COO−、−OCO−、又はシクロへキシレン基によって置換されていてもよく、
pは1以上の整数を表し、複数存在するR 2 及びR 4 は同一でも異なっていてもよく、
R 1 〜R 4 のうちの3つ以上がZを含み、R 1 〜R 4 のうちの2つ以上が−O(CH 2 CH 2 O) n −Zである。]
[2]前記ポリエチレングリコール鎖の前記(CH 2 CH 2 O) n で表されるエチレングリコールの平均繰り返し数が20から500の範囲にある前記[1]に記載の光分解性架橋剤。
[3]前記R 1 〜R 4 で表される末端の数が4又は8であり、R 1 〜R 4 は−O(CH 2 CH 2 O) n −Zを表す前記[1]又は[2]に記載の光分解性架橋剤。
[4]ネオペンチル骨格を有する前記[1]〜[3]のいずれか一つに記載の光分解性架橋剤。
[5]分子内に合計2以上のアミノ基又はヒドロキシル基を有する高分子化合物の前記アミノ基又は前記ヒドロキシル基と、前記[1]〜[4]のいずれか1つに記載の光分解性架橋剤の前記活性エステル基によるアミド結合又はエステル結合を有する光分解性ゲル。
[6]前記高分子化合物が、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、塩基性多糖類、タンパク質、およびこれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも1つである、前記[5]に記載の光分解性ゲル。
[7]前記高分子化合物が、分岐型のポリエチレングリコール誘導体である、前記[5]又は[6]に記載の光分解性ゲル。
[8]前記高分子化合物が、ゼラチンである、前記[5]又は[6]に記載の光分解性ゲル。
[9]前記[5]〜[8]のいずれか一つに記載の光分解性ゲルからなる層が、細胞培養基材の表面に形成されている細胞培養器具。
[10]前記細胞培養基材の少なくとも表面が、スチレン樹脂または細胞接着性材料からなる、前記[9]に記載の細胞培養器具。
[11]前記[9]又は[10]に記載の細胞培養器具、及び
該細胞培養器具に光を照射する照射部、
を備え、
前記照射部は、光源、及び前記光源からの光を該細胞培養器具の表面の任意の一部領域にのみ照射させる照射領域調整部、を有する、
細胞配列・分別装置。
[12]前記[9]又は[10]に記載の細胞培養器具の一部領域にのみ光を照射し、前記一部領域の光分解性ゲルを選択的に分解することによって、前記一部領域の細胞、及び当該一部領域以外の領域にある細胞を分別する工程を有する、細胞分別方法。
[13]前記[9]又は[10]に記載の細胞培養器具の一部領域にのみ光を照射し、前記一部領域の光分解性ゲルを選択的に分解することによって、前記一部領域に細胞を配列する工程を有する、細胞配列方法。
[14]
(I)前記[5]〜[8]のいずれか一つに記載の光分解性ゲルを形成する工程;
(II)光照射によって前記光分解性ゲルの形状を規定する工程;
(III)前記光分解性ゲルに細胞を播種する工程;及び
(IV)細胞を培養する工程;
を含む、組織体形成方法。
[15]
(I)細胞を内包させた、前記[5]〜[8]のいずれか一つに記載の光分解性ゲルを形成する工程;
(II)光照射によって前記光分解性ゲルの構造を規定する工程;及び
(III)細胞を培養する工程;
を含む、組織体形成方法。
[16]前記[5]〜[8]のいずれか一つに記載の光分解性ゲル、及び細胞、を含む組織体。
Claims (17)
- 3以上の分岐鎖を有するポリエチレングリコール主鎖、及び前記分岐鎖を有するポリエチレングリコール主鎖の末端に配置された光分解性のベンジル基、を含み、
前記ベンジル基は、アミノ基又はヒドロキシル基に対する反応性を有する活性エステル基、及び、一つまたは複数のニトロ基を、当該ベンジル基のベンゼン環に有する、光分解性架橋剤。 - 前記活性エステル基がN−ヒドロキシコハク酸イミドの誘導体である請求項1記載の光分解性架橋剤。
- 前記分岐鎖におけるエチレングリコールの平均繰り返し数が20から500の範囲にある請求項1に記載の光分解性架橋剤。
- 前記分岐鎖の数が4又は8である請求項1に記載の光分解性架橋剤。
- 前記ポリエチレングリコール主鎖が、ネオペンチル骨格を有する請求項1に記載の光分解性架橋剤。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の光分解性架橋剤、及び分子内に合計2以上のアミノ基又はヒドロキシル基を有する高分子化合物、を反応させて得られ、前記高分子化合物のアミノ基またはヒドロキシル基が、前記光分解性架橋剤の活性エステル基と縮合して架橋されていることを特徴とする光分解性ゲル。
- 前記高分子化合物が、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、塩基性多糖類、タンパク質、およびこれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも1つである、請求項6に記載の光分解性ゲル。
- 前記高分子化合物が、分岐型のポリエチレングリコール誘導体である、請求項6に記載の光分解性ゲル。
- 前記高分子化合物が、ゼラチンである、請求項6に記載の光分解性ゲル。
- 請求項6に記載の光分解性ゲルからなる層が、細胞培養基材の表面に形成されている細胞培養器具。
- 前記細胞培養基材の少なくとも表面が、スチレン樹脂または細胞接着性材料からなる、請求項10に記載の細胞培養器具。
- 請求項10に記載の細胞培養器具、及び
該細胞培養器具に光を照射する照射部、
を備え、
前記照射部は、光源、及び前記光源からの光を該細胞培養器具の表面の任意の一部領域にのみ照射させる照射領域調整部、を有する、
細胞配列・分別装置。 - 請求項10に記載の細胞培養器具の一部領域にのみ光を照射し、前記一部領域の光分解性ゲルを選択的に分解することによって、前記一部領域の細胞、及び当該一部領域以外の領域にある細胞を分別する工程を有する、細胞分別方法。
- 請求項10に記載の細胞培養器具の一部領域にのみ光を照射し、前記一部領域の光分解性ゲルを選択的に分解することによって、前記一部領域に細胞を配列する工程を有する、細胞配列方法。
- (I)請求項6に記載の光分解性ゲルを形成する工程;
(II)光照射によって前記光分解性ゲルの形状を規定する工程;
(III)前記光分解性ゲルに細胞を播種する工程;及び
(IV)細胞を培養する工程;
を含む、組織体形成方法。 - (I)細胞を内包させた、請求項6に記載の光分解性ゲルを形成する工程;
(II)光照射によって前記光分解性ゲルの構造を規定する工程;及び
(III)細胞を培養する工程;
を含む、組織体形成方法。 - 請求項6に記載の光分解性ゲル、及び細胞、
を含む組織体。
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