JPWO2012117855A1 - 核酸多糖複合体 - Google Patents
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Abstract
Description
そのため、RNA干渉効果を有効に奏させるという技術的観点からは、ホスホロチオエート化されたポリデオキシアデニンを付加したsiRNA(特に21mer型のsiRNA)とシゾフィランの複合体は採用し得ないと考えられているのが現状である。
項1.共刺激因子に対するsiRNAにポリデオキシアデニンを付加したポリヌクレオチドと、シゾフィランとの核酸多糖複合体を含む、移植治療における拒絶反応を抑制するための製剤。
項2. 前記siRNAが21mer型であって、該siRNAのセンス鎖にホスホジエステル結合のうち少なくとも一部がホスホロチオエート化されたポリデオキシアデニンを付加したポリヌクレオチドが付加されている、項1に記載の製剤。
項3.前記ポリデオキシアデニンのホスホジエステル結合のうち少なくとも50%以上がホスホロチオエート化されている、項1または2に記載の製剤。
項4.前記共刺激因子が、Dectin-1発現細胞において発現している共刺激因子である、項1〜3のいずれかに記載の製剤。
項5.前記共刺激因子が、CD40、B7.1およびB7.2のいずれか一つである、項1〜4のいずれかに記載の製剤。
項6.前記共刺激因子が、CD40である、項1〜4のいずれかに記載の製剤。
項7.移植治療が、腎臓移植、心臓移植、肺移植、骨髄移植、皮膚移植、または角膜移植である、項1〜6のいずれかに記載の製剤。
項8.共刺激因子に対するsiRNAにポリデオキシアデニンを付加したポリヌクレオチドと、シゾフィランとの核酸多糖複合体を、移植臓器または組織に対する拒絶の治療または予防が必要とされる動物に投与する工程を含む、移植治療における拒絶反応の抑制方法。
項9.共刺激因子に対するsiRNAにポリデオキシアデニンを付加したポリヌクレオチドと、シゾフィランとの核酸多糖複合体の、移植治療における拒絶反応を抑制するための製剤の製造のための使用。
項10.標的遺伝子に対するsiRNAに、ホスホジエステル結合のうち少なくとも一部がホスホロチオエート化されたポリデオキシアデニンを付加したポリヌクレオチドとシゾフィランとの核酸多糖複合体。
項11.前記siRNAが21mer型であって、該siRNAのセンス鎖にホスホジエステル結合のうち少なくとも一部がホスホロチオエート化されたポリデオキシアデニンを付加したポリヌクレオチドが付加されている、項10に記載の核酸多糖複合体。
項12.前記ポリデオキシアデニンのヌクレオチド数が、30〜50である、項10又は11に記載の核酸多糖複合体。
項13.前記ポリデオキシアデニンのホスホジエステル結合のうち少なくとも50%以上がホスホロチオエート化されている、項10〜12のいずれかに記載の核酸多糖複合体。
項14.前記標的遺伝子が、Dectin-1発現細胞において発現している遺伝子である、項10〜13のいずれかに記載の核酸多糖複合体。
項15.前記標的遺伝子が、Dectin-1発現細胞において発現している共刺激因子である、項10〜14のいずれかに記載の核酸多糖複合体。
項16.前記共刺激因子が、CD40遺伝子である、項15に記載の核酸多糖複合体。
項17.項10〜16のいずれかに記載の核酸多糖複合体を含む医薬組成物。
項18.項1〜6のいずれかに記載の核酸多糖複合体を含むDectin-1発現細胞の機能調節剤。
項19.前記Dectin-1発現細胞の機能が免疫調節機能である、項18に記載の機能調節剤。
項20.項10〜16のいずれかに記載の核酸多糖複合体を含む免疫調節剤。
項21.Dectin-1発現細胞が担う生体内機能に影響を及ぼす遺伝子に対するsiRNAにホスホジエステル結合のうち少なくとも一部がホスホロチオエート化されたポリデオキシアデニンを付加したポリヌクレオチドと、シゾフィランとの核酸多糖複合体を、Dctin-1を発現する細胞に接触させる工程を含む、Dectin-1発現細胞の機能調節方法。
項22.前記Dectin-1発現細胞の機能調節が免疫調節である、項21に記載の方法。
項23.Dectin-1発現細胞が担う生体内機能に影響を及ぼす遺伝子に対するsiRNAにホスホジエステル結合のうち少なくとも一部がホスホロチオエート化されたポリデオキシアデニンを付加したポリヌクレオチドと、シゾフィランとの核酸多糖複合体を、免疫機能の調節を必要とする動物に投与することを特徴とする、免疫機能の調節方法。
項24.Dectin-1発現細胞が担う生体内機能に影響を及ぼす遺伝子に対するsiRNAにホスホジエステル結合のうち少なくとも一部がホスホロチオエート化されたポリデオキシアデニンを付加したポリヌクレオチドと、シゾフィランとの核酸多糖複合体の、免疫機能調節剤の製造のための使用。
本発明の核酸多糖複合体は、標的遺伝子に対するsiRNAを構成するセンス鎖又はアンチセンス鎖の少なくとも1つの末端に、ポリデオキシアデニンテイルが付加され、当該ポリデオキシアデニンの1本鎖とシゾフィランの2本鎖により三重螺旋を形成している。また、本発明においては、前記ポリデオキシアデニンテイルにおいて、ホスホジエステル結合の少なくとも1部がホスホロチオエート化されていてもよい。
また、SPGへの機能性分子の結合部位や当該機能性分子を連結させるリンカーを結合する部位については、特に限定されるものではないが、SPGのβ-1,3-グルカンの主鎖から分枝された1,6-グルコピラノシド結合を持つグルコースの1,2-ジオール部位と置換されて結合していることが好ましい。
本発明は、更に、Dectin-1発現細胞が担う生体内機能に影響を及ぼす遺伝子に対するsiRNAにポリデオキシアデニンを付加したポリヌクレオチドと、シゾフィランとの核酸多糖複合体を有効成分として含有する免疫機能調節剤を提供する。
以下の実施例で用いた核酸多糖複合体は次のようにして形成した。分子量約15万のSPGを、0.25N水酸化ナトリウム水溶液に最終濃度15mg/ml になるように調製した後、1時間振動攪拌して4℃で1日静置し変性させた。330mMの第1リン酸ナトリウムに溶解させたS化poly(dA)を付加したsiRNAの溶液を、この変性SPG溶液に加えて中和し4℃で24時間以上静置した。この時、siRNA 1モルに対してSPGが0.27モルとなるようにした。なお、S化poly(dA)を付加したsiRNAは、siRNAのセンス鎖5’末端にホスホロチオエート化された40個のデオキシアデニンが、リン酸エステル結合によって連結されたものである。以下の実施例において、S化poly(dA)をdA40(s)と略記することがある。また、以下の実施例で使用されるS化ポリデオキシアデニンのS化率はいずれも100%である。
表1に記載の条件になるように、試料をリン酸緩衝液(PBS)もしくは細胞培養培地(10%FBS+RPMI(FBS; バイオロジカルインダストリー社 Cat# 04-001-1A、RPMI; 和光純薬工業社 Cat# 189-02025))を加え調製した。その試料を37℃で4時間もしくは24時間インキュベートした後、12.5%ポリアクリルアミドゲル(Tris-ホウ酸-EDTA(TBE))を用いて100ボルト、60分の条件で電気泳動を行い、SYBRGold(ライフテクノロジーズジャパン社)で染色した。
(3-1)非S化dAテイル核酸多糖複合体のDicer感受性
本実施例においては、Recombinant human dicer enzymeキット(Genlantis社製:Cat# T510002)を使用した。また、下記組成(A〜E)のプレミックスを調製した。
B. 10mM ATP : 1μl
C. 50mM MgCl2 : 0.5μl
D. Dicer Reactionバッファー: 4μl
E. Recombinant Dicer Enzyme (1 Unit) : 2μl
PCRチューブに上記のB〜DもしくはB〜Eのサンプルを混合した後、Aの核酸試料を添加した。その後ヌクレアーゼフリーの蒸留水により最終容量を10μlに合わせた。その後、37℃にて15時間インキュベーションした。インキュベーション終了後、反応停止液で反応を終了させた。15%ポリアクリルアミドゲル(Tris-borate-EDTA(TBE))を用いて150V、80分で電気泳動を行い、SYBR(r)Gold(ライフテクノロジーズジャパン社)で染色した。
上記(3-1)と同様の方法により、S化されたdAテイルを有する核酸多糖複合体のDicer感受性を評価した。
Dual Luciferase発現ベクターpsiCHECKTM-2(プロメガ社 Cat# C8021)を、LipofectamineTM LTX(ライフテクノロジーズジャパン社 Cat# 15338-500)を用いHEK293細胞に導入した。この時、1ウェルあたりの細胞数を5万個となるよう揃えた。これに、dA40-siLuc (21nt)又はdA40-siLuc (27nt)を、TransITTM-TKO(タカラバイオ社、Cat# V2154)を用いて細胞に導入し、CO2インキュベーターで37℃、20時間インキュベーションをした。その後、Dual Luciferaseアッセイ(プロメガ社製, Dual-Glo Luciferase assay system , Cat# E2920)を行い、RNA干渉効果を測定した。コントロールとして、核酸試料を用いずに同様の操作を行った。RNA干渉効果は、コントロールにおける2つのルシフェラーゼの発現を比較し、その時のRNA干渉効果を0%とし、各試料における発現抑制の割合を%で表した。
ホスホロチオエート化poly(dA)を有するキメラsiRNAとSPGの複合体を用いたRNA干渉効果を、Dual Luciferaseアッセイ(プロメガ社製、Dual-Glo Luciferase assay system, Cat# E2920)を用いて評価した。細胞はDectin-1を強く発現するRAW264.7細胞(dRAW細胞)(東京薬科大学 薬学部 免疫学安達禎之准教授より入手)を使用した。使用した試料は、下表4に示す通りである。下表3において試料4は、TransITTM-TKO(タカラバイオ社、Cat# V2154)を用いてdA40(s)-siLuc(21nt)を導入したものである。
poly(dA)(s)-siRNA複合体によるRNA干渉効果の用量依存性
本実施例においては、siRNA活性の用量依存性を確認した。細胞は、10%血清培養において増殖性を示すdRAW 細胞を用いた。本実施例で使用した試料は下表5に示される。
dRAW細胞を回収し、48ウェルプレートに20000細胞/ウェル/200μlになるように播種して、37℃のCO2インキュベーターで20時間インキュベーションを行った。psiCHECKTM-2/LTX複合体を20μl/ウェル、培地を180μl/ウェルで混合し、48ウェルプレートに添加した。その後、Dual Luc アッセイ(プロメガ社製, Dual-Glo Luciferase assay system, Cat#: E2920)を行った。結果を下表5に示す。
(7-A)dRAW細胞への導入性
dRAW細胞を、1000000細胞/ディッシュ(5ml)になるように播種して、37℃のCO2インキュベーターで20時間インキュベーションを行った。その後、Alexa 647標識ネイキッドdA40(s)siLuc(21nt)、及びAlexa 647標識dA40(s)siLuc(21nt)/SPG複合体をそれぞれ100nMの濃度で培地に添加し、dRAW細胞に接触させた。各siRNA添加後、1,2,4,8時間後に、細胞を回収した。回収した細胞を10%平衡化ホルムアルデヒド(100μl/dish)で固定し、フローサイトメトリー(FACS)で、Alexia647で標識されている細胞数を測定した。
マウス(C57BL/6,雄,7週齢;4匹)から常法に従い脾臓細胞を得た。得られた脾臓細胞の一部をコントロールとして使用するために氷冷保存した。残りの脾臓細胞をMACS MSカラムによりCD11c(-)細胞群とCD11c(+)細胞群に分離した。カラムによる細胞の分離は2回行った。CD11c(+)細胞群を7×105cellsに調製し、下表6に示す各条件で、6ウェルプレート(容量2ml)で48時間(37℃;5% CO2)培養した。培養後、表6中の括弧内に示すFACS抗体を用いてFACS解析を行った。表中、Dectin-1-FITCはFITCで修飾された抗Dectin-1抗体を、CD11c-FITCはFITCで修飾された抗CD11c抗体を、PE Isotype controlはPEで修飾されたアイソタイプ・コントロール抗体を表す。
マウス(C57BL/6,雄,7週齢;4匹)から常法に従って脾臓細胞を得た。得られた脾臓細胞の一部をコントロールとして使用するために氷冷保存した。残りの脾臓細胞をMACS MSカラムによりCD11c(-)細胞群とCD11c(+)細胞群に分離した。カラムによる細胞の分離は2回行った。CD11c(+)細胞群を2×104細胞になるように調製し、チャンバーカバーガラス(4ウェル、容量1ml/ウェル)で24時間(37℃;5% CO2)培養した。その後、アンチセンス鎖の5'末端にAlexa647標識したsiLucおよびアンチセンス鎖の5'末端にAlexa647標識したdA40(s)siLuc/SPG複合体を100 nMとなるようにCD11c(+)細胞に添加し、1時間培養(37℃;5% CO2)した。
(i) Real Time PCR
継代培養しているdRAW 細胞(80% confluency)を培地(10 % FBS-RPMI (ライフテクノロジーズジャパン社, cat No 12718011S ))に懸濁し、1×105個/mlに調製した。その細胞懸濁液を各ウェル10000 個ずつ(100μl/well)、96ウェルプレートに加え、37℃、5% CO2条件下で一晩、培養した。培養後、培養上清をアスピレーターで取り除き、各ウェル100μlずつ培地を加えた。この操作を2回繰り返した。予め培地を用いて100nMの濃度に調整した各試料(表7)を各ウェル100μlずつ加え、37℃、5% CO2条件下で20時間、培養した。培養後、各ウェルに100μlの培地を加え、その後、アスピレーターで培地を取り除いた。予め培地を用いて調製した60ng/ml interferon-gamma(IFN-γ、PEPRTOTECH社、cat No 315-05)を各ウェル100μlずつ加え、37℃、5% CO2条件下で4時間、培養した。培養後、各ウェルの細胞からCellAmp Direct RNA Prep kit (タカラバイオ社、cat No 37329)を用いてtotal RNAを調製した。調製したtotal RNAをテンプレートとして、PrimerScript RT reagent Kit (タカラバイオ社、cat No RR037A)を用いてcDNAを合成した。合成したcDNAをSYBR Prime Ex Taq II
(タカラバイオ社、cat No RR081A)を用いてreal time qPCR を行い、CD40 mRNA 発現量を測定した。同時にbeta-actin mRNAの発現量を測定し、これを用いてCD40 mRNAの測定値の補正を行った。補正後の値を各条件におけるCD40 mRNA 発現量とした。qPCRに用いたプライマー配列は表8に示す通りである。
マウス脾臓細胞中のCD11(+)細胞を分離し、CD11(+)細胞におけるCD40陽性細胞の割合をFACSにて解析した。さらに、細胞培養と同様の環境、すなわち、10%FBS+RPMI培地に添加し、CO2インキュベーションで37℃に加温して指定の4時間〜48時間培養した。この時、CD11(+)細胞にSPG、ネイキッドdA40(s)siCD40(27nt)及びdA40(s)siCD40(27nt)/SPG複合体で処理し、その後のCD40発現をFACSで解析した。脾臓細胞の処理方法は上記(7-B)に記載の通りである。FACSで用いた抗体を下表9の括弧内に示す。表中、PE Isotype controlはPEで修飾されたアイソタイプ・コントロール抗体を、CD40-PEはPEで修飾された抗CD40抗体を表す。
免疫反応の初期応答因子として知られる共刺激因子CD40を標的分子として設定し、本分子に対するsiRNAによりResponder mouseの細胞を処理した。薬理効果はStimulator細胞とsiRNA未処理あるいは処理Responder細胞群とのMLR(Mixed Lymphocyte Reaction)を行い、それぞれの細胞増殖率をBrdU化学発光キットで測定することによって評価した。
本試験においては、dA40(s)-siCD40(27nt)/SPG複合体が免疫抑制作用を発揮することを確認した。
マウス(Balb/c(雄9週齢;2匹)、C57BL/6(雄9週齢;2匹))から脾臓細胞を回収した。溶血剤(塩化アンモニウム、カリウム)を添加して赤血球を溶解させた(溶血剤 5 ml, RPMI 5ml)。10% FBS(DSファーマバイオメディカル社)、RPMI 5mlで細胞を懸濁し、responder 側の脾臓細胞にマイトマイシンC(MMC)処理を行った(最終107細胞に対して25μgのMMC添加)。
脾臓細胞より回収した細胞を108細胞/試料に調整し、緩衝溶液(400μl)に懸濁した。CD11cマイクロビーズを100μl添加し、15分間冷蔵庫(2〜8℃)で静置した。
カラムを緩衝溶液(MACSバッファー:2mM EDTA, 0.5% BSA in PBS (1×)の溶液を調製後、脱気)でリンスした後、磁気標識された細胞の懸濁液500μlをピペットで注いで流出させた。流出した液を回収し、CD11c(-)細胞として用いた。
回収したCD11c陽性細胞を1.0×10 5 cells/conditionに分けた。そこにネイキッドsiCD40、siCD40/SPG複合体を最終濃度100 nMになるように添加し、37℃で4時間インキュベーションを行った。MLRは、5×105responder (splenocyte) 、5×105stimulator(CD11c陽性細胞 2.5×10 4とCD11c陰性細胞4.75×10 5の混合)を用いた。MLR条件を下表10に示す。
本試験においては、dA40(s)-siCD40(27nt)/SPG複合体が用量依存的に免疫抑制作用を発揮することを確認した。細胞の調製は、マウス(Balb/c(雄7週齢;2匹)、C57BL/6(雄7週齢;2匹))を用い、上記(A)に記載の方法と同様に行った。また、CD11c陽性細胞の精製、磁気分離についても上記(A)の方法に従った。MLR条件を下表11に示す。
(9-A)in vitro MLR
本試験においては、in vitroでdA40(s)-siCD40(21nt)/SPG複合体を投与した場合のリンパ球の増殖抑制効果を評価した。細胞の調製方法は次の通りである。
本試験では、ResponderマウスにdA40(s)-siCD40(21nt)/SPG複合体を尾静脈注射(i.v.)により投与して4時間経過後に脾臓細胞を採取し、Stimulatorマウス脾臓細胞とのMLRを行って、生体内におけるsiRNAの挙動を確認した。細胞の調製方法は以下の通りである。
本試験では、Alexa647標識dA40(s)-siLuc(21nt)/SPG複合体について、Dectin-1発現細胞への特異的な取り込みについて評価した。試験方法は次の通りである。
(11-A)
本試験では、ResponderマウスにdA40(s)-siCD40(21nt)/SPG複合体を尾静脈注射(i.v.)により投与して4時間経過後に脾臓細胞を採取し、Stimulatorマウス脾臓細胞とのMLRを行って、生体内におけるsiRNAの挙動を確認した。細胞の調製方法は以下の通りである。
本試験では、ResponderマウスおよびStimulatorマウスの双方に、dA40(s)-siCD40(21nt)/SPG複合体を尾静脈注射(i.v.)により投与して12時間経過後に脾臓細胞を採取し、Stimulatorマウス脾臓細胞とのMLRを行って、生体内におけるsiRNAの挙動を確認した。細胞の調製方法は以下の通りである。
Balb/cマウスから脾臓細胞を回収した。24穴プレート上に5×106/wellで細胞を播種して1 ml/wellになるように10容量%FBSを含むRPMI培地を加えた。そのプレートに、ビオチンを側鎖修飾したSPGを用いたdA40(s)-siCD40(21nt)/SPG複合体をsiRNA量として300ng/well、又はsiMockとしてのPBSを含むコントールサンプルを添加し、CO2インキュベーター(37℃)で一晩培養した。培地を吸引除去後、100 mM NaCl及び1 mM EDTAを含む10 mM Tris-HCl(pH7.5)に再懸濁し、ソニケーターで細胞を15秒間破砕し、50 mlのstreptavidin labeled magnetic particles (Roche Applied Science社、cat# 11641778001)を加え、室温で撹拌しながら15分間反応した。遠心分離を行い沈殿を回収し、得られた沈殿を100μlのSDS(ドデシル酸ナトリウム)バッファーに再懸濁し、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動に供して、ニトロセルロースメンブレンに転写した。次いで、マウス抗TRBP2抗体及びペルオキシダーゼ結合抗マウスIgG抗体でTRBP2を検出した。
異所心移植モデルマウスを利用し、心臓同種移植におけるdA40(s)-siCD40(21nt)/SPG複合体の効果を試験した。
Claims (9)
- 共刺激因子に対するsiRNAにポリデオキシアデニンを付加したポリヌクレオチドと、シゾフィランとの核酸多糖複合体を含む、移植治療における拒絶反応を抑制するための製剤。
- 前記siRNAが21mer型であって、該siRNAのセンス鎖にホスホジエステル結合のうち少なくとも一部がホスホロチオエート化されたポリデオキシアデニンを付加したポリヌクレオチドが付加されている、請求項1に記載の製剤。
- 前記ポリデオキシアデニンのホスホジエステル結合のうち少なくとも50%以上がホスホロチオエート化されている、請求項1または2に記載の製剤。
- 前記共刺激因子が、Dectin-1発現細胞において発現している共刺激因子である、請求項1〜3のいずれかに記載の製剤。
- 前記共刺激因子が、CD40、B7.1およびB7.2のいずれか一つである、請求項1〜4のいずれかに記載の製剤。
- 前記共刺激因子が、CD40である、請求項1〜4のいずれかに記載の製剤。
- 移植治療が、腎臓移植、心臓移植、肺移植、骨髄移植、皮膚移植、または角膜移植である、請求項1〜6のいずれかに記載の製剤。
- 共刺激因子に対するsiRNAにポリデオキシアデニンを付加したポリヌクレオチドと、シゾフィランとの核酸多糖複合体を、移植臓器または組織に対する拒絶の治療または予防が必要とされる動物に投与する工程を含む、移植治療における拒絶反応の抑制方法。
- 共刺激因子に対するsiRNAにポリデオキシアデニンを付加したポリヌクレオチドと、シゾフィランとの核酸多糖複合体の、移植治療における拒絶反応を抑制するための製剤の製造のための使用。
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