JPWO2012020790A1 - 感染症治療薬 - Google Patents
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Abstract
本発明は、糖鎖修飾リポソームを用いたドラッグデリバリーシステムに適した薬剤、特に感染症治療薬を提供することを目的とし、外表面がトリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ基及びシアリルルイスＸ基で修飾された糖鎖修飾リポソームに、バンコマイシンを包含させて感染症治療薬とする。
Description
本発明は感染症治療薬に関する。
ドラッグデリバリーシステムの一つとして、様々なリポソームが開発されている。とりわけ有力なものとして、糖鎖をリポソームに結合させた糖鎖修飾リポソームが開発された（特開２００３−２２６６３８号公報）。この糖鎖修飾リポソームは、癌などの標的細胞・組織を認識させることによって、局所的に薬剤や遺伝子を患部に送り込むための治療用ドラッグデリバリーシステム（特開２００３−２２６６３８号公報）や、蛍光マーカーで患部を画像化するための分子イメージング（ＷＯ２００７／０９１６６１ パンフレット）に用いられることが期待されている。
そこで、本発明は、糖鎖修飾リポソームを用いたドラッグデリバリーシステムに適した薬剤、特に感染症治療薬を提供することを目的とする。
本発明者らは、糖鎖修飾リポソームを用いたドラッグデリバリーシステムに適した薬剤、特に感染症治療薬を開発するために、内包させるための様々な薬剤、条件、性状を検討した結果、バンコマイシンを用いた場合に、長期間安定な感染症治療薬を製造できることを見出し、本発明の完成に至った。
本発明の一実施態様は、外表面がトリス（ヒドロキシアルキル）アルキルアミノ基及びシアリルルイスＸ基で修飾された糖鎖修飾リポソームであって、バンコマイシンを含有しているリポソームである。前記トリス（ヒドロキシアルキル）アルキルアミノ基が、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ基であることが好ましい。
本発明のさらなる一実施態様は、上記いずれかに記載のリポソームを含有する医薬組成物、特に感染症治療剤である。
本発明のさらなる一実施態様は、感染症の患者の治療方法であって、前記患者に上記いずれかに記載のリポソームを投与する治療方法である。このリポソームを、製造後、少なくとも１週間保存してもよい。なお、４℃以下で保存することが好ましい。
また、本発明のさらなる一実施態様は、医薬組成物、特に感染症治療剤の製造における、上記いずれかに記載のリポソームの使用方法である。
また、本発明のさらなる一実施態様は、医薬組成物の製造方法であって、外表面がトリス（ヒドロキシアルキル）アルキルアミノ基及びシアリルルイスＸ基で修飾された糖鎖修飾リポソームに、バンコマイシンを含有させる方法である。前記トリス（ヒドロキシアルキル）アルキルアミノ基が、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ基であることが好ましい。さらに、バンコマイシンを含有した前記糖鎖修飾リポソームを感染症治療剤に剤形化する工程を含んでもよい。
＝＝関連出願へのクロスリファレンス＝＝
本願は、２０１０年８月１１日付で出願した日本国特願２０１０−１８０４３６号に基づく優先権を主張するものであり、当該基礎出願を引用することにより、本明細書に含めるものとする。
本願は、２０１０年８月１１日付で出願した日本国特願２０１０−１８０４３６号に基づく優先権を主張するものであり、当該基礎出願を引用することにより、本明細書に含めるものとする。
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施例において特に説明がない場合には、市販の試薬キットや測定装置はそれらに添付のプロトコールを用いる。
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
＝＝糖鎖修飾リポソーム＝＝
本発明の糖鎖修飾リポソームは、外表面が、トリス（ヒドロキシアルキル）アルキルアミノ基及びシアリルルイスＸ基で修飾され、バンコマイシンを含有している。
本発明の糖鎖修飾リポソームは、外表面が、トリス（ヒドロキシアルキル）アルキルアミノ基及びシアリルルイスＸ基で修飾され、バンコマイシンを含有している。
本発明のリポソームを構成する脂質としては、例えば、フォスファチジルコリン類、フォスファチジルエタノールアミン類、フォスファチジン酸類、ガングリオシド類または糖脂質類またはフォスファチジルグリセロール類、コレステロール等が挙げられ、フォスファチジルコリン類としては、ジミリストイルフォスファチジルコリン、ジパルミトイルフォスファチジルコリン、ジステアロイルフォスファチジルコリン等が、また、フォスファチジルエタノールアミン類としては、ジミリストイルフォスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルフォスファチジルエタノールアミン等が、フォスファチジン酸類としては、ジミリストイルフォスファチジン酸、ジパルミトイルフォスファチジン酸、ジステアロイルフォスファチジン酸、ジセチルリン酸等が、ガングリオシド類としては、ガングリオシドＧＭ１、ガングリオシドＧＤ１a、ガングリオシドＧＴ１ｂ等が、糖脂質類としては、ガラクトシルセラミド、グルコシルセラミド、ラクトシルセラミド、フォスファチド、グロボシド等が、フォスファチジルグリセロール類としては、ジミリストイルフォスファチジルグリセロール、ジパルミトイルフォスファチジルグリセロール、ジステアロイルフォスファチジルグリセロール等が好ましい。
リポソーム外表面の修飾は、トリス（ヒドロキシアルキル）アルキルアミノ基が、直接脂質層に共有結合してもよいが、リンカーを介して脂質層に共有結合しているのが好ましい。ここで、リンカーは、当業者が適宜選択することができるが、タンパク質で構成されたリンカータンパク質が好ましい。リンカータンパク質は、特に限定されないが、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等の血清アルブミンが挙げられる。
トリス（ヒドロキシアルキル）アルキルアミノ基の２つのアルキル基は、独立して、メチル、エチル、ブチル、プロピル（ノルマルプロピル又はイソプロピル）などから選択しても良いが、両方ともメチルであるトリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ基が最も好ましい。
バンコマイシンは、グリコペプチド系抗生物質であり、薬理学的に許容される塩であってもよく、通常は、塩酸塩の形状で投与されるが、その塩は特に限定されない。
なお、リポソームは、バンコマイシン以外の試薬や医薬などを包含しても良い。例えば、リポソームの位置をトレースするために、リポソームに蛍光色素などを包含させても良い。また、バンコマイシン以外の抗生物質や抗菌剤などを包含させても良い。
＝＝糖鎖修飾リポソームの製造方法＝＝
リポソーム自体は、周知の方法に従い製造することができるが、例えば、薄膜法、逆層蒸発法、エタノール注入法、脱水−再水和法等を挙げることができる。また、超音波照射法、エクストルージョン法、フレンチプレス法、ホモジナイゼーション法等を用いて、リポソームの粒子径を調節することも可能である。
リポソーム自体は、周知の方法に従い製造することができるが、例えば、薄膜法、逆層蒸発法、エタノール注入法、脱水−再水和法等を挙げることができる。また、超音波照射法、エクストルージョン法、フレンチプレス法、ホモジナイゼーション法等を用いて、リポソームの粒子径を調節することも可能である。
本発明のリポソームの製法について、具体的に述べると、例えば、まず、フォスファチジルコリン類、コレステロール、フォスファチジルエタノールアミン類、フォスファチジン酸類、ガングリオシド類または糖脂質類またはフォスファチジルグリセロール類を配合成分とする脂質と界面活性剤コール酸ナトリウムとの混合ミセルを調製する。ここで、フォスファチジルエタノールアミン類は親水性化反応部位として、ガングリオシド類または糖脂質類またはフォスファチジルグリセロール類は、リンカー蛋白質の結合部位として機能する。こうして得られる混合ミセルの限外濾過を行うことにより、リポソームを作製する。
次に、リポソーム膜の脂質フォスファチジルエタノールアミン上に架橋用の２価試薬とトリス（ヒドロキシアルキル）アミノアルカンを用いてリポソーム表面を親水性にする。例えば、ジミリストイルフォスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルフォスファチジルエタノールアミン等の脂質を用いて、常法により得たリポソーム溶液に対し、ビススルフォスクシニミヂルスベラート、ジスクシニミヂルグルタレート、ジチオビススクシニミヂルプロピオネート、ジスクシニミヂルスベラート、3,3'-ジチオビススルフォスクシニミヂルプロピオネート、エチレングリコールビススクシニミヂルスクシネート、エチレングリコールビススルフォスクシニミヂルスクシネート等の２価試薬を加えて反応させることにより、リポソーム膜上のジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン等の脂質に２価試薬を結合させる。そして、結合させた２価試薬に、トリス（ヒドロキシアルキル）アミノアルカンを反応させることにより、リポソーム表面にトリス（ヒドロキシアルキル）アルキルアミノ基を結合させる。トリス（ヒドロキシアルキル）アミノアルカンとしては、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（単にトリスとも呼ばれる）が最も好ましい。
本発明においては、リポソームに、さらにシアリルルイスＸを結合させる。この結合は、リンカーを介するのが好ましく、以下、リンカーがタンパク質の場合を例にして具体的に述べると、まず、リポソームを、ＮａＩＯ４、Ｐｂ(Ｏ２ＣＣＨ３)４、ＮａＢｉＯ３等の酸化剤で処理して、リポソーム膜面に存在するガングリオシドを酸化し、次いで、ＮａＢＨ３ＣＮ、ＮａＢＨ４等の試薬を用いて、リンカータンパク質とリポソーム膜面上のガングリオシドを、還元的アミノ化反応により結合させる。そして、リンカータンパク質が有するアミノ基のなるべく多くの基に、架橋用２価試薬の一端を結合させる。そして、シアリルルイスＸの還元末端を、ＮＨ４ＨＣＯ３、ＮＨ２ＣＯＯＮＨ４等のアンモニウム塩を用いてグリコシルアミノ化し、付加されたアミノ基とリポソーム上の架橋用２価試薬の未結合の一端とを結合させる。次に、リンカータンパク質も親水性にするために、糖鎖が結合せずに未反応で残っている、リンカータンパク質上の２価試薬の未結合の一端に、トリス（ヒドロキシアルキル）アミノアルカンを結合させることにより、本発明で用いるリポソームを得ることができる。架橋用２価試薬としては、ビススルフォスクシニミヂルスベラート、ジスクシニミヂルグルタレート、ジチオビススクシニミヂルプロピオネート、ジスクシニミヂルスベラート、3,3'-ジチオビススルフォスクシニミヂルプロピオネート、エチレングリコールビススクシニミヂルスクシネート、エチレングリコールビススルフォスクシニミヂルスクシネート等を用いることができる。
リポソームへバンコマイシンを封入するには、周知の方法を用いればよく、例えば、混合ミセルを調製する際に、バンコマイシンを添加してリポソームを形成することにより、バンコマイシンはリポソーム内に封入される。
＝＝医薬組成物＝＝
本発明の医薬組成物は、バンコマイシンを包含した、外表面がトリス（ヒドロキシアルキル）アルキルアミノ基及びシアリルルイスＸ基で修飾された糖鎖修飾リポソームを含有する。
本発明の医薬組成物は、バンコマイシンを包含した、外表面がトリス（ヒドロキシアルキル）アルキルアミノ基及びシアリルルイスＸ基で修飾された糖鎖修飾リポソームを含有する。
このバンコマイシン含有糖鎖修飾リポソームは、長期保存が可能であり、製造後、少なくとも７日間保存してから投与してもよく、少なくとも１ヶ月保存してから投与してもよく、少なくとも３ヶ月保存してから投与してもよく、少なくとも１年保存してから投与してもよい。保存は、２５℃以下で行なってもよいが、２０℃以下で行なうことが好ましく、１５℃以下で行なうことがさらに好ましく、１０℃以下で行なうことがさらに好ましく、４℃以下で行なうことがさらに好ましいが、いずれにせよ０℃以上である必要があり、４℃で行なうことが最も好ましい。
この医薬組成物は、薬学的に受容可能なキャリアなどをさらに含んでもよい。薬学的に受容可能なキャリアとしては、例えば、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、希釈剤、賦形剤、薬学的アジュバントが挙げられるがそれらに限定されない。
この医薬組成物の剤形化は、pH、等張性、安定性、投与方法、投与したい組織などを考慮することにより、当業者は、容易に行うことができる。例えば、薬学的に受容可能なキャリアと配合し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤等の固形製剤、シロップ剤、懸濁剤、溶液剤等の液状製剤として、経口的にまたは非経口的に、投与することができる。
この薬剤の投与量や投与回数は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。
本発明の薬剤は、抗生物質であるバンコマイシンを含有しているので、バンコマイシンが有効な感染症に罹患した患者が投与対象となる。従って、広く感染症治療剤とするのが好ましく、感染細菌の種類や感染場所には限定されない。
以下、本発明の実施例を示すが、本発明は特にこれらにより限定されるものではない。
[実施例１]バンコマイシン内包リポソームの作製
＝＝Ｃｙ５．５標識ＨＳＡ(human serum albumin)の作製＝＝
ＨＳＡ及びＣｙ５．５−ＮＨＳエステル(Amersham Biosciences社) をそれぞれＴＡＰＳ緩衝液（１０ｍＭ Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）／１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ８．４）に溶かし１０ｍｇ／ｍＬ Ｃｙ５．５標識ＨＳＡ溶液，２ｍｇ／ｍＬ Ｃｙ−ｄｙｅとなるよう調製した。これらを重量比２：１の割合で混合して３７℃で３時間撹拌した後、限外濾過（ＮＭＷＬ：１０，０００）した。
＝＝Ｃｙ５．５標識ＨＳＡ(human serum albumin)の作製＝＝
ＨＳＡ及びＣｙ５．５−ＮＨＳエステル(Amersham Biosciences社) をそれぞれＴＡＰＳ緩衝液（１０ｍＭ Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）／１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ８．４）に溶かし１０ｍｇ／ｍＬ Ｃｙ５．５標識ＨＳＡ溶液，２ｍｇ／ｍＬ Ｃｙ−ｄｙｅとなるよう調製した。これらを重量比２：１の割合で混合して３７℃で３時間撹拌した後、限外濾過（ＮＭＷＬ：１０，０００）した。
＝＝リポソームの作製＝＝
８４ｍｇのジパルミトイルフォスファチジルコリン、５０．５ｍｇのコレステロール、７３ｍｇのガングリオシド、９ｍｇのジセチルフォスフェート、１１．５ｍｇのジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン、２３４．５ｍｇのコール酸ナトリウムを秤量し、１５ｍＬのメタノール・クロロホルム溶液（１：１）に溶解し、３７℃で１時間撹拌した後、ロータリーエバポレーターで溶媒を蒸発させ、真空乾燥させた。得られたリピッドフィルムに、１０ｍＬ Ｃｙ５．５標識ＨＳＡ溶液（１０ ｍｇ／ｍＬ）及び３０ｍＬバンコマイシン（ＶＣＭ）（３３．３ｍｇ／ｍＬ）溶液（ARDRICH社 製品番号＃８６１９８７）、１０ｍＬ ＴＡＰＳ緩衝液を加えて総量５０ ｍｌとし、再懸濁し、３７℃で１時間撹拌後、溶液上の空気を窒素置換し超音波処理をした。限外濾過（ＮＭＷＬ：１０，０００）によって、Ｃｙ５．５標識ＶＣＭ内包リポソーム溶液を得た。
８４ｍｇのジパルミトイルフォスファチジルコリン、５０．５ｍｇのコレステロール、７３ｍｇのガングリオシド、９ｍｇのジセチルフォスフェート、１１．５ｍｇのジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン、２３４．５ｍｇのコール酸ナトリウムを秤量し、１５ｍＬのメタノール・クロロホルム溶液（１：１）に溶解し、３７℃で１時間撹拌した後、ロータリーエバポレーターで溶媒を蒸発させ、真空乾燥させた。得られたリピッドフィルムに、１０ｍＬ Ｃｙ５．５標識ＨＳＡ溶液（１０ ｍｇ／ｍＬ）及び３０ｍＬバンコマイシン（ＶＣＭ）（３３．３ｍｇ／ｍＬ）溶液（ARDRICH社 製品番号＃８６１９８７）、１０ｍＬ ＴＡＰＳ緩衝液を加えて総量５０ ｍｌとし、再懸濁し、３７℃で１時間撹拌後、溶液上の空気を窒素置換し超音波処理をした。限外濾過（ＮＭＷＬ：１０，０００）によって、Ｃｙ５．５標識ＶＣＭ内包リポソーム溶液を得た。
＝＝リポソームの表面修飾＝＝
５０ｍＬのＣｙ５．５標識ＶＣＭ内包リポソーム溶液に対し、限外濾過（ＮＭＷＬ：３００，０００）によって、緩衝液をＣＢＳ緩衝液（５０ｍＭ 炭酸水素ナトリウム／１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ８．５）に置換し、５０ｍＬのリポソーム溶液を得た。一方、５０ｍｇのＢＳ３（ＰＩＥＲＣＥ社）を５００μＬのＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解し、これをリポソーム溶液に添加して、室温で２時間撹拌した後、４℃で一晩撹拌した。限外濾過（ＮＭＷＬ：３００，０００）により遊離のＢＳ３を除去し、１３２ｍｇ／ｍＬ トリス溶液（ＣＢＳ緩衝液、ｐＨ８．５）を１．５ｍＬ添加して、室温で２時間撹拌後、４℃で一晩撹拌した。限外濾過（ＮＭＷＬ：３００，０００）により遊離のトリスを除去するとともに、緩衝液をＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）に置換し、５０ｍＬのリポソーム溶液を得た。０．０５４ｇのメタ過ヨウ素酸ナトリウムを１．２５ｍＬのＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）に溶解し、これをリポソーム溶液に添加し、４℃で一晩撹拌した。限外濾過（ＮＭＷＬ：３００，０００）によってメタ過ヨウ素酸ナトリウムを除去するとともに緩衝液をＰＢＳ緩衝液（１０ｍＭ リン酸水素ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム／１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ８．０）に置換し、１０ｍｇ／ｍＬ ＨＳＡ溶液（ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ８．０）を１０ｍＬ添加し、室温で２時間反応させ、５０ｍＬのリポソーム溶液を得た。１５．５ｍｇのシアノホウ素酸ナトリウムを１２５μＬのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、これをリポソーム溶液に添加して、４℃で一晩撹拌した。限外濾過（ＮＭＷＬ：３００，０００）により遊離のシアノホウ素酸ナトリウム及び遊離のＨＳＡを除去するとともに、緩衝液をＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）にバッファー交換し、５０ｍＬのリポソーム溶液を得た。
５０ｍＬのＣｙ５．５標識ＶＣＭ内包リポソーム溶液に対し、限外濾過（ＮＭＷＬ：３００，０００）によって、緩衝液をＣＢＳ緩衝液（５０ｍＭ 炭酸水素ナトリウム／１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ８．５）に置換し、５０ｍＬのリポソーム溶液を得た。一方、５０ｍｇのＢＳ３（ＰＩＥＲＣＥ社）を５００μＬのＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解し、これをリポソーム溶液に添加して、室温で２時間撹拌した後、４℃で一晩撹拌した。限外濾過（ＮＭＷＬ：３００，０００）により遊離のＢＳ３を除去し、１３２ｍｇ／ｍＬ トリス溶液（ＣＢＳ緩衝液、ｐＨ８．５）を１．５ｍＬ添加して、室温で２時間撹拌後、４℃で一晩撹拌した。限外濾過（ＮＭＷＬ：３００，０００）により遊離のトリスを除去するとともに、緩衝液をＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）に置換し、５０ｍＬのリポソーム溶液を得た。０．０５４ｇのメタ過ヨウ素酸ナトリウムを１．２５ｍＬのＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）に溶解し、これをリポソーム溶液に添加し、４℃で一晩撹拌した。限外濾過（ＮＭＷＬ：３００，０００）によってメタ過ヨウ素酸ナトリウムを除去するとともに緩衝液をＰＢＳ緩衝液（１０ｍＭ リン酸水素ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム／１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ８．０）に置換し、１０ｍｇ／ｍＬ ＨＳＡ溶液（ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ８．０）を１０ｍＬ添加し、室温で２時間反応させ、５０ｍＬのリポソーム溶液を得た。１５．５ｍｇのシアノホウ素酸ナトリウムを１２５μＬのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、これをリポソーム溶液に添加して、４℃で一晩撹拌した。限外濾過（ＮＭＷＬ：３００，０００）により遊離のシアノホウ素酸ナトリウム及び遊離のＨＳＡを除去するとともに、緩衝液をＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）にバッファー交換し、５０ｍＬのリポソーム溶液を得た。
一方、シアリルルイスＸ糖鎖（ＳＬＸ）（Calbiochem社）を、最終濃度が４ｍｇ／ｍＬになるように精製水に溶解させた後、炭酸水素アンモニウムを飽和するまで溶解させ、３７℃で３日間反応し、氷冷後、０．４５μｍフィルターでろ過し、４ｍｇ／ｍＬのアミノ化ＳＬＸ溶液を得た。
２５ｍＬのリポソーム溶液に２５ｍｇのＤＴＳＳＰ（PIERCE社）を添加し、室温で２時間撹拌後、冷蔵下で一晩撹拌した。限外濾過（ＮＭＷＬ：３００，０００）により遊離のＤＴＳＳＰを除去し、４ｍｇ／ｍＬ アミノ化ＳＬＸ溶液をＳＬＸの最終濃度が５０μｇ／ｍＬとなるように添加し、室温で２時間撹拌後、１３２ｍｇ／ｍＬ トリス溶液（ＣＢＳ緩衝液、ｐＨ８．５）を５００μＬ添加し、４℃で一晩撹拌した。限外濾過（ＮＭＷＬ：３００，０００）により遊離のアミノ化糖鎖及び遊離のトリスを除去し、緩衝液をＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）に置換した後、０．４５μｍのフィルターで濾過した。
[実施例２]リポソームの安定性の測定
実施例１で作製したリポソームの粒子径、ゼータ電位は、リポソーム溶液を精製水で５０倍に希釈して、ゼータサイザー ナノ(Nano-ZS)(MALVERN社)で測定した。脂質量は、リポソームの構成脂質であるコレステロールを定量することにより総脂質量を算出した。脂質の定量にはコレステロールＥ−テストワコー（和光純薬、カタログ番号439-17501）を用いた。キットに添付されている２００ｍｇ／ｄＬ コレステロール標準液を精製水で希釈して用いた。キット付属の発色液３００μＬに検体もしくは標準液を１０μＬ添加し、撹拌した。３７℃で２０分間静置した後、吸光度５９５ｎｍを測定した。濃度既知である標準溶液により検量線を作成して、リポソームのコレステロール量を測定して脂質量を求めた。コレステロール量から脂質量を求める換算式：脂質量（ｍｇ／ｍＬ）＝コレステロール量（ｍｇ／ｍＬ）×４．５１（換算係数）。
実施例１で作製したリポソームの粒子径、ゼータ電位は、リポソーム溶液を精製水で５０倍に希釈して、ゼータサイザー ナノ(Nano-ZS)(MALVERN社)で測定した。脂質量は、リポソームの構成脂質であるコレステロールを定量することにより総脂質量を算出した。脂質の定量にはコレステロールＥ−テストワコー（和光純薬、カタログ番号439-17501）を用いた。キットに添付されている２００ｍｇ／ｄＬ コレステロール標準液を精製水で希釈して用いた。キット付属の発色液３００μＬに検体もしくは標準液を１０μＬ添加し、撹拌した。３７℃で２０分間静置した後、吸光度５９５ｎｍを測定した。濃度既知である標準溶液により検量線を作成して、リポソームのコレステロール量を測定して脂質量を求めた。コレステロール量から脂質量を求める換算式：脂質量（ｍｇ／ｍＬ）＝コレステロール量（ｍｇ／ｍＬ）×４．５１（換算係数）。
リポソームに結合あるいは内包されたＨＳＡ量の測定は、Micro BCATM Protein Assay Reagent kit(PIERCE社、Code.No.23235BN)を用いた。標準物質として、キットに添付された２ｍｇ／ｍＬ アルブミン（ＢＳＡ）を使用した。スタンダード溶液として、標準物質（２ｍｇ／ｍＬ：アルブミン）をＰＢＳ緩衝液で希釈して、０、０．２５、０．５、１、２、３、４、５μｇ／５０μＬ溶液を調製した。リポソームをＰＢＳ緩衝液で２０倍希釈し、被験試料とした。スタンダード溶液、検体溶液を５０μＬずつ分注した各試験管に３％ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ溶液）を１００μＬ添加した。キットに添付された試薬Ａ、Ｂ、Ｃを試薬Ａ：試薬Ｂ：試薬Ｃ＝４８：２：５０となるように混合して、各試験管に１５０μＬ添加した。この試験管を６０℃で１時間静置した後、室温に戻してから、吸光度５４０ｎｍを測定し、スタンダード溶液により検量線を作成して、リポソームに内包されたＨＳＡ量を測定した。
このようにして得られた結果を図１及び表１に示す。
また、バンコマイシン内包量（力価）を、製造直後と製造１年後（４℃保存）に、バイオアッセイで測定した。以下に、その方法を詳述する。
まず、Bacillus subtilis（ATCC6633）をNutrient寒天培地（１ｘNutrient Broth（Difco社）含有、１．５％寒天粉末（ＳＡＪ社））に接種し、３５℃で１６〜２４時間培養した。シングルコロニーを１００ｍＬのNutrient培地に接種し、３５℃で１６〜２４時間培養した。２．４ｇのNutrient Broth（Difco社）を３００ｍＬの精製水で溶解し、４．５ｇの寒天粉末を加え、オートクレーブ滅菌した。４５〜５０℃で培養液を２ｍＬ加えて、基層寒天培地の上に約５ｍＬ注いで寒天が水平になるよう静置し、種層寒天培地を作製した。種層寒天培地が固まった後、コルクポーラーを用いて、半径２５ｍｍの円周上に等間隔になるように、シャーレの底に達する直径約７ｍｍの円形の孔を４個あけ、穿孔寒天平板を作製した。
バンコマイシン塩酸塩をＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で溶解し、５〜５００μｇ／ｍＬ（力価）のバンコマイシン標準液を調製した。対照としては、ＨＥＰＥＳ緩衝液のみを使用した。６０μＬのリポソームサンプルまたはバンコマイシン標準液を５７０μＬのメタノール・クロロホルム溶液（１：１）と混合し、ボルテックスした後、穿孔寒天平板の穿孔に５０μＬずつ入れた。穿孔寒天平板を３５℃で１６〜２０時間培養し、形成された阻止円の直径をデジタルノギスで測定した。
バンコマイシンの力価（P）と阻止円の直径（d）との間には下式の関係が成立する。
（式中、α及びβは定数である。）
（式中、α及びβは定数である。）
各濃度のバンコマイシン標準液の阻止円直径から検量線を作成し、これをもとにリポソームサンプルのバンコマイシン力価を算出した。結果を表１に示す。
表１及び図１より、バンコマイシンを内包させたリポソームは、少なくとも１年間は、４℃保存で、粒子径分布もあまり変化はなく、平均粒子径はほとんど変わらず、全く漏れがなくて力価は安定していた。また、吸光度（６８０ｎｍ）は、少なくとも１年間はほぼ一定で、リポソームに内包されているＣｙ５．５量にも漏れが無かった。リポソームの表面電荷を示すゼータ電位は、少なくとも１年間は、−３０ｍＶ以下であり、リポソームは安定な分散性を有していた。脂質量もタンパク質量も、少なくとも１年間は変化が無かった。
このように、少なくとも１年間は、本発明のリポソームの性状に影響を及ぼすような変化は生じなかった。
＝＝比較例＝＝
バンコマイシンの代わりに、リン酸プレゾニゾロン、プラバスタチン、シスプラチン、ＩｇＧを、同様に糖鎖修飾リポソームに内包させ、製造直後と一定期間後に、薬剤量を測定した。
バンコマイシンの代わりに、リン酸プレゾニゾロン、プラバスタチン、シスプラチン、ＩｇＧを、同様に糖鎖修飾リポソームに内包させ、製造直後と一定期間後に、薬剤量を測定した。
リポソームに内包されたリン酸プレドニゾロンは、吸光度法により測定した。検出器としてはUltrospec6300pro（Amersham Biosciences社）を用いた。リン酸プレドニゾロン標準液（１０ｍｇ／ｍＬ、メタノール・クロロホルム溶液（１：１））をメタノール・クロロホルム溶液（１：１）で希釈し、０．０５、０．１、０．２５、０．５、１．０ｍｇ／ｍＬの各濃度のリン酸プレドニゾロン溶液を調製した。リポソーム溶液をメタノール・クロロホルム溶液（１：１）で１０倍希釈し、被験試料とした。吸光度２６０ｎｍを測定し、標準液より作成した検量線を基にして、リポソームに内包されたリン酸プレドニゾロン量を算出した。なお、リン酸プレドニゾロンの漏れは、冷蔵状態で７日間静置後、限外濾過（ＮＭＷＬ：３００，０００）によりリポソームから漏出したリン酸プレドニゾロンを除去し、吸光度法により測定することにより確認した。
リポソームに内包されたプラバスタチンは、吸光度法により測定した。吸光度測定には、Ultrospec6300pro（GE Healthcare社）を用いた。標準液として、標準物質（１ｍｇ／ｍＬ プラバスタチン）をＰＢＳ緩衝液で希釈して、０、２５、５０、１００、１２５、２５０、５００、７５０、１０００μｇ／ｍＬの各濃度のプラバスタチン溶液を調製した。標準液及び検体溶液を２０μＬ分注した各試験管にメタノール・クロロホルム溶液（１：１）を１８０μＬ添加した。吸光度２３９ｎｍを測定し、標準液より作成した検量線を基にして、リポソームに内包されたプラバスタチン量を算出した。なお、プラバスタチンの漏れは、冷蔵状態で３ヶ月間静置後、限外濾過（ＮＭＷＬ：３００，０００）によりリポソームから漏出したプラバスタチンを除去し、吸光度法によりリポソーム中のプラバスタチン量を測定することにより確認した。
リポソームに内包されたシスプラチンは、フレームレス原子吸光光度法（ＦＡＡＳ）により測定した。ＦＡＡＳには、AA-6700 Atomic absorption Flame emission spectrophotometer (島津製作所)を用いた。波長２６５．９ｎｍ、スリット幅０．５、ランプ電流１４ｍＡの条件下にて、１２０℃で３０秒間、２５０℃で１０秒間、７００℃で２０秒間，７００℃で５秒間、２６００℃で３秒間にわたって順次処理した。白金標準液（１ｍｇ／ｍＬ Ｐｔ）を精製水で希釈して、１２．５、２５、５０、１００、２００ｎｇ／ｍＬの各濃度の白金溶液を調製し、検量線を作成した。リポソーム溶液を精製水で１００００倍希釈して、被験試料とした。得られた白金量からシスプラチン量への換算は、白金とシスプラチンの分子量から、下式により算出した。なお、シスプラチンの漏れは、冷蔵状態で３ヶ月間静置後、限外濾過（ＮＭＷＬ：３００，０００）によりリポソームから漏出したＣＤＤＰを除去し、ＦＡＡＳによりリポソーム中のＣＤＤＰ量を測定することにより確認した。
シスプラチン量＝白金量（測定値）×３００（シスプラチンの分子量）／１９５（白金の分子量）
シスプラチン量＝白金量（測定値）×３００（シスプラチンの分子量）／１９５（白金の分子量）
リポソームに内包されたＩｇＧの測定は、Micro BCATM Protein Assay Reagent kit (PIERCE社、 Code.No.23235BN)を用いた。標準物質として、キットに添付された２ｍｇ／ｍＬ アルブミン（ＢＳＡ）を使用した。標準液として、標準物質（２ｍｇ／ｍＬ：アルブミン）をＰＢＳ緩衝液で希釈して、０、０．２５、０．５、１、２、３、４、５μｇ／５０μＬの各濃度の溶液を調製した。ＩｇＧ内包リポソームをＰＢＳ緩衝液で２０倍希釈し、被験試料とした。標準液及び検体溶液を５０μＬずつ分注した各試験管に３％ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ溶液）を１００μＬ添加した。キットに添付された試薬Ａ、Ｂ、Ｃを試薬Ａ：試薬Ｂ：試薬Ｃ＝４８：２：５０となるように混合して、各試験管に１５０μＬ添加した。この試験管を６０℃で１時間静置した。室温に戻ってから、吸光度５４０ｎｍを測定し、標準液より作成した検量線を基にして、リポソームに内包されたＩｇＧ量を算出した。なお、ＩｇＧの漏れは、冷蔵状態で７日間静置後、限外濾過（ＮＭＷＬ：３００，０００）によりリポソームから漏出したＩｇＧを除去し、ＢＣＡキットを用いて、リポソーム中のＩｇＧ量を測定することにより確認した。
結果を表２に示す。
バンコマイシンを内包させたリポソームは、４℃保存では、少なくとも１年間は非常に安定だったのに対し、プラバスタチンやシスプラチンは、３ヵ月後に、６％の漏れが検出され、リン酸プレゾニゾロンやＩｇＧは、７日後に、それぞれ３０％及び１２％もの漏れが検出された。
[実施例３]バンコマイシン（ＶＣＭ）内包リポソームのマウス感染症モデルへの投与
本実施例では、実施例１で作製したＶＣＭ内包リポソームをマウス感染症モデルの生体内に投与し、ＶＣＭ単独投与と感染症治療効果を比較して、実際にＶＣＭ内包リポソームが医薬としてより機能することを示す。
本実施例では、実施例１で作製したＶＣＭ内包リポソームをマウス感染症モデルの生体内に投与し、ＶＣＭ単独投与と感染症治療効果を比較して、実際にＶＣＭ内包リポソームが医薬としてより機能することを示す。
まず、軟部組織感染症モデルには、BALB/cマウスの浅殿筋内に５μＬのルシフェラーゼを発現するメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ Xen31系統、Caliper life Sciences社）（Am J Otolaryngol. 2010 Apr 29, published online）を８ｘ１０７ＣＦＵ（Colony Forming Units）／μLを注入する再現性の高いモデルを用いた。ＭＲＳＡは３７℃でＬＢ（Luria Bertani）培地にて培養した後、分注し−３０℃で保管したものを使用した。
ＭＲＳＡを浅殿筋内に注射直後に、実施例１で作製したＣｙ５．５標識ＶＣＭ内包リポソームを２０５μＬ（ＶＣＭ８μｇ含有）を尾静脈投与した。対照マウスには、同様の動物モデルにＶＣＭ溶液２４２μＬ（ＶＣＭ８μｇ含有）を尾静脈投与した。その後、ＢＬＩ（bioluminscence imaging）で細菌動態を、ＦＩ（fluorescence imaging）でリポソーム動態を経時的に観察した。図２に、５日目（図２Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ）と７日目（図２Ｂ，Ｆ）における、リポソーム注入マウス（図２Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ）及び対照マウス（図２Ａ，Ｂ）の観察結果を示す。なお、図２では、ＶＣＭ及びＶＣＭ内包リポソームを投与した結果を、それぞれＶＣＭ及びVCM/Lypoと表記した。また、細菌動態及びリポソーム動態を観察した像を、それぞれＭＲＳＡ及びLypoと表記し、細菌動態とリポソーム動態を重ね合わせた像をMergedと表記した。
５日目において、リポソーム注入マウス（図２Ｃ）及び対照マウス（図２Ａ）において、安定した感染巣が成立した。そして、リポソーム注入マウスにおいては、リポソームが感染巣周囲に特異的に集積していた（図２Ｄ，Ｅ）。７日目では、対照マウス（図２Ｂ）でバンコマイシンの投与にもかかわらず細菌が増殖し感染巣が拡大していたが、バンコマイシン内包リポソーム注入マウス（図２Ｆ）では、細菌による感染巣が縮小していた。
このように、感染症モデルにおけるＶＣＭ内包リポソームの投与は、バンコマイシン溶液の単独投与と比較して、治療効果が顕著に高くなることが明らかである。
[実施例４]バンコマイシン（ＶＣＭ）内包リポソームのマウス感染症モデルへの投与
実施例３では細菌を動物に注入直後（感染初期動物モデル）にＶＣＭ内包リポソームを投与し、その医薬効果を判定した。また、ＶＣＭ内包リポソームは、ＶＣＭ量８μｇという少量でも治療効果があることを示した。実施例４では、細菌が成体内に十分な感染巣を形成した後にＶＣＭ内包リポソームを投与しても、十分な治療効果があること、また、ＶＣＭ内包リポソームの投与量は、さらに少量でも治療効果があることを示す。
実施例３では細菌を動物に注入直後（感染初期動物モデル）にＶＣＭ内包リポソームを投与し、その医薬効果を判定した。また、ＶＣＭ内包リポソームは、ＶＣＭ量８μｇという少量でも治療効果があることを示した。実施例４では、細菌が成体内に十分な感染巣を形成した後にＶＣＭ内包リポソームを投与しても、十分な治療効果があること、また、ＶＣＭ内包リポソームの投与量は、さらに少量でも治療効果があることを示す。
軟部組織感染症モデルには、実施例３と同様に、BALB/cマウスの浅殿筋内に５μＬのルシフェラーゼを発現するメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ Xen31系統、Caliper life Sciences社）（Am J Otolaryngol. 2010 Apr 29, published online）を８ｘ１０７ＣＦＵ（Colony Forming Units）／μLを注入する再現性の高いモデルを用いた。ＭＲＳＡは３７℃でＬＢ（Luria Bertani）培地にて培養した後、分注し−３０℃で保管したものを使用した。
ＭＲＳＡを浅殿筋内に注射３日後に、細菌由来の発光を観察することによって、細菌の十分な成体への生着を確認した。その後、
（１）実施例１で作製したＣｙ５．５標識ＶＣＭ内包リポソームを２．９５７μｇ、１日１回静脈投与群
（２）実施例１で作製したＣｙ５．５標識ＶＣＭ内包リポソームを０．５５２μｇ、１日１回静脈投与群
（３）ＶＣＭ通常皮下注投与 ２７５０μｇ／回、１日２回静脈投与群
（４）ＶＣＭ通常静脈内投与 ３７５μｇ／回、１日２回静脈投与群
（５）ＶＣＭ通常静脈内投与 １．４７８μｇ／回、１日２回静脈投与群
（６）実施例１で作製したＣｙ５．５標識ＶＣＭが内包されていないリポソームの静脈投与群（対照群）
の６群間（Ｎ＝５／群）で、ＢＬＩ（bioluminscence imaging）で細菌動態を、ＦＩ（fluorescence imaging）でリポソーム動態を経時的に（１２時間、２４時間、３日、５日、７日目）観察した。図３に、上記の（２）（４）（５）（６）群の典型的なマウスの細菌動態とリポソーム動態を示す。また、（１）〜（６）群について、細菌による発光量の定量化グラフを図４に示す。
（１）実施例１で作製したＣｙ５．５標識ＶＣＭ内包リポソームを２．９５７μｇ、１日１回静脈投与群
（２）実施例１で作製したＣｙ５．５標識ＶＣＭ内包リポソームを０．５５２μｇ、１日１回静脈投与群
（３）ＶＣＭ通常皮下注投与 ２７５０μｇ／回、１日２回静脈投与群
（４）ＶＣＭ通常静脈内投与 ３７５μｇ／回、１日２回静脈投与群
（５）ＶＣＭ通常静脈内投与 １．４７８μｇ／回、１日２回静脈投与群
（６）実施例１で作製したＣｙ５．５標識ＶＣＭが内包されていないリポソームの静脈投与群（対照群）
の６群間（Ｎ＝５／群）で、ＢＬＩ（bioluminscence imaging）で細菌動態を、ＦＩ（fluorescence imaging）でリポソーム動態を経時的に（１２時間、２４時間、３日、５日、７日目）観察した。図３に、上記の（２）（４）（５）（６）群の典型的なマウスの細菌動態とリポソーム動態を示す。また、（１）〜（６）群について、細菌による発光量の定量化グラフを図４に示す。
（１）（２）群では、その他の群と比較して投与量が極端に少ないにもかかわらず、試薬投与２日目（2POD, Day5）には、同程度の細菌増殖の抑制効果を示し、７日目（7POD, Day10）には、そのほかの群より強力な細菌増殖の抑制効果を示し、細菌が消失し感染が治癒した。一方で、対照群の（６）群では細菌増殖は動物作製から感染は拡大し、４日目にしてほぼプラトーに達し感染は継続していた。さらに、１日あたりの投与量として（１）群と同量のＶＣＭを静脈内投与した（５）群でも感染は継続していた。また、過去の論文で一般に使用されている投与方法及び投与量の（３）群、（４）群では、細菌増殖は抑制傾向にあったが、７日目にしても感染は継続していた。（２）群のＶＣＭの投与濃度を過去の論文で一般に使用されているＶＣＭ通常皮下ならびに静脈投与の（３）群、（４）群と比較すると、それぞれ９９６４分の１と１３５９分の１の濃度となる。
このように、感染症モデルにおけるＶＣＭ内包リポソームの投与は、ＶＣＭ通常投与量の約１万分の１の極微量投与量での治療効果が、通常投与量以上に認められた。これは、実施例１で作製したリポソームの感染巣への高い特異的集積性に起因するものである。
本発明によって、糖鎖修飾リポソームを用いたドラッグデリバリーシステムに適した薬剤、特に感染症治療薬を提供することができるようになった。
Claims (7)
- 外表面がトリス（ヒドロキシアルキル）アルキルアミノ基及びシアリルルイスＸ基で修飾された糖鎖修飾リポソームであって、
バンコマイシンを含有しているリポソーム。 - 前記トリス（ヒドロキシアルキル）アルキルアミノ基が、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ基であることを特徴とする、請求項１に記載のリポソーム。
- 請求項１または２に記載のリポソームを含有する医薬組成物。
- 請求項１または２に記載のリポソームを含有する感染症治療剤。
- 医薬組成物の製造方法であって、
外表面がトリス（ヒドロキシアルキル）アルキルアミノ基及びシアリルルイスＸ基で修飾された糖鎖修飾リポソームに、バンコマイシンを含有させる工程を含む方法。 - 前記トリス（ヒドロキシアルキル）アルキルアミノ基が、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ基であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
- バンコマイシンを含有した前記糖鎖修飾リポソームを感染症治療剤に剤形化する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項５または６に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010180436 | 2010-08-11 | ||
| JP2010180436 | 2010-08-11 | ||
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Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2012020790A1 true JPWO2012020790A1 (ja) | 2013-10-28 |
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Citations (6)
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-
2011
- 2011-08-10 WO PCT/JP2011/068257 patent/WO2012020790A1/ja active Application Filing
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Non-Patent Citations (2)
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|---|
| JPN6011047682; Ｄａｒｉａ Ｎｉｃｏｌｏｓｉ ｅｔ ａｌ．: Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ Ｖｏｌ．３５, 201006, ｐ．５５３-５５８ * |
| JPN6011047684; ｚａｎｎａ Ｄｒｕｌｉｓ-Ｋａｗａ ｅｔ ａｌ．: Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ Ｖｏｌ．３８７, 201003, ｐ．１８７-１９８ * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2012020790A1 (ja) | 2012-02-16 |
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