JPWO2011002024A1 - 生体試料中の上皮性癌由来の細胞の存否を判定するための方法、分子マーカー及びキット - Google Patents
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- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
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Abstract
Description
しかしながら、これらの画像検査には熟練した技術が必要であること、検査において患者に不快感を与える場合があること及びコストが高いことなどの問題があった。
また、本発明は、メチル化解析によって上皮性癌由来の細胞の存否を判定するための新規分子マーカーを提供することを目的とする。さらに、本発明は、新規分子マーカーを用いたDNAのメチル化解析により上皮性癌由来の細胞の存否を判定するためのキットを提供することを目的とする。
また、本発明によれば、その方法に用い得る判定用新規分子マーカーおよび判定用キットを提供することができる。
本実施形態において、「メチル化の状態を解析する」とは、解析対象の塩基配列で示される領域に存在するCpG部位のメチル化の有無、または該塩基配列に存在するCpG部位のメチル化の頻度を解析することを意味する。ここで「解析対象の塩基配列」とは、配列番号1〜4の塩基配列から選択される少なくとも1つの塩基配列である。
上記の「メチル化の有無」は、解析対象の塩基配列で示される領域に存在する、少なくとも1つのCpG部位のシトシンがメチル化されているか否かを意味する。
また、「メチル化の頻度」は、解析対象の塩基配列で示される領域に存在する全てのCpG部位または任意のCpG部位のうち、メチル化されているCpG部位の数の割合を意味する。なお、メチル化の頻度は、配列番号1〜4の塩基配列のそれぞれについて解析されてもよいし、配列番号1〜4から選択される複数の塩基配列を一まとめにして解析されてもよい。
配列番号1の塩基配列で示される領域における5’末端側から2〜12番目のCpG部位、
配列番号2の塩基配列で示される領域における5’末端側から23〜31番目のCpG部位、
配列番号3の塩基配列で示される領域における5’末端側から5〜10番目のCpG部位、及び
配列番号4の塩基配列で示される領域における5’末端側から13〜27番目のCpG部位
から選択されることが好ましい。
まず、生体試料から抽出されたDNAと非メチル化シトシン変換剤とを反応させる。非メチル化シトシン変換剤は、DNAに含まれる非メチル化シトシンを、シトシン以外の塩基(ウラシル、チミン、アデニン又はグアニン)に変換させる物質である。このような非メチル化シトシン変換剤としては、亜硫酸水素塩(バイサルファイト)が好ましく用いられる。亜硫酸水素塩としては、亜硫酸水素のナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などを用いることができる。これらのうちいずれか1つ以上を用いてDNAを処理(バイサルファイト処理)する。バイサルファイト処理により、DNA中のメチル化されていないシトシンはウラシルに変換されるが、メチル化されたシトシンはウラシルに変換されない。
このバイサルファイト処理における亜硫酸水素塩の濃度は、DNAの非メチル化シトシンを充分に変換できる濃度であれば特に限定されない。より具体的な亜硫酸水素塩の濃度としては、通常1M以上、好ましくは1〜15 M、より好ましくは3〜10 Mである。
例えば、試料中の最終濃度が4Mとなるように亜硫酸水素ナトリウムを生体試料から抽出されたDNAに添加する場合、10〜90分間、50〜80℃でインキュベートすることにより、非メチル化シトシンをウラシルに変換させることができる。また、亜硫酸水素塩を低濃度で用いる場合は、非メチル化シトシンを充分に変換できる程度の処理時間及び温度に適宜変更すればよい。
なお、核酸増幅させる方法は、PCR法やLAMP法など公知の核酸増幅法であれば特に制限されない。また、核酸増幅法の条件も、核酸増幅法の種類、増幅させる領域のDNA断片の塩基配列、プライマーの塩基配列などに応じて適宜選択できる。
具体的には、解析対象の塩基配列が配列番号1であるとき、下記のプライマーセットを用いることができる。
配列番号13:ttttatgagttatagatgtaggtgatagt
配列番号14:ccaccttaatcaccaaataacc
解析対象の塩基配列が配列番号2であるとき、下記のプライマーセットを用いることができる。
配列番号15:taaaggatttgggattgagggtggg
配列番号16:ttcaaaaacatttctctaacaaaaaattc
解析対象の塩基配列が配列番号3であるとき、下記のプライマーセットを用いることができる。
配列番号17:gggagttaggtttaggtggggatatg
配列番号18:aaaatcaaaaaacaaaaaacccttaac
解析対象の塩基配列が配列番号4であるとき、下記のプライマーセットを用いることができる。
配列番号19:ttgtagtattattgttatagttttgtttttttt
配列番号20:attccactcctataataacatttatcaaaatctct
まず、バイサルファイト処理により、生体試料から抽出されたDNAに含まれる非メチル化シトシンをウラシルに変換させる。この処理では、メチル化シトシンはウラシルに変換されない。
次に、バイサルファイト処理後のDNAを、後述するプライマーセットを用いてPCR法により核酸増幅反応を行う。反応後、核酸増幅産物の有無によって、解析対象であるCpG部位のシトシンがメチル化シトシンであるか否かを判定できる。
また、解析対象であるCpG部位のシトシンがウラシルに変換された塩基配列は増幅できるが、該CpG部位のシトシンがウラシルに変換されていない塩基配列は増幅できないプライマーセットを用いることもできる。このようなプライマーセットを用いてPCR反応を行う場合、反応後に核酸増幅産物が検出されないとき、解析対象であるCpG部位がメチル化シトシンであることがわかる。
これらのプライマーセットに含まれるプライマーは、メチル化または非メチル化シトシンへの特異性を高めるために、プライマーの3’末端近傍に解析対象であるCpG部位のシトシンを含むように設計されることが好ましい。
配列番号5:gatgtaggtgatagttagcgatagcg
配列番号6:cctataaaaccgtctataaaaaaaacgaa
解析対象であるCpG部位が、配列番号2の塩基配列の5’末端側から28及び30番目であるとき、下記のプライマーセットを用いることができる。
配列番号7:gaggagttgtgtggttttattgagtc
配列番号8:tctctaacaaaaaattccgaaacgta
解析対象であるCpG部位が、配列番号3の塩基配列の5’末端側から6番目であるとき、下記のプライマーセットを用いることができる。
配列番号9:ttagaggcgagtaagagttagggtagtc
配列番号10:acctacaaaaacgacacaaaaaacg
解析対象であるCpG部位が、配列番号4の塩基配列の5’末端側から23及び24番目であるとき、下記のプライマーセットを用いることができる。
配列番号11:gggttgttatttaaggttatattcgtacga
配列番号12:taaaccgcaaatacgaaaacacgat
なお、解析対象の塩基配列で示される領域に存在する全CpG部位の数は既知であるので、該領域に存在するメチル化されたCpG部位の数自体をメチル化の頻度とすることができる。また、解析対象である領域に存在するメチル化されたCpG部位の数を、該領域に存在する全CpG部位の数で除した値を、メチル化の頻度とすることもできる。
例えば、配列番号1、配列番号3及び配列番号4の塩基配列で示される領域に存在する少なくとも1つのCpG部位にメチル化が有ると解析された場合に上皮性癌由来の細胞が存在すると判定でき、メチル化が無いと解析された場合に上皮性癌由来の細胞が存在しないと判定できる。
また、配列番号2の塩基配列で示される領域に存在する少なくとも1つのCpG部位にメチル化が無いと解析された場合に上皮性癌由来の細胞が存在すると判定でき、メチル化が有ると解析された場合に上皮性癌由来の細胞が存在しないと判定できる。
具体的には、配列番号1、配列番号3又は配列番号4の塩基配列で示される領域におけるメチル化の頻度が閾値より高い場合に上皮性癌由来の細胞が存在すると判定でき、該メチル化の頻度が閾値より低い場合に上皮性癌由来の細胞が存在しないと判定できる。
また、配列番号2の塩基配列で示される領域におけるメチル化の頻度が閾値より低い場合に上皮性癌由来の細胞が存在すると判定でき、該メチル化の頻度が閾値より高い場合に上皮性癌由来の細胞が存在しないと判定することができる。
具体的には、上皮性癌由来細胞でのメチル化の頻度が正常細胞でのメチル化の頻度よりも高い値を示す場合は、閾値は正常細胞のメチル化の頻度より高く、且つ上皮性癌由来細胞のメチル化の頻度より低い値に設定できる。上皮性癌由来細胞でのメチル化の頻度が正常細胞でのメチル化の頻度よりも低い値を示す場合、閾値は正常細胞のメチル化の頻度より低く、且つ上皮性癌由来細胞のメチル化の頻度より高い値に設定できる。
また、複数の正常細胞のメチル化の頻度と、複数の上皮性癌由来細胞のメチル化の頻度を解析し、最も高確率に正常細胞と上皮性癌由来細胞とを区別できる値を閾値とすることが好ましい。
メチル化DNA免疫沈降法及びマイクロアレイ(MeDIP-chip法)を用いて、乳癌由来の細胞のメチル化状態を解析した。
(1)メチル化DNA免疫沈降法
乳癌由来細胞株MCF7、MB-MDA231及びSKBR3、並びに正常乳腺上皮細胞株HMECから抽出した各ゲノムDNA(4μg)を生体試料として、これらを制限酵素MseI(NEB社)と37℃で一晩反応させて300〜1000 bpになるように断片化した。次いで、反応後の各生体試料を95℃で10分間加熱して変性させ、一本鎖ゲノムDNAにした。
Chromatin Immuoprecipitationアッセイキット(Upstate biotechnology社)に添付のマニュアルに従って、変性させた生体試料を該アッセイキットに付属の希釈用緩衝液で希釈し、これらにProteinG Sepharoseビーズ(GEヘルスケア社)を添加した。そして4℃で30分ローテーションした後、遠心分離して上清を回収することにより、該ビーズに非特異的に結合するタンパク質などを除いた。回収した上清を二つ分けて、それらを別々のチューブに移し、一方に抗メチル化シトシン抗体(検体試料用)を添加し、他方に正常マウスIgG抗体(SantaCruz社;対照試料用)を添加して、4℃で一晩ローテーションした。
これらにProteinG Sepharose ビーズ(GEヘルスケア社)を添加して4℃で1時間ローテーションして、前記抗体と前記抗体が認識して結合するゲノムDNAとの複合体を前記ビーズに結合させて回収した。回収したビーズを前記アッセイキットに添付のマニュアルに従ってアッセイキットに付属の洗浄用緩衝液で洗浄した後、免疫沈降させた複合体中のゲノムDNAを溶出用緩衝液で溶出した。
上記のメチル化DNA免疫沈降法で得たゲノムDNAを、プロテイナーゼKと反応させた後、Qiaquick PCR purificationキット(QIAGEN社)を用いて精製して、検体試料及び対照試料を得た。
上記(1)のメチル化DNA免疫沈降法によりメチル化DNAを特異的に回収できたかを確認するためにPCR法及びアガロース電気泳動法行った。
(i)PCR反応液の調製
下記の試薬を混合し、25μlの反応液を調製した。
2 x fastStart SYBR Green Master Mix(ROCHE社) 12.5μl
フォワード(F)−プライマー(10μM) 1μl
リバース(Rv)−プライマー(10μM) 1μl
ゲノムDNA(0.4 ng/μl) 1μl
dH2O 9.5μl
<ポジティブコントロール用プライマー>
「細胞株がMCF7及びHMECの場合:GSTP1 primer配列」
配列番号21:F: gaggccttcgctggagtt
配列番号22:Rv: gtactcactggtggcgaaga
「細胞株がMB-MDA231の場合:CDH1 primer配列」
配列番号23:F: gtgaaccctcagccaatcag
配列番号24:Rv: agttccgacgccactgag
「細胞株がSKBR3の場合:ER primer配列」
配列番号25:F: gcctacgagttcaacgccg
配列番号26:Rv: aacgccgcagcctcagac
<ネガティブコントロール用プライマー(非メチル化プローブ)>
「非メチル化遺伝子プライマー配列」
(1)ch14-cgf1
配列番号27:F: ggaggagtcaagagaagttggaagc
配列番号28:Rv: cccacactccatttccattcctc
(2)ch14-cgf2
配列番号29:F: gggtactttgccaatatagccatgc
配列番号30:Rv: tggctaagtgggagggagaacag
(3)ch14-cgf3
配列番号31:F: ggatgggagacacctggttca
配列番号32:Rv: ggatggaccagctgctttgtactc
(ii)PCR反応条件
上記の反応液を用い、下記の条件でPCRを行った。
95℃で10分、
95℃で30秒、66℃で15秒、72℃で30秒を45サイクル、
95℃で1分、66℃で30秒、95℃で30秒を1サイクル。
(iii)アガロース電気泳動
上記の各PCR産物を、2%アガロースゲルを用いて電気泳動し、増幅した核酸を確認した。
上記検体試料及び対照試料に含まれる核酸を、WT-Ovation(商標)Pico RNA Amplification System Version 1.0(NuGEN社)を用いて増幅した。具体的な操作は該製品に添付のマニュアルに従って行った。次いで、各試料の吸光度(260 nm及び280 nm)を測定して増幅した核酸の濃度を確認した。
そして、上記で増幅した検体試料及び対照試料に含まれる核酸を、FL-Ovation(商標) cDNA Biotin Module V2(NuGEN社)を用いて断片化及びビオチン標識を行った。具体的な操作は該製品に添付のマニュアルに従って行った。
(1)試料とマイクロアレイとの接触
上記で調製した検体試料及び対照試料を、マイクロアレイとしてのGeneChip(登録商標)Human Promoter 1.0R Array(Affymetrix社)に接触させて、マイクロアレイのプローブとのハイブリダイゼーションを行った。検体試料及び対照試料について、同種のマイクロアレイを1つずつ用いた。各試料の接触後の染色、洗浄及びスキャン(シグナルの測定)は、Affymetrix社から提供されるマニュアルに従って行った。
スキャン後、得られたアレイデータを解析した。アレイデータ解析は、Tiling Analysis Software(TAS:Affymetrix社)を用いて、抗メチル化シトシン抗体のサンプルが高いシグナルを示す領域ファイル(BARファイル)を作成し、各プローブのsignal、p-value(-10log10(p-value))を取得した。ある閾値以下の統計学的に有意なp-valueを示す領域(-10log10(p-value)<20など)はBEDファイルとして作成した。作成したBARファイル及びBEDファイルの解析には、標準ブラウザーであるIntegrated Genome Browser(Affymetrix社)を用いた。
そして、TASから出力した各p-value、signal値に相当するアノテーション情報を付加したデータを用いて、乳癌由来の細胞の存否を判定できる、新規分子マーカーの探索を行った。
メチル化状態の解析により特定した領域の塩基配列を、図1〜4に示す。解析の結果、正常乳腺上皮細胞株ではメチル化しておらず、乳癌細胞株ではメチル化しているDNA領域として、配列番号1、3及び4の領域を特定した。また、正常乳腺上皮細胞株ではメチル化しており、乳癌細胞株ではメチル化していないDNA領域として、配列番号2の領域を特定した。
すなわち、実施例1で特定した配列番号1〜4の領域は、正常細胞と乳癌由来の細胞との間でメチル化状態が異なる領域である。よって、これら領域は、メチル化解析における上皮性癌由来の細胞の存否を判定するための分子マーカーとして利用できる可能性が示唆された。
実施例1において特定された領域の塩基配列に含まれる、CpG部位のメチル化状態を、バイサルファイトシークエンスによって解析した。また、解析結果に基づいて、メチル化の頻度及び各CpG部位におけるメチル化の割合を求めた。
バイサルファイトシークエンスを行うため、細胞株から抽出したDNA及び組織由来ゲノムDNAをバイサルファイト処理し、分析用試料を調製した。
ロットが異なる3種類のヒト正常乳腺組織由来ゲノムDNA(BioChain社)を混合したものを、正常ヒト乳腺組織由来ゲノムDNAとして用いた。また、ロットが異なる3種類のヒト乳癌組織由来ゲノムDNA(BioChain社)を混合したものを、乳癌組織由来ゲノムDNAとして用いた。
各ゲノムDNA2μgに300μlの0.3 M NaOHを加え、37℃、10分間インキュベートした。次に、バイサルファイト処理を行うため、10 Mの亜硫酸水素ナトリウム溶液300μlを加え、80℃、40分間インキュベートした。バイサルファイト処理後の溶液中に含まれるDNAをQiaquick PCR purificationキット(QIAGEN社)を用いて精製した。このようにして、バイサルファイト処理された正常乳腺組織由来ゲノムDNAを含む正常乳腺組織試料を取得し、バイサルファイト処理された乳癌組織由来ゲノムDNAを含む乳癌組織試料を取得した。
また、乳癌細胞株MCF7、及び正常乳腺上皮細胞株HMECは、QIAmp Blood Maxiキット(QIAGEN社)を用いてゲノムを抽出した。
抽出したゲノムDNA2μgに、300μlの0.3 M NaOHを加え、37℃、10分間インキュベートした。次に、バイサルファイト処理を行うため、10 Mの亜硫酸水素ナトリウム溶液300μlを加え、80℃、40分間インキュベートした。バイサルファイト処理後、溶液中に含まれるDNAをQiaquick PCR purificationキット(QIAGEN社)を用いて精製した。このようにして、バイサルファイト処理された正常乳腺上皮細胞株HMEC由来ゲノムDNAを含む正常乳腺細胞株試料を取得し、バイサルファイト処理された乳癌細胞株MCF7由来ゲノムDNAを含む乳癌細胞株試料を取得した。
上記で精製された正常乳腺組織試料、乳癌組織試料、正常乳腺細胞株試料及び乳癌細胞株試料について、下記に示す反応溶液を用いてPCRを行い、PCR増幅産物を得た。
<PCR反応液>
10×Ex Taq Buffer(20 mM Mg2+plus)(TaKaRa社) 2.5μL
dNTP Mixture(各2.5 mM) 2μL
F-primer (10μM) 1μL
Rv-primer (10μM) 1μL
Template 1μL
TaKaRa Ex Taq HS(5U/μl) 0.2μL
dH 2 O 17.3μL
Total 25μL
<正常乳腺組織試料及び乳癌組織試料に含まれるDNAを増幅するためのPCR反応条件>
95℃ 4.5分
95℃ 30秒、57.3℃ 30秒、72℃ 30秒を40cycles
配列番号13:F: ttttatgagttatagatgtaggtgatagt
配列番号14:Rv: ccaccttaatcaccaaataacc
<配列番号2の領域をシークエンスするためのプライマー配列>
配列番号15:F: taaaggatttgggattgagggtggg
配列番号16:Rv: ttcaaaaacatttctctaacaaaaaattc
<配列番号4の領域をシークエンスするためのプライマー配列>
配列番号19: F: ttgtagtattattgttatagttttgtttttttt
配列番号20:Rv: attccactcctataataacatttatcaaaatctct
<PCR反応液>
10×Ex Taq Buffer(20 mM Mg2+plus)(TaKaRa社) 2.5μL
dNTP Mixture(各2.5 mM) 2μL
F-primer (10μM) 1μL
Rv-primer (10μM) 1μL
Template 1μL
TaKaRa Ex Taq HS(5U/μl) 0.2μL
dH 2 O 17.3μL
Total 25μL
<正常乳腺細胞株試料及び乳癌細胞株試料に含まれるDNAを増幅するためのPCR反応条件>
95℃ 4.5分
95℃ 30秒、57.6℃ 30秒、72℃ 30秒を40cycles
配列番号17: F: gggagttaggtttaggtggggatatg
配列番号18:Rv: aaaatcaaaaaacaaaaaacccttaac
<配列番号4の領域をシークエンスするためのプライマー配列>
配列番号19: F: ttgtagtattattgttatagttttgtttttttt
配列番号20:Rv: attccactcctataataacatttatcaaaatctct
上記PCRにより得られた増幅産物を、TAクローニングキット(TOPO TA Cloning キット(invitrogen社))を用いてベクターに組み込んだ。ベクターに組み込まれた構築物を用いて、大腸菌(TOP10)を形質転換した。その後、形質転換した大腸菌をLB寒天培地(組成:1%(w/v)トリプトン、0.5%(w/v)酵母エキス、1%(w/v)塩化ナトリウム、1.5%(w/v)寒天)を用いて、37℃で一晩培養した。
培養後、得られた大腸菌から、GenElute Plasmid Miniprepキット(SIGMA社)を用いてプラスミドを精製した。精製したプラスミドに組み込まれている前記増幅産物の塩基配列を、BigDye terminator Cycle Sequencing法により、遺伝子解析システム(Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer(アプライドバイオシステムズ社))を用いて決定した。
塩基配列解析後、各サンプルにおいて、CpG部位がメチル化されているか否かを解析した。
各領域(配列番号1〜4)における、メチル化されているか否かを解析した結果を図5〜9に示す。メチル化されているCpG部位を「黒丸」、メチル化されていないCpG部位を「白丸」で示す。
図5は、正常乳腺組織7サンプル、乳癌組織9サンプルにおける、配列番号1の塩基配列の5’末端側から数えて2〜12番目のCpG部位のメチル化の有無を示した表である。
図6は、正常乳腺組織2サンプル、乳癌組織5サンプルにおける、配列番号2の塩基配列の5’末端側から数えて23〜31番目のCpG部位のメチル化の有無を示した表である。
図7は、正常乳腺上皮由来細胞株(HMEC)9サンプル、乳癌由来細胞株(MCF7)7サンプルにおける、配列番号3の塩基配列の5’末端側から数えて5〜10番目のCpG部位のメチル化の有無を示した表である。
図8は、正常乳腺上皮由来細胞株(HMEC)7サンプル、乳癌由来細胞株(MCF7)7サンプルにおける、配列番号4の塩基配列の5’末端側から数えて13〜24番目のCpG部位のメチル化の有無を示した表である。
図9は、正常乳腺組織4サンプル、乳癌組織4サンプルにおける、配列番号4の塩基配列の5’末端側から数えて13〜27番目のCpG部位のメチル化の有無を示した表である。
図10〜14で示された、正常細胞(正常乳腺組織、又は正常乳腺上皮由来細胞株)のメチル化の頻度と、乳癌由来の細胞(乳癌組織、又は乳癌由来細胞株)のメチル化頻度とから、閾値を50%と設定する。
配列番号1、3及び4の塩基配列で示される領域のメチル化の頻度において、正常細胞では閾値より低く、乳癌由来の細胞では設定した閾値よりも高い。
このことから、被検者より採取された生体試料から抽出されたDNAに含まれる、配列番号1、3及び4の領域では、メチル化の頻度が高いという解析結果が得られた場合に、生体試料中に上皮性癌由来の細胞が存在すると判定できることが示唆された。
また、配列番号2の塩基配列で示される領域のメチル化の頻度において、正常細胞では閾値より高く、乳癌由来の細胞では設定した閾値よりも低い。
このことから、被検者より採取された生体試料から抽出されたDNAに含まれる、配列番号2の領域では、メチル化の頻度が低いという解析結果が得られた場合に、生体試料中に上皮性癌由来の細胞が存在すると判定できることが示唆された。
図15〜19より、配列番号1、3及び4の塩基配列に存在するCpG部位のメチル化の割合は乳癌由来の細胞の方が高く、配列番号2の塩基配列に存在するCpG部位のメチル化の割合は正常細胞の方が高い。
このことから、配列番号1、3及び4の塩基配列に存在するCpG部位にメチル化が有ると解析されたときに生体試料中に乳癌由来の細胞が存在すると判定でき、配列番号2の塩基配列に存在するCpG部位にメチル化が無いと解析されたときに生体試料中に乳癌由来の細胞が存在すると判定できることが示唆された。
また、これらのCpG部位の中でも、正常細胞と乳癌由来の細胞とでメチル化の割合の差が大きいCpG部位は、メチル化状態を解析するのに適している。このようなCpG部位を標的としてメチル化特異的PCR用のプライマーを設計することによって、より正確に乳癌由来の細胞の存否を判定できるといえる。
乳癌のゲノムDNAにおける、配列番号1、3及び4の塩基配列に含まれるCpG部位のメチル化状態を、メチル化特異的PCR法によって解析した。
ゲノムDNAは、ロットの異なる3種類の正常ヒト乳腺組織由来ゲノムDNA(BioChain社)、及びロットが異なる3種類のヒト乳癌組織由来ゲノムDNA(BioChain社)を用いた。
各ゲノムDNA2μgに300μlの0.3 M NaOHを加え、37℃、10分間インキュベートした。次に、バイサルファイト処理を行うため、10 Mの亜硫酸水素ナトリウム溶液300μlを加え、80℃、40分間インキュベートした。バイサルファイト処理後の溶液中に含まれるDNAをQiaquick PCR purificationキット(QIAGEN社)を用いて精製した。このようにして、バイサルファイト処理された正常乳腺組織由来ゲノムDNAを含む正常乳腺組織検体A、B及びCを取得し、バイサルファイト処理された乳癌組織由来ゲノムDNAを含む乳癌組織検体D、E及びFを取得した。
配列番号1と配列番号4のメチル化解析を行うためのPCR反応には、下記に示す反応溶液、反応条件及びプライマーを用いた。
配列番号1に対するメチル化特異的PCR用プライマーは、配列番号1の塩基配列の5'末端側から3、4及び10番目のCpGを標的としてメチル化の有無を解析するためのプライマーである。配列番号4に対するメチル化特異的PCR用プライマーは、配列番号4の塩基配列の5'末端側から23及び24番目のCpG部位を標的としてメチル化の有無を解析するためのプライマーである。
2 x FastStart SYBR Green Master Mix(ROCHE社)12.5μL
F-primer (10μM) 1μL
Rv-primer (10μM) 1μL
Template 1μL
dH 2 O 9.5μL
Total 25μL
<配列番号1及び4のPCR反応条件>
95℃ 10分
95℃ 30秒、62℃ 30秒、72℃ 30秒を33cycles
95℃ 1分、62℃ 30秒、95℃ 30秒を 1cycle
配列番号5:F: gatgtaggtgatagttagcgatagcg
配列番号6:Rv: cctataaaaccgtctataaaaaaaacgaa
<配列番号4のメチル化特異的PCR用プライマー>
配列番号11:F: gggttgttatttaaggttatattcgtacga
配列番号12:Rv: taaaccgcaaatacgaaaacacgat
<PCR反応液>
2 x FastStart SYBR Green Master Mix(ROCHE社) 12.5μL
F-primer (10μM) 1μL
Rv-primer (10μM) 1μL
Template 1μL
dH 2 O 9.5μL
Total 25μL
<配列番号3のPCRの反応条件>
95℃ 10分
95℃ 30秒、62℃ 30秒、72℃ 30秒を35cycles
95℃ 1分、62℃ 30秒、95℃ 30秒を1cycle
配列番号9 :F: ttagaggcgagtaagagttagggtagtc
配列番号10:Rv: acctacaaaaacgacacaaaaaacg
メチル化特異的PCRにより増幅された増幅産物をアガロースゲル電気泳動で確認した結果を図17〜19に示す。
図17(配列番号1のメチル化特異的PCR解析)、図18(配列番号3のメチル化特異的PCR解析)、及び図19(配列番号4のメチル化特異的PCR解析)のいずれにおいても、正常乳腺組織検体A、B及びCと比較して、乳癌組織検体D、E及びFでは増幅産物の量が多いことが確認できた。
このことから、被検者より採取された生体試料から抽出されたDNAに含まれる、配列番号1〜4の塩基配列に存在するCpG部位を、メチル化特異的PCR法により解析することで、生体試料中の乳癌由来の細胞の存否を判定できることが示唆された。
大腸癌、胃癌、子宮頸癌のゲノムDNAにおける、配列番号1の塩基配列に含まれるCpG部位のメチル化状態を、メチル化特異的PCR法によって解析した。
QIAmp Blood Maxiキット(QIAGEN社)を用いて、大腸癌細胞株HCT16、胃癌細胞株KATO3ならびに子宮頸癌細胞株C33A及びSiHaからゲノムを抽出した。抽出した各ゲノムDNA2μgに300μlの0.3 M NaOHを加え、37℃、10分間インキュベートした。次に、バイサルファイト処理を行うため、10 Mの亜硫酸水素ナトリウム溶液300μlを加え、80℃、40分間インキュベートした。バイサルファイト処理後の溶液中に含まれるDNAをQiaquick PCR purificationキット(QIAGEN社)を用いて精製した。このようにして、バイサルファイト処理されたHCT16由来ゲノムDNAを含む大腸癌HCT16試料を取得し、バイサルファイト処理されたKATO3由来ゲノムDNAを含む胃癌KATO3試料を取得し、バイサルファイト処理されたC33A由来ゲノムDNAを含む子宮頸癌C33A試料を取得し、バイサルファイト処理されたSiHa由来ゲノムDNAを含む子宮頸癌SiHa試料を取得した。
さらに、ロットが異なる2種類のヒト大腸癌組織由来ゲノムDNA(BioChain社)及び1種類のヒト正常大腸組織由来ゲノムDNA(BioChain社)についても、上記細胞株と同様の処理を行った。このようにして、バイサルファイト処理された大腸癌組織由来ゲノムDNAを含む2種類の大腸癌組織試料(大腸癌組織試料A及び大腸癌組織試料B)を取得し、バイサルファイト処理された正常大腸組織由来ゲノムDNAを含む正常大腸組織試料を取得した。
配列番号1のメチル化解析を行うためのPCR反応には、実施例3に記載の反応溶液、反応条件及びプライマーを用いた。
配列番号1の塩基配列のメチル化特異的PCR法により増幅された増幅産物をアガロースゲル電気泳動で確認した結果を図23に示す。この結果から、正常大腸癌組織試料と比較して、大腸癌乳癌組織試料A及びBでは増幅産物の量が多いことが確認できた。さらに、大腸癌HCT16試料、胃癌KATO3試料、子宮頸癌C33A試料及び子宮頸癌SiHa試料においても大腸癌乳癌組織試料A及びBとほぼ等しい量の増幅産物を確認できることが示された。
以上のことから、配列番号1の塩基配列に存在するCpG部位を、メチル化特異的PCR法によりメチル化解析することで、乳癌、大腸癌、胃癌、子宮頸癌などの上皮性癌由来の細胞の存否を判定できることが示唆された。
大腸癌のゲノムDNAにおける、配列番号2の塩基配列に含まれるCpG部位のメチル化状態を、メチル化特異的PCR法によって解析した。
測定試料として、上記の実施例4で得られた2種類の大腸癌組織試料(大腸癌組織試料A及び大腸癌組織試料B)ならびに正常大腸組織試料を用いた。
配列番号2に対するメチル化特異的PCR用プライマーは、配列番号2の5'末端側から28及び30番目のCpGを標的としてメチル化の有無を解析するためのプライマーである。
2 x FastStart SYBR Green Master Mix(ROCHE社) 12.5μL
F-primer (10μM) 1μL
Rv-primer (10μM) 1μL
Template 1μL
dH 2 O 9.5μL
Total 25μL
<配列番号2のPCR反応条件>
95℃ 10分
95℃ 30秒、62℃ 30秒、72℃ 30秒を33cycles
95℃ 1分、62℃ 30秒、95℃ 30秒を 1cycle
配列番号7:F : gaggagttgtgtggttttattgagtc
配列番号8:Rv: tctctaacaaaaaattccgaaacgta
(結果)
PCDHB6遺伝子(配列番号2)のメチル化特異的PCR法により増幅された増幅産物をアガロースゲル電気泳動で確認した結果を図24に示す。この結果から、大腸癌乳癌組織試料A及びBと比較して、正常大腸癌組織試料では増幅産物の量が多いことが確認できた。
以上のことから、配列番号2の塩基配列中に存在するCpG部位を、メチル化特異的PCR法によりメチル化解析することで、大腸癌などの上皮性癌由来の細胞の存否を判定できることが示唆された。
大腸癌及び子宮頸癌のゲノムDNAにおける、配列番号3の塩基配列に含まれるCpG部位のメチル化状態を、メチル化特異的PCR法によって解析した。
測定試料として、実施例4で得られた大腸癌HCT16試料、子宮頸癌C33A試料及び子宮頸癌SiHa試料、ならびに2種類の大腸癌組織試料(大腸癌組織試料A及び大腸癌組織試料B)及び正常大腸組織試料を用いた。
また、配列番号3の塩基配列のメチル化解析を行うためのPCR反応には、実施例3に記載の反応溶液、反応条件及びプライマーを用いた。
配列番号3の塩基配列のメチル化特異的PCR法により増幅された増幅産物をアガロースゲル電気泳動で確認した結果を図25に示す。この結果から、正常大腸癌組織試料と比較して、大腸癌乳癌組織試料A及びBでは増幅産物の量が多いことが確認できた。さらに、大腸癌HCT16試料、子宮頸癌C33A試料及び子宮頸癌SiHa試料においても、大腸癌乳癌組織試料A及びBとほぼ等しい量の増幅産物を確認できることが示された。
以上のことから、配列番号3の塩基配列に存在するCpG部位を、メチル化特異的PCR法によりメチル化解析することで、乳癌、大腸癌、子宮頸癌などの上皮性癌由来の細胞の存否を判定できることが示唆された。
大腸癌、胃癌、子宮頸癌のゲノムDNAにおける、chromosome1遺伝子(配列番号4)に含まれるCpG部位のメチル化状態を、メチル化特異的PCR法によって解析した。
測定試料として、上記実施例4で得られた大腸癌HCT16試料、胃癌KATO3試料、子宮頸癌C33A試料及び子宮頸癌SiHa試料、ならびに2種類の大腸癌組織試料(大腸癌組織試料A及び大腸癌組織試料B)及び正常大腸組織試料を用いた。
また、配列番号4のメチル化解析を行うためのPCR反応には、実施例3に記載の反応溶液、反応条件、及びプライマーを用いた。
配列番号4の塩基配列のメチル化特異的PCR法により増幅された増幅産物をアガロースゲル電気泳動で確認した結果を図26に示す。この結果から、正常大腸癌組織試料と比較して、大腸癌乳癌組織試料A及びBでは増幅産物の量が多いことが確認できた。さらに、大腸癌HCT16試料、胃癌KATO3試料、子宮頸癌C33A試料及び子宮頸癌SiHa試料においても、大腸癌乳癌組織試料A及びBとほぼ等しい量の増幅産物が確認できることが示された。
以上のことから、配列番号4の塩基配列に存在するCpG部位を、メチル化特異的PCR法によりメチル化解析することで、乳癌、大腸癌、胃癌、子宮頸癌などの上皮性癌由来の細胞の存否を判定できることが示唆された。
Claims (13)
- 被検者から採取した生体試料からDNAを抽出する抽出工程と、
抽出工程で得られたDNAに含まれる配列番号1、配列番号2、配列番号3及び配列番号4の塩基配列で示される少なくとも1つの領域に存在するCpG部位における、メチル化の状態を解析する解析工程と、
解析工程で得られた解析結果に基づいて、生体試料中の上皮性癌由来の細胞の存否を判定する判定工程と
を含む、生体試料中の上皮性癌由来の細胞の存否を判定するための方法。 - 解析工程が、配列番号1、配列番号2、配列番号3及び配列番号4の塩基配列で示される少なくとも1つの領域に存在する、少なくとも1つのCpG部位のメチル化の有無を解析する工程である、請求項1に記載の方法。
- 判定工程が、解析工程において、配列番号1、配列番号3及び配列番号4の塩基配列で示される少なくとも1つの領域に存在するCpG部位にメチル化が有るという解析結果が得られた場合に、生体試料中に上皮性癌由来の細胞が存在すると判定する工程である、請求項2に記載の方法。
- 判定工程が、解析工程において、配列番号2の塩基配列で示される少なくとも1つの領域に存在するCpG部位にメチル化が無いという解析結果が得られた場合に、生体試料中に上皮性癌由来の細胞が存在すると判定する工程である、請求項2又は3に記載の方法。
- 解析工程が、配列番号1、配列番号2、配列番号3及び配列番号4の塩基配列で示される少なくとも1つの領域に存在する、CpG部位のメチル化の頻度を解析する工程である、請求項1に記載の方法。
- 判定工程が、解析工程において、配列番号1、配列番号3及び配列番号4の塩基配列で示される少なくとも1つの領域に存在するCpG部位のメチル化の頻度が高いという解析結果が得られた場合に、生体試料中に上皮性癌由来の細胞が存在すると判定する工程である、請求項5に記載の方法。
- 判定工程が、解析工程において、配列番号2の塩基配列で示される領域に存在するCpG部位のメチル化の頻度が低いという解析結果が得られた場合に、生体試料中に上皮性癌由来の細胞が存在すると判定する工程である、請求項5又は6に記載の方法。
- CpG部位が、
配列番号1の塩基配列で示される領域における、5’末端側から2〜12番目のCpG部位、
配列番号2の塩基配列で示される領域における、5’末端側から23〜31番目のCpG部位、
配列番号3の塩基配列で示される領域における、5’末端側から5〜10番目のCpG部位、及び
配列番号4の塩基配列で示される領域における、5’末端側から13〜27番目のCpG部位
から選択される、請求項1に記載の方法。 - 配列番号1、配列番号2、配列番号3及び配列番号4で示される少なくとも1つの領域に存在する、少なくとも1つのCpG部位から選択される、メチル化解析を用いた、上皮性癌由来の細胞の存否を判定するための分子マーカー。
- CpG部位が、
配列番号1の塩基配列で示される領域における、5’末端側から2〜12番目のCpG部位、
配列番号2の塩基配列で示される領域における、5’末端側から23〜31番目のCpG部位、
配列番号3の塩基配列で示される領域における、5’末端側から5〜10番目のCpG部位、及び
配列番号4の塩基配列で示される領域における、5’末端側から13〜27番目のCpG部位
から選択される、請求項9に記載の分子マーカー。 - 被検者から採取した生体試料から抽出されたDNAに含まれる非メチル化シトシンを他の塩基に変換する非メチル化シトシン変換剤と、
配列番号1、配列番号2、配列番号3又は配列番号4の塩基配列で示される領域に存在する、少なくとも1つのCpG部位のメチル化をメチル化特異的PCRによって確認するためのプライマーセットと、
を備える、生体試料中の上皮性癌由来の細胞の存否を判定するためのキット。 - CpG部位が、
配列番号1の塩基配列で示される領域における、5’末端側から2〜12番目のCpG部位、
配列番号2の塩基配列で示される領域における、5’末端側から23〜31番目のCpG部位、
配列番号3の塩基配列で示される領域における、5’末端側から5〜10番目のCpG部位、及び
配列番号4の塩基配列で示される領域における、5’末端側から13〜27番目のCpG部位
から選択される、請求項11に記載のキット。 - プライマーセットが、
配列番号5及び配列番号6の塩基配列で示されるプライマー、
配列番号7及び配列番号8の塩基配列で示されるプライマー、
配列番号9及び配列番号10の塩基配列で示されるプライマー、及び
配列番号11及び配列番号12の塩基配列で示されるプライマー
から選択される、請求項11又は12に記載のキット。
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