JPWO2010007701A1 - 心筋壊死を伴う疾患の治療薬及び検査薬 - Google Patents
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Abstract
Description
即ち、本発明は、心筋梗塞後の心破裂の防止及び/又は心筋壊死部位の修復を促進する物質を心筋梗塞、又は心筋壊死を伴う公知の疾患(心筋梗塞や心筋炎や心筋症など)の治療のための医薬及び検査薬として提供することを解決すべき課題とした。
まず、ペリオスチンの心臓での発現を調べてみると、ペリオスチンタンパク質は、マウスの発生過程においては心臓に発現しているが、成獣の心筋層ではその発現は消失していた。次に、マウスに対して左室下行冠動脈を結さつする心筋梗塞モデルを作製した。結さつ後3日後からペリオスチンタンパク質は心筋層と梗塞層の境界部位に発現が見られるようになり、7日目には心筋梗塞層内における発現が急激に増加した。ペリオスチンにはスプライシングバリアントが多数報告されており、その検討を行ったところ、心筋梗塞急性期にはC末端を一部欠いたΔbΔeというアイソフォーム[以下、ペリオスチンバリアント(ΔbΔe)タンパク質と称する。また、別称として、ペリオスチンバリアント(ΔbΔe)ポリペプチド、ペリオスチンバリアント(ΔbΔe)、ΔbΔeの名称も併用することがある]が特異的に発現していることが明らかとなった。
Adhesion Kinase)のリン酸化が重要であるといわれていることから、本発明者らはペリオスチン欠損マウスの心筋梗塞部位でのリン酸化に注目した。すると、興味深いことに、梗塞時には、野生型に比べてFAKのリン酸化が大きく減少していることがわかった。より詳細にペリオスチンとFAKとの関係を検討するため、培養条件下でΔbΔeを添加して検討を行った。その結果、添加時にはFAKのリン酸化亢進が見られたが、αVインテグリンを阻害することでFAKのリン酸化、及びペリオスチンによって誘導される線維芽細胞の遊走も阻害された。こうした実験結果から、ペリオスチンが関係するシグナル伝達機構にはαVインテグリンやFAKが関っており、急性心筋梗塞の修復において、ペリオスチンによる線維芽細胞の梗塞部位への移動・活性化とコラーゲンの細線維形成が重要であることが明らかとなった。
以上の知見に述べたように、ペリオスチンバリアント(ΔbΔe)が梗塞部位の修復に特異的な活性を有していることを示すことを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下の(1)〜(42)を提供するものである。
(2)[a]配列番号3、配列番号6、又は配列番号9で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
[b]配列番号3、配列番号6、又は配列番号9で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチド;又は
[c]配列番号3、配列番号6、又は配列番号9で表されるアミノ酸配列との同一性が60%以上であるアミノ酸配列を含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチド
を有効成分として含有する、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬。
(3)前記医薬が心臓機能改善作用を有する、(1)又は(2)の医薬。
(4)前記医薬が心臓再生促進作用を有する、(1)〜(3)の医薬。
(5)治療に有効量のペリオスチンバリアント(ΔbΔe)ポリペプチドを治療対象に投与することを含む、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防方法。
(6)[a]配列番号3、配列番号6、又は配列番号9で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
[b]配列番号3、配列番号6、又は配列番号9で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチド;又は
[c]配列番号3、配列番号6、又は配列番号9で表されるアミノ酸配列との同一性が60%以上であるアミノ酸配列を含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチド
からなる群から選んだ、治療に有効量のポリペプチドを治療対象に投与することを含む、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防方法。
(7)前記方法が心臓機能改善作用を有する、(5)又は(6)の方法。
(8)前記方法が心臓再生促進作用を有する、(5)〜(7)の方法。
(9)心筋壊死を伴う疾患の治療のための医薬の製造における、ペリオスチンバリアント(ΔbΔe)ポリペプチドの使用。
(10)心筋壊死を伴う疾患の治療のための医薬の製造における、
[a]配列番号3、配列番号6、又は配列番号9で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
[b]配列番号3、配列番号6、又は配列番号9で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチド;又は
[c]配列番号3、配列番号6、又は配列番号9で表されるアミノ酸配列との同一性が60%以上であるアミノ酸配列を含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチド
の使用。
(11)前記医薬が心臓機能改善作用を有する、(9)又は(10)の使用。
(12)前記医薬が心臓再生促進作用を有する、(9)〜(11)の使用。
(13)ペリオスチンバリアント(ΔbΔe)をコードするポリヌクレオチドを含有する、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬。
(14)[a]配列番号3、配列番号6、又は配列番号9で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
[b]配列番号3、配列番号6、又は配列番号9で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
[c]配列番号3、配列番号6、又は配列番号9で表されるアミノ酸配列との同一性が60%以上であるアミノ酸配列を含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;又は
[d]配列番号1、配列番号4、又は配列番号7で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
を含有する、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬。
(15)前記医薬が、心臓機能改善作用を有する、(13)又は(14)の医薬。
(16)前記医薬が、心臓再生促進作用を有する、(13)〜(15)の医薬。
(17)治療に有効量のペリオスチンバリアント(ΔbΔe)をコードするポリヌクレオチドを、治療対象に投与することを含む、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防方法。
(18)[a]配列番号3、配列番号6、又は配列番号9で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
[b]配列番号3、配列番号6、又は配列番号9で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
[c]配列番号3、配列番号6、又は配列番号9で表されるアミノ酸配列との同一性が60%以上であるアミノ酸配列を含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;又は
[d]配列番号1、配列番号4、又は配列番号7で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
からなる群から選んだ、治療に有効量のポリヌクレオチドを治療対象に投与することを含む、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防方法。
(19)前記方法が、心臓機能改善作用を有する、(17)又は(18)の方法。
(20)前記方法が、心臓再生促進作用を有する、(17)〜(19)の方法。
(21)心筋壊死を伴う疾患の治療のための医薬の製造における、ペリオスチンバリアント(ΔbΔe)をコードするポリヌクレオチドの使用。
(22)心筋壊死を伴う疾患の治療のための医薬の製造における、
[a]配列番号3、配列番号6、又は配列番号9で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
[b]配列番号3、配列番号6、又は配列番号9で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
[c]配列番号3、配列番号6、又は配列番号9で表されるアミノ酸配列との同一性が60%以上であるアミノ酸配列を含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;又は
[d]配列番号1、配列番号4、又は配列番号7で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
の使用。
(23)前記医薬が、心臓機能改善作用を有する、(21)又は(22)の使用。
(24)前記医薬が、心臓再生促進作用を有する、(21)〜(23)の使用。
(25)[a]ペリオスチンバリアント(ΔbΔe)ポリペプチドをコードするDNA、若しくはその部分断片であるDNA;
[b]配列番号1、配列番号4、又は配列番号7で表される塩基配列からなるDNA、若しくはその部分断片であるDNA;又は
[c]配列番号1、配列番号4、又は配列番号7で表される塩基配列における連続した5〜60塩基からなる配列を有するオリゴヌクレオチド若しくはその誘導体、前記オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド若しくはその誘導体
を含有する、心筋壊死を伴う疾患の検査薬。
(26)ペリオスチンバリアント(ΔbΔe)ポリペプチドを特異的に認識する抗体を含有する、心筋壊死を伴う疾患の検査薬。
(27)(1)検査対象より取得した生体試料から検査検体由来DNA又はcDNAを調製する工程、
(2)[a]ペリオスチンバリアント(ΔbΔe)ポリペプチドをコードするDNA、若しくはその部分断片であるDNA;
[b]配列番号1、配列番号4、又は配列番号7で表される塩基配列からなるDNA、若しくはその部分断片であるDNA;又は
[c]配列番号1、配列番号4、又は配列番号7で表される塩基配列における連続した5〜60塩基からなる配列を有するオリゴヌクレオチド若しくはその誘導体、前記オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド若しくはその誘導体
を用いて、前記検査検体由来DNA又はcDNAにおける、ペリオスチンバリアント(ΔbΔe)ポリペプチドをコードするDNAの変異を検出する工程、及び
(3)前記変異に基づいて、心筋壊死を伴う疾患のリスク、種類、程度、及び/又は状態を判定する工程
を含む、心筋壊死を伴う疾患の検査方法。
(28)(1)検査対象より取得した生体試料から検査検体由来DNA又はcDNAを調製する工程、
(2)[a]ペリオスチンバリアント(ΔbΔe)ポリペプチドをコードするDNA、若しくはその部分断片であるDNA;
[b]配列番号1、配列番号4、又は配列番号7で表される塩基配列からなるDNA、若しくはその部分断片であるDNA;又は
[c]配列番号1、配列番号4、又は配列番号7で表される塩基配列における連続した5〜60塩基からなる配列を有するオリゴヌクレオチド若しくはその誘導体、前記オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド若しくはその誘導体
を用いて、前記検査検体由来DNA又はcDNAにおける、ペリオスチンバリアント(ΔbΔe)ポリペプチドをコードするDNAを特異的に増幅し、その発現量を分析する工程、及び
(3)前記発現量に基づいて、心筋壊死を伴う疾患の程度及び/又は状態を判定する工程
を含む、心筋壊死を伴う疾患の検査方法。
(29)(1)検査対象より取得した生体試料から検体を調製する工程、
(2)ペリオスチンバリアント(ΔbΔe)ポリペプチドを特異的に認識する抗体を用いて、前記検体中のペリオスチンバリアント(ΔbΔe)ポリペプチドの発現量及び/又は構造変化を検出する工程、及び
(3)前記発現量及び/又は構造変化に基づいて、心筋壊死を伴う疾患の危険性、原因、程度、及び/又は状態を判定する工程
を含む、心筋壊死を伴う疾患の検査方法。
(30)(i)(1)又は(2)に記載のポリペプチドを発現する細胞における前記ポリペプチドの発現量と、(ii)前記ポリペプチドを発現する細胞と試験物質を接触させた場合の前記ポリペプチドの発現量とを比較し、前記ポリペプチドの発現量を増大させる物質を選択することを特徴とする、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬のスクリーニング方法。
(31)(i)(1)又は(2)に記載のポリペプチドを発現する細胞の機能と、(ii)前記ポリペプチドを発現する細胞と試験物質を接触させた場合の細胞の機能とを比較し、細胞の機能を制御する活性を有する物質を選択することを特徴とする、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬のスクリーニング方法。
(32)前記細胞が、ペリオスチンをコードする遺伝子を欠如している細胞である、(30)又は(31)のスクリーニング方法。
(33)心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬が、心臓機能改善作用を有する物質である、(30)〜(32)の方法。
(34)心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬が、心臓再生促進作用を有する物質である、(30)〜(32)の方法。
(35)(30)〜(34)の方法によって得られる化合物、又はその薬理学的に許容される塩。
(36)(35)の化合物、又はその薬理学的に許容される塩を含有する、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬。
(37)心臓機能改善作用を有する医薬である、(36)の心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬。
(38)修復心臓再生促進作用を有する医薬である、(36)の心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬。
(39)治療に有効量の(35)の化合物、又はその薬理学的に許容される塩を治療対象に投与することを含む、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防方法。
(40)心筋壊死を伴う疾患の治療のための医薬の製造における、(35)の化合物、又はその薬理学的に許容される塩の使用。
(41)ペリオスチンバリアント(ΔbΔe)タンパク質を特異的に認識する抗体。
(42)(41)の抗体を用いることを特徴とする、ペリオスチンバリアント(ΔbΔe)タンパク質の免疫学的検出又は定量方法。
本発明の更に別の側面によれば、心筋壊死を伴う疾患の治療のための医薬の製造における、上記ポリペプチドの使用が提供される。
本発明の更に別の側面によれば、心筋壊死を伴う疾患の治療のための遺伝子治療剤の製造における、上記ポリヌクレオチド(好ましくはDNA)の使用が提供される。
[a]配列番号3、配列番号6、又は配列番号9で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド(好ましくは、配列番号3、配列番号6、又は配列番号9で表されるアミノ酸配列を含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチド、より好ましくは、配列番号3、配列番号6、又は配列番号9で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド);
[b]配列番号3、配列番号6、又は配列番号9で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含み(好ましくは、配列番号3、配列番号6、又は配列番号9で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり)、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチド;又は
[c]配列番号3、配列番号6、又は配列番号9で表されるアミノ酸配列との同一性が60%以上であるアミノ酸配列を含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチド(好ましくは、配列番号3、配列番号6、又は配列番号9で表されるアミノ酸配列との同一性が60%以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチド)
を挙げることができる。
Harbor Laboratory Press (1989)(以下、モレキュラー・クローニング第2版と略す)、Current
Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)(以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す)、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc.Natl.
Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば、配列番号3、配列番号6、又は配列番号9で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。
A群:ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2−アミノブタン酸、メチオニン、O−メチルセリン、t−ブチルグリシン、t−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン。
B群:アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2−アミノアジピン酸、2−アミノスベリン酸。
C群:アスパラギン、グルタミン。
D群:リジン、アルギニン、オルニチン、2,4−ジアミノブタン酸、2,3−ジアミノプロピオン酸。
E群:プロリン、3−ヒドロキシプロリン、4−ヒドロキシプロリン。
F群:セリン、スレオニン、ホモセリン。
G群:フェニルアラニン、チロシン。
and AltschulによるアルゴリズムBLAST[Pro. Natl. Acad. Sci. USA,
90, 5873 (1993)]やFASTA[Methods Enzymol., 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている[J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)]。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばScore=100、wordlength=12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore=50、wordlength=3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
Heart Circ Physiol. 269:H2147-2154)により急性心筋梗塞を引き起こすことができる。上記活性の確認を行うポリペプチド(以下、評価対象ポリペプチドと称する)、あるいは、前記ポリペプチドをコードする遺伝子を、ペリオスチンノックアウト動物に投与した後、上記手法により心筋梗塞を発症させ、梗塞部位(心筋壊死部分)の状態を目視により、あるいは、公知の各種指標に基づいて、観察・測定することにより、心筋壊死部位を修復する活性を有しているか否かを確認することができる。なお、評価対象ポリペプチド又はその遺伝子を投与する時期は、前記のように、心筋梗塞発症前に行うこともできるし、あるいは、心筋梗塞発症後(又は同時)に行うこともできる。
ペリオスチンバリアント(ΔbΔe)のように、完全長cDNAが公知である場合、該完全長cDNAをもとに、必要に応じて、該タンパク質をコードする部分を含む適当な長さのDNA断片を調製しても良いし、該完全長cDNAの配列情報を基に、例えばヒト胎盤あるいは肺由来のcDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、ヒトペリオスチンバリアント(ΔbΔe)をコードするcDNAを単離することができる。得られたcDNAが全長cDNAでない場合は、このクローンをプローブとしたcDNAライブラリーのスクリーニングや、RACE法[rapid amplification of cDNA ends; Frohman MA et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 85, 8998 (1988)]により全長のcDNAを取得することができる。
Chemistry, 48, 669 (1984)]、pLSA1[Agric. Biol.
Chem., 53, 277 (1989)]、pGEL1[Proc. Natl.Acad.
Sci. USA, 82, 4306 (1985)]、pBluescript II SK(-)(Stratagene社製)、pGEX(Amersham
Pharmacia Biotech社製)、pET−3(Novagen社製)、pTerm2(USP4686191、USP4939094、USP5160735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pEG400[J.
Bacteriol., 172, 2392 (1990)]等を例示することができる。
ATCC14068、Brevibacterium
saccharolyticum ATCC14066、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium glutamicum ATCC14067、Corynebacterium glutamicum ATCC13869、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354、Pseudomonas sp. D-0110等を挙げることができる。
1プロモーター、gal 10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、CUP 1プロモーター等を挙げることができる。
Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)に記載の方法等を挙げることができる。
1307 (1987)]、pAGE210等を例示することができる。
(1988)等に記載された方法によって、ポリペプチド又はタンパク質を発現することができる。
Expression Vectors, A Laboratory Manual、W.H.Freeman and
Company,New York, (1992)]、Trichoplusia niの卵巣細胞であるHigh 5(Invitrogen社製)等を用いることができる。
酵母、動物細胞又は昆虫細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加されたポリペプチド又はタンパク質を得ることができる。
(1967)]、EagleのMEM培地[Science, 122, 501 (1952)]、ダルベッコ改変MEM培地[Virology, 8, 396 (1959)]、199培地[Proceeding
of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)]又はこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
Technologies社製)、ExCell400、ExCell405(いずれもJRH Biosciences社製)、Grace's Insect Medium[Grace, T.C.C.,Nature, 195,
788 (1962)]等を用いることができる。培養は、通常pH6〜7、25〜30℃等の条件下で、1〜5日間行う。また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
Technology Instrument社製、米国Synthecell-Vega社製、米国PerSeptive社製、島津製作所社製等のペプチド合成機を利用し合成することもできる。
上記1で取得されるポリペプチド又はタンパク質の部分断片精製標品、あるいは配列番号2、配列番号3、配列番号5、配列番号6、配列番号8、配列番号9で表されるアミノ酸配列を用いて、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体等、ペリオスチンバリアント(ΔbΔe)タンパク質を認識する抗体を作製することができる。
ペリオスチンバリアント(ΔbΔe)タンパク質又は該タンパク質の部分断片ポリペプチドの精製標品、あるいは該タンパク質の一部のアミノ酸配列を有するペプチドを抗原として用い、動物に投与することによりポリクローナル抗体を作製することができる。特に完全長のペリオスチン配列と異なる領域を抗原とすることが好ましいが、ペリオスチンバリアント(ΔbΔe)タンパク質を特異的に認識できれば、共通する配列を抗原としても良い。投与する動物として、ウサギ、ヤギ、ラット、マウス、ハムスター等を用いることができる。
(1988)]、又はDEAE−セファロースカラム、陰イオン交換カラム、プロテインA又はG−カラムあるいはゲル濾過カラム等を用いるクロマトグラフィー等を、単独又は組み合わせて処理する方法があげられる。作製した抗体の特異性を上げるために、ペリオスチンバリアント(ΔbΔe)カラムでアフィニティー精製を行ったり、完全長ペリオスチンや他のペリオスチンバリアントで吸収精製を行うことが好ましい。
(a)抗体産生細胞の調製
免疫原としては、前記ポリクローナル抗体の作製で使用可能なタンパク質やペプチドが使用できる。前記免疫に用いたタンパク質又は部分断片ポリペプチドに対し、その血清が十分な抗体価を示したマウス又はラットを抗体産生細胞の供給源として供する。該抗体価を示したマウス又はラットに抗原物質を最終投与した後3〜7日目に、脾臓を摘出する。
骨髄腫細胞としては、マウス又はラットから取得した株化細胞を使用する。例えば、8−アザグアニン耐性マウス(BALB/c由来)骨髄腫細胞株P3-X63Ag8-U1(以下、P3−U1と略す)[Curr. Topics. Microbiol. Immunol., 81, 1 (1978)、Europ. J. Immunol., 6, 511 (1976)]、SP2/0-Ag14(SP-2)[Nature, 276, 269 (1978)]、P3-X63-Ag8653(653)[J. Immunol., 123, 1548 (1979)]、P3-X63-Ag8(X63)[Nature, 256, 495 (1975)]等を用いることができる。これらの細胞株は、8−アザグアニン培地[RPMI-1640培地にグルタミン(1.5 mmol/L)、2−メルカプトエタノール(5×10-5 mol/L)、ジェンタマイシン(10μg/mL)及び牛胎児血清(FCS)(CSL社製、10%)を加えた培地(以下、正常培地という)に、更に8−アザグアニン(15μg/mL)を加えた培地]で継代するが、細胞融合の3〜4日前に正常培地で培養し、融合には該細胞を2×107個以上用いる。
(a)で取得した抗体産生細胞と(b)で取得した骨髄腫細胞をMEM培地又はPBS(リン酸二ナトリウム1.83 g、リン酸一カリウム0.21 g、食塩7.65 g、蒸留水1 L、pH7.2)でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞:骨髄腫細胞=5〜10:1になるよう混合し、1,200rpmで5分間遠心分離した後、上清を捨てる。
Chapter 14 (1988)]等に述べられている酵素免疫測定法により、ペリオスチンバリアント(ΔbΔe)の全長あるいは部分断片ポリペプチドに特異的に反応するハイブリドーマを選択する。
プリスタン処理[2,6,10,14−テトラメチルペンタデカン(Pristane)0.5 mLを腹腔内投与し、2週間飼育する]した8〜10週令のマウス又はヌードマウスに、(c)で取得したモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞5〜20×106細胞/匹を腹腔内に注射する。10〜21日間でハイブリドーマは腹水癌化する。
該検出方法に用いられるDNAとしては、例えば、配列番号1、配列番号4、配列番号7で表される塩基配列からなるDNA、もしくはそれらから得られるDNA断片等が挙げられる。以下、これらを本発明に用いるDNAとも称する。該遺伝子のmRNAの発現量や構造変化を検出する方法としては、例えば(1)ノーザンブロット法、(2)in
situハイブリダイゼーション法、(3)定量的PCR法、(4)デファレンシャル・ハイブリダイゼーション法、(5)DNAチップ法、(6)RNase保護アッセイ法などの方法等があげられる。
situハイブリダイゼーション法で、偽陽性を防ぐためには、ハイブリダイゼーション並びに洗浄工程は高ストリンジェントな条件で行うことが望ましい。この条件は、温度、イオン強度、塩基組成、プローブの長さ、及びホルムアミド濃度等の多数の因子により決定される。これらの因子は、例えばカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載されている。
vitroの転写系により標識したrNTPを用いて、標識したアンチセンスRNAを合成する。該標識アンチセンスRNAを検体由来RNAと結合させて、RNA−RNAハイブリッドを形成させた後、RNaseで消化し、消化から保護されたRNA断片をゲル電気泳動によりバンドを形成させ検出する。得られたバンドを定量することで、該遺伝子のmRNAの発現量を定量することができる。
ペリオスチンバリアント(ΔbΔe)タンパク質を特異的に認識する抗体(ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体)を用いて、微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞又は組織の細胞内あるいは細胞外に発現したペリオスチンバリアント(ΔbΔe)タンパク質を免疫学的に検出及び定量する方法としては、蛍光抗体法、酵素免疫測定法(ELISA法)、放射性物質標識免疫抗体法(RIA)、免疫組織染色法や免疫細胞染色法などの免疫組織化学染色法(ABC法、CSA法等)、ウェスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、サンドイッチELISA法、免疫凝集法[単クローン抗体実験マニュアル(講談社サイエンティフィック)(1987)、続生化学実験講座5
免疫生化学研究法(東京化学同人)(1986)]などが挙げられる。
(1988)]で分画した後、該ゲルをPVDF膜あるいはニトロセルロース膜にブロッティングし、該膜に本発明で用いる抗体を反応させ、更にFITCなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素標識を施した抗マウスIgG抗体あるいはその断片を反応させた後、確認する方法である。
当該方法に用いられるDNAとしては、例えば、配列番号1、配列番号4、配列番号7で表される塩基配列を有するDNA、もしくはそれらから得られるDNA断片等があげられる。
Genetics (1996), Tom Strachan and Andrew P. Read, BIOS Scientific Publishers
Limited]、(4)ミスマッチの酵素的切断法[Nature Genetics, 9,
103-104 (1996)]、(5)変性ゲル電気泳動法[Mutat. Res., 288,
103-112 (1993)]等の方法を挙げることができる。
gradient gel electrophoresis:DGGE法)は、検体由来DNA又は検体由来cDNAをテンプレートとして、配列番号1、配列番号4、配列番号7で表される塩基配列を有するDNAの塩基配列に基づき設計したプライマーで増幅したペリオスチンバリアント(ΔbΔe)をコードするDNA断片を化学的変性剤の濃度勾配や温度勾配を有するゲルを用いて電気泳動する方法である。増幅したDNA断片はゲル内を一本鎖に変性する位置まで移動し、変性後は移動しなくなる。ペリオスチンバリアント(ΔbΔe)をコードするDNAに変異がある場合とない場合では増幅したDNAのゲル内での移動度が異なることから、変異の存在を検出することが可能である。PCRに使用するそれぞれのプライマーにポリ(G:C)端末を付けて検出感度を上げることもできる。
1-4 (1994)]がある。該試験によりタンパク質の欠損を生み出すフレームシフト突然変異、スプライス部位突然変異、ナンセンス突然変異を特異的に検出することができる。PTT法は、配列番号1、配列番号4、配列番号7で表される塩基配列を有するDNAの5’末端にT7プロモーター配列と真核生物翻訳開始配列をつないだプライマーを設計し、該プライマーを用いて検体由来RNAより逆転写PCR(RT−PCR)法でペリオスチンバリアント(ΔbΔe)をコードするcDNAを作製する。該cDNAを用い、in vitro転写、翻訳を行うとタンパク質が生産される。該タンパク質をポリアクリルアミド電気泳動して、該タンパク質の泳動位置が完全長タンパク質に相当する位置にあれば欠損を生み出す変異は存在せず、該タンパク質に欠損がある場合は、完全長タンパク質より短い位置に該タンパク質は泳動され、該位置より欠損の程度を知ることができる。
of Human Genetics Linkage. The John Hopkins University Press, Baltimore (1994)に記載された方法に従い統計処理を行うことで、心筋壊死を伴う疾患との連鎖があるSNPs(シングル・ヌクレオチド・ポリモルフィズム)として同定することができる。また、心筋壊死を伴う疾患の病歴を持つ家族から、先に示した方法に従いDNAを取得し、変異を検出することで、心筋壊死を伴う疾患の原因遺伝子を同定することができる。
上記方法に用いられるDNAとしては、例えば、配列番号1、配列番号4、配列番号7で表される塩基配列を有するDNA、もしくはそれらから得られるDNA断片等があげられる。
心筋壊死を伴う疾患の原因は、ヒトのいずれかの組織における遺伝子の変異を検出することによって確認することができる。例えば、生殖細胞系に変異がある場合、当該変異を遺伝した個人は、心筋壊死を伴う疾患を発症し易い傾向である可能性がある。当該変異は、該個人の体のいずれかの組織から抽出したDNAを試験することによって検出することができる。例えば、ヒトから採血した血液の細胞からDNAを抽出し、該DNAを用いて、遺伝子の変異を検出することにより、心筋壊死を伴う疾患のリスクを検査することができる。また、羊膜細胞を採取してDNAを抽出し、該DNAを用いて、遺伝子の変異を検出することにより、出生前の心筋壊死を伴う疾患のリスクを検査することができる。
具体的には、該遺伝子の発現量が、統計的有意差をもって健常人よりも高いときには、心筋壊死を伴う疾患を発症したとみなすことができる。また、心筋梗塞のような心筋壊死を伴う疾患のモニタリングとしては、該遺伝子の発現量が非常に高い時には心破裂などの危険な状態であり、減少している時には安定期にあること等から、適当な治療方針を決定することができる。
配列番号1、配列番号4、配列番号7で表される塩基配列を有するDNA、及び検査検体由来DNAあるいは検査検体由来cDNAを用い、上記5のペリオスチンバリアント(ΔbΔe)をコードするDNAの変異を検出する方法に準じた方法により心筋壊死を伴う疾患の検査を行うことができるが、上記5の方法により、心筋壊死を伴う疾患との因果関係が見出された変異を検査検体由来DNA又は検査検体由来cDNAが有しているか否かを検査する方法としては、(1)制限酵素部位の検出、(2)対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドプローブを利用する方法(ASO:allele specific oligonucleotide
hybridization)、(3)対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドを用いたPCR(ARMS:amplification refractory mutation system)、(4)オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ(OLA:oligonucleotide ligation assay)、(5)PCR-PHFA法(PCR-preferential homoduplex
formation assay)、(6)オリゴDNAアレイを用いる方法[タンパク質核酸酵素、43, 2004-2011 (1998)]等の方法が挙げられる。
調べようとするペリオスチンバリアント(ΔbΔe)をコードするDNAの変異部位をその3’末端に有する20塩基程度のオリゴヌクレオチド、及び該変異部位に続く20塩基程度のオリゴヌクレオチドを、配列番号1、配列番号4、配列番号7で表される塩基配列を有するDNAの塩基配列に基づき設計、合成する。このとき、例えば、前者のオリゴヌクレオチドの5’末端にはビオチンを、後者のオリゴヌクレオチドの3’末端にはジゴケシゲニンなどの異なる標識体を付加しておく。次に検査検体由来DNAあるいは検査検体由来cDNAをテンプレートとして、配列番号1、配列番号4、配列番号7で表される塩基配列を有するDNAの塩基配列に基づき設計したプライマーを用い、PCRによりペリオスチンバリアント(ΔbΔe)をコードするDNAを増幅する。次に該増幅DNA断片と上記2本のオリゴヌクレオチドとをハイブリダイズさせる。ハイブリダイズ後、DNAリガーゼで2本のオリゴヌクレオチドを連結させる。連結反応後、2本鎖DNAを熱変性させて得られるビオチン標識一本鎖DNAを、例えばアビジンに結合するDNAとして回収する。変位部位を有する増幅DNA断片とハイブリダイズした上記2種類のオリゴヌクレオチドは上記連結反応により連結しているので、その3’末端にジゴケシゲニンを有するDNAとして得られ、該結合DNAを簡単に検出することができる。よって、変位を有するペリオスチンバリアント(ΔbΔe)をコードするDNAを迅速、簡便に検出可能である。OLAは電気泳動や遠心分離操作が不要なために、多数のサンプルを効果的に短期間で検査するのに適した変異検出法である。
PCR−PHFA法は、遺伝子増幅法(PCR)、非常に高い特異性を示す液相でのハイブリダイゼーション、及びELISAと同様の操作でPCR産物を検出するED−PCR(enzymatic detection of PCR product)の3つを組み合わせた方法である。DNP(dinitrophenyl)標識及びビオチン標識したプライマーセットを用いて、配列番号1、配列番号4、配列番号7で表される塩基配列を有するDNAをテンプレートにPCRを行い、両末端標識増幅DNA断片を調製する。次に、標識プライマーと同じ塩基配列を有する未標識プライマーセットを用いて、検査検体由来DNAあるいは検査検体由来cDNAをテンプレートに増幅して得られる非標識増幅DNA断片を、該標識増幅DNA断片と混合する。このとき非標識増幅DNA断片は標識増幅DNA断片に対し、20〜100倍の大過剰量を用いる。そして該混合物を熱変性処理後、1℃/5分〜10分間程度の緩やかな温度勾配で冷却し、完全な相補鎖を優先的に形成させる。こうして再形成された標識DNAは、ビオチンを介してストレプトアビジン固定化ウエルに捕獲吸着させ、DNPを介して酵素標識抗DNP抗体を結合させて酵素による発色反応により検出する。検体中に標識DNAと同じ配列の遺伝子が存在しない場合は、元の2本鎖の標識DNAが優先的に再形成されて発色を示す。これに対し、同じ塩基配列の遺伝子が存在する場合は、相補鎖の置換がランダムに生じるため再形成される標識DNAは減少するので、発色は著しく低下する。これにより、既知の変異・多型遺伝子の検出・定量が可能となる。
ヒト生体試料での、ペリオスチンバリアント(ΔbΔe)タンパク質の発現量の変化並びに発現しているタンパク質の構造変化を同定することは、心筋壊死を伴う疾患を発症する危険性を知るためや既に発症した心臓機能低下の原因やその程度や状態を知り、その状態をモニタリングして治療に役立てる上で有用である。
具体的には、該タンパク質の発現量あるいは構造変化の程度が、統計的有意差をもって健常人よりも高いときには、心筋壊死を伴う疾患を発症したとみなすことができる。また、心筋梗塞のような心筋壊死を伴う疾患のモニタリングとしては、該タンパク質の発現量あるいは構造変化の程度が非常に高い時には心破裂などの危険な状態であり、減少している時には安定期にあること等から、適当な治療方針を決定することができる。
本発明のスクリーニング方法に用いられるタンパク質としては、ペリオスチンバリアント(ΔbΔe)を挙げることができる。ペリオスチンバリアント(ΔbΔe)としての活性を有するタンパク質であれば、天然物由来のタンパク質でも、遺伝子工学的手法により製造されたタンパク質であってもよく、例えば天然由来の該タンパク質としては、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ラット、マウスなどあらゆる哺乳動物由来のペリオスチンバリアント(ΔbΔe)を挙げることができる。
ペリオスチンバリアント(ΔbΔe)の具体的例としては、配列番号2、配列番号3、配列番号5、配列番号6、配列番号8、配列番号9で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる。
ペリオスチンバリアント(ΔbΔe)をコードするDNAの具体的例としては、配列番号1、配列番号4、配列番号7で表される塩基配列を有するDNAを挙げることができる。
ペリオスチンバリアント(ΔbΔe)タンパク質を発現するように形質転換した微生物、動物細胞、又は昆虫細胞、及び精製したペリオスチンバリアント(ΔbΔe)タンパク質は、ペリオスチンバリアント(ΔbΔe)に特異的に作用する化合物をスクリーニングするために有用である。スクリーニングにより得られた化合物は、心筋壊死治療薬として有用である。
前記(1)では、初代培養したマウスの心筋繊維芽細胞の細胞遊走能に対するペリオスチンの効果を、例えば、インビトロ細胞遊走アッセイ(in-vitro cell migration assay)で検定する。その際、ペリオスチンとしては、精製タンパク質か、あるいは、細胞に発現ベクターを移入した形質転換体(トランスフェクタント)が分泌する細胞上清を用いることができる。ペリオスチンバリアントは細胞遊走活性があるため、細胞遊走能でその活性を検定することができる。
前記(2)では、例えば、マウス胎児由来細胞(例えば、C3H10T1/2)の血清除去した細胞培養液中にペリオスチンタンパク質を加えて1時間処理し、ペリオスチンが細胞に与える効果として、FAKのリン酸化をウェスタンブロットで検出する。ペリオスチンバリアントは細胞上のインテグリンに結合し、細胞を活性化するが、その細胞応答はFAKのリン酸化の度合いで検定できる。
前記(3)では、例えば、マウス胎児由来細胞(例えば、C3H10T1/2)、マウス骨芽細胞様細胞(例えば、MC3T3-E1)、マウス歯根膜細胞株(例えば、A9)にペリオスチン遺伝子を導入し、その形質転換体によるコラーゲンの産生を市販キット(例えば、Sircol Collagen Assay Kit;フナコシ)で測定する。また、同じ3種類の細胞を用いて、ペリオスチンとして精製タンパク質か、細胞に発現ベクターを移入した形質転換体が分泌する細胞上清でこれらの細胞を処理し、コラーゲンの架橋量を検定することができる。
心臓由来の初代培養細胞又は分化誘導させた心筋細胞で、ペリオスチンバリアント(ΔbΔe)遺伝子のmRNAあるいはペリオスチンバリアント(ΔbΔe)タンパク質の発現を促進する活性を有する化合物も、心筋壊死治療薬として有用である。
ペリオスチンバリアント(ΔbΔe)タンパク質又はそれらの改変体は、心筋壊死を伴う種々の疾患において、壊死部位の修復をすることや、その修復を促進して心機能の低下を抑制することに用いることができる。心筋壊死を伴う疾患としては、心筋梗塞や心筋炎(例えばウイルス性心筋炎)や心筋症(例えば拡張型心筋症)など、公知の疾患を挙げることができる。
上記8のスクリーニング方法により得られた化合物を有効成分として含有する心筋壊死の治療及び/又は予防のための医薬は、該有効成分を単独で投与することも可能ではあるが、通常は該有効成分を薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。好ましい医薬製剤形態等は、及び投与方法等は、上記9のとおりである。
ペリオスチンバリアント(ΔbΔe)タンパク質をコードするDNAを心筋壊死の遺伝子治療薬とてして用いる方法としては、該DNAを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、上記9に記載した常法に従って製剤化、処方及び投与する方法、あるいは非ウイルス遺伝子移入法により投与する方法を挙げることができる。
パッケージング細胞への組換えウイルスベクターの導入法としては、例えば、リン酸カルシウム法[特開平2-227075号公報]、リポフェクション法[Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 84, 7413 (1987)]等を挙げることができる。
すなわち、適当なサイズのペリオスチンバリアント(ΔbΔe)をコードするDNAを、アデノウイルス・ヘキソンタンパク質に特異的なポリリジン−コンジュゲート抗体と組み合わせてコンプレックスを作製し、得られたコンプレックスをアデノウイルスベクターに結合させることにより、ウイルスベクターを調製することができる。該ウイルスベクターは安定に標的細胞に到達し、エンドソームにより細胞内に取り込まれ、細胞内で分解され効率的に遺伝子を発現させることができる。
当該分野で公知の非ウイルス遺伝子移入法には、リン酸カルシウム共沈法[Virology, 52, 456-467 (1973);Science,
209, 1414-1422 (1980)]、マイクロインジェクション法[Proc. Natl.
Acad. Sci. USA,77,
5399-5403 (1980);Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77, 7380-7384 (1980);Cell, 27, 223-231 (1981);Nature, 294,
92-94 (1981)]、リポソームを介した膜融合−介在移入法[Proc. Natl.Acad. Sci.
USA,84, 7413-7417 (1987);Biochemistry, 28, 9508-9514 (1989);J.
Biol. Chem., 264, 12126-12129 (1989);Hum. Gene Ther.,
3, 267-275, (1992);Science, 249,
1285-1288 (1990);Circulation, 83, 2007-2011
(1992)]あるいは直接DNA取り込み及び受容体−媒介DNA移入法[Science, 247,1465-1468
(1990);J. Biol. Chem., 266, 14338-14342 (1991);Proc. Natl. Acad. Sci. USA,87, 3655-3659 (1991);J. Biol. Chem., 264,
16985-16987 (1989);BioTechniques, 11, 474-485
(1991);Proc. Natl. Acad. Sci. USA,87, 3410-3414 (1990);Proc. Natl. Acad. Sci. USA,88, 4255-4259 (1991);Proc. Natl. Acad. Sci.
USA,87, 4033-4037 (1990);Proc. Natl. Acad. Sci. USA,88, 8850-8854 (1991);Hum. Gene Ther., 3,
147-154 (1991)]等を挙げることができる。
急性心筋梗塞後の梗塞部位におけるペリオスチンバリアントの発現を検討するために、C57BL/6マウスに急性心筋梗塞を起こさせた後(0、1、2、3、4、5、6、7、14、28日後)のこの梗塞部位におけるmRNAを精製し、RT−PCRを行った。PCR産物は電気泳動により分析した。急性心筋梗塞は、実施例2の(3)に記載する方法に従って、左室下行冠動脈の結さつにより引き起こした。
ペリオスチンバリアント(Δb):領域bの位置にスプライシングがあるもの
ペリオスチンバリアント(Δe):領域eの位置にスプライシングがあるもの
ペリオスチンバリアント(ΔbΔe):領域b及び領域eの位置にスプライシングがあるもの
完全長ペリオスチン:スプライシングがないもの
が判別できるように、下記プライマーを設計した。なお、配列番号12[マウス・全長ペリオスチンのcDNA配列(シグナル含む)]において、塩基番号1900〜1968が領域a1、1969〜2013が領域a2、2014〜2094が領域b、2095〜2184が領域c1、2185〜2274が領域c2、2275〜2352が領域d、2353〜2436が領域e、2437〜2478が領域f1、2479〜2514が領域f2である。
P1F 5’−gataaaatacatccaaatcaagtttgttcg−3’
配列番号17:
P1R 5’−cgtggatcacttctggtcaccgtttcgc−3’
配列番号18:
P2F 5’−ctgaaaaacagactcgggaagaacg−3’
配列番号19:
P2R 5’−aaactctgtggtctggcctctggg−3’
配列番号20:
P3F 5’−gataaaatacatccaaatcaagtttgttcg−3’
配列番号21:
P3R 5’−aaactctgtggtctggcctctggg−3’
配列番号22:
gapdhF 5’−actttgtcaagctcatttcc−3’
配列番号23:
gapdhR 5’−tgcagcgaactttarrgctg−3’
領域eのスプライシングの有無は、上記プライマーP2F及びプライマーP2Rの組合せ(プライマーセット2)を使用して判別することができる。325bpに検出されるバンドは、eの位置にスプライシングが起こってないものであり、241bpに検出されるバンドは、eの位置にスプライシングが起こっているものである。
領域b及び領域eの同時スプライシングの有無は、上記プライマーP3F及びプライマーP3Rの組合せ(プライマーセット3)を使用して判別することができる。685bpに検出されるバンドは、b及びeのいずれの位置にもスプライシングが起こってないものであり、493bpに検出されるバンドは、b及びeの位置に同時にスプライシングが起こっているものである。なお、493bpと685bpの間に薄く検出されているバンドは、b又はeの位置にスプライシングが起こっているものである。
コントロールとして、GAPDHの発現を、プライマーgapdhF及びプライマーgapdhRの組合せを使用して確認した。
このことから、急性心筋梗塞から回復される過程で、各スプライスバリアントの機能の違いがあり、特に、傷害の回復初期には、ペリオスチンバリアント(ΔbΔe)が重要な役割を果たしていることが予想された。
本実施例では、Kitajima et
al, 2000 development. 127:3215-3226に記載された方法に従って、ペリオスチンノックアウトマウスを、Cre組み換えによって作製した。具体的な手順を以下に示す。
ペリオスチン遺伝子のエクソン1を含むBACクローンは、定法に従って、マウスC57BL6/J BACライブラリーから単離した。ターゲティングの工程を図2に示す。まず、7.3kb(XhoI-EcoRI)断片及び1.2kb(XbaI-BglII)断片の二つの相同遺伝子断片を、PGK-Neo-PGK-DT-Aカセットにサブクローニングした。直鎖化されたベクター(50μg)を、Yagi et al., 1993 Anal Biochem.
214:70-76に記載の方法に従って、TT2 ES細胞にエレクトロポレーションした。この中から、G418耐性ESクローンを2クローン選択し(#51及び#1051)、neo特異的プライマーPGK−R及びペリオスチンゲノミックプライマーPeri−R4を使用して、PCRにより相同組み換えが起こっていることを確認した。更に、これらのクローンについて、定法に従ってサザンブロット法によっても確認した。
これらの検討により、ペリオスチンノックアウトマウス作製用のターゲティングベクターが作製できていることがわかった。
配列番号24:
PGK−R 5’−CTAAAGCGCATGCTCCAGACT−3’
配列番号25:
Peri−R4 5’−GCACCTGCCTCTTCCCAATTACAGG−3’
次に、Kitajima et al,
2000 Development. 127:3215-3226に記載の方法に従って、凝集方法によって、キメラマウスを作製した。キメラのジャームラインは、上記で作製したES細胞クローン(#51あるいは#1051)を使用して作製した。TT2遺伝子バックグラウンド(アグーチコート色素によってモニターされる)の高い寄与によって、ICRマウスに育種された。#51キメラマウスは、neoカセットを除くために、Sakai and Miyazaki, 1997 Biochem. Biophys. Res. Commun. 237:318-324に記載のCAG−Creマウスと交配させ、それらの樹立マウスは、C57BL/6マウスに育種された。その結果、ペリオスチン遺伝子を欠如した対立遺伝子を持つマウスは、少なくとも6世代の間に、C57BL6/Jマウスに戻し交配された。
この検討により、ノックアウトマウスが作製できていることを確認した。
配列番号26:
Wild−F 5’−gttcttacagaaagcagaaggatac−3’
配列番号27:
Wild−R 5’−ttaaatcactccacagcagaacacg−3’
配列番号28:
Nock−F 5’−catgatagcttctctcccagttctc−3’
配列番号29:
Nock−R 5’−cttgcaataagtaaaacagctcccc−3’
上記のようにして作製したペリオスチンノックアウトマウスの性状を検討した。ペリオスチンノックアウトマウスの胚形成は、見かけ上正常であった。生まれた後も、切歯の萌出(eruption)以外は、繁殖性を含めて健康に見えた。更に、これらのマウスは、2,3週間以上生存した。また、成長した心臓において検討したが、8週令あるいは10週令のマウスでも、心筋・心室運動・弁機能・脈動・血圧における心筋細胞の異常はなく、大人の心筋においても重要な症状は認められなかった。
Physiol Heart Circ Physiol. 269:H2147-2154に記載の方法に従って行ったが、具体的手順を以下に示す。麻酔下において、8週令マウスに挿管し、げっ歯類用の人工呼吸器(SAR-830AP, CWE社製)に固定した。中程度の胸開術を行い、左室下行冠動脈を選び、7−0ナイロン縫合糸で動脈の周りを回り縛った。梗塞は、左室(LV)の変色から明らかであった。最後に、胸穴を閉じた。生理的な測定、組織学的、生物学的分析は、生き残っているマウスでのみ検討した。少なくとも5匹のマウスから心中央部(mid-part)セクションを使用して、上記文献(Michael et al, 1995)に記載の方法によって、梗塞の大きさ決定したり、危険性のある領域を調べた。
表1における各測定項目に関して、BWは体重(g)を意味し、以下、同様に、HRは心拍数(拍/分)を、LVEDDは左室拡張末期径(mm)を、LVESDは左室収縮末期径(mm)を、AWは前壁厚(mm)を、PWは後壁厚(mm)を、FSは左室径短縮率(%)を、ISは梗塞の大きさ(%)を、それぞれ、意味する。また、表1に示す記号「a」は、急性心筋梗塞を引き起こしたペリオスチン+/+マウスに対してP<0.05であることを示す。
(1)ペリオスチンバリアント(ΔbΔe)発現用アデノウイルスの作製
市販の発現用キット(Adeno-X
expression system2; BD Bioscience社製)を使用して、ペリオスチンバリアント(ΔbΔe)発現用アデノウイルスベクターとしてAd−ΔbΔeベクターを、全長ペリオスチン発現用ウイルスベクターとしてAd−Fullベクターを、コントロール用としてAd−nlsLacZベクターを、それぞれ、作製した。ペリオスチンバリアント(ΔbΔe)タンパク質をコードするcDNAとしては、配列番号4で表される塩基配列からなるcDNAを使用し、全長ペリオスチンをコードするcDNAとしては、配列番号12で表される塩基配列からなるcDNAを使用した。
ウイルスの精製は、Ugai, 2005
BBRC. 331:1053-1060の記載の方法に従って、塩化セシウム法により行った。
急性心筋梗塞(LAD ligation法による)を起こさせる1日前に、上記で作製した各ウイルス(Ad−ΔbΔeウイルス、Ad−Fullウイルス、又はAd−nlsLacZウイルス)を含む溶液(1.6×1010 pfu, 100μL)をペリオスチンノックアウトマウスに尾静脈注射にて投与した。
全長ペリオスチンでは、心破裂の度合いも梗塞の修復も改善されなかったが、ペリオスチンバリアント(ΔbΔe)では、いずれも有意に改善された。このことから、急性心筋梗塞からの回復において、特にペリオスチンバリアント(ΔbΔe)が重要な役割を果たしていることが明らかとなった。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
Claims (42)
- ペリオスチンバリアント(ΔbΔe)ポリペプチドを有効成分として含有する、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬。
- [a]配列番号3、配列番号6、又は配列番号9で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
[b]配列番号3、配列番号6、又は配列番号9で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチド;又は
[c]配列番号3、配列番号6、又は配列番号9で表されるアミノ酸配列との同一性が60%以上であるアミノ酸配列を含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチド
を有効成分として含有する、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬。 - 前記医薬が心臓機能改善作用を有する、請求項1又は2に記載の医薬。
- 前記医薬が心臓再生促進作用を有する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の医薬。
- 治療に有効量のペリオスチンバリアント(ΔbΔe)ポリペプチドを治療対象に投与することを含む、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防方法。
- [a]配列番号3、配列番号6、又は配列番号9で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
[b]配列番号3、配列番号6、又は配列番号9で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチド;又は
[c]配列番号3、配列番号6、又は配列番号9で表されるアミノ酸配列との同一性が60%以上であるアミノ酸配列を含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチド
からなる群から選んだ、治療に有効量のポリペプチドを治療対象に投与することを含む、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防方法。 - 前記方法が心臓機能改善作用を有する、請求項5又は6に記載の方法。
- 前記方法が心臓再生促進作用を有する、請求項5〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 心筋壊死を伴う疾患の治療のための医薬の製造における、ペリオスチンバリアント(ΔbΔe)ポリペプチドの使用。
- 心筋壊死を伴う疾患の治療のための医薬の製造における、
[a]配列番号3、配列番号6、又は配列番号9で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
[b]配列番号3、配列番号6、又は配列番号9で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチド;又は
[c]配列番号3、配列番号6、又は配列番号9で表されるアミノ酸配列との同一性が60%以上であるアミノ酸配列を含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチド
の使用。 - 前記医薬が心臓機能改善作用を有する、請求項9又は10に記載の使用。
- 前記医薬が心臓再生促進作用を有する、請求項9〜11のいずれか一項に記載の使用。
- ペリオスチンバリアント(ΔbΔe)をコードするポリヌクレオチドを含有する、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬。
- [a]配列番号3、配列番号6、又は配列番号9で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
[b]配列番号3、配列番号6、又は配列番号9で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
[c]配列番号3、配列番号6、又は配列番号9で表されるアミノ酸配列との同一性が60%以上であるアミノ酸配列を含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;又は
[d]配列番号1、配列番号4、又は配列番号7で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
を含有する、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬。 - 前記医薬が、心臓機能改善作用を有する、請求項13又は14に記載の医薬。
- 前記医薬が、心臓再生促進作用を有する、請求項13〜15のいずれか一項に記載の医薬。
- 治療に有効量のペリオスチンバリアント(ΔbΔe)をコードするポリヌクレオチドを、治療対象に投与することを含む、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防方法。
- [a]配列番号3、配列番号6、又は配列番号9で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
[b]配列番号3、配列番号6、又は配列番号9で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
[c]配列番号3、配列番号6、又は配列番号9で表されるアミノ酸配列との同一性が60%以上であるアミノ酸配列を含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;又は
[d]配列番号1、配列番号4、又は配列番号7で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
からなる群から選んだ、治療に有効量のポリヌクレオチドを治療対象に投与することを含む、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防方法。 - 前記方法が、心臓機能改善作用を有する、請求項17又は18に記載の方法。
- 前記方法が、心臓再生促進作用を有する、請求項17〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 心筋壊死を伴う疾患の治療のための医薬の製造における、ペリオスチンバリアント(ΔbΔe)をコードするポリヌクレオチドの使用。
- 心筋壊死を伴う疾患の治療のための医薬の製造における、
[a]配列番号3、配列番号6、又は配列番号9で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
[b]配列番号3、配列番号6、又は配列番号9で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
[c]配列番号3、配列番号6、又は配列番号9で表されるアミノ酸配列との同一性が60%以上であるアミノ酸配列を含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;又は
[d]配列番号1、配列番号4、又は配列番号7で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
の使用。 - 前記医薬が、心臓機能改善作用を有する、請求項21又は22に記載の使用。
- 前記医薬が、心臓再生促進作用を有する、請求項21〜23のいずれか一項に記載の使用。
- [a]ペリオスチンバリアント(ΔbΔe)ポリペプチドをコードするDNA、若しくはその部分断片であるDNA;
[b]配列番号1、配列番号4、又は配列番号7で表される塩基配列からなるDNA、若しくはその部分断片であるDNA;又は
[c]配列番号1、配列番号4、又は配列番号7で表される塩基配列における連続した5〜60塩基からなる配列を有するオリゴヌクレオチド若しくはその誘導体、前記オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド若しくはその誘導体
を含有する、心筋壊死を伴う疾患の検査薬。 - ペリオスチンバリアント(ΔbΔe)ポリペプチドを特異的に認識する抗体を含有する、心筋壊死を伴う疾患の検査薬。
- (1)検査対象より取得した生体試料から検査検体由来DNA又はcDNAを調製する工程、
(2)[a]ペリオスチンバリアント(ΔbΔe)ポリペプチドをコードするDNA、若しくはその部分断片であるDNA;
[b]配列番号1、配列番号4、又は配列番号7で表される塩基配列からなるDNA、若しくはその部分断片であるDNA;又は
[c]配列番号1、配列番号4、又は配列番号7で表される塩基配列における連続した5〜60塩基からなる配列を有するオリゴヌクレオチド若しくはその誘導体、前記オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド若しくはその誘導体
を用いて、前記検査検体由来DNA又はcDNAにおける、ペリオスチンバリアント(ΔbΔe)ポリペプチドをコードするDNAの変異を検出する工程、及び
(3)前記変異に基づいて、心筋壊死を伴う疾患のリスク、種類、程度、及び/又は状態を判定する工程
を含む、心筋壊死を伴う疾患の検査方法。 - (1)検査対象より取得した生体試料から検査検体由来DNA又はcDNAを調製する工程、
(2)[a]ペリオスチンバリアント(ΔbΔe)ポリペプチドをコードするDNA、若しくはその部分断片であるDNA;
[b]配列番号1、配列番号4、又は配列番号7で表される塩基配列からなるDNA、若しくはその部分断片であるDNA;又は
[c]配列番号1、配列番号4、又は配列番号7で表される塩基配列における連続した5〜60塩基からなる配列を有するオリゴヌクレオチド若しくはその誘導体、前記オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド若しくはその誘導体
を用いて、前記検査検体由来DNA又はcDNAにおける、ペリオスチンバリアント(ΔbΔe)ポリペプチドをコードするDNAを特異的に増幅し、その発現量を分析する工程、及び
(3)前記発現量に基づいて、心筋壊死を伴う疾患の程度及び/又は状態を判定する工程
を含む、心筋壊死を伴う疾患の検査方法。 - (1)検査対象より取得した生体試料から検体を調製する工程、
(2)ペリオスチンバリアント(ΔbΔe)ポリペプチドを特異的に認識する抗体を用いて、前記検体中のペリオスチンバリアント(ΔbΔe)ポリペプチドの発現量及び/又は構造変化を検出する工程、及び
(3)前記発現量及び/又は構造変化に基づいて、心筋壊死を伴う疾患の危険性、原因、程度、及び/又は状態を判定する工程
を含む、心筋壊死を伴う疾患の検査方法。 - (i)請求項1又は2に記載のポリペプチドを発現する細胞における前記ポリペプチドの発現量と、(ii)前記ポリペプチドを発現する細胞と試験物質を接触させた場合の前記ポリペプチドの発現量とを比較し、前記ポリペプチドの発現量を増大させる物質を選択することを特徴とする、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬のスクリーニング方法。
- (i)請求項1又は2に記載のポリペプチドを発現する細胞の機能と、(ii)前記ポリペプチドを発現する細胞と試験物質を接触させた場合の細胞の機能とを比較し、細胞の機能を制御する活性を有する物質を選択することを特徴とする、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬のスクリーニング方法。
- 前記細胞が、ペリオスチンをコードする遺伝子を欠如している細胞である、請求項30又は31に記載のスクリーニング方法。
- 心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬が、心臓機能改善作用を有する物質である、請求項30〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬が、心臓再生促進作用を有する物質である、請求項30〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項30〜34のいずれか一項に記載の方法によって得られる化合物、又はその薬理学的に許容される塩。
- 請求項35に記載の化合物、又はその薬理学的に許容される塩を含有する、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬。
- 心臓機能改善作用を有する医薬である、請求項36に記載の心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬。
- 修復心臓再生促進作用を有する医薬である、請求項36に記載の心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬。
- 治療に有効量の請求項35に記載の化合物、又はその薬理学的に許容される塩を治療対象に投与することを含む、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防方法。
- 心筋壊死を伴う疾患の治療のための医薬の製造における、請求項35に記載の化合物、又はその薬理学的に許容される塩の使用。
- ペリオスチンバリアント(ΔbΔe)タンパク質を特異的に認識する抗体。
- 請求項41に記載の抗体を用いることを特徴とする、ペリオスチンバリアント(ΔbΔe)タンパク質の免疫学的検出又は定量方法。
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Date | Code | Title | Description |
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