JPWO2009072657A1 - ナノ機能性シリカ粒子およびその製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
MRIなど多種の装置において共通に用いることができる、多モードの(Multimodal)機能を持つ多機能性プローブの開発が所望され進められている(非特許文献1及び2)。また、多モードのイメージングプローブに治療効果を付加し、診断から治療まで一貫して活用できる多機能粒子の開発が所望されている。こうした多機能性粒子は医療に革新をもたらし、患者の負担が軽減し、高い治療効果を得ることができると考えられる。
しかしながら、現存の造影剤はマクロ観察が可能であっても顕微鏡を用いたミクロ観察は行うことができない。また、顕微鏡観察に用いる蛍光標識した抗体をCTやMRIにて観察することができない。多モードのイメージング効果を持ち、さらに治療効果を合わせ持つ粒子も世界各地で開発競争が進められているが、技術的に難点があり完成には至っていない。
さらに、近年開発された有機シリカ粒子の優れた表面ならびに内部機能化能と他の機能性物質との機能的融合の実現により、in vivo とin vitroまたミクロとマクロ、さらにCTやPET、MRIなど多種の装置において共通に用いることができる多モードの機能を持つ多機能性プローブ並びに治療用プローブを提供することを目的とする。
本発明のナノ機能性シリカ粒子は、
(A1)メルカプトプロピルトリメトキシシラン(MPS)、メルカプトプロピルトリエトキシシラン(MPES)、メルカプトプロピルメチルジメトキシシラン(MPDMS)、トリメトキシ[2−(7−オキサビシクロ[4.1.0]−ヘプトー3−イル)エチル]シラン(EpoPS)、チオシシアナトプロピルトリエトキシシラン(TCPS)、アクリルオキシプロピルトリメトキシシラン(ACPS)およびアミノプロピルトリメトキシシラン(APS)からなる群より選択される1種以上の有機シリカ化合物から得られるシリカを主成分とするシェルと、
(A2)該シェル内部に磁性体、金コロイド、量子ドット、ガドリニウム含有粒子、イメージング機能性物質含有液の1種または複数種を含む直径2〜200nmのコアと、
を有している。
(A1)メルカプトプロピルトリメトキシシラン(MPS)、メルカプトプロピルトリエトキシシラン(MPES)、メルカプトプロピルメチルジメトキシシラン(MPDMS)、トリメトキシ[2−(7−オキサビシクロ[4.1.0]−ヘプトー3−イル)エチル]シラン(EpoPS)、チオシシアナトプロピルトリエトキシシラン(TCPS)、アクリルオキシプロピルトリメトキシシラン(ACPS)およびアミノプロピルトリメトキシシラン(APS)からなる群より選択される1種以上の有機シリカ化合物と、
(A2)アミノプロピルトリエトキシシラン(APES)と、
から得られるシリカを主成分とするシェルと、
(A3)該シェル内部に磁性体、金コロイド、量子ドット、ガドリニウム含有粒子、イメージング機能性物質含有液の1種または複数種を含む直径2〜200nmのコアと、
を有しても良い。
Fluor 647、DY
635、DY 485、DY495、DY
505およびトリスジクロロツテニウム(II)ヘキサハイドレートからなる群より選択され、かつ、該蛍光性物質が単独、またはN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、イソチオシアネート(ITC)およびマレイミドから選択される化合物との結合状態で保有することが好ましい。
(A1)(a)有機シリカ化合物、機能性物質、およびアンモニア水溶液の混合液を調製する工程;または有機シリカ化合物、機能性物質、機能性化合物およびアンモニア水溶液の混合液を調製する工程;および
(b)所定の温度条件下で該有機シリカ化合物と該アンモニア水溶液を反応させる工程;
を包含し、
(A2)ここで、前記有機シリカ化合物は、メルカプトプロピルトリメトキシシラン(MPS)、メルカプトプロピルトリエトキシシラン(MPES)、メルカプトプロピルメチルジメトキシシラン(MPDMS)、トリメトキシ[2−(7−オキサビシクロ[4.1.0]−ヘプト−3−イル)エチル]シラン(EpoPS)、チオシシアナトプロピルトリエトキシシラン(TcPS)およびアクリルオキシプロピルトリメトキシシラン(ACPS)およびアミノプロピルトリメトキシシラン(APS)からなる群より選択される1種以上であり、
(A3)前記機能性物質が、磁性体、金コロイド、量子ドット、ガドリニウム含有粒子、イメージング機能性物質含有液からなる群より選択される1種または複数種であり、
(A4)そして、工程(a)および(b)における、アンモニア水溶液および温度条件が、
(i)高温(80〜100℃での温度範囲);及び
(ii)高アンモニア濃度(最終濃度25%以上)
の条件を満たすように調整される。
(A1)(a)有機シリカ化合物、機能性物質、およびアンモニア水溶液の混合液を調製する工程;または有機シリカ化合物、機能性物質、機能性化合物およびアンモニア水溶液の混合液を調製する工程;および
(b)所定の温度条件下で該有機シリカ化合物と該アンモニア水溶液を反応させる工程;
を包含し、
(A2)ここで、前記有機シリカ化合物は、メルカプトプロピルトリメトキシシラン(MPS)、メルカプトプロピルトリエトキシシラン(MPES)、メルカプトプロピルメチルジメトキシシラン(MPDMS)、トリメトキシ[2−(7−オキサビシクロ[4.1.0]−ヘプトー3−イル)エチル]シラン(EpoPS)、チオシシアナトプロピルトリエトキシシラン(TcPS)およびアクリルオキシプロピルトリメトキシシラン(ACPS)およびアミノプロピルトリメトキシシラン(APS)からなる群より選択される1種以上と、アミノプロピルトリエトキシシラン(APES)とであり、
(A3)前記機能性物質が、磁性体、金コロイド、量子ドット、ガドリニウム含有粒子、イメージング機能性物質含有液からなる群より選択される1種または複数種であり、
(A4)そして、工程(a)および(b)における、アンモニア水溶液および温度条件が、
(i)高温(80〜100℃での温度範囲);及び
(ii)高アンモニア濃度(最終濃度25%以上)
の条件を満たすように調整されることもできる。
更に、本発明に係るナノ機能性シリカ粒子と製造方法には、効果に関し、従来にない次の特長ないしは特徴を有する。
(a)ナノ機能性シリカ粒子の特長は次の通りである:
(1)機能性物質がナノ機能性シリカ粒子の内部あるいは内層ないしはコア領域に局在し、有機シリカ化合物の上層あるいは外層ないしはシェル領域と形態学的に区別しうる。換言すれば、該シリカ粒子の構造は、シェル領域とコア領域の2つに概別できる;
(2)ナノ機能性シリカ粒子が、含有する機能性物質の有する機能を保持している:
(3)ナノ機能性シリカ粒子の表面および/またはシェル内および/またはコア内に蛍光色素、薬剤等の機能性化合物を保有することができる。
(4)有機シリカ化合物の表層あるいは表面のアクセプター基により、タンパク質や核酸等の吸着能が高い;
(5)抗原、抗体、酵素等の変性(活性や機能の失活)を生じることなく、これ等の機能を保持した状態で効率良く、これ等を表面に結合させることができる;
(6)表層上で抗原抗体反応が可能である;
(7)粒子の表面上で高感度に物質を検出することができる;
(8)共役試薬によるタンパク質、核酸、色素等の化学物質の表層への結合が可能である;
(9)粒子の作製や表層修飾に起因する凝集が少ない;及び
(10)粒径とその形態は、シリカ層の調節により、機能性物質を核(コア)として、ナノサイズからミクロンサイズまでの調整・調節が可能である。
(11)シリカ層に化学共役物質を結合させるとタンパク質等の吸着効率が飛躍的に向上する。
(12)本粒子に励起光を照射することを条件に周囲の細胞の増殖活性が低下する。従って、本粒子は、イメージング機能を有していることのみならず、励起光照射を条件に細胞障害機能をも有している。
(1)製造に要する日数が、極めて短時間(1〜12時間)である;及び
(2)製造に要する試薬の種類が少なく(サーファクタントや塩酸等を使用しない)、製造プロセスが1段階ないしは1工程の反応で量産可能である;製造に要する容器、チューブ、フラスコ、タンク等は、生産規模に応じ1個である。
N-(4-Aminophenyl)maleimide,1,2-Bis(maleimido)ethane,
N,N'-1,4-Phenylenedimaleimide, N-(4-Nitrophenyl)maleimide,
N-Bromomethyl-2,3-dichloromaleimide, N-[4-(2-Benzimidazolyl)phenyl]maleimide,
N-Succinimidyl 4-Maleimidobutyrate, N-Cyclohexylmaleimide, 4-Maleimidobutyric
acid sulfo-N-succinimidyl ester, 1,2-Bis(maleimido)ethane, TFA/N+Maleimide が含まれ、これを用いると粒子表面の官能基との結合が可能となる。
などまたはそれらを含むものなどである。
(a)MPSとアンモニアとを用いる多機能性MPS粒子の作製:
機能性物質に、MPSと28重量%アンモニア水溶液とを混合した後、温度80〜100℃で、好ましくは95±5℃にて、1〜12時間、好ましくは7±5時間、攪拌・保温し、反応させ、多機能性MPS粒子を生成させる。生成した多機能性MPS粒子は、高速遠心によるペレットのかたちで採取し、これを70%エタノール水溶液と蒸留水とで交互に計4〜8回、遠心により洗浄する。採取したペレット(多機能性MPS粒子)は高速ホモジナイザーや超音波処理等により分散させた後、使用に供する。多機能性MPS粒子の粒径はナノサイズからミクロンサイズまで、生成に用いるMPS濃度の変量により、調整・調節できる。例えば、28重量%アンモニア水溶液(一定量)に対するMPSの添加量を、所望の粒径が得られるよう調節し、適宜、変量できる。
チオール基と反応する物質、例えば、マレイミド化合物と、標識分子、例えば、ローダミンとの結合物と、MPSのチオール基とを反応させることによりMPS一標識分子共役体を事前に調製する。次いで、該共役体、金コロイド、MPS及びアンモニア水溶液を混合の後、又は該共役体、MPS、アンモニア水溶液を混合の後、上記(a)と同様にして、攪拌・保温することにより、標識分子含有MPS層状被覆金コロイドを生成させる。尚、標識分子は一種以上を含有させることができる。また、MPSに限らず、他種のシリカ化合物を用い、他種のシリカ化合物一標識分子共役体を調製することも可能である。粒径は上述の通りMPS濃度により調節できる。生成したMPS層状被覆金コロイドは、採取、洗浄、及び分散の後、使用に保する。具体例は後述する実施例4に記載されている。
磁性体又は量子ドットに、MPSと28重量%アンモニア水溶液、標識分子、例えば、ローダミンとの結合物とを混合した後、上記(a)と同様にして、攪拌・保温することにより、標識分子を含有させた、磁性体又は量子ドット含有多機能性MPS粒子を生成させる。具体例は後述する実施例13及び実施例19に記載されている。
(1)MPS層状被覆磁性体
(a)イメージング技術の向上
MRIによるマクロ評価と組織学的評価が可能なボーダーレスプローブとしての用途が期待される。蛍光MRIプローブの最大のメリットとして、マクロミクロ観察が1つのプローブで行えることが挙げられ、様々な波及効果をもたらすと考えられる。
(b)分子標的薬の開発
新規抗体をプローブ表面に標識し生体に投与しMRIで観察することにより、標的臓器へのターゲッティングの確認のみならず予期せぬ臓器や組織へのターゲッティングを検出し、副作用の予測や回避を行うことが可能となる。また、細胞レベルでターゲッティングを確認できることから、標的組織へのターゲッティングをより正確に評価可能となる。また様々なリガンド等を結合させた粒子を投与し、ハイスループットなターゲッティングのスクリーニングが可能となり、分子標的薬の開発をより加速するものと考えられる。
(c)ドラッグデリバリーの担体
例えば、ナノ機能性シリカ粒子による悪性腫瘍に対する治療のメリットとしては、1)100nm前後の粒子サイズが腫瘍部位に集積しやすいとする腫瘍組織選択効果(Effect of permeability and retention)、2)ナノ粒子表面の抗体などの腫瘍特異的結合する分子による機能化による腫瘍細胞選択効果、3)磁気、蛍光などのシグナル機能によるターゲット評価効果、4)粒子内部もしくは表面に薬剤を含有させ、光線や磁場誘導温熱による薬剤の活性化や放出による物理力学的選択効果、が考えられ、これら4つの効果により、革新的な医療が開発できると考える。
(2)MPS層状被覆金コロイド
局所プラズモン共鳴プローブとしての用途が期待される。本発明により金コロイド表面の表層修飾能は飛躍的に向上し、局所プラズモン共鳴を用いた新たなアッセイデザインが構築されるものと期待される。
(3)MPS層状被覆量子ドット
高速動画撮影用量子ドット、低毒素・無毒素量子ドット、サイズ制御量子ドット、二蛍光量子ドット等の開発が期待される。有機シリカ被覆層内に蛍光色素を含有させることにより、近年、汎用されつつある量子ドットの蛍光点滅を改良した粒子として生物現象のより詳細な観察となる。また毒性低下によりユーザーへの安心をもたらすと共に生体内への投与を可能とし、蛍光イメージング技術に大きく寄与すると考えられる。
(20
nm以下のMPS層状被覆100 nm金コロイド)
100 nm金コロイド(田中貴金属製) 90μlに、500倍に希釈したMPS100μl及び28重量%アンモニア水溶液810μlをそれぞれ添加混合し、100℃で3時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機(10,000×g、5分間)にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、70容量%エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に3回、合計6回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし電子顕微鏡で観察した。その結果、20 nm以下のMPS層状被覆が確認された。なお、シェルの厚みの制御率は約15%であった。
(10
nm以下のMPS層状被覆100 nm金コロイド)
100 nm金コロイド(田中貴金属製) 85μlに、500倍に希釈したMPS50μl及び28重量%アンモニア水溶液865μlをそれぞれ添加混合し、100℃で3時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機(10,000×g、5分間)にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、70容量%エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に3回、合計6回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし電子顕微鏡で観察した。その結果、10 nm以下のMPS層状被覆が確認された。なお、シェルの厚みの制御率は約30%であった。
(30
nm以下のMPS層状被覆250 nm金コロイド)
250 nm金コロイド(BBinternational製) 500μlに、500倍に希釈したMPS100μl及び28重量%アンモニア水溶液450μlをそれぞれ添加混合し、100℃で3時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機(10,000×g、5分間)にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、70容量%エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に3回、合計6回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし電子顕微鏡で観察した。その結果、30 nm以下のMPS層状被覆が確認された。なお、シェルの厚みの制御率は約16であった。
(20
nm以下かつ蛍光色素(ローダミン)を含有するMPS層状被覆40 nm金コロイド)
マレイミド化合物として、Rhodamine RedTM C2 maleimide(約5mg)を73.5μlのDMSO溶液に溶解した後、チオール基を有する(3−メルカプトプロピル)−トリメトキシシラン((3−Mercaptopropyl)−trimethoxysilan)を、上記Rhodamine RedTM C2 maleimideと等モルになるように添加混合し、2時間、チューブミキサーを用いて遮光下にて攪拌し反応させることにより、ローダミン(標識分子)含有シリカ化合物を調製した。
100 nm金コロイド(田中貴金属製) 400μlに、500倍に希釈したMPS100μl及び28重量%アンモニア水溶液500μl, 100 mM MPS-Rhodamineをそれぞれ添加混合し、100℃で4時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機(10,000×g、5分間)にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、70容量%エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に3回、合計6回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし電子顕微鏡で観察した。その結果、20 nm以下のMPS層状被覆が確認された。また蛍光顕微鏡にてローダミンの蛍光が確認できた。なお、シェルの厚みの制御率は約17であった。
(蛍光色素(ローダミン)含有MPS層状被覆金コロイドよる細胞標識)
実施例4にて調製した粒子をマウス腹腔内投与し、翌日、腹腔内の細胞を回収し、5%バラフォルムアルデヒトで固定後蛍光顕微鏡で観察した。蛍光観察(図5右)にて粒子に標識されローダミンの蛍光を持つ細胞が確認できた。図5左は明視野の観察、中央はマージした所見である。
(MPS層状被覆金コロイドの局所プラズモン共鳴による蛋白の検出)
実施例2と同様の方法にて作製した10 nm以下のMPS層状被覆100 nm金コロイドを用いて局所プラズモン共鳴による蛋白の検出を検討した。MPS層状被覆100 nm金コロイド溶液900μl(A1)に100μg/ml 抗グルタチオン-S-トランスフェラーゼ抗体溶液を9μl(A2)加え、さらに9μl(A3)を加えた後、溶液の吸収を評価した(図6左)。また抗体溶液の添加による希釈の影響を考慮し400nmで補正を行った(図6左)。局所プラズモン共鳴による吸収の変化が確認できた。
(20
nm以上のMPS層状被覆40 nm金コロイド)
40 nm金コロイド(田中貴金属製) 200μlに、100倍に希釈したMPS50μl及び28重量%アンモニア水溶液250μlをそれぞれ添加混合し、100℃で3時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機(10,000×g、5分間)にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、70容量%エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に3回、合計6回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし電子顕微鏡で観察した。その結果、20 nm以上のMPS層状被覆が確認された。なお、シェルの厚みの制御率は約12であった。
(20
nm以上のTcPS層状被覆40 nm金コロイド)
40 nm金コロイド(田中貴金属製) 200μlに、77倍に希釈した(3-Thiocyanatopropyl)triethoxysilane (TcPS) 50μl及び28重量%アンモニア水溶液250μlをそれぞれ添加混合し、100℃で3時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機(10,000×g、5分間)にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、70容量%エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に3回、合計6回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし電子顕微鏡で観察した。その結果、20 nm以上のTcPS層状被覆が確認された。なお、シェルの厚みの制御率は約20%であった。
(20
nm以下のTcPS層状被覆40 nm金コロイド)
40 nm金コロイド(田中貴金属製) 200μlに、385倍に希釈した(3-Thiocyanatopropyl)triethoxysilane (TcPS) 25μl及び28重量%アンモニア水溶液275μlをそれぞれ添加混合し、100℃で3時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機(10,000×g、5分間)にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、70容量%エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に3回、合計6回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし電子顕微鏡で観察した。その結果、20 nm以上のTcPS層状被覆が確認された。なお、シェルの厚みの制御率は約6%であった。
(5
nm以下のTcPS層状被覆40 nm金コロイド)
40 nm金コロイド(田中貴金属製) 200μlに、385倍に希釈した(3-Thiocyanatopropyl)triethoxysilane (TcPS) 5μl及び28重量%アンモニア水溶液295μlをそれぞれ添加混合し、100℃で3時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機(10,000×g、5分間)にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、70容量%エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に3回、合計6回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし電子顕微鏡で観察した。その結果、5 nm以上のTcPS層状被覆が確認された。
(5
nm以下のEpoPS層状被覆40 nm金コロイド)
40 nm金コロイド(田中貴金属製) 200μlに、80倍に希釈した 2-(3,4-Epoxycyclohexyl)-ethyltrimethoxysilane (EpoPS) 25μl及び28重量%アンモニア水溶液275μlをそれぞれ添加混合し、100℃で3時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機(10,000×g、5分間)にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、70容量%エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に3回、合計6回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし電子顕微鏡で観察した。その結果、5 nm以上のEpoPS層状被覆が確認された。
(MPS層状被覆量子ドット)
Qdot 605 crystal (4μM, Quantum dot 社製) 3μlに、100倍に希釈したMPS50μl(a)または100μl(b)及び28重量%アンモニア水溶液947μl(a)または897μl(b)をそれぞれ添加混合し、100℃で3時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機(20,000×g、30分間)にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、70容量%エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に3回、合計6回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし電子顕微鏡で観察した。その結果、MPS層状被覆量子ドットが確認された(図12左は(a),図12右は(b))。なお、粒子のサイズ制御率は約36%であった。
(ローダミン含有MPS層状被覆量子ドット)Qdot 605 crystal (4μM, Quantum dot 社製) 3μlに、500倍に希釈したMPS100μl及び28重量%アンモニア水溶液896μl, 100 mM MPS-Rhodamine 1μlをそれぞれ添加混合し、100℃で3時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機(20,000×g、30分間)にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、70容量%エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に3回、合計6回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし電子顕微鏡で観察した。その結果、MPS層状被覆量子ドットが確認された (図13上)。さらに、この粒子一つの蛍光強度の変化を蛍光顕微鏡で評価した。図13下グラフ、赤線はローダミン含有MPS層状被覆量子ドット、黒破線は無処理の量子ドットの蛍光強度を示している。ローダミン含有MPS層状被覆量子ドットは高強度並びに安定し、点滅のない蛍光を持続したのに対して、無処理の量子ドットは蛍光強度の変動が激しく蛍光が低下した時には観察できなかった(photo blinking現象)。なお、粒子のサイズ制御率は約21%であった。
(蛍光色素で表層修飾を行ったMPS層状被覆量子ドット)
実施例12の方法で作成したMPS層状被覆量子ドットの含む溶液20μlに蒸留水 75μl、10 mM fluorescein-5-maleimide (A)または10 mM DY-635 maleimide (B) 20μlをそれぞれ添加混合し、室温で3時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機(20,000×g、30分間)にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、70容量%エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に3回、合計6回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし蛍光顕微鏡で観察した。図14下a-d
はfluorescein
(A)、e-hはDY-635(B)で表層修飾したものの所見である。いずれもQdot
605 の蛍光が確認できたと共に(A)ではfluorescein、(B)ではDY-635の蛍光がそれぞれ観察できた。dはaとb、hはeとgをマージさせた所見である。
これらから、マレイミドとフルオレセイン、ローダミンなどの蛍光色素との結合体や、ストレプトアビジン、HRP(Horseradish roots peroxidase:西洋わさびペルオキシターゼ)など蛋白質との結合体、その他、ビオチンやポリエチレングリコールなどの機能性物質との結合体を直接粒子表面に結合させることも可能であることがわかる。
(MPS層状被覆量子ドットの蛋白による表層修飾)
実施例12の方法で作成したMPS層状被覆量子ドットの含む溶液10μlに10μg/ml
green fluorecent protein (GFP)溶液 10μlを混合し、数分反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機(20,000×g、30分間)にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットを生理的食塩水で3回、洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし蛍光顕微鏡で観察した。粒子はQdotの蛍光(a)に加え、GFPの蛍光(b)も観察できた。図15cはaとbのマージ像。
(MPS層状被覆量子ドットによる細胞標識)
実施例13にて調製した粒子をマウス腹腔内投与し、翌日、腹腔内の細胞を回収し、5%バラフォルムアルデヒトで固定後蛍光顕微鏡で観察した。蛍光観察(図16右)にて粒子に標識されローダミンの蛍光を持つ細胞が確認できた。図16左は明視野の観察、中央はマージした所見である
(TcPS層状被覆量子ドット)
Qdot 605 crystal (4μM, Quantum dot 社製) 3μlに、385倍に希釈したTcPS 100μl及び28重量%アンモニア水溶液897μlをそれぞれ添加混合し、100℃で4時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機(20,000×g、30分間)にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、70容量%エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に3回、合計6回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし電子顕微鏡で観察した。その結果、MPS層状被覆量子ドットが確認された。なお、粒子のサイズ制御率は約25%であった。
(MPS層状被覆磁性体)
10 nm磁性粒子(FerroTec社製) を100倍希釈したもの2μlに、500倍に希釈したMPS100μl及び28重量%アンモニア水溶液690μl, 2-propanol 200μlをそれぞれ添加混合し、100℃で3時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機(20,000×g、30分間)にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、70容量%エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に3回、合計6回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし電子顕微鏡で観察した。その結果、MPS層状被覆が確認された(図18上)。また28重量%アンモニア水溶液, 2-propanol の容量を498μl、400μl(図18下左)、398μl、500μl(図18下右)ではMPS層状被覆層の厚みに変化が認められた。なお、粒子のサイズ制御率は約13%であった。
(蛍光色素含有MPS層状被覆磁性体)
10 nm磁性粒子(FerroTec社製) を100倍希釈したもの50μlに、500倍に希釈したMPS100μl及び28重量%アンモニア水溶液650μl, 2-propanol 200μl、 100 mM MPS-Rhodamine 1μl をそれぞれ添加混合し、100℃で4時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機(20,000×g、5分間)にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、70容量%エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に3回、合計6回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし電子顕微鏡で観察した。その結果、MPS層状被覆が確認された(図19右)。また蛍光顕微鏡にて粒子(層)にローダミンの蛍光が確認できた(図19左)。
(蛍光色素含有MPS層状被覆磁性体による細胞標識)
実施例19にて調製した粒子をマウス腹腔内投与し、翌日、腹腔内の細胞を回収し、5%バラフォルムアルデヒトで固定後蛍光顕微鏡で観察した。蛍光観察(図20右)にて粒子に標識されローダミンの蛍光を持つ細胞が確認できた。図20左は明視野の観察、中央はマージした所見である。
(TcPS層状被覆磁性体)
10 nm磁性粒子(FerroTec社製) を100倍希釈したもの10μlに、364倍に希釈したTcPS100μl及び28重量%アンモニア水溶液890μlをそれぞれ添加混合し、100℃で3時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機(20,000×g、30分間)にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、70容量%エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に3回、合計6回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし電子顕微鏡で観察した。その結果、MPS層状被覆が確認された。なお、粒子のサイズ制御率は約13%であった。
(MPS層状被覆大腸菌)
一晩培養しした大腸菌JM109を25% グルタールアルデヒト溶液にて固定を行い洗浄をした後、その固定した大腸菌液100μlに、50倍に希釈したMPS100μl及び28重量%アンモニア水溶液800μlをそれぞれ添加混合し、100℃で4時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機(10,000×g、5分間)にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、70容量%エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に3回、合計6回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし電子顕微鏡で観察した。左図は被覆化処理を行っていないもの、右図は処理を行ったものである。処理を行ったものでは大腸菌のサイズ表面構造に変化が確認でき、MPS層状被覆が確認された。
(MPS層状被覆大腸菌の蛋白による表層修飾)
一晩培養した大腸菌JM109を4% パラフォルムアルデヒト溶液にて固定を行い洗浄をした後、その固定した大腸菌液100μlに、50倍に希釈したMPS100μl及び28重量%アンモニア水溶液800μlをそれぞれ添加混合し、100℃で4時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機(10,000×g、5分間)にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、70容量%エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に3回、合計6回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌した。大腸菌溶液5μlに250μg/ml Green fluorescein protein (GFP) 溶液を混合し蛍光顕微鏡にて観察を行った。上図は被覆化処理を行っていないもの、下図23は処理を行ったものである。被覆化処理を行った大腸菌はGFPの付着による蛍光が確認できた。
(Liquid core organosilica shellの作製)
32倍希釈したMPS19μl、32倍希釈した(3-Thiocyanatopropyl)triethoxysilane (TcPS) 27.7μl及び28重量%アンモニア水溶液453.3μlをそれぞれ添加混合し、100℃で3時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機(10,000×g、5分間)にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、70容量%エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に3回、合計6回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし電子顕微鏡で観察した。その結果、約50〜100
nmのMPSとTcPSからなるシリカシェルに液体が被覆された直径約300~600
nm Liquid core organosilica shellが確認された。なお、粒子のサイズ制御率は約25%であった。
(蛍光色素含有Liquid core organosilica shellの作製)
32倍希釈したMPS19μl、32倍希釈した(3-Thiocyanatopropyl)
triethoxysilane (TcPS) 27.7μl、100 mM Fluorescein 50μl水溶液、及び28重量%アンモニア水溶液403.3μlをそれぞれ添加混合し、100℃で4時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機(10,000×g、5分間)にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、70容量%エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に3回、合計6回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし電子顕微鏡で観察した。その結果、約60~100 nmのMPSとTcPSからなるシリカシェルに液体が被覆されたLiquid core organosilica shellが確認された。さらに蛍光顕微鏡で観察を行ったところMPS、TcPSで単独で同じ方法で作製した粒子と比較して優位に強い蛍光が観察された。
tetraethoxyorthosilicate 15μl、エタノール500μl、蒸留水125μl及び28重量%アンモニア水溶液50μlをそれぞれ添加混合し、室温で2日間反応させ、無機シリカTEOS粒子を作製した。
無機シリカTEOS粒子5μlに500倍希釈したMPS 10μl、10 mM MPS-rhodamine 1μl及び28重量%アンモニア水溶液84μlをそれぞれ添加混合し、100℃で3時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機(10,000×g、5分間)にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、70容量%エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に3回、合計6回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし蛍光顕微鏡で観察した。その結果、粒子より蛍光が観察でき、シリカ表面の蛍光色素を含む有機シリカ被覆が行えたことを確認した。
(量子ドットの有機シリカ被覆)
T2-MP EviTags (evident社製; Non-functionalized) 10μlに、100倍希釈したMPS19μl、100倍希釈した(3-Thiocyanatopropyl)
triethoxysilane (TcPS) 27.7μl及び28重量%アンモニア水溶液443.3μl、100℃で1.5時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機(20,000×g、30分間)にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、70容量%エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に3回、合計6回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし電子顕微鏡で観察した。その結果、二種の有機シリカによる層状被覆が確認された。
(磁性体の有機シリカ被覆-1)
4倍希釈したMPS4.7μl、4倍希釈した(3-Thiocyanatopropyl)
triethoxysilane (TcPS) 6.9μl及び28重量%アンモニア水溶液388.4μlに100 mg/ml に調整したblack iron oxide
particles (Polyscience 社製、直径約200nm)を100μlそれぞれ添加混合し、100℃で2時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機(10,000×g、5分間)にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、70容量%エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に3回、合計6回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし電子顕微鏡で観察した。その結果、MPSとTcPSからなるシリカシェル層に被覆された磁性体が確認できた。また下図上段は被覆した粒子が0.1 mg/ml GFP溶液との混合においてGFPと良好に結合し蛍光を確認できるが、下段の非被覆の粒子は蛍光は確認できなかった。
(磁性体の有機シリカ被覆-2)
10 nm磁性粒子(FerroTec社製) 2μlに、100倍希釈したMPS19μl、100倍希釈した(3-Thiocyanatopropyl)triethoxysilane (TcPS) 27.7μl及び28重量%アンモニア水溶液451.3μl、100℃で1.5時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機(20,000×g、30分間)にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、70容量%エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に3回、合計6回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし電子顕微鏡で観察した。その結果、シリカ層状被覆が確認された。
(有機シリカ被覆磁性体のMRI評価)
実施例18にて作製したMPS層状被覆磁性体(A)並びに上記、<磁性体の有機シリカ被覆-2>にて作製したMPSとTcPSで層状被覆した磁性体(B)を小動物用コンパクトMRI(DSファーマバイオメディカル(株)社製)にて評価を行った。コントロールとして実施例-00の方法にて作製した磁性体を含まないMPSとTcPSからなるLiquid core
organosilica shell(C)を用いた。
磁性体はT2強調条件にて陰性造影剤として水のシグナルを減弱する。下図は核粒子を遠心チューブに入った状態でT2強調条件で撮影したものである。(C)においては白い陽性シグナルが観察されるのに対して(A), (B)共に陽性シグナルが検出出来ず、シグナルが陰性化していた。有機シリカ被覆磁性体がMRIのT2強調条件にて陰性シグナルを示すことが確認できた。
(二種の機能性物質の有機シリカ被覆1:量子ドットと磁性体を含有するMPSシリカ粒子)
Qdot 605 crystal (320 nM, Quantum dot 社製) 50μlと100倍希釈した10 nm磁性粒子(FerroTec社製) を10μlに、500倍に希釈したMPS100μl及び28重量%アンモニア水溶液840μlを添加混合し、100℃で3時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機(20,000×g、15分間)にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、70容量%エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に3回、合計6回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし電子顕微鏡で観察した。その結果、MPS層状被覆された量子ドットと磁性体のハイブリッド粒子が確認された。
(二種の機能性物質の有機シリカ被覆2:量子ドットと磁性体を含有する有機シリカ粒子)
20倍希釈した10 nm磁性粒子(FerroTec社製) を2μlに、10μM T2-MP EviTags (evident社製; Non-functionalized) を5 μl、100倍に希釈したMPS19μl、100倍に希釈したTcPS27.7μl及び28重量%アンモニア水溶液438.3μlをそれぞれ添加混合し、100℃で1.5時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機(20,000×g、30分間)にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、70容量%エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に3回、合計6回、遠心による洗浄を繰返した。さらに、次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし電子顕微鏡で観察した。その結果、有機シリカ層状被覆が確認された。
(二種の有機シリカによる被覆:APS/MPS被覆)
10 nm磁性粒子(FerroTec社製) を100倍希釈したもの10μlに、40倍に希釈したMPSとAPSをそれぞれ19μl、22.6μl及び28重量%アンモニア水溶液448.4μlをそれぞれ添加混合し、100℃で16時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機(20,000×g、30分間)にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、70容量%エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に3回、合計6回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし電子顕微鏡で観察した。その結果、APS/MPS層状被覆された磁性体が確認された。なお、磁性粒子を含まないAPS/MPSからなる粒子も観察されている。
(非水溶性磁性体を用いたMPS層状被覆磁性体の作製)
32 mg 乾燥磁性粒子(EMG1500, FerroTec社製) に、MPS10μl及び28重量%アンモニア水溶液940μl, 10 mM Rhodamine B 50μlをそれぞれ添加混合し、100℃で3時間反応させた。次いで、反応終了液上清を高速遠心機(20,000×g、10分間)にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、70容量%エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に3回、合計6回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし電子顕微鏡で観察した。その結果、MPS層状被覆磁性体粒子が確認された(図34)。また蛍光顕微鏡において粒子より蛍光が観察できた(図35)。被覆された粒子は水中において分散していた。
・シリカ化合物と蛍光色素の結合体(MPS-Rhodamineなど)を用いずに、Rhodamine B(ローダミンB)のみで一段階の反応で、色素が粒子の有機シリカ被覆層に含有されている。
(金コロイドのMPS被覆粒子と従来の金コロイド粒子との表面修飾能比較)
種々の濃度(0〜20μg/ml:具体的には0μg/ml,10μg/ml,20μg/ml)のGreen fluorescent
protein(GFP)溶液を作製した。このGFP溶液5μlと、以下のA〜Eの粒子溶液5μlとをフローサイトメーター用試験管に加え、よく混和した後、(特に反応のための時間を加えず)490μlの蒸留水で希釈しフローサイトメトリーで測定(FCM-48-3820)を行った。
B: 100 nm金コロイドをSiO2にて被覆
C: 100 nm金コロイドをSiO2にて被覆したものをMPSにて処理
D: 100 nm金コロイドをSiO2にて被覆したものをAPSにて処理
E: 100 nm金コロイドをMPSにて被覆
このうち粒子A〜Dは、従来の被覆粒子と、更にその表面にAPS、MPSをカップリング剤として処理したものであり、粒子Eが本発明の一例であるMPSの被覆粒子Eであることがわかる。
(有機シリカ被覆粒子の化学共役物質を用いた表面の機能化)
有機シリカにて被覆を行なった粒子表面に蛋白質をより高効率に結合させるため化学共役物質、具体的にはカップリング剤としてマレイミド化合物の1つである4-maleimidobutyric acid N-succinimidyl esterを使用し、有効な結果を得た。具体的には種々の濃度(0〜50μg/ml:具体的には0μg/ml,12.5μg/ml,25μg/ml,50μg/ml)のGreen fluorescent
protein(GFP)溶液を作製した。このGFP溶液25μlと、以下のA〜Cの粒子溶液5μlとをフローサイトメーター用試験管に加え、よく混和し30分反応させた後、470μlの蒸留水で希釈しフローサイトメトリー(実施例35と同様)で測定を行った。
B: 250 nm金コロイドをMPSにて被覆
C: 250 nm金コロイドをMPSにて被覆した粒子250μlに対して終濃度 1 mM となるように4-maleimidobutyric
acid N-succinimidyl esterを加えて1時間反応させた粒子
ここで、4-maleimidobutyric acid N-succinimidyl esterは蛋白質のアミノ基とMPS被覆粒子のチオール基に結合し、蛋白質を粒子表面に結合させることができる化学共役物質の1つであり、本粒子ではサクシミドエステルを表面保有させた粒子作製がなされている。
(有機シリカで被覆した粒子のゼータ電位)
コアとなる種々の機能性粒子について表面修飾(被覆)しない場合とシリカ化合物で被覆した場合と表面修飾しない場合とのゼータ電位差(Z電位の差)について測定した。表5は左から順にそれぞれの粒子のゼータ電位と、コア粒子とのゼータ電位の差と、コア粒子とのゼータ電位の差の絶対値と、コア粒子とこれに被覆した粒子の説明と、を示している。
(励起光の照射により細胞障害機能の検証:(EMG1500)RhodamineB/MPS)粒子)
本実施例では、マウス腹腔よりマクロファージを2mlの10%FBSを含むRPMIにて採取し96ウェルのマイクロウェートに培養した。その後、以下のA〜Cの条件の溶液に細胞増殖試薬(Cell Proliferation Reagent WST-1:Roche社) 10μl添加し、30分または90分培養後、溶液の吸収波長 (440 nm 参照波長 750 nm)を測定した。
B: 腹腔マクロファージ 100 μl + ((EMG1500)RhodamineB/MPS) 粒子 10μl
添加
C: 腹腔マクロファージ 100 μl + ((EMG1500)RhodamineB/MPS) 粒子 10μl
添加した後、蛍光顕微鏡下にて励起光(528-553 nm)を照射
ここで、((EMG1500)RhodamineB/MPS) 粒子とは、乾燥磁性ナノ粒子EMG1500(フェローテック社)に蛍光色素(Rhodamine B)を含有させMPS被覆した粒子である。
なお、図40では蛍光顕微鏡下にて励起光(528-553 nm)を照射した細胞(マクロファージ)の形態変化を示している(上記条件C)。照射開始時 (0sec)において細胞内の粒子からの蛍光が観察できるが、100 sec 後において蛍光は消失し、その後、細胞の形態変化・破壊所見が観察される。
Claims (12)
- メルカプトプロピルトリメトキシシラン(MPS)、メルカプトプロピルトリエトキシシラン(MPES)、メルカプトプロピルメチルジメトキシシラン(MPDMS)、トリメトキシ[2−(7−オキサビシクロ[4.1.0]−ヘプトー3−イル)エチル]シラン(EpoPS)、チオシシアナトプロピルトリエトキシシラン(TCPS)、アクリルオキシプロピルトリメトキシシラン(ACPS)およびアミノプロピルトリメトキシシラン(APS)からなる群より選択される1種以上の有機シリカ化合物から得られるシリカを主成分とするシェルと、該シェル内部に磁性体、金コロイド、量子ドット、ガドリニウム含有粒子、イメージング機能性物質含有液の1種または複数種を含む直径2〜200nmのコアとを有する、ナノ機能性シリカ粒子。
- メルカプトプロピルトリメトキシシラン(MPS)、メルカプトプロピルトリエトキシシラン(MPES)、メルカプトプロピルメチルジメトキシシラン(MPDMS)、トリメトキシ[2−(7−オキサビシクロ[4.1.0]−ヘプトー3−イル)エチル]シラン(EpoPS)、チオシシアナトプロピルトリエトキシシラン(TCPS)、アクリルオキシプロピルトリメトキシシラン(ACPS)およびアミノプロピルトリメトキシシラン(APS)からなる群より選択される1種以上の有機シリカ化合物と、アミノプロピルトリエトキシシラン(APES)とから得られるシリカを主成分とするシェルと、該シェル内部に磁性体、金コロイド、量子ドット、ガドリニウム含有粒子、イメージング機能性物質含有液の1種または複数種を含む直径2〜200nmのコアとを有する、ナノ機能性シリカ粒子。
- 前記シェルの表面および/または前記シェルの内部および/または前記コアの内部に機能性化合物を保有する、請求項1〜2のいずれか1項に記載のナノ機能性シリカ粒子。
- 前記シェルと前記機能性化合物自体との表面電位差が3mV以上である、請求項3に記載のナノ機能性シリカ粒子。
- 前記シェルの表面および/または前記シェルの内部および/または前記コアの内部に保有される機能性化合物が官能基、蛍光性物質、蛋白質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、糖鎖、生理活性物質、造影剤、薬剤およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項3または4に記載のナノ機能性シリカ粒子。
- 粒径が3〜500nmである、請求項1〜5のいずれか1項に記載のナノ機能性シリカ粒子。
- 前記蛍光性物質が、ローダミンレッド、フルオロセイン、ヘキサン酸−6−(テトラメチルローダミン−5−カルボキサミド)、ヘキサン酸5−(テトラメチルローダミン−5−カルボキサミド)、Alexa
Fluor 647、DY
635、DY 485、DY495、DY
505およびトリスジクロロツテニウム(II)ヘキサハイドレートからなる群より選択され、かつ、該蛍光性物質が単独、またはN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、イソチオシアネート(ITC)およびマレイミドから選択される化合物との結合状態で保有される、請求項1〜6のいずれかに記載のナノ機能性シリカ粒子。 - 前記シェルの表面に保有される機能性化合物が官能基、蛍光性物質、蛋白質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、糖鎖、生理活性物質、造影剤、薬剤およびそれらの組合せからなる群より選択されるが、単独による結合状態、単独とカップリング試薬の添加による結合状態、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、イソチオシアネート(ITC)およびマレイミドから選択される化合物との結合状態で保有される、請求項1〜7のいずれかに記載のナノ機能性シリカ粒子。
- 前記シェルの表面および/または前記シェルの内部および/または前記コアの内部に細胞障害活性機能を有する物質を保有する、請求項1〜8のいずれかに記載のナノ機能性シリカ粒子。
- 前記物質は、光照射されることにより細胞障害活性機能を発揮する、請求項9に記載のナノ機能性シリカ粒子。
- ナノ機能性シリカ粒子の作製方法であって、
(a)有機シリカ化合物、機能性物質、およびアンモニア水溶液の混合液を調製する工程;または有機シリカ化合物、機能性物質、機能性化合物およびアンモニア水溶液の混合液を調製する工程;および
(b)所定の温度条件下で該有機シリカ化合物と該アンモニア水溶液を反応させる工程;
を包含し、
ここで、前記有機シリカ化合物は、メルカプトプロピルトリメトキシシラン(MPS)、メルカプトプロピルトリエトキシシラン(MPES)、メルカプトプロピルメチルジメトキシシラン(MPDMS)、トリメトキシ[2−(7−オキサビシクロ[4.1.0]−ヘプト−3−イル)エチル]シラン(EpoPS)、チオシシアナトプロピルトリエトキシシラン(TcPS)およびアクリルオキシプロピルトリメトキシシラン(ACPS)およびアミノプロピルトリメトキシシラン(APS)からなる群より選択される1種以上であり、
前記機能性物質が、磁性体、金コロイド、量子ドット、ガドリニウム含有粒子、イメージング機能性物質含有液からなる群より選択される1種または複数種であり、
そして、工程(a)および(b)における、アンモニア水溶液および温度条件が、
(i)高温(80〜100℃での温度範囲);及び
(ii)高アンモニア濃度(最終濃度25%以上)
の条件を満たすように調整される方法。 - ナノ機能性シリカ粒子の作製方法であって、
(a)有機シリカ化合物、機能性物質、およびアンモニア水溶液の混合液を調製する工程;または有機シリカ化合物、機能性物質、機能性化合物およびアンモニア水溶液の混合液を調製する工程;および
(b)所定の温度条件下で該有機シリカ化合物と該アンモニア水溶液を反応させる工程;
を包含し、
ここで、前記有機シリカ化合物は、メルカプトプロピルトリメトキシシラン(MPS)、メルカプトプロピルトリエトキシシラン(MPES)、メルカプトプロピルメチルジメトキシシラン(MPDMS)、トリメトキシ[2−(7−オキサビシクロ[4.1.0]−ヘプトー3−イル)エチル]シラン(EpoPS)、チオシシアナトプロピルトリエトキシシラン(TcPS)およびアクリルオキシプロピルトリメトキシシラン(ACPS)およびアミノプロピルトリメトキシシラン(APS)からなる群より選択される1種以上と、アミノプロピルトリエトキシシラン(APES)とであり、
前記機能性物質が、磁性体、金コロイド、量子ドット、ガドリニウム含有粒子、イメージング機能性物質含有液からなる群より選択される1種または複数種であり、
そして、工程(a)および(b)における、アンモニア水溶液および温度条件が、
(i)高温(80〜100℃での温度範囲);及び
(ii)高アンモニア濃度(最終濃度25%以上)
の条件を満たすように調整される方法。
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