JPWO2009034961A1 - ヒト樹状細胞の評価方法およびヒト細胞免疫療法剤 - Google Patents
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Abstract
Description
このように、ヒトNKT細胞免疫療法に使用するためのヒト樹状細胞の品質を事前に評価し得る有効な手段は存在しないのが現状である。
Cancer Res.59,5102−5105,1999 J.Immunol.Meth.272,147−159,2003 J.Immunol.177,3484−3492,2006 Immunogenetics 50,146−151,1999
(1) 以下の工程を含む、ヒト樹状細胞の抗原提示能の評価方法:
(a)α−ガラクトシルセラミドをパルスしたヒト樹状細胞を、非ヒト哺乳動物に投与する工程;
(b)該非ヒト哺乳動物からNKT細胞含有試料を採取する工程;
(c)該試料中に存在するNKT細胞の活性化を検出する工程。
(2) 非ヒト哺乳動物がマウスである、上記(1)に記載の方法。
(3) NKT細胞含有試料が、脾臓、肝臓または末梢血由来である、上記(1)または(2)に記載の方法。
(4) NKT細胞の活性化を、該NKT細胞が産生する1種以上のサイトカインを指標として評価することを特徴とする、上記(1)〜(3)のいずれかに記載の方法。
(5) サイトカインが、インターフェロン−γおよび/またはインターロイキン−4を含む、上記(4)に記載の方法。
(6) ヒトNKT細胞免疫療法に使用するヒト樹状細胞を選別するためのものである、上記(1)〜(5)のいずれかに記載の方法。
(7) ヒト樹状細胞がNKT細胞免疫療法により治療効果が得られうる疾患の患者由来である、上記(6)に記載の方法。
(8) 疾患が癌である、上記(7)に記載の方法。
(9) 上記(6)または(7)に記載の方法により、NKT細胞に対して抗原提示能を有すると判定されたヒト樹状細胞を含有してなる、ヒトNKT細胞免疫療法剤。
(10) 癌の治療用である、上記(9)記載の剤。
(11) 以下の工程を含む、ヒトNKT細胞を活性化し得るリガンドのスクリーニング方法:
(a)被験物質をパルスしたヒト樹状細胞を、非ヒト哺乳動物に投与する工程;
(b)該非ヒト哺乳動物からNKT細胞含有試料を採取する工程;
(c)該試料中に存在するNKT細胞の活性化を検出する工程。
(12) 被験物質の代わりにα−ガラクトシルセラミドを用いて前記(a)〜(c)の工程を実施し、該被験物質をパルスした場合とα−ガラクトシルセラミドをパルスした場合との間で、NKT細胞の活性化の程度を比較することをさらに含む、上記(10)記載の方法。
(13) 非ヒト哺乳動物がマウスである、上記(11)または(12)記載の方法。
αGCによるhDCのパルスは周知慣用の手法により行えばよく、例えば、αGCを約100〜約200ng/mlの濃度で含有する培地(例えば、RPMI−1640培地等)中で、hDCを約12〜約48時間培養することにより実施することができる。αGCのパルスは、上記未成熟のhDCをGM−CSFおよびIL−4存在下で培養・成熟させる過程で、培地にαGCを添加することにより行ってもよい。
本発明の評価方法によれば、hDCの投与量依存的にNKT細胞が活性化されるので、hDCの定性的評価のみならず定量的な評価も可能である。さらに、hDCによる非ヒト哺乳動物NKT細胞の活性化は、レシピエント由来のDCによるNKT細胞の活性化とも定量性よく相関するので、レシピエントの個体差による評価のばらつきを補正することも可能である。
(a)被験物質をパルスしたhDCを、非ヒト哺乳動物に投与する工程;
(b)該非ヒト哺乳動物からNKT細胞含有試料を採取する工程;
(c)該試料中に存在するNKT細胞の活性化を検出する工程。
一方、αGCおよび被験物質でパルスした場合に、αGCのみでパルスした場合に比べて有意に変化した場合、該被験物質はαGCによるNKT細胞の活性化を調節し得ると判定することができる。該被験物質がαGCと競合的にCD1d上にロードされるのか、あるいは、αGCのロード率やロードされたαGCのNKT細胞活性化能力を変化させるのかは、被験物質のみでhDCをパルスした場合に、該hDCがNKT細胞を活性化し得るかどうかによって判別することができる。
健康な血液供与者から得た静脈血から、末梢血単核球細胞(PBMC)を、Ficoll−Hypaque(GE Healthcare Biosciences、Uppsala、Sweden)密度勾配遠心により分離した。PBSでPBMCを3回洗浄し、使用するまで液体窒素タンク中に保管した。書面によるインフォームドコンセントは、ヘルシンキ宣言にしたがって患者から得た。全ての研究は理化学研究所治験審査委員会により承認を得た。
6〜8週齢の、無菌C57BL/6、DBA/2およびBALB/cメスマウスを日本クレア(東京)から購入した。これらのマウスおよびJα18−/−マウスは、SPF条件下で飼育、維持し、研究所の指針にしたがって、研究を行った。
αGCは、理化学研究所にて合成した。αGCおよびビヒクル(0.4% DMSO)は、PBSに希釈した。ヒトリコンビナント(r)GM−CSFおよびIL−4は、R&D systems(Minneapolis、MN)から購入した。抗マウス−CD19モノクローナル抗体(1D3)、抗−TCRβモノクローナル抗体(H57−597)およびマウスIgG1(A85−1)は、BD PharMingen(San Diego、CA)から購入した。NKT細胞のフローサイトメトリーには、リコンビナントの可溶性二量体の、マウスCD1d:Ig(BD PharMingen)−PEおよびFITC標識した抗マウスCD19抗体を使用した。解析には、FACS CaliburTM装置およびCELLQuestTM(BD Biosciences)を使用した。
磁気ビーズ(Miltenyi Biotec Inc.Auburn、CA)を使用して、PBMCから、CD14+単球を精製し、500U/mlヒトIL−4および100ng/mlヒトGM−CSF存在下にて、7日間培養した。αGC(100ng/ml)または等量のビヒクルを6日目にhDCに添加して、さらに24時間培養した。マウス骨髄由来のDCは、既に報告されたように、5%FCSおよびマウスGM−CSFを含むRPMI−1640中で骨髄前駆体から増殖した(J.Exp.Med.176,1693−1702,1992)。6日目に、αGC(100ng/ml)を未成熟DCに添加し、多くの実験では、さらに2日間培養した。αGCをパルスしたDC(DC/Gal)は、8日目に回収した。
96穴タイタープレート(Millipore、Bedford、MA)を抗マウスIFN−γモノクローナル抗体または抗マウスIL−4モノクローナル抗体(どちらも10μg/ml、BD PharMingen)で被覆した。ヒトDC/Galで免疫した2日後、脾臓細胞(3×105細胞/穴)を、ビヒクルまたはαGC(100ng/ml)のいずれかと共に16時間培養した。培養後、プレートを洗浄し、ビオチン化した抗マウスIFN−γモノクローナル抗体または抗マウスIL−4モノクローナル抗体(どちらも1μg/ml、BD PharMingen)と共にインキュベートした。IFN−γまたはIL−4スポット形成細胞数(SFC)は、顕微鏡で定量した。
マンホイットニーのU検定を使用してデータの相違を解析した。P<0.05は、統計的有意であると考えられる。
C57BL/6由来の肝臓単核細胞を刺激するために、αGCをロードしたヒトまたはマウスDCを使用した(図1)。インビトロでは、マウスDCは、αGC依存的にNKT細胞を刺激して、IFN−γが産生された一方、ヒトDCはNKT細胞を効率的に刺激しなかった(図1A)。次に、αGCでパルスしたマウスDC(mDC/Gal)またはヒトDC(hDC/Gal)を投与した2日後に、免疫したマウスにおけるNKT細胞反応を試験した(図1B)。その結果、hDC/Galを投与したマウスから、100個以上のαGC特異的なIFN−γスポットが検出された。この結果から、この手法がNKT細胞刺激に対するDC機能を評価するのに有用であることが示された。ヒトDCをマウスに投与した場合、非特異的な応答が生じてしまうと考えられたが、図1のように評価に使えるようになるとは、予想していない結果であった。
αGCをパルスしたhDCを段階的な量にてC57BL/6マウスに投与した2日後に、NKT細胞によるIFN−γおよびIL−4産生について調べた(図2A)。パルスしていないhDCをマウスに投与しても、IFN−γスポットは検出されなかった。hDC/Galを投与したマウスでは、IFN−γ産生スポット数は投与したhDC/Galの数に相関して増加し、1×106細胞が適量であると決定した。NKT細胞欠損マウスであるJα18−/−マウスに、1×106個のhDC/Galを投与しても、IFN−γまたはIL−4産生スポットはいずれも観察されなかった(図2B)。このことから観察されるサイトカイン産生は、リガンドとNKT細胞の相互作用に依存していることが示された。
ELISPOTアッセイでみられたIFN−γスポットが、NKT細胞およびリガンドの存在に依存的か否かを検討した(図3)。ELISPOTアッセイを行う前に、1×106個のhDC/Galを投与したマウスの脾臓細胞由来のNK1.1+細胞、CD3+細胞、またはCD1d−ダイマー+細胞を除去すると、ほとんどのスポットが消失することを見出した。このことから、IFN−γ産生細胞は、少なくともNK1.1+CD3+CD1d−ダイマー+細胞に依存していることが示された。
NKT細胞の活性化がマウスの系統依存的かどうかを調べるために、様々な系統のマウスにおいて、hDC/Galに対するNKT細胞の反応について試験した。hDC/Galを投与した2日後に、C57BL/6、DBA/2およびBALB/cマウス由来の脾臓細胞を回収して、FACS解析を行った。全てのマウス系統において、NKT細胞数が2倍以上増加していることが明らかとなった(図4A)。試験した系統のマウス全てにおいて、IFN−γおよびIL−4を産生する細胞が同様に増加していることも見出した(図4B)。これらの結果から、マウスの特異的な遺伝的バックグラウンド、すなわちC57BL/6に限定して実験が成功したのではなく、野生型マウスの多くの系統が、この方法を用いてhDCの有効性について評価する際に使用できることが示された。
(a)αGCパルスの条件検討
hDCをαGCと共に0.5時間、2時間または24時間培養した後に、hDCがインビボにおいてマウスNKT細胞を活性化する能力について試験した。αGCを0.5時間パルスしたhDCを投与したマウスにおけるIFN−γ産生NKT細胞は、ほとんどゼロに等しいが、αGCを2時間パルスしたhDCは、αGCを24時間パルスしたhDCを投与したマウスのおよそ半分の活性が見られた(図5A)。
さらに、安定性試験として、液体窒素中に2週間保存したhDC/Galに比較して、フレッシュなhDC/Gal培養物を投与したマウスにおけるNKT細胞活性化に相違があるかどうかについて調べた。図5Bに示した結果から、フレッシュでも、予め凍結したhDCでもどちらも同程度のNKT細胞反応を示すことが明らかとなった。このことは、αGCを一度ロードしたhDCは非常に安定であり、凍結保存により長期使用が可能であることを示している。
Claims (13)
- 以下の工程を含む、ヒト樹状細胞の抗原提示能の評価方法:
(1)α−ガラクトシルセラミドをパルスしたヒト樹状細胞を、非ヒト哺乳動物に投与する工程;
(2)該非ヒト哺乳動物からNKT細胞含有試料を採取する工程;
(3)該試料中に存在するNKT細胞の活性化を検出する工程。 - 非ヒト哺乳動物がマウスである、請求項1に記載の方法。
- NKT細胞含有試料が、脾臓、肝臓または末梢血由来である、請求項1または2に記載の方法。
- NKT細胞の活性化を、該NKT細胞が産生する1種以上のサイトカインを指標として評価することを特徴とする、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- サイトカインが、インターフェロン−γおよび/またはインターロイキン−4を含む、請求項4に記載の方法。
- ヒトNKT細胞免疫療法に使用するヒト樹状細胞を選別するためのものである、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- ヒト樹状細胞がNKT細胞免疫療法により治療効果が得られうる疾患の患者由来である、請求項6に記載の方法。
- 疾患が癌である、請求項7に記載の方法。
- 請求項6または7に記載の方法により、NKT細胞に対して抗原提示能を有すると判定されたヒト樹状細胞を含有してなる、ヒトNKT細胞免疫療法剤。
- 癌の治療用である、請求項9記載の剤。
- 以下の工程を含む、ヒトNKT細胞を活性化し得るリガンドのスクリーニング方法:
(1)被験物質をパルスしたヒト樹状細胞を、非ヒト哺乳動物に投与する工程;
(2)該非ヒト哺乳動物からNKT細胞含有試料を採取する工程;
(3)該試料中に存在するNKT細胞の活性化を検出する工程。 - 被験物質の代わりにα−ガラクトシルセラミドを用いて前記(1)〜(3)の工程を実施し、該被験物質をパルスした場合とα−ガラクトシルセラミドをパルスした場合との間で、NKT細胞の活性化の程度を比較することをさらに含む、請求項10記載の方法。
- 非ヒト哺乳動物がマウスである、請求項11または12記載の方法。
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