JPWO2008139947A1 - 下痢の予防又は治療剤 - Google Patents
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Abstract
Description
Nature, 1993, Vol.366(6455), p.575-580 J. Endocrinol., 2000, Vol.165(2), p.173-177 Eur. J. Pharmacol., 2002, Vol.447(2-3), p.271-278 Cell Calcium, 2004, Vol.35(3), p.209-216 J. Biol. Chem., 2006, Vol.281(13), p.8864-8870 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006, Vol.103(25), p.9390-9397
(1)カルシウム受容体活性化作用を有する化合物を含む下痢の予防又は治療剤。
(2)前記化合物が、ペプチド、ペプチド誘導体、シナカルセットまたは下記式(1)もしくは(2)の構造を有する化合物から選択される、前記下痢の予防又は治療剤。
(4)前記XがCys(SNO)、Cys(S−allyl)、Gly、Cys(S−Me)、Cys、Abu、tLeu、Cle、Aib、PenまたはSerであり、前記YがGly、Val、Glu、Lys、Phe、Ser、Pro、Arg、Asp、Met、Thr、His、Orn、Asn、CysまたはGlnである、前記下痢の予防又は治療剤。
(5)前記ペプチドが、γ−Glu−Val−Glyまたはγ-Glu−tLeu−Glyである、前記下痢の予防又は治療剤。
(6)前記ペプチド誘導体が、下記式(3)の構造を有するペプチド誘導体である、前記下痢の予防又は治療剤。
γ−Glu−X−OCH(Z)CO2H ・・・(3)
(式中、Xはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表し、ZはH又はCH3を表す。)
(7)下記式(3)の構造を有する化合物。
γ−Glu−X−OCH(Z)CO2H ・・・(3)
(式中、Xはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表し、ZはH又はCH3を表す。)
(8)前記式(3)において、XがtLeuまたはAbuである、(7)記載の化合物。
(9)γ−Glu−tLeu−Glyで表される化合物。
本発明の下痢の予防又は治療剤は、カルシウム受容体活性化作用を有する化合物を含む。
カルシウム受容体活性化作用を有する化合物は、ペプチドもしくはこれらの誘導体、又は各種低分子化合物を含む。あるいは、カルシウム受容体と被検物質とを反応させ、カルシウム受容体活性を検出することにより取得することもできる。このようにして得られるペプチドや低分子化合物について、下痢の予防又は治療効果を有することを確認することが好ましい。
1)カルシウム受容体活性を測定するためのカルシウム受容体活性測定系に被検物質を添加して、カルシウム受容体活性を測定する。
2)被験物質を添加したときのカルシウム受容体活性と、被験物質を添加しなかったときのカルシウム受容体活性を比較する。
3)被験物質を添加したときに高いカルシウム受容体刺激活性を示す被験物質を選択する。
以下に生きた細胞を用いた一例を示すが、この一例に限定されるものではない。
(1)Gly:グリシン
(2)Ala:アラニン
(3)Val:バリン
(4)Leu:ロイシン
(5)Ile:イソロイシン
(6)Met:メチオニン
(7)Phe:フェニルアラニン
(8)Tyr:チロシン
(9)Trp:トリプトファン
(10)His:ヒスチジン
(11)Lys:リジン
(12)Arg:アルギニン
(13)Ser:セリン
(14)Thr:トレオニン
(15)Asp:アスパラギン酸
(16)Glu:グルタミン酸
(17)Asn:アスパラギン
(18)Gln:グルタミン
(19)Cys:システイン
(20)Pro:プロリン
(21)Orn:オルニチン
(22)Sar:サルコシン
(23)Cit:シトルリン
(24)N−Val:ノルバリン
(25)N−Leu:ノルロイシン
(26)Abu:α−アミノ酪酸
(27)Tau:タウリン
(28)Hyp:ヒドロキシプロリン
(29)t−Leu:tert−ロイシン
(30)Cle:シクロロイシン
(31)Aib:α−アミノイソブチル酸(α-aminoisobutyric acid、2−メチルアラニン)
(32)Pen:L−ペニシラミン(penicillamine)
カルシウム受容体活性化作用を有する化合物は、下痢の予防又は治療剤の有効成分として使用することができる。本発明の下痢の予防又は治療剤の形態としては、医薬、医薬部外品、食品等が挙げられる。
上記既知のカルシウム受容体活性化剤としては、カルシウム及びカドリニウムなどのカチオン、ポリアルギニン、ポリリジンなどの塩基性ペプチド、プトレッシン、スペルミン、スペルミジンなどのポリアミン、プロタミンなどのタンパク質、フェニルアラニンなどのアミノ酸、グルタチオンなどのペプチド、シナカルセットの類縁化合物などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明において、上記既知のカルシウム受容体活性化剤は単独で加えてもよく、また任意の2種又は3種以上を混合して加えることも可能である。上記既知のカルシウム受容体活性化剤のうち、カルシウム及びガドリニウムなどのカチオンが好ましく、カルシウムがより好ましい。すなわち、更に加えられる既知のカルシウム受容体活性化剤の少なくとも1種はカチオンであることが好ましい。
カルシウム受容体の遺伝子の調製は以下のように行った。NCBIに登録されたDNA配列(カルシウム受容体:NM_000388)を元に、PCRに使う合成オリゴDNA(フォワードプライマー(配列番号1)、及びリバースプライマー(配列番号2))を合成した。
L型アミノ酸試料として、各々特級グレードのアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、オルニチン、タウリン(上記、味の素株式会社)、ヒドロキシプロリン(ナカライテスク株式会社)の23種類を用いた。D−CysおよびD−Trp(ナカライテスク株式会社)及び塩化カルシウムは特級グレードのものを用いた。
Boc−Val−OH(8.69 g, 40.0 mmol)とGly−OBzl・HCl(8.07 g, 40.0 mmol)を塩化メチレン(100 ml)に溶解し、溶液を0℃に保った。トリエチルアミン(6.13 ml, 44.0 mmol)、HOBt(1−Hydroxybenzotriazole, 6.74 g, 44.0 mmol)及びWSC・HCl(1−Ethyl−3−(3−dimethylaminopropyl)carbodiimide Hydrochloride, 8.44 g, 44.0 mmol)を溶液に加え、室温で一夜撹拌した。反応液を減圧濃縮し、残渣を酢酸エチル(200 ml)に溶解した。溶液を水(50 ml)、5%クエン酸水溶液(50 ml x 2回)、飽和食塩水(50 ml)、5%炭酸水素ナトリウム水溶液(50 ml x 2回)、飽和食塩水(50 ml)で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、硫酸マグネシウムを濾過して除き、濾液を減圧濃縮した。残渣を酢酸エチル−n−ヘキサンから再結晶してBoc−Val−Gly−OBzl(13.2 g, 36.2 mmol)を白色結晶として得た。
上記H−Val−Gly−OBzl・HCl及びZ−Glu−OBzl(5.57 g, 15.0 mmol)を塩化メチレン(50 ml)に溶解し、溶液を0℃に保った。トリエチルアミン(2.30 ml, 16.5 mmol)、HOBt(1−Hydroxybenzotriazole, 2.53 g, 16.5 mmol)及びWSC・HCl(1−Ethyl−3−(3−dimethylaminopropyl)carbodiimide Hydrochloride, 3.16 g, 16.5 mmol)を溶液に加え、室温で二夜撹拌した。反応液を減圧濃縮し、残渣を加熱した酢酸エチル(1500 ml)に溶解した。溶液を水(200 ml)、5%クエン酸水溶液(200 ml x 2回)、飽和食塩水(150 ml)、5%炭酸水素ナトリウム水溶液(200 ml x 2回)、飽和食塩水(150 ml)で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、硫酸マグネシウムを濾過して除き、濾液を減圧濃縮した。析出した結晶を濾取、減圧乾燥してZ−Glu(Val−Gly−OBzl)−OBzl(6.51 g,10.5 mmol)を白色結晶として得た。
1H−NMR(400MHz, D2O)δ(ppm):0.87 (3H, d, J=6.8 Hz), 0.88 (3H, d, J=6.8 Hz), 1.99−2.09 (3H, m), 2.38−2.51 (2H, m), 3.72 (1H, t, J=6.35 Hz), 3.86 (1H, d, J=17.8 Hz), 3.80 (1H, d, J=17.8 Hz), 4.07 (1H, d, J=6.8 Hz).
還元型グルタチオン(15.0 g, 48.8 mmol)を水(45 ml)に加え、窒素を吹き込みながら水酸化ナトリウム(4.52 g, 2.2当量, 107 mmol)を少しずつ加えた。ヨウ化メチル(4.56 ml, 1.5当量, 73 mmol)を加え、密栓して室温で2時間撹拌した。濃塩酸で反応液のpHを2〜3に調整し、エタノール(150 ml)を加え冷蔵庫に一夜保存した。油状物が分離したので、上澄みを除いた。残った油状物を水に溶かしエタノールを徐々に加えると、一部結晶を伴う油状物が析出したので再度上澄みを除いた。残渣を水(300 ml)に溶解し、イオン交換樹脂(Dowex 1−acetate, 400 ml)を充填したカラムに吸着させ、水洗した後に1N−酢酸水溶液で溶出した。溶出液を減圧濃縮し、水−エタノールから再沈殿させ、γ−Glu−Cys(S−Me)−Glyの白色粉末(5.08 g, 15.8 mmol)を得た。
1H−NMR(400MHz, D2O)δ(ppm):2.14 (3H, s), 2.15−2.22 (2H, m), 2.50−2.58 (2H, m), 2.86 (1H, dd, J=9.0 Hz, J=14.0 Hz), 3.03 (1H, dd, J=5.0 Hz, J=14.0 Hz), 3.84 (1H, t, J=6.5 Hz), 3.99 (2H, s), 4.59 (1H, dd, J=5.0 Hz, J=9.0 Hz).
γ−Glu−Met(O)、γ−Glu−Val−NH2、γ−Glu−Val−ol、γ−Glu−Ser、γ−Glu−Tau、γ−Glu−Cys(S−Me)(O)、γ−Glu−t−Leu、γ−Glu−Cys(S−allyl)−Gly、γ−Glu−Cys(S−Me)、γ−Glu−Cle−Gly、γ−Glu−Aib−Glyは実施例3および実施例4に準じて合成した。
Boc−tLeu−OH(9.26 g, 40.0 mmol)とGly−OBzl・HCl(8.06 g, 40.0 mmol)を塩化メチレン(60 ml)に溶解し、溶液を0℃に保った。トリエチルアミン(5.60 ml, 40.0 mmol)、HOBt(1−Hydroxybenzotriazole, 6.75 g, 44.0 mmol)及びWSC・HCl(1−Ethyl−3−(3−dimethylaminopropyl)carbodiimide Hydrochloride, 8.47 g, 44.0 mmol)を溶液に加え、室温で一夜撹拌した。反応液を減圧濃縮し、残渣を酢酸エチル(200 ml)に溶解した。溶液を水(50 ml)、5%クエン酸水溶液(50 ml x 2回)、飽和食塩水(50 ml)、5%炭酸水素ナトリウム水溶液(50 ml x 2回)、飽和食塩水(50 ml)で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、硫酸マグネシウムを濾過して除き、濾液を減圧濃縮した。残渣を酢酸エチル−n−ヘキサンから再結晶してBoc−tLeu−Gly−OBzl(15.20 g, 40.1 mmol)を粘性の油状物として得た。
1H−NMR(400MHz, D2O)δ(ppm):0.95 (9H, s), 2.04−2.08 (2H, m), 2.45−2.48 (2H, m), 3.73 (1H, t), 3.87−3.90 (2H, m), 4.07 (1H, s).
Boc−Abu−OH(6.10 g, 30.0 mmol)とBenzyl Glycolate(H−GlyA−OBzl,4.39 g, 30.0 mmol)を塩化メチレン(40 ml)に溶解し、溶液を0℃に保った。DMAP(4−Dimethylaminopyridine,1.10g, 9.0 mmol)とWSC・HCl(6.33 g, 33.0 mmol)を溶液に加え、室温で一夜撹拌した。反応液を減圧濃縮し、残渣を酢酸エチル(150 ml)に溶解した。溶液を水(50 ml)、5%クエン酸水溶液(50 ml x 2回)、飽和食塩水(50 ml)、5%炭酸水素ナトリウム水溶液(50 ml x 2回)、飽和食塩水(50 ml)で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、硫酸マグネシウムを濾過して除き、濾液を減圧濃縮してBoc−Abu−GlyA−OBzl(9.47 g, 28.1 mmol)を粘性の油状物として得た。
上記H−Abu−GlyA−OBzl・HCl及びZ−Glu−OBzl(10.47 g, 28.1 mmol)を塩化メチレン(100 ml)に溶解し、溶液を0℃に保った。トリエチルアミン(4.30 ml, 30.9 mmol)、HOBt(4.74 g, 30.9 mmol)及びWSC・HCl(5.95 g, 30.9 mmol)を溶液に加え、室温で二夜撹拌した。反応液を減圧濃縮し、残渣を加熱した酢酸エチル(200 ml)に溶解した。溶液を水(50 ml)、5%クエン酸水溶液(150 ml x 2回)、飽和食塩水(50 ml)、5%炭酸水素ナトリウム水溶液(50 ml x 2回)、飽和食塩水(50 ml)で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、硫酸マグネシウムを濾過して除き、濾液を減圧濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製してZ−Glu(Abu−GlyA−OBzl)−OBzl(11.20 g,19.0 mmol)を粘性の油状物として得た。
1H−NMR(400MHz, D2O)δ(ppm):0.86 (3H, t, J=7.40 Hz), 1.60−1.74 (1H, m), 1.82−1.88 (1H, m), 2.04−2.12 (2H, m), 2.45 (2H, t, J=7.40 Hz), 3.79 (1H, t, J=6.36 Hz), 4.31−4.45 (1H, m), 4.57 (2H, s).
Boc−Abu−OHの代わりにBoc−Val−OHを用いる以外は、実施例7と同様にしてγ−Glu−Val−GlyAを白色粉末として77.5%の収率で得た。
1H−NMR(400MHz, D2O)δ(ppm):0.90 (6H, t, J=6.52 Hz), 2.05−2.15 (2H, m), 2.15−2.25 (1H, m), 2.45−2.50 (2H, m), 3.80 (1H, t, J=6.52 Hz), 4.36 (1H, t, J=5.64 Hz), 4.61(2H, s).
Boc−Abu−OHの代わりにBoc−tLeu−OHを用いる以外は、実施例7と同様にしてγ−Glu−Val−GlyAを白色粉末として73.4%の収率で得た。
1H−NMR(400MHz, D2O)δ(ppm):0.94 (9H, s), 2.03−2.10 (2H, m), 2.45−2.50 (2H, m), 3.78 (1H, t), 4.26 (1H, s), 4.60 (2H, s).
Benzyl Glycolate(H−GlyA−OBzl)の代わりにBenzyl (S)−Lactate(H−LacA−OBzl)を用いる以外は、実施例7と同様にしてγ−Glu−Abu−LacAを白色粉末として99.0%の収率で得た。
1H−NMR(400MHz, D2O)δ(ppm):0.91 (3H, t, J=7.40 Hz), 1.40 (3H, d, J=7.08 Hz), 1.60−1.75 (1H, m), 1.80−1.90 (1H, m), 2.00−2.12 (2H, m), 2.40−2.45 (2H, m), 3.74−3.78 (1H, m), 4.25−4.29 (1H, m), 4.89−4.95 (1H, m).
Boc−Abu−OHの代わりにBoc−Val−OHを、Benzyl Glycolate(H−GlyA−OBzl)の代わりにBenzyl (S)−Lactate(H−LacA−OBzl)を用いる以外は、実施例7と同様にしてγ−Glu−Val−LacAを白色粉末として78.0%の収率で得た。
1H−NMR(400MHz, D2O)δ(ppm):0.85−0.92 (6H, m), 1.42 (3H, d, J=7.08 Hz), 2.02−2.11 (3H, m), 2.18−2.25 (1H, m), 2.42−2.50 (2H, m), 3.78 (1H, t, J=6.36 Hz), 4.20−4.31 (1H, m), 4.91−4.97 (1H, m).
Boc−Abu−OHの代わりにBoc−tLeu−OHを、Benzyl Glycolate(H−GlyA−OBzl)の代わりにBenzyl (S)−Lactate(H−LacA−OBzl)を用いる以外は、実施例7と同様にしてγ−Glu−tLeu−LacAを白色粉末として55.0%の収率で得た。
1H−NMR(400MHz, D2O)δ(ppm):0.96 (9H, s), 1.42 (3H, d, J=7.08 Hz), 2.05−2.10 (2H, m), 2.40−2.50 (2H, m), 3.73−3.78 (1H, m), 4.19 (1H, s), 4.90−5.00 (1H, m).
カルシウム受容体の活性化作用の評価には、アフリカツメガエル卵母細胞発現系を用いたCa濃度イオン依存性Clイオン電流測定法を用いた。カルシウム受容体を発現させたアフリカツメガエル卵母細胞に、各活性化剤を添加すると、細胞内のCaイオンが増加する。次にCa濃度イオン依存性Clチャネルが開き、イオン電流として細胞内電流値が変化する。この細胞内電流値の変化を測定することで、カルシウム受容体の活性化作用の有無を知り得ることができる。
実施例13に記載した方法を用い、カルシウム受容体に対するカルシウムの活性化作用を評価した。すなわち、カルシウム受容体のcRNAもしくは滅菌水を注入した卵母細胞を調製し、2電極膜電位固定法により−70mVに膜電位固定した。膜電位固定された卵母細胞に、カルシウム(2mM、5mM、10mM、20mM)を添加し、Ca濃度イオン依存性Cl応答電流を測定した。結果は図1に示した。この結果より、卵母細胞に注入したカルシウム受容体のcRNAが機能的に発現していることが確認された。また、水を注入した卵母細胞は、高い濃度のカルシウムにも反応していないことから、卵母細胞自身にはカルシウム受容体が発現していないことが確認された。
実施例13に記載した方法を用い、カルシウム受容体に対するL型アミノ酸の活性化作用を評価した。すなわち、カルシウム受容体のcRNAもしくは滅菌水を注入した卵母細胞を調製し、2電極膜電位固定法により−70mVに膜電位固定した。膜電位固定された卵母細胞に、アラニン(10mM)、アルギニン(10mM)、アスパラギン(10mM)、アスパラギン酸(10mM)、システイン(10mM)、グルタミン(10mM)、グルタミン酸(10mM)、グリシン(10mM)、ヒスチジン(10mM)、イソロイシン(10mM)、ロイシン(10mM)、リジン(10mM)、メチオニン(10mM)、フェニルアラニン(10mM)、プロリン(10mM)、セリン(10mM)、トレオニン(10mM)、トリプトファン(10mM)、チロシン(10mM)、バリン(10mM)、オルニチン(10mM)、タウリン(10mM)、又はヒドロキシプロリン(10mM)を添加し、Ca濃度イオン依存性Cl応答電流を測定した。結果は図2に示した。この結果より、システイン、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンがカルシウム受容体に対する明瞭な活性化作用を有することが示された。なお、上記アミノ酸についてはProc Natl Acad Sci U S A. 2000 Apr 25;97(9):4814−9で活性化作用が報告されている。
実施例13に記載した方法を用い、カルシウム受容体に対するD−システインの活性化作用を評価した。すなわち、カルシウム受容体のcRNAもしくは滅菌水を注入した卵母細胞を調製し、2電極膜電位固定法により−70mVに膜電位固定した。膜電位固定された卵母細胞に、D−システイン(10mM)、L−システイン(10mM)、D−トリプトファン(10mM)又はL−トリプトファン(10mM)を添加し、Ca濃度イオン依存性Cl応答電流を測定した。結果は図3に示した。この結果より、D−システインがカルシウム受容体に対する明瞭な活性化作用を有することが示された。
実施例13に記載した方法を用い、カルシウム受容体に対するペプチドの活性化作用を評価した。すなわち、カルシウム受容体のcRNAもしくは滅菌水を注入した卵母細胞を調製し、2電極膜電位固定法により−70mVに膜電位固定した。膜電位固定された卵母細胞に、γ−Glu−Cys−Gly(50μM)、γ−Glu−Cys(SNO)−Gly(50μM)、γ−Glu−Ala(50μM)、γ−Glu−Gly(500μM)、γ−Glu−Cys(50μM)、γ−Glu−Met(500μM)、γ−Glu−Thr(50μM)、γ−Glu−Val(50μM)、γ−Glu−Orn(500μM)、Asp−Gly(1mM)、Cys−Gly(1mM)、Cys−Met(1mM)、Glu−Cys(50μM)、Gly−Cys(500μM)、Leu−Asp(1mM)を添加し、Ca濃度イオン依存性Cl応答電流を測定した。結果は図4に示した。この結果より、上記ペプチドは、カルシウム受容体に対する活性化作用を有することが示された。
実施例17と同様に、カルシウム受容体に対するペプチドの活性化作用を評価した。膜に電位固定された卵母細胞に、表1の各ペプチドについて、1000μM、300μM、100μM、30μM、10μM、3μM、1μM、0.3μM、0.1μMを添加し、Ca濃度イオン依存性Cl応答電流を測定した。電流が検出された最低濃度を表1に活性として示した。この結果より、これら32種類のペプチドは、カルシウム受容体に対する活性化作用を有することが明らかとなった。
Balb/cマウスに抗癌剤を投与して下痢を誘導し、γ−Glu−Val−Gly(以下、「γEVG」という)の下痢抑制効果を検討した。低蛋白質栄養食(4% Casein食)を一週間与えた6週齢のBalb/cマウスに対して、5-FU(1mg/匹/日)を3日間連続で腹腔内投与した。下痢症状は3回目の抗癌剤投与から5日目頃から発症し、7日目には全例下痢症状を呈した。下痢の有無は尾根部の便の付着の有無で判定した。統計検定は、コントロール群に対するχ2検定(下痢の有無)を用い、p<0.05を有意差ありとした。
コントロール群では全例(10/10)のマウスで下痢症状が認められたのに対し、0.01%γEVG投与群では5匹中2匹のマウスに下痢症状が見られなかった。以上の結果は、γEVGが抗癌剤誘発下痢モデルにおいて有意な下痢治療効果を有することを示す。
雄性ICRマウス(5週齢)を用いた。マウスに0.5 %カルボキシメチルセルロース水溶液に溶解させたγEVGを経口投与し、1時間後に5-HTP(5−ヒドロキシトリプトファン、10mg/kg, 5ml/kg)を皮下投与した。30分後、便性状のスコア(0:正常便あるいは便なし、1:下痢あるいは軟便)を測定した。対照として、薬物を含まないビークル(vehicle; 0.5 %カルボキシメチルセルロース水溶液)をマウスに投与した。
<方法>
ペントバルビタール麻酔下にて雄性SD(IGS)ラットの腹部より盲腸、大腸を取り出し、盲腸直下から5cmを結紮し大腸ループを作製した。ループ作製直後にPGE2(4μg/ml/kg、SIGMA)を腹腔内投与し、30分後に作製したループ内へ2mlのタイロード溶液(NaCl 136.9mM、KCl 2.7mM、CaCl2・2H2O 1.8mM、MgCl2・6H2O 1.04mM、NaH2PO4・2H2O 0.04mM、NaH2PO4・2H2O 0.04mM、Glucose 5.55mM、NaHCO3 11.9mM)に溶解させた薬物を注入した(薬液はpH6.5〜7.5に調整)。対照として、薬物を含まないタイロード溶液(ビークル)を投与した。1時間後にループ重量、ループ内の液を除いた重量とループ面積を測定することで、ループ内に残存した単位面積当たりの液重量を算出した。。
単位面積当たりの残存液量(g/cm2)=(ループ重量−液を除去したループ重量) / ループの面積
抑制率(%)=100−(薬物投与下の単位面積当たりの残存液量−ベースの単位面積当たりの残存液量(平均))/(ビークル投与下の単位面積当たりの残存液量(平均)−ベースの単位面積当たりの残存液量(平均))×100。
(ベース=無刺激時(PGE2無処置)
Balb/cマウスに抗癌剤を投与して下痢を誘導し、カルシウム受容体活性化剤(以下、「CaSRアゴニスト」という)の下痢抑制効果を検討した。低蛋白質栄養食(4% Casein食)を一週間与えた6週齢のBalb/cマウスに対して、5-FU(1mg/匹/日)を3日間連続で腹腔内投与した。下痢症状は3回目の抗癌剤投与から5日目頃から発症し、7日目には全例下痢症状を呈した。下痢の有無は尾根部の便の付着の有無で判定した。統計検定は、コントロール群に対するχ2検定(下痢の有無)を用い、p<0.05を有意差ありとした。
CaSRアゴニストは自由飲水にて低蛋白質栄養食と同時に投与を開始し、実験終了まで継続した。
実施例2、実施例6〜10で合成した各種ペプチドについて、活性を以下のように測定した。特許文献WO2007/055393A1の実施例1に記載の方法で得られたヒトCaSRのcDNAをCMVプロモーターを有する動物細胞用発現ベクターに組み込み、最大細胞密度の約70%に増殖したHEK293細胞にFuGINE6(ロシュ社)を用いて遺伝子導入した。4〜48時間培養した後、96ウェルプレートに0.6〜1.0×105細胞/ウェルの細胞を播種し、1日培養した後、細胞をCalcium 3 アッセイキットで染色し、FLEXSTATION(モレキュラーデバイス社、インストラクションマニュアル)を用いたカルシウムイメージング法でCaSRアゴニストペプチドの活性の有無を確認した。更に、用量特性曲線から最大活性の50%を与える濃度をEC50として求めた。
Claims (9)
- カルシウム受容体活性化作用を有する化合物を含む下痢の予防又は治療剤。
- 前記ペプチドが、γ−Glu−X−Gly(Xはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す)、γ−Glu−Val−Y(Yはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す)、γ−Glu−Ala、γ−Glu−Gly、γ−Glu−Cys、γ−Glu−Met、γ−Glu−Thr、γ−Glu−Val、γ−Glu−Orn、Asp−Gly、Cys−Gly、Cys−Met、Glu−Cys、Gly−Cys、Leu−Asp、γ−Glu−Met(O)、γ−Glu−γ−Glu−Val、γ−Glu−Val−NH2、γ−Glu−Val−ol、γ−Glu−Ser、γ−Glu−Tau、γ−Glu−Cys(S−Me)(O)、γ−Glu−Leu、γ−Glu−Ile、γ−Glu−t−Leuおよびγ−Glu−Cys(S−Me)、からなる群から選択される1種または2種以上である、請求項2に記載の下痢の予防又は治療剤。
- 前記XがCys(SNO)、Cys(S−allyl)、Gly、Cys(S−Me)、Cys、Abu、t−Leu、Cle、Aib、PenまたはSerであり、前記YがGly、Val、Glu、Lys、Phe、Ser、Pro、Arg、Asp、Met、Thr、His、Orn、Asn、CysまたはGlnである、請求項3に記載の下痢の予防又は治療剤。
- 前記ペプチドが、γ−Glu−Val−Glyまたはγ−Glu−tLeu−Glyである、請求項3又は4に記載の下痢の予防又は治療剤。
- 前記ペプチド誘導体が、下記式(3)の構造を有するペプチド誘導体である、請求項2に記載の下痢の予防又は治療剤。
γ−Glu−X−OCH(Z)CO2H ・・・(3)
(式中、Xはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表し、ZはH又はCH3を表す。) - 下記式(3)の構造を有する化合物。
γ−Glu−X−OCH(Z)CO2H ・・・(3)
(式中、Xはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表し、ZはH又はCH3を表す。) - 前記式(3)において、XがtLeuまたはAbuである、請求項7に記載の化合物。
- γ−Glu−tLeu−Glyで表される化合物。
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