JPWO2008133075A1

JPWO2008133075A1 - 活性化免疫細胞の検出方法

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Publication number: JPWO2008133075A1
Application number: JP2008520458A
Authority: JP
Inventors: 山本　健二; 健二山本; 昭芳星野; 和男鈴木
Original assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 2007-04-12
Filing date: 2008-04-14
Publication date: 2010-07-22
Also published as: WO2008133075A1

Abstract

本発明の目的は、活性化により免疫細胞の表面に表出したタンパク質を高感度に検出することができる活性化免疫細胞の検出方法を提供することである。本発明は、量子ドットを蛍光プローブとする抗体を用いて、活性化により免疫細胞の表面に表出したタンパク質を検出する活性化免疫細胞の検出方法である。

Description

本発明は、活性化により免疫細胞の表面に表出したタンパク質を高感度に検出することができる活性化免疫細胞の検出方法に関する。

例えば、免疫細胞の一種である好中球は、微生物等の病原体が侵入し、感染症を起こした場合、この病原体を取り込み、その細胞内に存在するミエロペルオキシターゼ（ＭＰＯ）によって殺菌する機能を有する（非特許文献１）。ところが、川崎病や急速進行性糸球体腎炎等を初めとする血管炎の患者は、発病初期からＭＰＯに対する抗好中球細胞質自己抗体（ＭＰＯ−ＡＮＣＡ）を有することが知られており、これが診断基準の必要要件の一つに挙げられている（非特許文献２）。健常者の血液や健常なマウスの血液等に含まれる好中球は不活性な状態であるが、血管炎等を発病した患者の好中球は、細胞内に存在していたＭＰＯが細胞表面に表出した活性化状態にあるのではないかと考えられている。また、健常者の好中球であっても、白血球走化因子（ｆＭＬＰ）等で刺激を与えることで活性化するものと考えられている。
このような免疫細胞の活性化による特定のタンパク質の表出は、好中球のみならず、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞等の免疫細胞の多くに見られる現象であると考えられる。

血管炎に対する治療としては、従来、ステロイド剤や抗炎症剤等による薬物治療や、γグロブリン療法等の免疫治療法が行われている。しかし、γグロブリン療法等による治療が有効で症状が緩解した場合であっても、ＭＰО−ＡＮＣＡが陽性のままであることがあった。そのため、診断と治療の有効性についての評価のためには、その病態を反映する活性化免疫細胞の検査方法が求められていた。

しかしながら、活性化免疫細胞の検出を行うのは極めて困難であるのが現状であった。検査方法としては、例えば、活性化細胞上の指標タンパク質に特異的に結合する分子認識物質を蛍光体等のマーカー物質に結合した分子認識体を用いて検出する蛍光顕微鏡法等が考えられる。ところが、従来用いられていた蛍光体等のマーカー物質は、発光効率が低く感度の点で満足できるものではなかったことに加え、活性化免疫細胞に結合させようとすると光退色を起こしてしまうという問題があった。
ＡｒａｔａｎｉＹ，ＫｕｒａＦ，ＷａｔａｎａｂｅＨ，ＡｋａｇａｗａＨ，ＴａｋａｎｏＹ，ｅｔａｌ．２００２．ＪＩｎｆｅｃｔＤｉｓ１８５：１８３３−７ＧｒｏｓｓＷＬ，ＳｃｈｍｉｔｔＷＨ，ＣｓｅｒｎｏｋＥ．１９９３．ＣｌｉｎＥｘｐＩｍｍｕｎｏｌ９１：１−１２

本発明は、上記現状に鑑み、活性化により免疫細胞の表面に表出したタンパク質を高感度に検出することができる活性化免疫細胞の検出方法を提供することを目的とする。

本発明は、量子ドットを蛍光プローブとする抗体を用いて、活性化により免疫細胞の表面に表出したタンパク質を検出する活性化免疫細胞の検出方法である。
以下に本発明を詳述する。

フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）やフェコエリトリン（ＰＥ）のような従来の有機蛍光体プローブは、活性化免疫細胞に結合させると、活性化免疫細胞から生じる活性酸素種の働きによって光退色を起こしていたものと考えられる。本発明者らは、鋭意検討の結果、蛍光プローブとして量子ドット（ＱｕａｎｔｕｍＤｏｔ：ＱＤ）を結合した抗体を用いれば、極めて高い発光効率で活性化により細胞表面に表出したタンパク質を高感度に検出することができることを見出し、本発明を完成するに至った。これは、量子ドットは有機蛍光体に比べて発光効率自体が高いことに加え、活性酸素種によっても変性されることなく光退色を起こさないためと考えられる。

本発明の活性化免疫細胞の検出方法となる免疫細胞としては、例えば、好中球、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞等が挙げられる。また、上記免疫細胞としては、ヒト細胞の他にもマウス等の哺乳類の細胞も対象となり得る。
本願明細書において活性化免疫細胞とは、疾患により、又は、健常人であっても刺激を与えることにより、正常な状態にあっては細胞の内側に存在する特定のタンパク質が免疫細胞の表面に表出した状態をいう。

例えば、好中球にあっては、血管炎等を発病した場合や白血球走化因子（ｆＭＬＰ）等で刺激を与えることにより、ミエロペルオキシターゼ（ＭＰＯ）が好中球の表面に表出して活性化好中球となる。
Ｔ細胞は、Ｔ細胞レセプター刺激によりＦａｓリガンドがＴ細胞の表面に表出して活性化Ｔ細胞となる。これによりＦａｓ／Ｆａｓリガンドを介して細胞のアポトーシスを誘導するものと考えられる。
Ｔ細胞は、刺激によりＣＤ６９がＴ細胞の表面に表出して活性化Ｔ細胞となる。これによりリュウマチが誘導されると考えられている。
好中球やマクロファージは、刺激によりＣＤ６９やｆＭＬＰレセプター、ＴＮＦαレセプターが細胞の表面に表出して活性化好中球、活性化マクロファージとなる。
樹状細胞は、抗原による刺激により該抗原の部分構造を細胞の表面に提示して活性化樹状細胞となる。活性化樹状細胞はＢ細胞に対応する抗体産生を誘導する等、免疫系細胞の活性化を行う。

また、例えば、好中球やマクロファージ等の免疫細胞の膜表面には７回膜貫通型Ｇ蛋白質共役型タンパク質であるケモカインレセプターが表出している。ケモカイン（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）は細胞遊走活性（ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ）を有するサイトカインであり、現在までに５０以上のケモカインが同定されている。ケモカインがケモカインレセプターと結合すれば特定の組織に特定の炎症細胞が集積し活性化され、やがて局所に特異的炎症が起こることが知られている。例えばマクロファージでは、ケモカインレセプターの中の一つのサブグループであるＣＣケモカインレセプター（例えば、ＣＣＲ１（ケモカインレセプター１）〜ＣＣＲ１０（ケモカインレセプター１０）等）が表出している。
骨髄で生成したときのマクロファージでは、ほとんどすべてのＣＣケモカインレセプターが細胞膜の表面に表出している。その後、マクロファージは肺、脳、骨、肝臓等の臓器に移動して、臓器特異的マクロファージに成熟して各々の機能を発現する。臓器特異的マクロファージにおいては、各臓器に対応した特異的なＣＣケモカインレセプターのみが細胞膜上に表出し、他のＣＣケモカインレセプターは細胞膜上から消失する。例えば、腹腔マクロファージにおいてはＣＣＲ８のみが表出しており、手術後の癒着に関係することが知られている。また、骨におけるマクロファージ（破骨細胞）においてはＣＣＲ１とＣＣＲ５のみが表出しており、骨粗鬆症との関連が知られている。特異的なＣＣケモカインレセプターは、その各々の臓器において正常機能を維持するために極めて重要な役割を担っていると考えられる。このような特異的なＣＣケモカインレセプターの表出もまた、活性化の１種であると考えられる。「活性化マクロファージ」の細胞膜上に表出した特異的なＣＣケモカインレセプターを検出することは、マクロファージの正常な機能発現を評価するうえで極めて重要である。

本願発明の活性化免疫細胞の検出方法では、このように活性化により免疫細胞の表面に表出したタンパク質（ＭＰＯ、Ｆａｓリガンド、ＣＤ６９、ｆＭＬＰレセプター、ＴＮＦαレセプター、樹状細胞表面に提示された抗原の部分構造等）に特異的に結合する抗体に、蛍光プローブとして量子ドットを結合したものを用いることを特徴とする。例えば、活性化好中球の検出においては、抗ミエロペルオキシターゼ抗体（以下、抗ＭＰＯ抗体ともいう）に結合した量子ドット（以下、抗ＭＰＯ抗体結合量子ドットともいう）を分子認識体として用いる。
以下、抗ＭＰＯ抗体結合量子ドットを用いた活性化好中球の検出を例として、本発明を更に詳しく説明する。なお、量子ドットを蛍光プローブとする抗ミエロペルオキシターゼ抗体を用いて、活性化好中球の表面に表出したミエロペルオキシターゼを検出する活性化好中球の検出方法もまた、本発明の１つである。

本明細書において量子ドットとは、結晶からなる量子サイズ効果をもつ大きさの粒子（通常１０ｎｍ以下）であって、量子サイズ効果の大きなバンドギャップにより蛍光発光（紫外〜赤外領域）するナノ粒子を意味する。
上記量子ドットは、励起光照射により蛍光を発する粒子であり、本発明では、分子認識発光性微粒子のマーカー物質となる粒子である。このような量子ドットを構成する物質としては特に限定されず、例えば、Ｉ族、ＩＩ族、ＩＩＩ族、ＩＶ族、Ｖ族、ＶＩ族、ＶＩＩ族の化合物等が挙げられる。具体的には、例えば、ＣｕＣｌ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＭｇＴｅ、ＧａＡｓ、ＧａＰ、ＧａＳｂ、ＧａＮ、ＨｇＳ、ＨｇＳｅ、ＨｇＴｅ、ＩｎＡｓ、ＩｎＰ、ＩｎＳｂ、ＩｎＮ、ＡｌＡｓ、ＡｌＰ、ＡｌＳｂ、ＡｌＳ、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、Ｇｅ、Ｓｉ等、又は、これらのアロイ材料等が挙げられる。中でも、ＣｕＣｌ等のＩ−ＶＩＩ族化合物半導体、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ等のＩＩ−ＶＩ族、ＩｎＡｓ等のＩＩＩ−Ｖ族化合物半導体、Ｓｉ、Ｇｅ等のＩＶ族半導体からなる半導体結晶が好適である。
上記量子ドットを構成するその他の物質としては、例えば、ＴｉＯ_２等の金属酸化物、フタロシアニン、アゾ化合物等の有機化合物等も好適に用いられる。

上記ＩＶ族半導体からなる半導体結晶としては、例えば、ＩＶ族の元素とハロゲン元素とからなるメタルハライド化合物が好ましい。
上記メタルハライド化合物としては、例えば、シリコン化合物、ゲルマニウム化合物、チタン化合物等が挙げられる。具体的には、例えば、ＳｉＣｌ_４、ＧｅＣｌ_４、ＴｉＣｌ_４、ＳｉＢｒ_４、ＧｅＢｒ_４、ＴｉＢｒ_４、ＳｉＩ_４、ＧｅＩ_４、ＴｉＩ_４等が挙げられる。
上記量子ドットの原料は単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。２種以上を併用した場合、これらのアロイ材料を得ることが可能となる。

上記量子ドットの粒子構造としては特に限定されず、例えば、単一又は２種以上の材料を混合或いはアロイ化した単粒子、単粒子の表面にシェル構造を設けたコアシェル構造、シェルを多層化した多層シェル構造等が挙げられる。

上記コアシェル構造としては、例えば、ＣｄＳをコア−ＣｄＳｅをシェル、ＣｄＳｅをコア−ＣｄＳをシェル、ＣｄＳをコア−ＺｎＳをシェル、ＣｄＳｅをコア−ＺｎＳをシェル、ＣｄＳｅのナノ結晶をコア−ＺｎＳをシェル、ＣｄＳｅのナノ結晶をコア−ＺｎＳｅをシェル、Ｓｉをコア−ＳｉＯ_２をシェルとするコア−シェル構造を有するもの等が挙げられる。

上記量子ドットとしては、本発明の目的を損なわない範囲であれば、表面を化学的又は物理的に修飾されたものであってもよく、また、界面活性剤、分散安定剤又は酸化防止剤等の添加剤を加えたものであってもよい。このような量子ドットは、コロイド化学的な方法、例えば、逆ミセル法（Ｌｉａｎｏｓ，Ｐ．ｅｔａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．，１２５，２９９（１９８６））やホットソープ法（Ｐｅｎｇ，Ｘ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１９，７０１９（１９９７））等によって合成することができる。

上記量子ドットの粒子径としては特に限定されないが、通常、好ましい下限は０．５ｎｍ、好ましい上限は１００ｎｍである。この範囲内であると、充分な蛍光強度や水系溶媒中での分散安定性を得ることができる。より好ましい下限は１ｎｍ、より好ましい上限は５０ｎｍ、更に好ましい上限は１０ｎｍである。

上記量子ドットは、正又は負の電荷を有していることが好ましい。正又は負の電荷を有することにより、例えば、静電引力によって上記量子ドットを用いてなる分子認識発光性微粒子を、標的物質である活性化好中球に好適に結合させることができる。また、上記量子ドット同士は、静電反発することから凝集することを防止することができるとともに、活性化好中球へ結合させる際に上記量子ドット同士が重なって結合することを防止することができる。

上記量子ドットに正又は負の電荷を帯電させる方法としては特に限定されず、例えば、上記量子ドットに正又は負の電荷を有する材質を用いる方法や、後述する方法で抗ＭＰＯ抗体を量子ドット表面に結合する際に、量子ドット表面を処理する化合物として正又は負の電荷を有する化合物を用いる方法等が挙げられる。

上記量子ドットは、本発明の目的を損なわない範囲であれば、界面活性剤、分散安定剤又は酸化防止剤等の添加剤を加えたものであってもよい。

上記量子ドットは、励起光照射によって高輝度の蛍光（フォトルミネッセンス）を発し、微量成分の高感度測定に好適に用いることができる。上記量子ドットは、粒子径を制御することで励起光照射により励起して発する蛍光を変化させることができる。すなわち、上記量子ドットの粒子径が大きくなるほど、蛍光波長は長波長側（赤外側）にシフトし、逆に上記量子ドットの粒子径が小さくなるほど、蛍光波長は短波長側（紫外側）にシフトする。粒子径の異なる量子ドットを目的に応じて使い分けることにより、発光スペクトルを任意に調節したり設計したりすることが可能であり、より精密な測定への応用を図ることができる。

本発明による活性化好中球の検出方法に用いる抗ＭＰＯ抗体結合量子ドットを製造する方法としては特に限定されないが、図１の概略図に示した方法が好適である。このような製造方法によって得られた抗ＭＰＯ抗体結合量子ドットは、抗原を認識する機能及びＦｃレセプター結合機能等を含む抗体としての機能を保持していることから、本発明の活性化免疫細胞の検出方法に好適に用いることができる。

図１に示した抗ＭＰＯ抗体結合量子ドットの製造方法は、量子ドット表面を親水化した後、システインでコートする工程（１）（Ｓｔｅｐ１）を有する。
上記量子ドット表面を親水化する方法としては特に限定されないが、上記量子ドット表面をカルボキシル基でキャップする方法が好適である。
上記量子ドット表面をカルボキシル基でキャップする方法としては、具体的には、例えば、以下の方法が好適に用いられる。

すなわち、上記量子ドットの原料物質を、トリ−ｎ−オクチルホスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）等を含有する配位溶媒中に分散させ、上記原料物質の微粒子をＴＯＰＯでミセル化（ＴＯＰＯミセル）する。
次いで、ＴＯＰＯミセルをアルゴンガス封入条件下で加熱してＴＯＰＯミセル内の原料物質の微粒子を成長させ、表面にＴＯＰＯが固定された量子ドット（ＴＯＰＯ固定量子ドット）を作製する（ホットソープ法）。なお、このとき作製する量子ドットの粒子径を制御することで、励起光照射により発する蛍光の波長を制御することができる。また、この状態の量子ドットは、トルエンやテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）等の有機溶媒に可溶である。
その後、作製したＴＯＰＯ固定量子ドットをＴＨＦに溶解させ、そこに、例えば、トリ−ｎ−オクチルホスフィンオキシド等のプロパン酸を加えて加温、還流後（チオール変換反応）、ＮａＯＨ水溶液を加え、濾過及びカラム等を用いて未反応物の精製と濃縮とを行うことで、量子ドットの表面がカルボキシル基でキャップされたカルボキシル基固定量子ドットを製造することができる。

上記工程（１）では、上記表面を親水化した量子ドットをシステインでコートする。
上記表面親水化量子ドットをシステインでコートする方法としては特に限定されないが、例えば、上述した方法によりカルボキシル基でキャップされた量子ドットを用いる場合、該カルボキシル基でキャップされた量子ドット溶液を、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）カップリング剤とともにシステイン溶液に加えて混合する方法が好適に用いられる。

図１に示した抗ＭＰＯ抗体結合量子ドットの製造方法は、システインでコートした量子ドットの表面に、抗ミエロペルオキシターゼ抗体（抗ＭＰО抗体）を結合する工程（２）（Ｓｔｅｐ２）を有する。
上記抗ＭＰＯ抗体としては特に限定されず、従来公知の手段により得られるものを用いることができる。具体的には、例えば、マウスＣ５７ＢＬ／６株から得られたＭＰＯ欠損マウスにヒトＭＰＯのリコンビナントで免疫し、このマウスから得た血液をＤＥＡＥカラム、ＣＭセファロースカラムで精製したものを、７０％硫酸アンモニウムで濃縮し、ＨＰＬＣにてＣＭセファロースカラムで更に精製することにより得ることができる。

上記システインでコートした量子ドットの表面に抗ＭＰＯ抗体を結合する方法としては特に限定されないが、例えば、カラムにて遊離アミノ酸を除去した後、Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−ｔｒａｎｓ−４−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ）カップリング剤等を用いて上記抗ＭＰＯ抗体を量子ドット表面に結合させる方法が好適に用いられる。

本発明で用いる抗ＭＰＯ抗体結合量子ドットにおいて、上記量子ドットの表面に結合する抗ＭＰО抗体の量としては特に限定されないが、好ましい下限は１Ａｂｓ、好ましい上限は１００Ａｂｓである。１Ａｂｓ未満であると、活性化好中球に対する結合能が低いことがあり、１００Ａｂｓを超えると、蛍光発光が探知できなくなることがある。より好ましい上限は１０Ａｂｓである。

上記量子ドットに結合した抗ＭＰＯ抗体は、例えば、四酸化オスミウムの逆染色法による透過電子顕微鏡観察により視覚的に確認することができる。また、量子ドット表面の抗ＭＰＯ抗体数は、例えば、ブラットフォード試薬を用いたアミノ酸含有量の測定により確認することができる。

本発明の活性化免疫細胞の検出方法では、上記量子ドットを蛍光プローブとする抗体を用いて、活性化により免疫細胞の表面に表出したタンパク質を検出する。例えば、上記量子ドットに結合した抗ＭＰＯ抗体を、血管炎等の疾患により、又は、健常人であっても刺激を与えることによりＭＰＯが細胞表面に表出した活性化好中球に作用させると、該細胞表面のＭＰＯに結合する。このようにして活性化好中球に結合させた抗ＭＰＯ抗体結合量子ドットを発光させることで、活性化好中球を検出することができる。検出には顕微鏡等を用いた目視による観察の他、量子ドットの蛍光強度等を数値化して定量的に行うこともできる。具体的には例えば、蛍光ウエスタンブロット法、組織化学的分析等の従来公知の方法により行うことができる。

健常者の血液や健常なマウスの血液等に含まれる免疫細胞は不活性な状態であるが、疾患により活性化される。本発明の活性化免疫細胞の検出方法によれば、このような疾患の診断や治療の有効性についての評価に極めて有効である。例えば、川崎病や急速進行性糸球体腎炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、ビュルガー病、チャーグストラウス症候群（ＣＳＳ）、結節性多発性動脈炎（ＰＮ）、顕微鏡的多発性血管炎（ＭＰＡ）等の血管炎等の診断や治療の有効性についての評価には、上記抗ＭＰＯ抗体結合量子ドットを用いた活性化好中球の検出方法が有効である。

免疫細胞の活性化は、種々の刺激物質による刺激よっても起こり得る。例えば、健常者から採集した不活性な好中球に対して白血球走化因子（ｆＭＬＰ）等による刺激を付与することにより活性化させることができ、その活性化の状態を上記抗ＭＰＯ抗体結合量子ドットを用いた活性化好中球の検出方法により検出することも可能である。このような研究は、免疫系の異常による疾患の発症機構の解明や、これらの疾患に対する医薬の開発等に重要である。

本発明の活性化免疫細胞の検出方法では、量子ドットを蛍光プローブとする抗体を用いることにより、活性化した免疫細胞の表面であっても光退色することなく高い発光を得ることができる。これにより、活性化免疫細胞を高感度で視覚的に検出することができる。
本発明によれば、活性化により免疫細胞の表面に表出したタンパク質を高感度に検出することができる活性化免疫細胞の検出方法を提供できる。

以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。

（実施例１）
（１）抗ＭＰＯ抗体結合量子ドットの調製
（ａ）量子ドットの作製
アルゴン気流下、トリ−ｎ−オクチルホスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）７．５ｇに、ステアリン酸２．９ｇ、ｎ−テトラデシルホスホン酸６２０ｍｇ、酸化カドミニウム２５０ｍｇ、を加え３７０℃に加熱混合した。
これを２７０℃まで自然冷却させた後、予めトリブチルフォスフィン２．５ｍＬにセレン２００ｍｇを溶解させた溶液を加え、減圧乾燥し、ＴＯＰＯで被覆されたＣｄＳｅ微粒子を得た。
得られたＣｄＳｅ微粒子に、ＴＯＰＯを１５ｇ加え加熱し、引き続き２７０℃でトリオクチルホスフィン１０ｍＬにＺｎ（Ｓ_２ＣＮＥｔ_２）１．１ｇを溶解した溶液を加え、表面にＴＯＰＯが固定されたＣｄＳｅのナノ結晶をコア−ＺｎＳをシェルとする量子ドット（平均粒子径７ｎｍ、約６４２ｎｍの赤色蛍光発色）を作製した。

作製した表面にＴＯＰＯが固定された量子ドット５０ｍｇを、４ｍＬフラスコ中でテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）１ｍＬに溶解させ、３−メルカプトプロパン酸（シグマアルドリッチ社製）２５μＬ加えた８５℃、２４時間反応させた。
その後、混濁液を集めて最大速度の遠心分離機にかけて堆積物を得た。得られた堆積物をアセトン洗浄してＴＯＰＯを除去し、水酸化ナトリウム水溶液に溶解させて最大速度の遠心分離機にかけて不溶性残渣を除去し、溶解性量子ドットを含有する浮遊物を捕集した。
得られた溶液をセファデックスカラム（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＭｉｃｒｏＳｐｉｎＧ−２５Ｃｏｌｕｍｎ）で洗浄し、限外濾過膜（ＭｉｃｒｏｃｏｎＹＭ−３：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて濃縮し、減圧蒸留にて粉末化した。

（ｂ）抗ＭＰＯ抗体の調製
マウスＭＰＯのｃＤＮＡを導入した大腸菌から製造した組み換えマウスＭＰＯにより免疫付与することで、多クローン性反組み換えマウスＭＰＯ抗体（ａｎｔｉ−ｒｍＭＰＯＡｂ）を調製した。なお、このａｎｔｉ−ｒｍＭＰＯＡｂは、マウス及びヒトのＭＰＯ分子に対して交差反応できるものであった。

（ｃ）αＭＰＯ−ＱＤの調製
１００μＭの量子ドット溶液を、同体積の１００ｍＭのシステイン溶液に、１００ｍＭの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）カップリング剤（ＰｉｅｒｃｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）共存のもとで、４℃、１時間混合した。Ｎａｐ−５カラム（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて遊離アミノ酸を除去した後、ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣカップリング剤（ＰｉｅｒｃｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いて、量子ドットに１ｍｇの抗体を二次的に結合させ、４℃で２時間超音波分離させた。生成物をｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｃｏｌｕｍｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で精製し、限外濾過膜（ＮＭＷＬ１００ｋＤａ，Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて濃縮し、量子ドット表面に抗ＭＰＯ抗体が結合した分子認識発光性微粒子（αＭＰＯ−ＱＤ）を製造した。その後、０．１μｍ薄膜フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で濾過した。
得られたαＭＰＯ−ＱＤを四酸化オスミウムによる逆染色して透過型電子顕微鏡で観察した。結果を図２に示す。図２（ａ）は、αＭＰＯを結合する前の量子ドットのみの観察結果であり、図２（ｂ）は、αＭＰＯ−ＱＤの観察結果を示す電子顕微鏡写真である。図２（ｂ）より、製造したαＭＰＯ−ＱＤは、ＱＤの表面に紐状物質が観察されており、ＱＤの表明にαＭＰＯが結合していることが確認された。
また、ウシ血清アルブミンの検量線のあるブラッドフォード試薬（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）で測定した量子ドット表面の抗体は、１の量子ドット当たり約８．５Ａｂｓであった。
（ｄ）コントロールＩｇＧ−ＱＤの調製
ａｎｔｉ−ｒｍＭＰＯＡｂに代えて、アイソタイプラビットＩｇＧを用いた以外は、同様の方法により、分子認識発光性微粒子（ＩｇＧ−ＱＤ）を調製し、これをαＭＰＯ−ＱＤに対するコントロールとした。

（２）活性化好中球の検出
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６及び成熟（１３週、オス）ＳＣＧ／Ｋｊ）の腹腔内に８％カゼイン／ＰＢＳ注射をし、３時間経過後腹膜腔からマウス好中球を採集した。
ＭＰＯ−ＡＮＣＡ関連の急速進行性糸球体腎炎患者、及び、健常者からヒト好中球を採集した。ヒト好中球は、ヘパリン化した抹消血をＬＹＭＰＨＯＰＲＥＰ（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ社製）を用いて顆粒球を分離させ、得られた顆粒球を１．５％デキスクラン（２００ｋＤａ）溶液に懸濁させ、残留赤血球をｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ（０．７５％ＮＨ_４Ｃｌ含有２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６））で除去して抽出した。

採集したマウス好中球及びヒト好中球を３７℃のハンクス液（ＨＢＳＳ）で１０分間前培養し、前加熱した１２μｍ厚のシリコン製ゴムウェルプレートで覆われたカバースリップ（松浪ガラス社製）上に１０分間載置した。好中球を炎症性サイトカインによる刺激後、すぐに冷却した１％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳで凝固させ、必要に応じて０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘにて透明化した。その後、１％ウシ血清アルブミン（シグマアルドリッチ社製、Ｃａｔ♯Ａ６００３：血清ＭＰＯ分子を含まない）で３０分間ブロックした後、αＭＰＯ−ＱＤ又はＩｇＧ−ＱＤを作用させた。

活性化好中球の検出は、ウエスタンブロッティング法により、ロングパス（＞６１０ｎｍ）フィルタユニットを備えた蛍光顕微鏡ＩＸ−８１（オリンパス社製）で、冷却ＣＣＤカメラＤＰ−７０（オリンパス社製）を用いて行った。
図３に、結果を示した。図３中、「ＦＭ」は、分子認識発光性微粒子を蛍光性分子量サイズ（８５ｋＤａ）のマーカーに結合させた結果を示し、「Ｍｓ」は、分子認識発光性微粒子を組み換えマウスＭＰＯ（７３ｋＤａ）に結合させた結果を示し、「Ｈｕ」は、分子認識発光性微粒子をヒトＭＰＯ（５９ｋＤａ）に結合させた結果を示す。

次に、ＨＢＳＳ中のヒト好中球（２×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を３７℃でプレインキュベートしたカバースリップ上に接着し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘにて透明化して好中球中のＭＰＯの観察を行った。結果を図４に示した。図４に示したように、αＭＰＯ−ＱＤによって、ＭＰＯ分子が好中球内部に顆粒状に存在していることが明確に視覚化された。一方、ＩｇＧ−ＱＤでは、好中球をほとんど検出できなかった。

（比較例１）
ＱＤに代えてフェコエリトリン（ＰＥ）を用いた以外は、実施例１と同様にしてＰＥを蛍光プローブとする分子認識発光性微粒子（αＭＰＯ−ＰＥ）を調製した。
得られたαＭＰＯ−ＰＥを用いた以外は実施例１と同様にして、ＨＢＳＳ中のヒト好中球（２×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を３７℃でプレインキュベートしたカバースリップ上に接着し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘにて透明化して好中球中のＭＰＯの観察を行った。結果を図５に示した。図５より、αＭＰＯ−ＰＥを用いた場合には、好中球をほとんど検出できないことがわかった。

（実施例２）
実施例１で製造したαＭＰＯ−ＱＤを結合したヒト好中球について、該ヒト好中球に刺激を与えるｆＭＬＰの濃度を変え、好中球表面のＭＰＯ分子量の変化を評価した。
結果を図６に示した。図６より、好中球表面へのＭＰＯの表出は、ｆＭＬＰの濃度が１０^−８Ｍレベルから観察され、ｆＭＬＰ濃度の上昇に伴い増加することが確認された。

（実施例３）
健常者から採取した好中球と急速進行性糸球体腎炎患者から採取した好中球とについて、それぞれ実施例１で製造したαＭＰＯ−ＱＤで染色したものを蛍光顕微鏡観察した。結果を図７に示した。図７中、左列は、健常者から採取した好中球の蛍光顕微鏡写真であり、右列は、急速進行性糸球体腎炎患者から採取した好中球の蛍光顕微鏡写真である。また、上段は、健常者と急速進行性糸球体腎炎患者の好中球にαＭＰＯ−ＱＤを結合した結果を示し、第二段目は、細菌菌体タンパク質ペプチドであるｆＭＬＰで刺激した後に染色した結果を示し、第三段目は、界面活性剤で好中球の細胞膜に穴を開けた後染色をした結果を示し、第四段目は、ＦＭＬＰでの刺激と界面活性剤での細胞膜による穴開けとを併用した好中球の細胞膜を示す。
上段の結果より、患者の好中球は量子ドットによる蛍光が観察された。また、第三段目の結果より、健常者及び患者の両方で蛍光が見られたことから、健常者のＭＰＯは、好中球の細胞内に存在し、患者のＭＰＯは、好中球の表面に存在していることが示唆された。また、第二段目の結果より、健常者及び患者の両方に蛍光が見られたことより、好中球のＭＰＯは、ｆＭＬＰで刺激されると、健常者の場合であっても好中球の表面に移動することが明らかとなった。

（実施例４）
マウス及びヒト好中球の表面のＭＰＯ転位を確認するため、ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウス（ｃｏｎｔｒｏｌ）、好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）による血管炎を発症したマウス、及び、成熟（１３週、オス）したＳＣＧ／Ｋｊマウスの腹腔好中球を用意し、ｆＭＬＰの刺激前、及び、刺激後に、実施例１で製造したαＭＰＯ−ＱＤを作用させた。蛍光顕微鏡による観察結果を図８に示した。

（実施例５）
炎症性サイトカインによる刺激後のヒト好中球のＭＰＯ表面転位を調べた。すなわち、ヒト好中球（２×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を、１μＭのｆＭＬＰ、１ｍｇ／ｍＬのＣＡＷＳ、２０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−α、２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１β、及び、２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−８でそれぞれ１０分間刺激した後、実施例１で製造したαＭＰＯ−ＱＤを作用させた。蛍光顕微鏡による観察結果を図９に示した。

（実施例６）
実施例１で製造したαＭＰＯ−ＱＤ１ｍｇを注射した成熟（１３週、オス）ＳＣＧ／Ｋｊマウスから脾臓、肺、肝臓及び腎臓を取り出し、４μｍの厚さにスライスして蛍光顕微鏡により観察した。結果を図１０に示した。なお図１０中のバーは、２５０μｍを示すスケールである。
更に、腎臓のスライスを拡大して蛍光顕微鏡観察した。比較のため、コントロールＩｇＧ−ＱＤを注射したマウスの腎臓のスライスを蛍光顕微鏡観察した。結果を図１１に示した。なお、図１１中のバーは、５０μｍを示すスケールである。

本発明によれば、活性化により免疫細胞の表面に表出したタンパク質を高感度に検出することができる活性化免疫細胞の検出方法を提供できる。

抗ＭＰＯ抗体結合量子ドットの製造方法の概略図である。実施例１におけるαＭＰＯ結合前のＱＤと、αＭＰＯ−ＱＤの電子顕微鏡写真である。実施例１におけるウエスタンブロッティング法による量子ドットの発光状態を示す電子顕微鏡写真である。実施例１においてαＭＰＯ−ＱＤ、ＩｇＧ−ＱＤをヒト好中球に結合させた電子顕微鏡写真である。比較例１においてαＭＰＯ−ＰＥをヒト好中球に結合させた電子顕微鏡写真である。実施例２の結果を示す電子顕微鏡写真である。実施例３の結果を示す電子顕微鏡写真である。実施例４の結果を示す電子顕微鏡写真である。実施例５の結果を示す電子顕微鏡写真である。実施例６の脾臓、肺、肝臓及び腎臓の電子顕微鏡写真である。実施例６の腎臓スライスを拡大した電子顕微鏡写真である。

Claims

量子ドットを蛍光プローブとする抗体を用いて、活性化により免疫細胞の表面に表出したタンパク質を検出することを特徴とする活性化免疫細胞の検出方法。
量子ドットを蛍光プローブとする抗ミエロペルオキシターゼ抗体を用いて、活性化好中球の表面に表出したミエロペルオキシターゼを検出することを特徴とする活性化好中球の検出方法。