JPWO2008096814A1 - 新規ポリペプチド及びそれを有効成分として含有する抗菌剤 - Google Patents

Abstract

要約優れた抗菌活性を有する新規なポリペプチド及びそれを有効成分として含有する抗菌剤が開示されている。特定のアミノ酸配列を有するポリペプチド及びそれを有効成分として含有する抗菌剤が提供された。優れた抗菌活性を有する新規なポリペプチド及びそれを有効成分として含有する抗菌剤が提供された。この抗菌剤は、褥瘡、創傷、皮膚潰瘍、蜂巣炎、急性リンパ管炎、リンパ節炎、丹毒、皮膚膿瘍、壊死性皮下感染、ブドウ球菌性熱傷様 皮膚症候群（SSSS）、毛包炎、フルンケル、化膿性汗腺炎、カルブンケル（癰）、感染性爪囲炎、紅色陰癬、重症感染症（敗血症）等の疾患の処置のための予防、改善又は治療等に優れた効果を発揮する。

Description

本発明は、新規ポリペプチド及びそれを有効成分として含有する抗菌剤に関する。

抗菌剤の１種として、ポリペプチドから成るポリペプチド系抗菌剤が知られている。ポリペプチド系抗菌剤は、広い抗菌スペクトルを示し、他の種類の抗生物質に対する耐性菌に対しても抗菌活性を示すものが知られている。例えば、αへリックス抗菌ペプチドであるマゲイニン（非特許文献１）やカテリシジン（LL-37）（非特許文献２）等が挙げられる。他にもディフェンシン（非特許文献２）などの抗菌活性を有するペプチドが知られている。さらに近年においても新たなαへリックス抗菌ペプチドが創製されている（特許文献１）。しかし既存の抗生物質に比較するとその抗菌活性は十分とはいえない。そこで、新規な構造を有し、優れた抗菌活性を有する新規なポリペプチド系抗菌剤が常に求められている。

本願発明者らは、先に血管内皮増殖活性を有するポリペプチドを発明し、特許出願した（特許文献２）。特許文献２には、該ポリペプチドが抗菌活性を有することも示唆されている。

特開2006-45214 WO 2005/090564 A1 Proc Natl Acad Sci U S A., 1987 Aug;84(15):5449-53 J Invest Dermatol., 2005 Jul;125(1):9-13.

本発明の目的は、優れた抗菌活性を有する新規なポリペプチド及びそれを有効成分として含有する抗菌剤を提供することである。

本願発明者らは、鋭意研究の結果、特許文献２に記載されたポリペプチドを修飾することにより、該ポリペプチドよりも高い抗菌活性を有するポリペプチドが得られることを見出し本発明を完成した。

すなわち、本発明は、
(1) 下記一般式[I]
LIFLHRLKX₁MRKRLX₂RKLRFWHRK [I]
（式中、X₁は親水性アミノ酸残基を示し、X₂は親水性アミノ酸残基又は疎水性アミノ酸残基を示す）
で表されるポリペプチド、
(2) 上記一般式[I]で表されるポリペプチドのＮ末端にMLX₃（X₃は親水性アミノ酸残基を示す）が付加され及び／若しくは上記一般式[I]で表されるポリペプチドのＣ末端にX₄YX₅（X₄は親水性アミノ酸残基を示し、X₅は、X₂が親水性アミノ酸残基の場合には親水性アミノ酸残基、X₂が疎水性アミノ酸残基の場合には疎水性アミノ酸残基を示す）が付加されたポリペプチド、
(3) 上記一般式[I]で表されるポリペプチドのＮ末端及び／若しくはＣ末端にキャッピング構造が付加されたポリペプチド、又は
(4) 上記一般式[I]で表されるポリペプチドのＮ末端にMLX₃（X₃は親水性アミノ酸残基を示す）が付加され及び／若しくは上記一般式[I]で表されるポリペプチドのＣ末端にX₄YX₆（X₄は親水性アミノ酸残基を示し、X₆は親水性アミノ酸残基又は疎水性アミノ酸残基を示す）が付加されたポリペプチドのＮ末端及び／若しくはＣ末端にキャッピング構造が付加されたポリペプチドを提供する。

また、本発明は、上記本発明のポリペプチドを有効成分として含有する抗菌剤を提供する。さらに、本発明は、抗菌的に有効量の上記本発明のポリペプチドを、増殖を抑制すべき微生物と接触させることを含む抗菌方法を提供する。さらに、本発明は、上記本発明のポリペプチドの、抗菌剤の製造のための使用を提供する。さらに、本発明は、上記本発明のポリペプチドである、抗菌用ポリペプチドを提供する。

また、本発明は、ポリペプチドを有効成分として含有する、褥瘡、創傷、皮膚潰瘍、蜂巣炎、急性リンパ管炎、リンパ節炎、丹毒、皮膚膿瘍、壊死性皮下感染、ブドウ球菌性熱傷様 皮膚症候群（SSSS）、毛包炎、フルンケル、化膿性汗腺炎、カルブンケル（癰）、感染性爪囲炎、紅色陰癬及び重症感染症（敗血症）からなる群から選択される疾患の処置のための予防、改善又は治療剤を提供する。さらに、本発明は、有効量の上記本発明のポリペプチドを哺乳動物（ヒトを包含する）に投与することを含む、上記疾患の処置のための予防、改善又は治療方法を提供する。さらに、本発明は、上記本発明のポリペプチドの、上記疾患の処置のための予防、改善又は治療剤の製造のための使用を提供する。さらに本発明は、上記本発明のポリペプチドである、上記疾患の処置のための予防、改善又は治療用ポリペプチドを提供する。

本発明により、優れた抗菌活性を有する新規なポリペプチド及びそれを有効成分として含有する抗菌剤が提供された。

本発明の実施例及び比較例の血管新生誘導活性を示す図である。

特許文献２に記載されているF2ペプチド（本願明細書において「AG-30」と呼ぶ）のアミノ酸配列を配列番号６に示す。AG-30は、特許文献２に記載され、また、下記実施例において具体的に記載するように抗菌活性及び血管新生誘導活性を有する。AG-30の種々の修飾体を作製し、その抗菌活性及び血管新生誘導活性を調べた。その結果、上記した本発明のポリペプチドが、優れた抗菌活性を有することが明らかになった。下記実施例に具体的に記載するように、本発明の実施例になるポリペプチドは、いずれもAG-30よりも抗菌活性が高かった。

上記の通り、本発明のポリペプチドは、
(1) 上記一般式[I]で表されるポリペプチド（なお、単に「一般式[I]と言う場合は、上記したX₁及びX₂の定義も包含する）、
(2) 上記一般式[I]で表されるポリペプチドのＮ末端にMLX₃（X₃は親水性アミノ酸残基を示す）が付加され及び／若しくは上記一般式[I]で表されるポリペプチドのＣ末端にX₄YX₅（X₄は親水性アミノ酸残基を示し、X₅は、X₂が親水性アミノ酸残基の場合には親水性アミノ酸残基、X₂が疎水性アミノ酸残基の場合には疎水性アミノ酸残基を示す）が付加されたポリペプチド、
(3) 上記一般式[I]で表されるポリペプチドのＮ末端及び／若しくはＣ末端にキャッピング構造が付加されたポリペプチド、又は
(4) 上記一般式[I]で表されるポリペプチドのＮ末端にMLX₃（X₃は親水性アミノ酸残基を示す）が付加され及び／若しくは上記一般式[I]で表されるポリペプチドのＣ末端にX₄YX₆（X₄は親水性アミノ酸残基を示し、X₆は親水性アミノ酸残基又は疎水性アミノ酸残基を示す）が付加されたポリペプチドのＮ末端及び／若しくはＣ末端にキャッピング構造が付加されたポリペプチド、である。なお、一般式[I]において、X_n（ｎは数字）以外のアルファベットは、国際的に承認されている、アミノ酸の１文字表記である。

前記一般式[I]中、X₁、X₂、X₃、X₄、X₅及びX₆の少なくとも１つが親水性アミノ酸残基である場合、該親水性アミノ酸残基は、互いに独立に、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アルギニン、セリン、スレオニン、アスパラギン及びグルタミンから成る群より選択されるアミノ酸残基であることが好ましく、特に、アスパラギン酸、セリン、アルギニン、アスパラギン、リジン及びヒスチジンから成る群より選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。

前記一般式[I]中、X₂、X₅及びX₆の少なくとも１つが疎水性アミノ酸残基である場合、該疎水性アミノ酸残基が、互いに独立に、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、システイン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンから成る群より選ばれるアミノ酸残基であることが好ましく、特に、ロイシン、メチオニン及びプロリンから成る群より選ばれるロイシン、メチオニン及びプロリンから成る群より選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。

上記(1)のポリペプチド、すなわち、上記一般式[I]で表されるポリペプチドには、AG-30の両末端の３アミノ酸ずつを欠失させたポリペプチドが包含される。このポリペプチドの両末端に後述する、それぞれ３アミノ酸から成るキャッピング構造を付加したポリペプチド（AG24-CP、配列番号１)が優れた抗菌活性を有することから、キャッピング構造を有さない該ポリペプチドも抗菌活性を有することが明らかである。(1)のポリペプチドのうち、X₁及びX₂が両方とも親水性アミノ酸残基であるものが好ましい。

上記(2)のポリペプチドは、上記一般式[I]で表されるポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に、それぞれ所定のアミノ酸配列から成るトリペプチドを付加したものであり、下記実施例において具体的に作製したAG30-2C（配列番号３）、AG30-2Hb（配列番号４）及びAG30-5C（配列番号５）が包含される。(2)のポリペプチドのうち、(i)X₁〜X₅の全てが親水性アミノ酸残基のもの、及び(ii) X₁〜X₅のうち、X₂及びX₅が疎水性アミノ酸残基で、その他が全て親水性アミノ酸残基であるものが好ましい。AG30-2C、AG30-2Hb及びAG30-5CはいずれもAG-30（配列番号６）よりも高い抗菌活性を有し、いずれも血管新生誘導活性を有する。特に、AG30-5Cは、血管新生誘導活性もAG-30よりも有意に高いので、血管新生誘導活性を併有することが望まれる、例えば創傷の処置等の抗菌用途において優れた性能を発揮する。

上記(3)のポリペプチドは、上記一般式[I]で表されるポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に、キャッピング構造を付加したポリペプチドであり、下記実施例において具体的に作製したAG24-CP（配列番号１）が包含される。ここで、キャッピング構造は、ポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に、ポリペプチドの構造を安定化させることが知られている、オリゴペプチドである（文献：1）D'Andrea LD, Iaccarino G, Fattorusso R, Sorriento D, Carannante C, Capasso D, Trimarco B, Pedone C., "Targeting angiogenesis: structural characterization and biological properties of a de novo engineered VEGF mimicking peptide.", Proc Natl Acad Sci U S A., 2005 Oct 4;102(40):14215-20. Epub 2005 Sep 26；2）（文献：2）Aurora R, Rose GD.,"Helix capping"., Protein Sci. 1998 Jan;7(1):21-38）。本発明において、Ｎ末端に付加するキャッピング構造としてはKLTが好ましく、Ｃ末端に付加するキャッピング構造としてはKGIが好ましい。また、(3)のポリペプチドのうち、X₁及びX₂が両方とも親水性アミノ酸残基であるものが好ましい。

上記(4)のポリペプチドは、上記(2)のポリペプチド又はAG-30のＮ末端及び／又はＣ末端に、キャッピング構造を付加したポリペプチドであり、下記実施例において具体的に作製したAG30-CP（配列番号２）が包含される。ここで、キャッピング構造は、上記(3)のポリペプチドで説明した通りであり、Ｎ末端に付加するキャッピング構造としてはKLTが好ましく、Ｃ末端に付加するキャッピング構造としてはKGIが好ましい。(4)のポリペプチドのうち、X₁、X₂、X₃及びX₄が親水性アミノ酸残基でX₆が疎水性アミノ酸残基であるものが好ましい。

下記実施例に具体的に記載されるように、キャッピング構造を付加した上記(3)又は(4)、特に(3)のポリペプチドは、抗菌活性が高く、かつ、AG-30が有している血管新生誘導活性を有さない。一般に予期しない副作用がもたらされる危険性を避けるため、単一の活性のみが必要とされる医薬用途では、必要とされる活性以外の生理活性を有さない方が好ましい。従って、上記(3)又は(4)のポリペプチドは、血管新生誘導活性が不要な抗菌用途において優れた性能を発揮する。特に、下記実施例で具体的に作製されたAG24-CPやAG30-CP、特にAG24-CPは、抗菌活性がAG-30よりも高く、AG-30が有している血管新生誘導活性を有さないので、血管新生誘導活性が不要な抗菌用途において非常に優れた性能を発揮する。

一般に、ポリペプチドから成る医薬において、生体内でのポリペプチドの安定性を高めるために、ポリペプチドに糖鎖やポリエチレングリコール(PEG)鎖を付加したり、ポリペプチドを構成するアミノ酸の少なくとも一部としてＤ体アミノ酸を用いたりする技術が広く知られており、用いられている。糖鎖やPEG鎖を付加したり、ポリペプチドを構成するアミノ酸の少なくとも一部としてＤ体アミノ酸を用いたりすることにより、生体内でのペプチダーゼによる分解を受けにくくなり、生体内におけるポリペプチドの半減期が長くなる。本発明のポリペプチドは、抗菌活性を有する限り、生体内安定化のためのこれらの公知の修飾を施したものであってもよく、本明細書及び特許請求の範囲における「ポリペプチド」という語は、文脈上そうでないことが明らかな場合を除き、生体内安定化のための修飾を施したものも包含する意味で用いている。

ポリペプチドに対する糖鎖付加は周知であり、例えば、Sato M, Furuike T, Sadamoto R, Fujitani N, Nakahara T, Niikura K, Monde K, Kondo H, Nishimura S., "Glycoinsulins: dendritic sialyloligosaccharide-displaying insulins showing a prolonged blood-sugar-lowering activity.",J Am Chem Soc. 2004 Nov 3;126(43):14013-22やSato M, Sadamoto R, Niikura K, Monde K, Kondo H, Nishimura S,"Site-specific introduction of sialic acid into insulin.", Angew Chem Int Ed Engl. 2004 Mar 12;43(12):1516-20等に記載されている。糖鎖は、Ｎ末端、Ｃ末端又はそれらの間のアミノ酸に結合可能であるが、ポリペプチドの活性を阻害しないためにＮ末端又はＣ末端に結合することが好ましい。また、付加する糖鎖の個数は、１個又は２個が好ましく、１個が好ましい。糖鎖は、単糖から４糖が好ましく、さらには２糖又は３糖が好ましい。糖鎖は、ポリペプチドの遊離のアミノ基又はカルボキシル基に直接又は例えば炭素数１〜１０程度のメチレン鎖等のスペーサー構造を介して結合することができる。

ポリペプチドに対するPEG鎖の付加も周知であり、例えば、Ulbricht K, Bucha E, Poschel KA, Stein G, Wolf G, Nowak G., "The use of PEG-Hirudin in chronic hemodialysis monitored by the Ecarin Clotting Time: influence on clotting of the extracorporeal system and hemostatic parameters.", Clin Nephrol. 2006 Mar;65(3):180-90.やDharap SS, Wang Y, Chandna P, Khandare JJ, Qiu B, Gunaseelan S, Sinko PJ, Stein S, Farmanfarmaian A, Minko T., "Tumor-specific targeting of an anticancer drug delivery system by LHRH peptide.", Proc Natl Acad Sci USA. 2005 Sep 6;102(36):12962-7.等に記載されている。PEG鎖は、Ｎ末端、Ｃ末端又はそれらの間のアミノ酸に結合可能であり、通常、１個又は２個のPEG鎖が、ポリペプチド上の遊離のアミノ基やカルボキシル基に結合される。PEG鎖の分子量は、特に限定されないが、通常3000〜7000程度、好ましくは5000程度のものが用いられる。

ポリペプチドを構成するアミノ酸の少なくとも一部をＤ体とする方法も周知であり、例えば、Brenneman DE, Spong CY, Hauser JM, Abebe D, Pinhasov A, Golian T, Gozes I., "Protective peptides that are orally active and mechanistically nonchiral.", J Pharmacol Exp Ther. 2004 Jun;309(3):1190-7やWilkemeyer MF, Chen SY, Menkari CE, Sulik KK, Charness ME., "Ethanol antagonist peptides: structural specificity without stereospecificity.", J Pharmacol Exp Ther. 2004 Jun;309(3):1183-9.等に記載されている。ポリペプチドを構成するアミノ酸の一部をＤ体としてもよいが、ポリペプチドの活性をできるだけ阻害しないため、ポリペプチドを構成するアミノ酸の全てをＤ体アミノ酸とすることが好ましい。

本発明のポリペプチドは、市販のペプチド合成機を用いた化学合成等の常法により容易に製造することができる。また、上記安定化修飾も、上記各文献に記載されているような周知の方法により容易に行なうことができる。

本発明のポリペプチドは、高い抗菌活性を有するので、抗菌剤として用いることができる。本発明の抗菌剤は、各種微生物の増殖抑制に有効であり、例えば、大腸菌、緑膿菌等のグラム陰性細菌、黄色ブドウ球菌等のグラム陽性細菌、カンジダ等の真菌類に対して有効である。

抗菌剤としての使用方法は公知のポリペプチド系の抗菌剤と同様であり、好ましくは軟膏、溶液剤、乳剤、懸濁剤、粉剤、散剤、顆粒剤、ゲル、または経皮パッチとして、特に好ましくは溶液剤あるいは軟膏として投与することができる。これらの剤形への製剤方法は、周知であり、周知のいずれの方法をも採用することができる。すなわち、製剤に使用される薬剤的に許容できる担体としては、例えば軟膏のような外用剤の場合には、炭化水素類（親水ワセリン、白色ワセリン、精製ラノリン、流動パラフィン等）、酸化亜鉛、高級脂肪酸及びそのエステル（アジピン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、アジピン酸エステル、ミリスチン酸エステル、パルミチン酸エステル、セバシン酸ジエチル、ラウリン酸ヘキシル、イソオクタン酸セチル等）、ロウ類（鯨ロウ、ミツロウ、セレシン等）、高級アルコール（セタノール、ステアリルアルコール、セトステアリルアルコール等）などが挙げられる。溶液剤の場合には、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水等を挙げることができ、経口剤の場合には、乳糖、デンプン等を挙げることができる。その他、必要に応じ、乳化剤、界面活性剤、等張化剤、pH調整剤等の各種医薬添加剤を配合することもできる。なお、これらの薬剤的に許容できる担体及び医薬添加剤は、製剤分野において周知であり、広く用いられているものである。

軟膏中のポリペプチドの濃度は、特に限定されないが、通常、0.01mg/g〜100mg/g程度、好ましくは0.1mg/g〜100mg/g程度、特に好ましくは1mg/g〜10mg/g程度である。また、溶液中のポリペプチドの濃度は、特に限定されないが、通常、0.001mg/mL〜100mg/mL程度、好ましくは0.01mg/mL〜100mg/mL程度、特に好ましくは0.1mg/mL〜10mg/mL程度である。投与経路は、殺菌が必要な部位への塗布や注射等の局所投与、静脈注射等の全身的非経口投与及び経口投与が可能であり、局所投与及び全身的な非経口投与が好ましく、特に局所投与が好ましい。また、生体への投与に限られず、生体以外の物の消毒に利用することも可能である。生体に投与する場合の投与量は、症状や患部の大きさ等に応じて適宜選択されるが、通常、ポリペプチド量として0.01mg〜100mg程度、好ましくは0.1mg〜100mg程度、特に好ましくは0.1mg〜10mg程度であるが、もちろん、これらの範囲に限定されるものではない。

生体に投与する場合の具体的な疾患及び障害の例として、褥瘡、創傷、皮膚潰瘍、蜂巣炎、急性リンパ管炎、リンパ節炎、丹毒、皮膚膿瘍、壊死性皮下感染、ブドウ球菌性熱傷様皮膚症候群（SSSS）、毛包炎、フルンケル、化膿性汗腺炎、カルブンケル（癰）、感染性爪囲炎、紅色陰癬、重症感染症（敗血症）等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。本発明の抗菌剤は、これらの疾患又は障害に対する予防、改善又は治療剤として用いることができる。なお、上記の通り、上記(3)及び(4)のポリペプチドは、高い抗菌活性を有する一方、血管新生誘導活性を有さないので、抗菌活性のみが求められる疾患又は障害の予防、改善又は治療剤として特に適しており、このような疾患又は障害として、上記の疾患又は障害のうち重症感染症（敗血症）を挙げることができる。

本発明の抗菌剤は、単独で使用することもできるし、他の抗菌剤又は抗生物質と併用することもできる。これらの抗菌剤又は抗生物質の例として、セフェム系、カルバペネム系、アミノグリコシト系、ニューキノロン系、β-ラクタム系、ペニシリン系及びグリコペプチド系抗生物質等を挙げることができ、より具体的には、セフタジジム、メロペネム、トブラマイシン、シプロフロキサシン、メチシリン、アンピシリン及びバンコマイシン等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。

以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

実施例１〜５、比較例１、２
１． ポリペプチドの作製
市販のペプチド合成機を用いて、tBoc法、Fmoc法のいずれかを用い固相合成法でポリペプチドを化学合成した。Fmoc法には Applied Biosystems社 433A 型全自動固相合成機を、tBoc法には Applied Biosystems社 430A 型全自動固相合成機をそれぞれ使用した。化学合成したポリペプチドは、AG-30（配列番号６、比較例１）、AG24-CP（配列番号１、実施例１）、AG30-CP（配列番号２、実施例２）、AG30-2C（配列番号３、実施例３）、AG30-2Hb（配列番号４、実施例４）、AG30-5C（配列番号５、実施例５）、AG30-5Hb（配列番号７、比較例２）であった。

２． ポリペプチドの抗菌活性
(1) AG-30（比較例１）の抗菌活性
AG-30及び公知のポリペプチド系抗生物質であるLL-37（Koczulla R, von Degenfeld G, Kupatt C, Krotz F, Zahler S, Gloe T, Issbrucker K, Unterberger P, Zaiou M, Lebherz C, Karl A, Raake P, Pfosser A, Boekstegers P, Welsch U, Hiemstra PS, Vogelmeier C, Gallo RL, Clauss M, Bals R., "An angiogenic role for the human peptide antibiotic LL-37/hCAP-18.", J Clin Invest. 2003 Jun;111(11):1665-72.）の各種細菌に対する抗菌活性を調べた。

抗菌活性は、米国National Committee for Clinical Laboratory Standard(NCCL Documents M7-A3)に従って評価した。すなわち、マイクロタイタープレートあるいは試験管を用いて、菌の増殖を阻害するペプチドの最小濃度を求めた。対象菌株には、大腸菌DH5α (E. coli (DH5α))、大腸菌ATCC25922(E. coli ATCC25922)、緑膿菌ATCC27853（P. Aeruginosa ATCC27853)及び黄色ブドウ球菌ATCC29213 (S. aureus ATCC29213)を用いた。

ミューラー・ヒントン・ブロス寒天培地（Mueller Hinton Broth Agar、MHA）またはミューラー・ヒントン・ブロス (Mueller Hinton Broth、MHB)へ菌を接種し、一晩培養した。培養後、数コロニーまたは培養液50μlをMHB2mlへ接種した。35±2℃で4〜6時間振盪培養した。培養液を10倍希釈し、1x10⁵〜10⁸倍希釈の希釈液を調製した。それぞれの菌液20μlをMHA2枚ずつに塗布した。37℃で一晩培養した。培養している間、残りの菌液は4℃に保存した。培養後、MHA上のコロニーをカウントし、生菌数（cfu/ml）を計算した。菌数が1x10⁵cfu/mlとなるように、菌を試験培地に添加した。

各ペプチドは任意の濃度に調製し、そこから段階希釈を行った（希釈媒体はリン酸緩衝液、pH7およびミューラー・ヒントン・ブロス）。菌液を分注したマイクロプレートあるいは試験管に各濃度段階のポリペプチドを添加した。ペプチド無添加のものを陰性対照とした。プレートを37℃で16時間培養し、菌の増殖を阻害する最小濃度（最小発育阻止濃度：MIC）を求めた。結果を下記表１に示す。

表１からAG-30は、試験した全ての細菌に対して抗菌活性を発揮し、黄色ブドウ球菌に対する抗菌活性は、LL-37の４倍以上であった。

(2) 本発明のポリペプチドの抗菌活性
上記(1)と同様にして、本発明のポリペプチドであるAG24-CP（実施例１）、AG30-CP（実施例２）、AG30-2C（実施例３）、AG30-2Hb（実施例４）及びAG30-5C（実施例５）並びに本発明の範囲外であるAG30-5Hb（配列番号７、比較例２）の黄色ブドウ球菌ATCC29213に対する抗菌活性を調べた。結果を下記表２に示す。表２には、比較のため、表１に示すAG-30（比較例１）の抗菌活性も併せて示す。

表２に示すように、本発明のポリペプチドは、いずれもAG-30と比較して２倍又は４倍の黄色ブドウ球菌に対する抗菌活性を有していた。

さらに、発明のポリペプチドであるAG24-CP（実施例１）の緑膿菌ATCC27853に対する抗菌活性を調べた。MIC測定方法は上記(1)と同様に行ったが菌液の調製については次のように行った。

MHAへ菌を接種し、一晩培養した。培養液から、数コロニーをMHB2mlへ接種した。35±2℃で4〜6時間振盪培養した。分光光度計を用いて培養後の菌液の600nmの吸光度を測定し、菌液をMacFarlamd＃0.5に調整した。すなわち、McFarland Turbity Standard 0.5 (Becton, Dickinson and Company)は、OD₆₀₀＝0.075であるため、菌液を0.075±0.01となるように希釈した。希釈後、さらに10倍希釈し、試験培地１mlに対して菌液を0.05μl添加した。添加は菌液調製後15分以内に行った。

結果を下記表３に示す。

表３に示すように、AG24-CPはAG-30と同等から２倍の緑膿菌に対する抗菌活性を有していた。

(3) 本発明のポリペプチドの抗真菌活性
本発明のポリペプチドであるAG24-CP（実施例１）の酵母様真菌Candida krusei ATCC6258およびCandida parapsilosis ATCC90018に対する抗真菌活性を調べた。方法はJ. Invest. Dermatol. 125:1088-115,2005に記載のMIC測定法に準拠した。

修飾Dixon培地(mDixon、pH 5.0±0.1、4% モールトエキストラクト (Fluka Biochemika,ドイツ国Steinheim),0.6%バクトペプトン (Bectone, Dickinson and Company)、1% グルコース (Sigma-Aldrich,米国ミズーリ州St Louis)、1% Tween-80 (商品名、Sigma-Aldrich)) に酵母様真菌C. krusei ATCC6258またはC. parapsilosis ATCC90018をそれぞれ接種し、37℃にて一晩培養した。培養後の培地から一部を新たな培地へ接種し、37℃で4〜6時間振盪培養した。当該培養液をOD₆₀₀＝0.01±0.01と同程度になるよう培地で希釈した。菌液は調製してから15分以内にMIC測定試験に用いた。

ポリペプチド混合培地は下記表４に従って調製した。

* 20%mDixon（1 mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7、16μg/mlクロラムフェニコール、20 % mDixon、ｐH5.5、5.0ｍM Na⁺、1.6mM K⁺、4mg/dL phosphate）

ポリペプチド混合培地へ前述の調製した菌液を終濃度2.5-5.0x10⁵cfu/mlとなるように添加し、振盪培養機で35±2℃、48時間培養した。目視で菌の生育が阻止されている最小の濃度をMICとした。培地が白濁するか、培地が透明で 1 mm 以上のかたまりがある場合は、生育しているとみなした。

各ポリペプチドのMICを下記表５に示す。

表５に示すように、AG24−CPはAG−30と比較して8倍から16倍の抗真菌活性を有していた。

３． ポリペプチドの血管新生誘導活性
AG-30（比較例１）、AG24-CP（実施例１）、AG30-CP（実施例２）、AG30-2C（実施例３）、AG30-2Hb（実施例４）、AG30-5C（実施例５）及びAG30-5Hb（比較例２）の血管新生誘導活性を調べた。クラボウの血管新生キット(Angiogenesis Kit, KZ-1000, 倉敷紡績株式会社)を用いて管腔形成を調べた。陰性対照として、ブランク（NC、ペプチドなし）を用いた。

血管新生専用培地（倉敷紡績（株）KZ-1400）中へ、各ポリペプチド10μg/Lの濃度になるように添加して培養した。培養は37℃、5%CO₂インキュベーターにて行った。培地は、培養４日目、７日目および９日目に同じ添加物を含有するものと交換した。培養開始１１日目に培地を除き、管腔染色キット（CD31抗体染色用：倉敷紡績（株）KZ-1225）を用いて以下の手順に従い染色した。

CD31(PECAM-1)染色１次抗体（マウス抗ヒトCD31抗体）をブロッキング液（1%-BSAを含むダルベッコリン酸緩衝液（PBS(-)）で4,000倍希釈した。各ウェルにこの１次抗体溶液0.5mlを添加し、60分間37℃でインキュベートした。インキュベート終了後、1mlのブロッキング液で各ウエルを計３回洗浄した。

次いでブロッキング液で500倍希釈した２次抗体溶液（ヤギ抗マウスIgGアルカリホスファターゼ複合体）0.5mlを各ウエルに添加し、60分間37℃でインキュベートした後、1mlの蒸留水で３回洗浄した。その間に、BCIP/NBTの錠剤２錠を蒸留水20mlに溶解し、ポアサイズ0.2μmのフィルターで濾過して基質溶液を準備した。調製したBCIP/NBT基質溶液0.5mlを各ウエルに添加し、管腔が深紫色になるまで（通常５〜１０分間）37℃でインキュベートした。インキュベート終了後、蒸留水1mlで、各ウエルを３回洗浄した後洗浄液を吸引除去し、自然乾燥するため静置した。乾燥後、顕微鏡下で各ウエルを観察した。

各ウエルを顕微鏡で倍率40倍で観察し、写真を撮影した。得られた各画像を血管新生定量ソフトウェア(KSW-5000U, 倉敷紡績株式会社)を用い定量化した。様々な指標でコンピューター解析をして、このスケールをもとに各視野中に形成された管腔の面積（図左欄）、長さ（図右欄）を測定した。

結果を図１に示す。図１に示されるように、キャップ構造を有するAG24-CP（実施例１）及びAG30-CP（実施例２）は、血管新生誘導活性を有していなかった。一方、AG30-5C（実施例５）は、AG-30（比較例１）よりも有意に高い血管新生誘導活性を有していた。

Claims (24)

1. (1) 下記一般式[I]
   LIFLHRLKX₁MRKRLX₂RKLRFWHRK [I]
   （式中、X₁は親水性アミノ酸残基を示し、X₂は親水性アミノ酸残基又は疎水性アミノ酸残基を示す）
   で表されるポリペプチド、
   (2) 上記一般式[I]で表されるポリペプチドのＮ末端にMLX₃（X₃は親水性アミノ酸残基を示す）が付加され及び／若しくは上記一般式[I]で表されるポリペプチドのＣ末端にX₄YX₅（X₄は親水性アミノ酸残基を示し、X₅は、X₂が親水性アミノ酸残基の場合には親水性アミノ酸残基、X₂が疎水性アミノ酸残基の場合には疎水性アミノ酸残基を示す）が付加されたポリペプチド、
   (3) 上記一般式[I]で表されるポリペプチドのＮ末端及び／若しくはＣ末端にキャッピング構造が付加されたポリペプチド、又は
   (4) 上記一般式[I]で表されるポリペプチドのＮ末端にMLX₃（X₃は親水性アミノ酸残基を示す）が付加され及び／若しくは上記一般式[I]で表されるポリペプチドのＣ末端にX₄YX₆（X₄は親水性アミノ酸残基を示し、X₆は親水性アミノ酸残基又は疎水性アミノ酸残基を示す）が付加されたポリペプチドのＮ末端及び／若しくはＣ末端にキャッピング構造が付加されたポリペプチド。
2. 前記(3)又は(4)のポリペプチドである請求項１記載のポリペプチド。
3. 前記(3)のポリペプチドである請求項２記載のポリペプチド。
4. 一般式[I]中のX₁及びX₂が互いに独立して親水性アミノ酸残基である請求項３記載のポリペプチド。
5. ポリペプチドのＮ末端に付加される前記キャッピング構造がKLTから成る請求項１ないし４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
6. ポリペプチドのＣ末端に付加される前記キャッピング構造がKGIから成る請求項１ないし５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
7. 前記X₁、X₂、X₃、X₄、X₅及びX₆の少なくとも１つが親水性アミノ酸残基である場合、該親水性アミノ酸残基は、互いに独立に、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アルギニン、セリン、スレオニン、アスパラギン及びグルタミンから成る群より選択される請求項１ないし６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
8. 前記親水性アミノ酸残基が、アスパラギン酸、セリン、アルギニン、アスパラギン、リジン及びヒスチジンから成る群より選ばれる請求項７記載のポリペプチド。
9. 前記X₂、X₅及びX₆の少なくとも１つが疎水性アミノ酸残基である場合、該疎水性アミノ酸残基が、互いに独立に、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、システイン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンから成る群より選ばれる請求項１ないし８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
10. 前記疎水性アミノ酸残基が、互いに独立に、ロイシン、メチオニン及びプロリンから成る群より選ばれる請求項９記載のポリペプチド。
11. 配列番号１ないし５のいずれかで示されるアミノ酸配列から成る請求項１記載のポリペプチド。
12. 配列番号１で示されるアミノ酸配列から成る請求項１１記載のポリペプチド。
13. 請求項１ないし１２のいずれか１項に記載のポリペプチドを有効成分として含有する抗菌剤。
14. 緑膿菌及び／又は黄色ブドウ球菌に対して抗菌活性を有する請求項１３記載の抗菌剤。
15. カンジダに対して抗菌活性を有する請求項１３記載の抗菌剤。
16. 抗菌的に有効量の請求項１ないし１２のいずれか１項に記載のポリペプチドを、増殖を抑制すべき微生物と接触させることを含む抗菌方法。
17. 前記微生物が緑膿菌及び黄色ブドウ球菌から成る群より選ばれる少なくとも１種である請求項１６記載の方法。
18. 前記微生物がカンジダである請求項１６記載の方法。
19. 請求項１ないし１２のいずれか１項に記載のポリペプチドの、抗菌剤の製造のための使用。
20. 請求項１ないし１２のいずれか１項に記載のポリペプチドである、抗菌用ポリペプチド。
21. 請求項１ないし１２のいずれか１項に記載のポリペプチドを有効成分として含有する、褥瘡、創傷、皮膚潰瘍、蜂巣炎、急性リンパ管炎、リンパ節炎、丹毒、皮膚膿瘍、壊死性皮下感染、ブドウ球菌性熱傷様 皮膚症候群（SSSS）、毛包炎、フルンケル、化膿性汗腺炎、カルブンケル（癰）、感染性爪囲炎、紅色陰癬及び重症感染症（敗血症）からなる群から選択される疾患の処置のための予防、改善又は治療剤。
22. 有効量の請求項１ないし１２のいずれか１項に記載のポリペプチドを、哺乳動物に投与することを含む、褥瘡、創傷、皮膚潰瘍、蜂巣炎、急性リンパ管炎、リンパ節炎、丹毒、皮膚膿瘍、壊死性皮下感染、ブドウ球菌性熱傷様 皮膚症候群（SSSS）、毛包炎、フルンケル、化膿性汗腺炎、カルブンケル（癰）、感染性爪囲炎、紅色陰癬及び重症感染症（敗血症）からなる群から選択される疾患の処置のための予防、改善又は治療方法。
23. 請求項１ないし１２のいずれか１項に記載のポリペプチドの、褥瘡、創傷、皮膚潰瘍、蜂巣炎、急性リンパ管炎、リンパ節炎、丹毒、皮膚膿瘍、壊死性皮下感染、ブドウ球菌性熱傷様 皮膚症候群（SSSS）、毛包炎、フルンケル、化膿性汗腺炎、カルブンケル（癰）、感染性爪囲炎、紅色陰癬及び重症感染症（敗血症）からなる群から選択される疾患の処置のための予防、改善又は治療剤の製造のための使用。
24. 請求項１ないし１２のいずれか１項に記載のポリペプチドである、褥瘡、創傷、皮膚潰瘍、蜂巣炎、急性リンパ管炎、リンパ節炎、丹毒、皮膚膿瘍、壊死性皮下感染、ブドウ球菌性熱傷様 皮膚症候群（SSSS）、毛包炎、フルンケル、化膿性汗腺炎、カルブンケル（癰）、感染性爪囲炎、紅色陰癬及び重症感染症（敗血症）からなる群から選択される疾患の処置のための予防、改善又は治療用ポリペプチド。

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