JPWO2008096730A1

JPWO2008096730A1 - 抗炎症剤及びその用途

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Publication number: JPWO2008096730A1
Application number: JP2008557111A
Authority: JP
Inventors: 和博石黒; 秀実後藤; 貴文安藤
Original assignee: Nagoya University NUC; Tokai National Higher Education and Research System NUC
Current assignee: Nagoya University NUC; Tokai National Higher Education and Research System NUC
Priority date: 2007-02-09
Filing date: 2008-02-05
Publication date: 2010-05-20
Also published as: WO2008096730A1

Abstract

新規抗炎症剤及びその用途を提供することを課題とする。酢酸又は酢酸の塩を主成分として含有する抗炎症剤が提供される。本発明の抗炎症剤は転写因子ＮＦＡＴの活性化を特異的に抑制することにより抗炎症作用を発揮する。ステロイド系抗炎症剤を組み合わせることによって一層の治療的効果が得られる。

Description

本発明は抗炎症剤及びその用途に関する。本発明の抗炎症剤は炎症性疾患の治療等に利用される。

炎症性腸疾患や接触性皮膚炎などの炎症性疾患においてT細胞は極めて重要な役割を果たしている(非特許文献１、２)。そして転写因子であるNFATやNF-κBはそのT細胞の活性化をコントロールしている(非特許文献３、４)。実際、NFATやNF-κBの活性化を抑制する薬剤が炎症性疾患の治療に有効であることがこれまでに報告されている(非特許文献５〜７)。
NFATの活性化には多くのステップ、即ちcalcineurinによるNFATの脱リン酸化、核内移行に必要なimportinsとの結合、核内におけるNFATの修飾、DNAとの結合、他の核内タンパクとの結合などが必要とされる(非特許文献８)。それぞれのステップがNFATの活性化、即ちNFATによるサイトカインなどの標的遺伝子の発現に必要である。例えばcyclosporin AやFK506はcyclosphilinやFKBP12を介してcalcineurinに結合し、その脱リン酸化酵素活性を阻害することによりNFATの脱リン酸化を抑制する(非特許文献８)。一方、NF-κBの活性化にも多くのステップ、即ちIκBの分解、核内移行に必要なimportin α3/4との結合、核内におけるNF-κBの修飾、DNAとの結合、他の核内タンパクとの結合などが必要とされる(非特許文献３、９)。NFAT同様、それぞれのステップがNF-κBによる標的遺伝子の発現に必要とされる。例えば、デコイオリゴヌクレオチドはNF-κBのDNAへの結合を妨げることにより効果を発揮する(非特許文献５)。
今後は、これらNFAT、NF-κBの活性化を制御する物質を同定し、その分子的機序を解明するとともに、同定された物質が炎症性疾患の改善に有効であるかどうかを動物実験において評価していくことが重要である。これまで特定のアミノ酸がNF-κBやNFATの活性化に影響を与えることが報告されている(非特許文献１０〜１３)。しかし、糖代謝、アルコール代謝に由来するカルボン酸である酢酸、乳酸そしてピルビン酸がT細胞におけるNFATやNF-κBの活性化に与える影響については過去に報告がない。
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本発明は新規抗炎症剤及びその用途を提供することを課題とする。

以上の背景の下、本発明者らはNFAT依存又はNF-κB依存ルシフェレースレポーターアッセイを用いて酢酸、乳酸、及びピルビン酸の効果を評価し、併せてその分子的機序を解明することを試みた。その結果、酢酸及び酢酸塩（酢酸ナトリウム）がNFATの活性を特異的に抑制することを見出すとともに、NFATによって発現が誘導されるインターロイキン-2(IL-2)の産生が酢酸塩により濃度依存的に抑制されることも認めた。また、酢酸塩は、Cyclosporin AやFK506と異なり、calcineurinの活性やNFATの脱リン酸化に影響を与えず、NFATとimportin β1との相互作用を抑制することによりNFATの核内移行を障害することが示唆された。以上の結果を得た後、トリニトロベンゼンスルホン酸(trinitrobenzenesulfonic acid：TNBS)によって腸炎を誘発させた腸炎マウスモデルとジニトロフルオロベンゼン(dinitrofluorobenzene：DNFB)によって皮膚炎を誘発させた皮膚炎マウスモデルを用いて酢酸塩の効能を評価したところ、酢酸塩投与がデキサメタゾン投与と同等の治療的効果を発揮することが証明された。しかも、酢酸塩とデキサメタゾンを併用することによって、いずれかを単独で使用した場合に比較して高い治療的効果が認められた。これらの所見はNFATの活性を特異的に抑制する酢酸及び酢酸塩が炎症性疾患の治療に有用であることを示す。また、酢酸又は酢酸塩をステロイド系抗炎症剤と併用することが、高い治療的効果をもたらすための有効な治療戦略になることを示唆する。一方、ヒトを対象とした試験においても酢酸塩に高い抗炎症作用があることを示す結果が集まりつつある。
本発明は以上の知見ないし成果に基づき、以下の抗炎症剤などを提供する。
［１］酢酸又は酢酸の塩を主成分として含有する抗炎症剤。
［２］前記酢酸の塩が酢酸ナトリウムであることを特徴とする、［１］に記載の抗炎症剤。
［３］ステロイド系抗炎症剤が組み合わされることを特徴とする、［１］又は［２］に記載の抗炎症剤。
［４］炎症性腸疾患又は接触性皮膚炎の治療用であることを特徴とする、［１］〜［３］のいずれかに記載の抗炎症剤。
［５］難治性潰瘍性大腸炎の治療用であることを特徴とする、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の抗炎症剤。
［６］［１］又は［２］に記載の抗炎症剤を含有する食品。
［７］抗炎症剤を製造するための、酢酸又は酢酸の塩の使用。
［８］炎症性疾患を罹患した対象に対して、酢酸又は酢酸の塩を治療上有効量投与することを含む、炎症性疾患の治療法。

酢酸・酢酸塩によるNFATの活性化、NF-κBの活性化、及びIL-2産生への影響。（Ａ，Ｂ）Jurkat細胞を5mMの酢酸、乳酸、ピルビン酸あるいは塩酸の存在下PMA+ionomycinで刺激し、NFATの活性化あるいはNF-κBの活性化をNFAT依存（Ａ）あるいはNF-kB依存（Ｂ）ルシフェレースレポーターアッセイで測定した。実験は３回行い、グラフは平均±標準偏差を示す。（Ｃ）胸腺のT細胞を酢酸塩あるいはCyclosporin A (CsA)存在下PMA+ionomycinで刺激した。NFATの脱リン酸化(dephosphorylated)をウエスタンブロット解析で評価した。（Ｄ）5〜10mMの酢酸塩によるNF-κB活性化への影響をレポーターアッセイで用いて評価した。（Ｅ）Jurkat細胞を酢酸塩0〜10mM存在下PMA+ionomycinで刺激した後に培地中のIL-2の濃度を測定した。酢酸塩によるNFAT1の核内移行、p65の核内移行、NFAT1の脱リン酸化、calcineurin活性およびNFAT1-importin beta1に対する影響。（Ａ，Ｂ）Jurkat細胞（Ａ）あるいは胸腺から取り出した細胞（Ｂ，主にT細胞からなる）を酢酸塩存在下PMA+ionomycinで刺激した。核分画中NFAT1およびp65の量をウエスタンブロット分析で評価した。実験は３回行ったがいずれも同様な結果を得た。（Ｃ）Jurkat細胞を酢酸塩存在下PMA+ionomycinで刺激した。NFAT1の脱リン酸化を細胞溶解液のウエスタンブロット分析で評価した。（Ｄ）Calcineurinの活性に対する酢酸塩5〜10mMの影響を比色実験で評価した。実験は３回行い、グラフは平均±標準偏差を示す。（Ｅ）Jurkat細胞を酢酸塩存在下PMA+ionomycinで刺激し、溶解し、抗NFAT1抗体で免疫沈降（IP）を行った。血漿中酢酸塩濃度および酢酸塩投与のTNBS腸炎に対する効果。（Ａ）マウスに酢酸塩150 mM 600μl(白丸)あるいは500mM 400μl(黒四角)を腹腔内に投与し、７．５分、３０分、１２０分後に採血をし、血漿中の酢酸塩の濃度を測定した。グラフは平均±標準偏差を示す。各時点では３つのサンプルを測定した。（Ｂ）TNBS注腸前および２日後に体重を測定した。グラフは平均±標準偏差を示す。各群５匹のマウスを使用した。コントロール群と比較し、＊は危険率５％以下、＊＊は危険率１％以下で有意差があることを示す。（Ｃ）腸管の長さを測定した。正常とはTNBS注腸を受けていないマウスを示し、５匹を使用した。（Ｄ）腸炎の程度を組織像で評価しスコアで表した。各群から採取した腸管の肉眼的所見および顕微鏡的所見。（Ａ）各群から採取した腸管の肉眼的所見を示す。（Ｂ〜Ｄ）コントロール群（Ｂ）、酢酸塩群（Ｃ）、デキサメタゾン群（Ｄ）から採取した腸管の顕微鏡所見を示す。倍率は２００倍である。酢酸塩投与のDNFB皮膚炎に対する効果。マウスの耳にDNFBで皮膚炎を誘起した。耳の厚さを皮膚炎誘起前および誘起１日後に測定し、耳の腫脹を評価した。グラフは平均±標準偏差を示す。各群６匹のマウスを使用した。コントロール群と比較し、＊＊は危険率１％以下で有意差があることを示す。 NFAT活性化を抑制する機序のモデル。T細胞受容体刺激やPMA+ionomycin刺激などによりNFATはcalcineurinを介して脱リン酸化される。脱リン酸化によりNFATの核内移行シグナルは露出され、importinsとの複合体の形成が生じ、その結果、核内へとNFATは移行して行く。Cyclosporin AやFK506はcalcineurinの活性を抑制する。noncoding RNA repressor of NFAT（NRON)はimportin β1と結合し、NFATの核内移行を妨げる。酢酸塩はNFATとimportin β1との複合体形成を障害し、NFATの核内移行を阻害する。大腸内視鏡検査所見。難治性潰瘍性大腸炎の症例に酢酸ナトリウム注腸を行った。治療前（左）では広範囲に認められた粘膜の発赤、浮腫、潰瘍が治療後（右）ではほとんど認められない。

本発明の抗炎症剤は酢酸又は酢酸の塩を主成分として含有する。即ち本発明の抗炎症剤には、抗炎症作用を発揮する有効成分として酢酸（ＣＨ_３ＣＯＯＨ）又は酢酸の塩が含有される。酢酸の塩の例として酢酸ナトリウム（ＣＨ_３ＣＯＯＮａ）、酢酸カルシウム（（ＣＨ_３ＣＯＯ）_２Ｃａ）等を挙げることができる。これらの中でも特に酢酸ナトリウムが好ましい。ナトリウム塩は食品添加物や医薬品原料などとして幅広い用途で使用されてきた実績があり、その安全性が高いからである。
本発明の抗炎症剤に使用される酢酸の塩は無水物又は水和物のいずれであってもよい。例えば、酢酸ナトリウムであれば無水物又は三水和物が使用される。
主成分として２種類以上の化合物（いずれの成分も酢酸又は酢酸の塩である）を併用して本発明の抗炎症剤を構成してもよい。２種類以上の化合物を併用した場合の具体例として、酢酸と酢酸ナトリウムを主成分として含有する抗炎症剤を挙げることができる。

後述の実施例に示す通り、酢酸及び酢酸の塩は転写因子NFATの活性化を特異的に抑制することによりその抗炎症作用を発揮することが明らかとなった。この作用機序に鑑みれば、酢酸又は酢酸の塩を主成分として含有する本発明の抗炎症剤は、実際に確認された炎症性腸疾患および接触性皮膚炎のみならず、NFATの活性化を抑制する免疫抑制剤（シクロスポリンなど）が治療に有効であるとことが既に証明されている炎症性疾患、例えばベーチェット病や膠原病性間質性肺炎などに対しても有効であると推測される。このように本発明の抗炎症剤の治療対象疾患は、NFATの活性化を抑制することが治療上有効であるという条件を満たす限り、特に限定されるものではない。
好ましくは、炎症性腸疾患又は接触性皮膚炎（特にアレルギー性皮膚炎）の治療において本発明の抗炎症剤が使用される。尚、炎症性腸疾患とは消化管（主として小腸、大腸）の炎症を症状とする疾患であり、潰瘍性大腸炎（UC：Ulcerative Colitis）とクローン病（CD：Crohn's Disease）を含む。一態様では、難治性潰瘍性大腸炎（ステロイド難治症例やステロイド離脱困難症例など）の治療に本発明の抗炎症剤が使用される。

本発明の抗炎症剤の製剤化は常法に従って行うことができる。製剤化する場合には、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）を含有させることができる。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、D-マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。無痛化剤としてはベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトール等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、ジエチリン亜硫酸塩、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等と用いることができる。

製剤化する場合の剤型も特に限定されず、例えば錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、注射剤、点滴剤、外用剤、及び座剤などとして本発明の抗炎症剤を提供できる。
本発明の抗炎症剤には、期待される治療効果を得るために必要な量（即ち治療上有効量）の有効成分（主成分）が含有される。本発明の抗炎症剤中の有効成分量は一般に剤型によって異なるが、所望の投与量を達成できるように有効成分量を例えば約0.3重量％〜100重量％の範囲内で設定する。

本発明の抗炎症剤はその剤型に応じて経口投与又は非経口投与（静脈内、動脈内、皮下、筋肉、又は腹腔内注射、経皮、経鼻、経腸、経肛門、経粘膜など）によって対象に適用される。ここでの「対象」は特に限定されず、ヒト及びヒト以外の哺乳動物（ペット動物、家畜、実験動物を含む。具体的には例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、サル、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ニワトリ、ウズラ等である）を含む。好ましくは、本発明の抗炎症剤はヒトに対して使用される。

本発明の抗炎症剤の投与量は、期待される治療効果が得られるように設定される。治療上有効な投与量の設定においては一般に患者の病状、年齢、性別、及び体重などが考慮される。尚、当業者であればこれらの事項を考慮して適当な投与量を設定することが可能である。有効成分量が例えば80mg/kg/日〜250mg/kg/日、好ましくは100mg/kg/日〜200mg/kg/日となるように投与量を設定することができる。投与スケジュールとしては例えば１日１回〜数回、２日に１回、或いは３日に１回などを採用できる。投与スケジュールの作成においては、患者の病状や有効成分の効果持続時間などを考慮することができる。

後述の実施例で示すように、酢酸又は酢酸の塩の作用機序の一端が明らかになるとともに、ステロイド系抗炎症剤であるデキサメタゾンとの併用によって一層の治療的効果がもたらされることが判明した。この知見に基づいて本発明の一態様はステロイド系抗炎症剤が組み合わされることを特徴とする。「ステロイド系抗炎症剤が組み合わされる」とは、酢酸又は酢酸の塩とともにステロイド系抗炎症剤が用いられること、即ちステロイド系抗炎症剤が併用されることを意味する。この態様の抗炎症剤は、典型的には、酢酸又は酢酸の塩とステロイド系抗炎症剤とを混合した配合剤として提供されるが、これに限られるものではない。即ち、酢酸又は酢酸の塩を含有する抗炎症剤とステロイド系抗炎症剤を別々に用意することにしてもよい。この場合、対象に対して同時又は所定の時間的間隔を置いて両剤が投与（適用）されることになる。好ましくは、両剤を同時に投与することにする。両剤の作用が相俟って高い治療的効果が発揮されるからである。ここでの「同時」は厳密な同時性を要求するものではない。従って、両剤を混合した後に対象へ投与する等、両者の投与が時間差のない条件下で実施される場合は勿論のこと、片方の投与後、速やかに他方を投与する等、両剤の投与が実質的な時間差のない条件下で実施される場合もここでの「同時」の概念に含まれる。一方、片方の投与後、所定の時間的間隔を置いて他方を投与することにする場合は、両剤の作用期間が少なくとも一部で重なり合うように時間的間隔を設定することが好ましい。例えば、片方の投与後５時間以内、好ましくは１時間以内、更に好ましくは３０分以内に他方を投与する。

ステロイド系抗炎症剤の種類は特に限定されない。プロピオン酸クロベタゾール、酢酸ジフロラゾン、プロピオン酸デキサメタゾン、ジフルプレドナート、ジプロピオン酸ベタメタゾン、ブデソニド、吉草酸ジフルコルトロン、フルオシノニド、アムシノニド、ハルシノニド、酪酸ジプロピオン酸ヒドロコルチゾン、フランカルボン酸モメタゾン、酢酸プロピオン酸ベタメタゾン、吉草酸デキサメタゾン、プロピオン酸デポロドン、吉草酸ベタメタゾン、プロピオン酸ベクロメタゾン、フルオキシノロンアセトニド、フルドロキシコルチド、吉草酸プレドニゾロン、トリアムシノロンアセトニド、ピバル酸フルメタゾン、酪酸クロベタゾン、デキサメタゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、プロピオン酸アルクロメタゾン、酢酸メチルプレドニゾロン、酢酸プレドニゾロン、プレドニゾロン等をステロイド系抗炎症剤の例として挙げることができる。ステロイド系抗炎症剤の使用量は、当該ステロイド系抗炎症剤が単独で使用される場合の使用量（即ち、通常の使用量）に準ずる。当業者であれば患者の病状や年齢、性別、体重などを考慮して「通常の使用量」を設定することができる。一例を示すと、デキサメタゾンの場合であればその使用量を例えば0.04〜0.4mg/kg/日とすればよい。

本発明の抗炎症剤を食品の形態で提供することもできる。本発明での「食品」の例として一般食品（穀類、野菜、食肉、各種加工食品、菓子類、清涼飲料水、アルコール飲料等）、栄養補助食品（サプリメント）を挙げることができる。栄養補助食品の場合、粉末、顆粒末、タブレット、ペースト、液体等の形状で提供することができる。抗炎症剤の使用量（含有量）は、本発明の食品の摂取（継続的な摂取を含む）によって、炎症性疾患に対する治療的又は予防的効果が期待できる量とする。抗炎症剤の使用量は、本発明の食品を摂取する者（適用対象）の症状、年齢、性別、体重などを考慮して設定することができる。

＜酢酸及び酢酸塩の新規作用及びその分子的機序＞
１．実験材料と方法
（１）試薬
酢酸、乳酸、ピルビン酸、塩酸、酢酸塩(酢酸ナトリウム)、TNBS、及びDNFBは和光純薬工業株式会社（大阪、日本）から購入した。PMA、ionomycin、ウサギ抗importin β1抗体はシグマ−アルドリッチ社（セントルイス、ミズーリ州、米国）より購入した。デキサメタゾンはLKT Laboratories（セントポール、ミネソタ州、米国）から購入した。マウス抗NFAT1抗体はBD Pharmingen（サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）から、ウサギ抗NFAT1抗体はAviva Antibody Corporation（サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）から購入した。ウサギ抗p65抗体はCell Signaling（ベバリー、マサチューセッツ州、米国）から購入した。

（２）ルシフェレースレポーターアッセイ
NFAT依存およびNF-κB依存fireflyルシフェレースレポーターについては既報の通りである(参考文献２０、２１)。T細胞白血病由来のJurkat cellsにNFAT依存（10μg）あるいはNF-κB依存（3μg）ルシフェレースレポーターおよびRenillaルシフェレースを発現するphRL-TK（10ng）をエレクトロポレーションにより導入した(参考文献２２)。翌日、細胞を酢酸、乳酸、ピルビン酸、塩酸あるいは酢酸塩とともに３０分間培養し、PMA(20ng/ml)+ionomycin(0.4μM)で４時間刺激した後にルシフェレースの活性をdual-luciferase reporter assay system（プロメガ社）を用いて測定した。NFATあるいはNF-κBの活性はfireflyルシフェレースの活性をRenillaルシフェレースで補正することにより評価した。

（３）IL-2産生
Jurkat細胞(3×10⁶)を300μlの培地に集め、酢酸塩0〜10mMと３０分間培養し、PMA(20ng/ml)+ionomycin(0.4μM)で６時間刺激した後に培地のIL-2の濃度をenzyme amplified sensitivity immunoassay（Biosource社）で測定した。

（４）核分画抽出
Jurkat細胞(1×10⁷)あるいはマウスの胸腺から得た細胞(3×10⁷)を500μlの培地に集め、酢酸塩5mMと３０分間培養し、PMA(20ng/ml)+ionomycin(0.4μM)で３０分間刺激した後に核分画を抽出した(参考文献２３)。DC protein assay（バイオラッド社）を利用して、ウエスタンブロット分析に用いるサンプル中の総タンパクを同量に調整した。

（５）NFATの脱リン酸化
胸腺のT細胞（1×10⁷）を400μlに集め、酢酸塩5mMあるいはCyclosporin A 5μMと30分間培養し、PMA(20ng/ml)+ionomycin(0.4μM)で３０分間刺激した後に溶解バッファー(20 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM ethylenediaminetetraacetic acid pH 8.0, 50 mM NaF, 1 % Triton X-100, 1 mM sodium vanadate, 5,8 KIU/ml aprotinin)で溶解し、上清を遠心分離で得た。BCA protein assay（Perce社）を利用して、ウエスタンブロット分析に用いるサンプル中の総タンパクを同量に調整した。

（６）Calcineurin活性
Calcineurinの脱リン酸化活性に対する酢酸塩の影響をBIOMOL GREEN Calcineurin Assay Kit（BIOMOL International社）で評価した。手短に記すと、40Uのcalcineurinを5mM又は10mMの酢酸塩と混合し、リン酸化ペプチド基質と反応させた。Calcineurinの脱リン酸化活性により遊離したリン酸で試薬を発色させその吸光度を測定した。

（７）免疫沈降
Jurkat細胞(3×10⁶)を300μlに集め酢酸塩5mMと３０分間培養し、PMA(20ng/ml)+ionomycin(0.4μM)で３０分間刺激した後に溶解バッファーで溶解した。マウス抗NFAT1抗体2μgとプロテインG-セファロース（GEヘルスケアバイオサイエンス社）15μlを用いてNFAT1を沈降させた。

（８）動物実験
メス７週齢のBALB/cマウスをJapan SLC（浜松、日本）から購入した。全ての動物実験は名古屋大学医学部動物実験施設のガイドラインに沿い名古屋大学医学部倫理委員会の承認のもとで行われた。

（９）血漿中酢酸塩濃度
マウスの腹腔内に酢酸塩を150mM 600μlあるいは500mM 400μl投与した。７．５分、３０分、１２０分後に採血を行い、F-kit（ロッシュ・ダイアグノスティックス社）を用いて酵素法により血漿中の酢酸塩の濃度を測定した。

（１０）TNBSによる腸炎の誘発と酢酸塩の投与
５匹のマウスを群間で体重の偏りがないように３群に分けた。マウスにはTNBS 1mgを含む50%エタノールを100μl注腸した。以前の実験によりこの注腸により低い死亡率で効率よく腸炎を誘発しかつ体重減少が２日後にピークに達することがわかっている(参考文献６)。そのため、酢酸ナトリウム500mM 400μl(酢酸塩群)、塩化ナトリウム500mM 400μl(コントロール群)あるいはデキサメタゾン15μg/mlを含んだ塩化ナトリウム500mM 400μl(デキサメタゾン群)をTNBS注腸の直前と６時間後に腹腔内に投与し、体重は最初の投与の前とTNBS注腸の２日後に測定した。体重減少は下記の式に従って計算した。
体重減少(％)＝（最初の投与前の体重−TNBS注腸２日後の体重）／最初の投与前の体重×100

体重を測定した後、大腸を摘出するためマウスを安楽死させた。大腸遠位２センチを長軸方向に開き、４％パラホルムアルドヒドで固定し、パラフィンに包埋した。作成した切片をヘマトキシリンとエオジンで染色し、Fussらのスコア(参考文献２４)を少し改良したものを用いて腸炎の程度を組織像で評価した（０：炎症なし；１：高倍率視野で５０％に満たない範囲でリンパ球浸潤有り、腸管の構造に変化なし；２：高倍率視野で５０％に満たない範囲でリンパ球浸潤有り、cryptの構造変化有り、上皮の破壊なし；３：高倍率視野で５０％以上の範囲にリンパ球浸潤有り、上皮の破壊なし；４：高倍率１視野を越えない局所的な上皮の破壊；５：高倍率１視野を越える上皮の破壊；６：高倍率２視野を越える広範な上皮の破壊）。全てのスライドは盲目的に評価した。

（１１）DNFBによる皮膚炎の誘起と酢酸塩の投与
６匹のマウスを群間で体重の偏りがないように４群に分けた。マウスの背中を剃毛しDNFB 0.2% 40μlを連日２回塗布することにより感作し、それから３日後に右耳の両側にDNFB 0.2% 20μl塗布することで皮膚炎を誘起した。以前の実験および予備的な実験により皮膚の腫脹（肥厚）は皮膚炎誘起１日後にピークに達することがわかっている(参考文献２５〜２７)。そのため酢酸ナトリウム500mM 400μl(酢酸塩群)、デキサメタゾン15μg/mlを含んだ酢酸ナトリウム500mM 400μl（酢酸塩＋デキサメタゾン群）、塩化ナトリウム500mM 400μl(コントロール群)あるいはデキサメタゾン15μg/mlを含んだ塩化ナトリウム500mM 400μl(デキサメタゾン群)を皮膚炎誘起直前と６時間後に腹腔内に投与し、耳の厚さを最初の投与前と皮膚炎誘起１日後に小型デジタルノギスで測定した。耳の腫脹は下記の式に従って計算した。
耳の腫脹（％）=(皮膚炎誘起１日後の耳の厚さ−最初の投与前の耳の厚さ)／最初の投与前の耳の厚さ×100

（１２）統計処理
Mann-Whitney U testを用いて統計処理を行った。危険率５％未満を有意差ありと判定した。

２．結果
（１）酢酸及び酢酸塩（酢酸ナトリウム）がNFATの活性化、NF-κBの活性化、IL-2の産生に与える影響
酢酸、乳酸、ピルビン酸そして塩酸がNFATの活性化およびNF-κBの活性化に与える影響を評価するためにルシフェレースレポーターアッセイを行った。その結果、酢酸が最も劇的にNFATの活性化を抑制することがわかった(図１Ａ)。ピルビン酸もNFATの活性化を抑制するもののその程度はごくわずかであった(図１Ａ)。乳酸、塩酸はNFATの活性化に影響を与えなかった(図１Ａ)。一方、いずれの酸もNF-κBの活性化には影響を与えなかった(図１Ｂ)。酢酸同様に酢酸塩もNFATの活性化を劇的に抑制する一方でNF-κBの活性化には影響を与えなかった。(図１Ｃ、Ｄ)。酢酸塩の方が酢酸に比べ培地のpHに与える影響がはるかに少ないため（+5 mM 酢酸塩, pH 7.40 → 7.43; +5 mM 酢酸, pH 7.40 → 7.04）、以下の実験では酢酸塩を用いた。
酢酸塩がサイトカインであるインターロイキン-2(IL-2)の産生に与える影響を評価するためT細胞の白血病由来のJurkat細胞を酢酸塩の存在下及び非存在下で刺激した後に培地のIL-2の濃度を測定した。その結果、酢酸塩が存在するとIL-2の産生が抑制されることがわかった(図１E)。

（２）酢酸塩はNFAT1とimportin β1との相互作用を妨げ、NFAT1の核内移行を障害する
酢酸塩がNFAT1およびNF-κBの核内移行に与える影響を評価するため、細胞の核内のNFAT1およびNF-κBのサブユニットであるp65の量をウエスタンブロット分析で評価した。その結果、酢酸塩はNFAT１の核内移行を妨げる一方でNF-κBの核内移行には影響を与えないことがわかった。Jurkat細胞においてもマウスの胸腺から取り出した細胞においても同様な結果を得た(図２Ａ、Ｂ)。しかしながら酢酸塩はNFAT1の核内移行に先行するNFAT1の脱リン酸化には影響を与えなかった(図２Ｃ)。更にNFAT1を脱リン酸化するcalcineurinの酵素活性にも影響を与えなかった(図２Ｄ)。そこでNFAT1が脱リン酸化した後に生じるNFAT1とimportin β1と結合について評価するために細胞を酢酸塩の存在下及び非存在下で刺激し、その後に免疫沈降によりNFAT1を回収した。刺激によりimportin β1はNFAT1とともに回収されるが、酢酸塩が存在するとその回収が妨げられた(図２Ｅ)。このことから酢酸塩はNFAT1とimportin β1との相互作用を妨げることによりNFAT1の核内移行を障害することがわかった。

（３）TNBS腸炎およびDNFB皮膚炎に対する酢酸塩の効果について。
マウスの腹腔内に酢酸塩を150mM 600μlあるいは500mM 400μl投与した後に採血を行い、血漿中の酢酸塩がどの程度上昇するか測定した。その結果、150mM 600μl投与後には約2mMまで上昇する一方で500mM 400μl投与後には5mMを超えることがわかった(図３Ａ)。また投与２時間後には酢酸塩濃度は投与前のレベルに戻ることもわかった(図３Ａ)。以上から酢酸塩の血漿中濃度を2.5〜10mMになるべく長く保った上でTNBS腸炎およびDNFB皮膚炎に対する効果を判定するために酢酸塩500mM 400μlを腸炎・皮膚炎を誘起する直前と６時間後に投与することにした。

TNBSをマウスに注腸すると腸炎が誘起され体重は減少した(図３Ｂ)。酢酸塩を投与するとその体重減少はステロイドであるデキサメタゾンを投与した場合と同程度改善された(図３Ｂ)。また腸炎により大腸の長さも短縮するがその短縮も酢酸塩、デキサメタゾンで同等に改善された(図３Ｃ、図４Ａ)。腸管の組織像を評価したところ酢酸塩、デキサメタゾンにより腸炎が改善されたことが確認できた(図３Ｄ、図４Ｂ〜Ｄ)。
DNFBにより耳に皮膚炎が誘起され耳は腫脹（肥厚）するが、その腫脹は酢酸塩、デキサメタゾンを投与すると改善された(図５)。興味深いことに酢酸塩とデキサメタゾンを併用投与すると耳の腫脹は更に一層改善された(図５)。

３．考察
NFATはT細胞においてサイトカインの産生や分化において重要な役割を果たす転写因子である(参考文献４)。Cyclosporin AやFK506のようなNFATの活性化を抑制する薬剤は強力な免疫抑制剤として知られ、炎症性疾患の治療に用いられている。我々はレポーターアッセイを用いて酢酸および酢酸塩がPMA+ionomycin（T細胞受容体を刺激した場合と同様な効果を発揮）によるNFATの活性化に与える影響を評価した。その結果、酢酸・酢酸塩ともにNFATの活性化を劇的に抑制することがわかった。また酢酸・酢酸塩は抗体でT細胞受容体を刺激した場合のNFAT活性化も抑制することを確認している(データ省略)。一方、酢酸・酢酸塩いずれもNF-κBの活性化には影響を与えなかった。以上から酢酸・酢酸塩はT細胞においてNFATの活性化を特異的に抑制することが示唆された。NFATはもともとIL-2の発現を制御する転写因子として同定され(参考文献１４)、IL-2のpromoterに存在する５つのNFAT結合部位はIL-2の発現に必須である(参考文献１５)。そこで我々はPMA+ionomycinで刺激したJurkat細胞の培地のIL-2濃度を測定したところ、酢酸塩は濃度依存的にIL-2の産生を抑制することを発見した。

活性化していないT細胞ではNFAT及びNF-κBはいずれも細胞質に存在し、T細胞受容体刺激やPMA+ionomycin刺激があると核内へと移行する(参考文献３、４、７)。酢酸塩はNFATの核内移行を障害するがNF-κBの核内移行は障害しなかった。このことは酢酸塩がNFATの核内輸送の段階に介入して効果を発揮していることを意味している。

核内輸送においてNFATはcalcineurinにより脱リン酸化される(参考文献４)。この脱リン酸化によりNFATの核内移行シグナルが露出されimportinsに認識され、NFAT/importinsの複合体が形成され細胞質から核内へと輸送されていく(参考文献１６)。NFATを標的とした免疫抑制剤であるcyclosporin AやFK506はcalcineurinの活性を抑制し、NFATの脱リン酸化を妨げることが知られている(参考文献７)。これとは対照的に酢酸塩はNFATの脱リン酸化もcalcineurinの活性化も抑制しなかった。noncoding RNA repressor of NFAT(NRON)がimportin β1と結合することでNFATの活性化、核内移行を特異的に抑制するという報告が過去にあった(参考文献１７)。これはimportin β1がNFATの核内移行に関与していていることを示唆している。我々は酢酸塩がこのimportin β1とNFATとの相互作用を妨げているのではないかと推測した。そこでその相互作用に対する酢酸塩の影響を評価したところ、細胞をPMA+ionomycinで刺激するとimportin β1はNFAT1と結合するが酢酸塩はこの結合を妨げることがわかった。Importin β1はNFAT1に直接、あるいはimportins αを介して結合すると考えられる(参考文献１６)。したがって、酢酸塩の効果の分子的機序については以下の３つの可能性が考えられる。酢酸塩はimportin β1とNFATとの直接的な相互作用を妨げる。Importin β1はimportin αを介してNFATに結合し、酢酸塩はimportin β1とimportin αとの相互作用を妨げるか、もしくはimportin αとNFATとの相互作用を妨げる。

最後に我々は二つの炎症性疾患マウスモデル（TNBS誘発腸炎とDNFB誘発皮膚炎）を用いて酢酸塩投与が炎症性疾患の改善に有効かどうか評価した。TNBSとDNFBはともにT細胞の活性化を介して炎症を誘起することでよく知られたハプテンである(参考文献１８、１９)。予備的な実験の結果、酢酸塩500mM 400μlを腹腔内に投与することで血漿中の酢酸塩を5〜10mMまで高めることができることを確認した。炎症性疾患の治療において頻用されるとの理由から、有効な薬剤のコントロールとしてデキサメタゾンを使用することにした。今回投与した量は0.6mg/kg/日に相当し臨床投与量0.04〜0.4mg/kg/日より若干多くした。
TNBS腸炎では体重が減少し腸管も短縮するが、酢酸塩はデキサメタゾンと同等にそれらを改善した。さらに腸管の組織像を検討した結果、酢酸塩が腸炎を抑制するのに有効であることが確認された。またDNFBにより耳に皮膚炎を誘起すると耳が腫脹（肥厚）するが、酢酸塩はデキサメタゾンと同等にこの腫脹を改善した。更に酢酸塩とデキサメタゾンを併用投与するとより一層の改善を見た。したがって、酢酸塩をデキサメタゾンと併用することでより一層の治療的効果が期待できる。
まとめとして図６に酢酸塩の作用機序のモデルを提示する。NFATの活性化はcalcineurinの脱リン酸化により始まり、その脱リン酸化はNFATとimportinsとの複合体形成を招き、細胞質から核内へと移行していく。Cylcosporin AとFK506はcalcineurinの活性を抑制することでNFATの活性化を抑える。更にそれより下流で酢酸塩とNRONはNFATとimportin β1と関連を妨げることでNFATの核内移行を障害する。

＜酢酸塩のヒトでの治療効果＞
１．方法
（１）対象
炎症性腸疾患、特にステロイド難治症例あるいはステロイド離脱困難症例（潰瘍性大腸炎の左側大腸炎型）を対象とした。
（２）投与方法・投与期間
酢酸ナトリウム50mMを50ml、１日２回経肛門的に投与（注腸)した。投与期間は４週間とした。
（３）判定項目
症状（下痢及び出血の頻度）、血液検査及び内視鏡的所見によって治療効果を評価した。

２．結果
下痢の頻度を治療前後で比較したところ、治療前の６．０回／日（治療前３日間の平均）に比較して治療後は３．７回／日（治療後３日間の平均）であり、治療による明らかな改善を認めた。出血（便への血液の混入）の頻度についても同様に明らかな改善を認めた（治療前：100%、治療後：50%以下）。一方、内視鏡的所見では、治療前では広範囲にわたって認められた潰瘍及び炎症が（図７左）、治療によって明らかに減少ないし軽減していた（図７右）。

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本発明の抗炎症剤はステロイド系抗炎症剤と異なる機序で作用するものであり、炎症性疾患に対する治療法の新たな選択肢を提供する。一方、本発明の抗炎症剤をステロイド系抗炎症剤と併用することが、炎症性疾患に対する効果的な治療法の一つとなるであろう。炎症性腸疾患や接触性皮膚炎をはじめ、NFATの活性化が発症又は病状の進行の原因となる様々な炎症性疾患に対する治療法において本発明の抗炎症剤が使用されることが大いに期待される。

この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。

Claims

酢酸又は酢酸の塩を主成分として含有する抗炎症剤。
前記酢酸の塩が酢酸ナトリウムであることを特徴とする、請求項１に記載の抗炎症剤。
ステロイド系抗炎症剤が組み合わされることを特徴とする、請求項１又は２に記載の抗炎症剤。
炎症性腸疾患又は接触性皮膚炎の治療用であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗炎症剤。
難治性潰瘍性大腸炎の治療用であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗炎症剤。
請求項１又は２に記載の抗炎症剤を含有する食品。