JPWO2007105797A1

JPWO2007105797A1 - 新規なヒトｔ細胞集団

Info

Publication number: JPWO2007105797A1
Application number: JP2008505206A
Authority: JP
Inventors: 修治中村; 龍一元田; 正義木畑; 薫三折田; 史行山▲さき▼
Original assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 2006-03-15
Filing date: 2007-03-15
Publication date: 2009-07-30
Anticipated expiration: 2027-03-15
Also published as: WO2007105797A1; TW200813226A; EP1997884A4; JP5118624B2; EP1997884A1; KR20080111054A; US20090297490A1; EP1997884B1; US8883495B2; TWI410495B

Abstract

細胞障害活性および免疫抑制活性の両方を有する新規なヒトＴ細胞集団、並びにその取得方法を提供することを課題とし、ヒトの血液から採取される単核球細胞をストローマ細胞と共培養することによって取得され、かつ、下記の特徴を有するヒトＴ細胞集団：（１）ＣＤ３、ＣＤ２５、ＣＤ２８及びＴ細胞抗原受容体αβが陽性である、（２）本質的に、ＣＤ４陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞、ＣＤ４陽性ＣＤ８弱陽性Ｔ細胞およびＣＤ４陰性ＣＤ８陽性Ｔ細胞の３つのグループからなる、（３）共培養したストローマ細胞に対して細胞障害活性を発揮する、及び、（４）活性化Ｔ細胞に対して免疫抑制活性を発揮する、を提供することにより、課題を解決する。

Description

本発明は新規なヒトＴ細胞集団に関するものであり、とりわけ、ストローマ細胞と共培養することによって取得され、かつ、細胞障害活性及び免疫抑制活性を有する新規なヒトＴ細胞集団に関するものである。
背景技術

Ｔ細胞は、種々の病原体に対する生体防御システムとしての免疫系の中心的役割をになう細胞集団の一つである。Ｔ細胞は大別してＣＤ４陽性のヘルパーＴ細胞とＣＤ８陽性の細胞障害性Ｔ細胞に分類され、前者は免疫応答の促進、後者はウイルス感染細胞や腫瘍細胞の排除に関与している。ヘルパーＴ細胞はさらに細胞性免疫を促進する１型ヘルパー細胞と体液性免疫を促進する２型ヘルパーＴ細胞に分類される。このような性質の異なるＴ細胞は、巧妙にバランスのとれた免疫応答の下、病原体の排除や感染抵抗性の獲得のために作用している。

通常、正常な免疫応答においては、生体を形成する自己抗原に対しては免疫学的寛容が成立しており排除機構が働かない。すなわち、自己反応性Ｔ細胞は、細胞死の誘導又は自己抗原に対する不応答性の誘導がなされる。とりわけ、制御性Ｔ細胞がそのような抑制に能動的に関与しているといわれている。制御性Ｔ細胞は、他のＴ細胞に対して抑制的な作用を有するということによって定義付けられており、近年、特定の免疫応答を抑制する機能を有する細胞集団として研究され、細胞表面マーカーや産生するサイトカインの種類、免疫抑制の機構などが異なる種々の制御性Ｔ細胞が報告されている。

制御性Ｔ細胞の中でも最もよく研究されているものは、例えば、サカグチ・エス、「ナチュラリーアライジングＣＤ４＋レギュラトリーＴセルフォーイムノロジックセルフ−トレランスアンドネガティブコントロールオブイミュンレスポンシーズ」、アニュアル・レビュー・オブ・イムノロジー、第２２巻、５３１乃至５６２頁、２００４年に記載される、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性制御性Ｔ細胞（ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ_ｒｅｇ）である。現在に至るまでの多くの研究成果において、この細胞はＣＤ４及びＣＤ２５陽性を示すことから、ＣＤ４及びＣＤ２５が制御性Ｔ細胞のマーカーとなりうると考えられている。また、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性制御性Ｔ細胞については、フォンテノット・ジェイ・ディー、ギャビン・エム・エー、ルーデンスキー・エー・ワイ、「Ｆｏｘｐ３プログラムズザデベロップメントアンドファンクションオブＣＤ４＋ＣＤ２５＋レギュラトリーＴセルズ」、ネイチャー・イムノロジー、第４巻、第４号、３３０乃至３３６頁、２００３年では、転写因子のフォークヘッドボックスＰ３（ＦＯＸＰ３）を、タカハシ・ティー、タガミ・ティー、ヤマザキ・エス、ウエダ・ティー、シミズ・ジェイ、サカグチ・エヌ、タック・ダブル・エム、サカグチ・エス、「イムノロジックセルフ−トレランスメインテインドバイＣＤ２５＋ＣＤ４＋レギュラトリーＴセルズコンスティテューティブリーエクスプレッシングサイトトキシックＴリンフォサイト−アソシエーティドアンチゲン４」、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン、第１９２巻、第２号、３０３乃至３０９頁、２０００年では、Ｔ細胞を不応答に導く細胞障害性Ｔ細胞関連抗原−４（ＣＴＬＡ−４）を発現していることを開示している。一方、コスミ・エル、リオッタ・エフ、ラツェリ・エフ、フランカランキ・エム、アンジェリ・アール、マツィンジー・ビー、サンタルラスキ・ブイ、マネッティ・アール、ロマニャーニ・ピー、マッギ・イー、ロマニャーニ・エス、アニュンツィアート・エフ、「ヒューマンＣＤ８＋ＣＤ２５＋サイモサイツシェアーフェノティピックアンドファンクションフィーチャーウイッズＣＤ４＋ＣＤ２５＋レギュラトリーサイモサイツ」、ブラット、第１０２巻、第１２号、４１０７乃至４１１４頁、２００３年では、ＣＤ８陽性ＣＤ２５陽性のマーカーを有する免疫抑制活性を有するＴ細胞を開示している。

一方、細胞障害活性を有するＴ細胞としては、上記のとおりＣＤ８陽性細胞障害性Ｔ細胞が良く知られており、当該細胞は標的細胞に対して特異性の高い細胞障害活性を発揮する。特開２００５−２４５４３０号公報では、腫瘍細胞又は腫瘍細胞に特徴的な蛋白質と共に培養することにより、その腫瘍細胞に対して特異的な細胞障害活性を発揮させることが開示されている。

また、造血幹細胞の移植が実用化されている現在、十分量の造血幹細胞を取得するため、ｅｘｖｉｖｏ細胞培養技術が求められている。造血幹細胞の培養には、生体内環境を擬似したストローマ細胞との共培養が必要であるものの、長期培養が可能であり、かつ、十分な造血支持能を有するヒトストローマ細胞株はなく、さらにヒトストローマ細胞は造血幹細胞を一部分化させるサイトカインを分泌するという問題点が指摘されている。ヒト以外の異種ストローマ細胞株を用いたヒト臍帯血由来造血幹細胞の培養方法が研究されており、例えば、シュ・エム・ジェイ、ツジ・ケー、ウエダ・ティー、ムコウヤマ・ワイ、ハラ・ティー、ヤン・エフ・シー、エビハラ・ワイ、マツオカ・エス、マナベ・エー、キクチ・エー、イトウ・エム、ミヤジマ・エー、ナカハラ・ティー、「スティムレーションオブマウスアンドヒューマンプリミティブヘマトポエシスバイミューリンエンブリオティックアオルタ−ゴナド−メソネフロス−デライブドストローマルセルライン」、ブラッド、第９２巻、第６号、２０３２乃至２０４０頁、１９９８年ではヒト臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞に対して、また、ナカムラ・ワイ、アンドウ・ケイ、チャーグイ・ジェイ、カワダ・エイチ、サトウ・ティー、ツジ・ティー、ホッタ・ティー、カトウ・エス、「エックスビボジェネレーションオブＣＤ３４＋セルフロムＣＤ３４− ヘマトポエティックセルズ」、ブラッド、第９４巻、第１２号、４０５３乃至４０５９頁、１９９９年ではヒト臍帯血由来ＣＤ３４陰性細胞に対して、マウスストローマ細胞株との共培養による増殖培養法が試みられている。しかしながら、上記の培養方法は、分化した細胞集団を排除した造血幹細胞集団を、分化させないで増殖させることを目的としており、また、免疫抑制活性や細胞障害活性は、分化した造血系細胞が有する活性であることから、上記の方法で培養された細胞集団は、そのような活性を有しないと考えられる。

Ｔ細胞は、免疫系において重要な役割を担う細胞であるものの、不明な点がまだ多く、医薬品として使用されるに至っていない。研究用途及び医薬用途に、新しいヒトＴ細胞集団の取得が求められている。

斯かる状況に鑑み、本発明は、新規なヒトＴ細胞集団、並びにその取得方法を提供することを課題とするものである。

本発明者等が鋭意研究したところ、血液から採取された単核球細胞をストローマ細胞とインビトロで共培養すると、ストローマ細胞に障害を与えつつ増殖するヒトＴ細胞集団が発生することを見い出した。さらに、このヒトＴ細胞集団は、その取得のために共培養に用いたストローマ細胞だけでなく、他のストローマ細胞や一部の腫瘍細胞株に対しても細胞障害活性を発揮し、かつ、活性化ヒトＴ細胞に対して免疫抑制活性をも発揮すること、さらに、このヒトＴ細胞集団は、ＣＤ３、ＣＤ２５、ＣＤ２８及びＴ細胞抗原受容体αβ（ＴＣＲαβ）などの細胞膜抗原がほぼすべての細胞において陽性であり、ＣＤ４陽性ＣＤ８陽性のグループ、ＣＤ４陽性ＣＤ８弱陽性のグループ、ＣＤ４陰性ＣＤ８陽性のグループの３グループが共存する、生体から直接採取することができない新規なヒトＴ細胞集団であることを確認し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、細胞障害活性及び免疫抑制活性の両方を有する新規なヒトＴ細胞集団、及びその取得方法を提供することによって、前記課題を解決するものである。

本発明によれば、細胞障害活性及び免疫抑制活性の両方を有するヒトＴ細胞集団を取得することができる。この方法で取得されるヒトＴ細胞集団は生体から直接採取することができない新規な細胞集団であり、研究用途に有用である。また、これを含む医薬組成物は、各種癌疾患、自己免疫疾患及びアレルギー性疾患の治療、移植時における拒絶反応や移植片対宿主反応の緩和に有用である。

図１は、本発明のヒトＴ細胞集団Ｕ３のＣＤ４及びＣＤ８の発現分布を示すフローサイトメトリー図である。図２は、本発明のヒトＴ細胞集団Ｕ３とＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性Ｔ細胞におけるＦＯＸＰ３のＲＴ−ＰＣＲ解析結果を示す図である。図３は、本発明のヒトＴ細胞集団Ｕ３と各グループにおけるＦＯＸＰ３のウエスタンブロッティング解析結果を示す図である。図４は、本発明のヒトＴ細胞集団Ｐ１のＣＤ４及びＣＤ８の発現分布を示すフローサイトメトリー図である。図５は、本発明のヒトＴ細胞集団Ｐ１のＴＣＲγδの発現分布を示すフローサイトメトリー図である。

符号の説明

１：ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性制御性Ｔ細胞
２：抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体処理したＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性制御性Ｔ細胞
３：ヒトＴ細胞集団Ｕ３
４：ヒトＴ細胞集団Ｕ３
５：ヒトＴ細胞集団Ｕ３におけるＡグループ
６：ヒトＴ細胞集団Ｕ３におけるＢグループ
７：ヒトＴ細胞集団Ｕ３におけるＣグループ

本発明のヒトＴ細胞集団は、ヒト血液から採取される単核球細胞をストローマ細胞と共培養することにより取得され、以下の特徴を有する。
（１）ＣＤ３、ＣＤ２５、ＣＤ２８及びＴＣＲαβが陽性である。
（２）ＣＤ４陽性ＣＤ８陽性（ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋）のグループ、ＣＤ４陽性ＣＤ８弱陽性（ＣＤ４^＋ＣＤ８^ｄｉｍ）のグループ、及び、ＣＤ４陰性ＣＤ８陽性（ＣＤ４⁻ＣＤ８^＋）のグループからなる。
（３）共培養に用いたストローマ細胞に対して細胞障害活性を発揮する。
（４）活性化Ｔ細胞に対して免疫抑制活性を発揮する。
また、この他に、本発明のヒトＴ細胞集団は、ＩＬ−２存在下においてインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）を産生する。

本発明のヒトＴ細胞集団は、ヒトの血液から採取された単核球細胞をストローマ細胞と共培養することによって取得される。ヒトの血液としては、どのようなものを用いてもよいが、例えば、臍帯血、末梢血又は骨髄液などが利用され、同一ドナーからの必要量の確保のしやすさの点で、臍帯血又は末梢血が有利に用いられる。臍帯血は、近年の臍帯血移植技術の普及につれて、インフォームドコンセントの下で容易に収集されるようになった。また、本発明のヒトＴ細胞集団の取得には、現在の臍帯血収集の主目的であるＣＤ３４陽性の細胞集団を必要としないことから、ＣＤ３４陽性の細胞を採取した残りの臍帯血由来の単核球細胞であっても利用できる。なお、本発明のヒトＴ細胞集団には、ＣＤ３４陽性の細胞集団は存在しないことから、取得の工程で消失すると考えられる。一方、末梢血は、同一ドナーからの繰り返しの採取が可能であり、また、患者から採取した末梢血に対して本発明のヒトＴ細胞集団の取得方法を適用して、本発明のヒトＴ細胞集団を取得した後、それを再び同一患者に戻す治療方法、すなわち、ｅｘｖｉｖｏ療法に適用できるという利点がある。本発明のヒトＴ細胞集団は、どのような血液サンプルからでも取得可能であると考えられるが、ドナーによっては取得できない場合や、以前に取得されたドナーからでも必ずしも取得できない場合がある。

ヒトの血液から単核球細胞を採取する方法としては、常法のフィコールパックなどを使用した密度勾配遠心法などが適用される。採取された単核球細胞は、血液細胞用の培地、例えば、Ｄ−ＭＥＭ培地、α−ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地などにより、常法により培養される。所望により、適宜の濃度のウシ胎児血清を補足した培地を用いることができる。本発明のヒトＴ細胞集団を取得するには、血液から採取した単核球細胞とストローマ細胞との共培養の工程が重要であり、単核球細胞の単独培養、及び、ストローマ細胞以外の細胞との共培養では取得することは難しい。ストローマ細胞は、造血幹細胞の培養系において必須な細胞であるといわれており、細胞接着及びケモカイン類を介して、造血幹細胞を増殖させる能力がある。ストローマ細胞としては、入手しやすさの点で、市販のマウスストローマ細胞株、例えば、ＳＴ２細胞、ＯＰ９細胞、ＭＣ３Ｔ３−Ｇ２／ＰＡ６細胞などが使用され、また、所望により、マウスから採取した正常ストローマ細胞を用いてもよい。また、ヒトストローマ細胞などの、マウス以外の哺乳動物由来のストローマ細胞も用いることができる。ストローマ細胞は、その使用に先だち、適宜の培養培地とともに予めマイクロプレートなどに播種した後、１日乃至数日間培養することにより、ウェル底部にコンフルエントな状態になるまで培養される。これに単核球細胞を、ストローマ細胞に対して、細胞数で０．２倍乃至１０倍数、好ましくは１乃至４倍数播種し、５％ＣＯ_２雰囲気中、３７℃で培養すると、ストローマ細胞の生細胞数が次第に減少する。この現象は、単核球細胞がストローマ細胞との細胞接着により刺激され、分化が進行した結果、細胞障害活性を有する細胞集団が出現し、それによりストローマ細胞が破壊されるためと考えられる。ストローマ細胞が全て破壊されると、単核球細胞の増殖が抑制されることから、ストローマ細胞が全て破壊されないうちに、単核球細胞を含む培養培地を、新鮮なストローマ細胞を付着させたマイクロプレートに移し替える必要がある。移し替えにあたっては、浮遊する単核球細胞数が増え始めたら、１日乃至数日間隔で、順次、浮遊細胞をピペットなどで回収して、別のストローマ細胞を付着させた新鮮なマイクロプレートに移し替える。元のマイクロプレートには新鮮な培地を添加して引き続き培養を行い、さらに浮遊細胞を回収する。この作業を元のプレートのストローマ細胞が全て死滅するまで続けると効率よく単核球細胞を回収することができる。このようにして、３乃至８週間培養を続けることにより、Ｔ細胞までに分化した細胞集団が出現することになる。

本発明のヒトＴ細胞集団の取得にあたっては、血液から採取された単核球細胞の中には、ＩＬ−２依存性の活性化Ｔ細胞が存在しており、それらを増殖させないために、通常、単核球細胞は、サイトカイン無添加の条件で培養され、特に、インターロイキン−２（ＩＬ−２）非存在下で３週間乃至８週間培養される。また、培養培地中にＩＬ−２の存在が懸念される場合には、市販の抗ＩＬ−２抗体を用いたＥＩＡキットなどにより、培地中のＩＬ−２量を測定し、ＩＬ−２が検出された場合には、培地中に抗ＩＬ−２抗体を添加して、ＩＬ−２活性を中和することも有利に実施できる。

かくして取得される本発明のヒトＴ細胞集団は、単独培養では長くとも１週間しか維持できないが、ストローマ細胞との共培養を続けることにより約１ヶ月維持することができる。しかしながら、その後はしだいに増殖活性が低下し、やがては死滅するので、ＩＬ−２又はインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）などのサイトカイン存在下での培養することにより、約２ヶ月間増殖培養を続けることができる。なお、本発明のヒトＴ細胞集団は、上記サイトカインの作用により増殖するものの、その特性（細胞障害活性、免疫抑制活性、細胞膜抗原）が多少変化するので、上記サイトカインによる増殖培養を開始してから、通常１ヶ月以内、好ましくは２週間以内に使用される。特に、末梢血から取得されたヒトＴ細胞集団には、臍帯血から取得されたヒトＴ細胞集団では見られないＣＤ４弱陽性ＣＤ８弱陽性ＴＣＲγδ陽性のＴ細胞が混在することがあり、それはＩＬ−２存在下での増殖培養によりその存在比率が増加することがある。

本発明のヒトＴ細胞集団は、ＣＤ３、ＣＤ２５、ＣＤ２８及びＴＣＲαβなどのＴ細胞に特徴的な細胞膜抗原が、ほぼすべての細胞において陽性であることから、ほぼ完全なＴ細胞の集団であると考えられる。また、このヒトＴ細胞集団は、ストローマ細胞との共培養でなければ取得できないこと、ウイルスの感染が認められないこと、サイトスピン像が正常リンパ球の形態を示すこと、染色体の核型に異常が認められないことから、正常なＴ細胞からなる細胞集団であると考えられる。

本発明のヒトＴ細胞集団は、本質的に、ＣＤ４陽性ＣＤ８陽性のＡグループ、ＣＤ４陽性ＣＤ８弱陽性のＢグループ、及び、ＣＤ４陰性ＣＤ８陽性のＣグループからなり、これら３グループの合計が全体の９０％以上、好ましくは、９３％以上を占める。上記３グループの割合は、抗ＣＤ４抗体及び抗ＣＤ８抗体を併用したフローサイトメトリー法により測定され、Ａグループが７．９乃至５１．６％、Ｂグループが１．１乃至７１．７％、Ｃグループが１１．８乃至７９．４％の範囲内で存在する。なお、培養期間が長くなるほど、Ｂグループの割合は減少し、Ｃグループの割合が増加する傾向にある。各グループの分別採取は、抗ＣＤ４抗体及び抗ＣＤ８抗体を用いた常法のセルソーティング法により、必要に応じて行うことができる。

本発明のヒトＴ細胞集団は、その取得のために共培養に用いたストローマ細胞に対して細胞障害活性を発揮する。細胞障害活性は、後記実施例４に記載の方法で測定される。効果細胞（Ｅ）としての本発明のヒトＴ細胞集団と、標的細胞（Ｔ）としてのストローマ細胞との比率（Ｅ／Ｔ比）が１／１以上で、ほとんどの取得に用いられたストローマ細胞は死滅する。また、ストローマ細胞としてマウスストローマ細胞株を用いた場合、本発明のヒトＴ細胞集団の取得に利用したマウスストローマ細胞株とは異なるストローマ細胞株に対しても細胞障害活性を発揮する。また、マウスやヒトの腫瘍細胞株に対しても、細胞障害活性を発揮する場合がある。また、後記実施例に記載のとおり、抗ＣＤ４抗体及び抗ＣＤ８抗体によるセルソーティング法で分別採取された３グループは、取得に使用したマウスストローマ細胞株ＳＴ２細胞に対して細胞障害活性を発揮する。細胞障害性Ｔ細胞は、通常、ＣＤ８陽性であり、本発明のヒトＴ細胞集団におけるＣＤ４陰性ＣＤ８陽性のＣグループは、それに対応するとも考えられる。一方、本発明のヒトＴ細胞集団におけるＣＤ４陽性ＣＤ８陽性のＡグループ及びＣＤ４陽性ＣＤ８弱陽性のＢグループは、ＣＤ８陽性細胞障害性Ｔ細胞に対応するものではなく、新規なＴ細胞集団である可能性が高い。

本発明のヒトＴ細胞集団は、活性化ヒトＴ細胞に対して免疫抑制活性を発揮する。免疫抑制活性は、例えば、後記実施例８に記載の、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性制御性Ｔ細胞における免疫抑制活性の測定に利用される同種混合リンパ球反応法により測定される。この手法によれば、本発明のヒトＴ細胞集団と、それに含まれるＡグループとＣグループについては、高い免疫抑制活性が測定されることから、本発明のヒトＴ細胞集団は、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性制御性Ｔ細胞と同様の免疫抑制活性を有している。なお、上記した末梢血から取得されたヒトＴ細胞集団において時折取得されるＣＤ４弱陽性ＣＤ８弱陽性（ＣＤ４^ｄｉｍＣＤ８^ｄｉｍ）のグループ（Ｄグループ）は他のグループと比較すると、細胞障害活性については強く、免疫抑制活性は弱いという特徴があり、また、ＴＣＲγδ陽性を示すことから従来の細胞障害性Ｔ細胞であると考えられる。このＤグループについては、抗ＴＣＲγδ抗体を用いる磁気分離法により、分離したり除去したりすることができる。

また、後記実施例９に記載のとおり、本発明のヒトＴ細胞集団は、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性制御性Ｔ細胞に特徴的な転写因子ＦＯＸＰ３を発現しているが、その発現量はやや少ない。また、本発明のヒトＴ細胞集団は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体での処理により細胞増殖せず、ＦＯＸＰ３の発現量についてもほとんど増加しない。また、文献的には、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性制御性Ｔ細胞の取得には、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体での処理が必須である。本発明のヒトＴ細胞集団の取得工程には抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体での処理工程がないことから、従来のＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性制御性Ｔ細胞は、本発明のヒトＴ細胞集団の取得工程において増殖していないか、または死滅しており、本発明のヒトＴ細胞集団中に含まれていないと考えられる。

また、セルソーティング法により分別採取された３グループはどれもＦＯＸＰ３を発現しており、上記ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性制御性Ｔ細胞が含まれる可能性があるＣＤ４陽性ＣＤ８弱陽性のＢグループのみならず、ＣＤ４陽性ＣＤ８陽性のＡグループ及びＣＤ４陰性ＣＤ８陽性のＣグループにおいても弱いながらも発現している。それゆえに、本発明のヒトＴ細胞集団には、従来のＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性制御性Ｔ細胞とは異なる制御性Ｔ細胞が含まれると考えられる。

また、本発明のヒトＴ細胞集団は、後記実施例の記載のとおり、ＩＬ−１０を産生する。通常、ＩＬ−１０は２型ヘルパーＴ細胞や制御性Ｔ細胞によって産生され、１型ヘルパーＴ細胞やマクロファージの活性を抑制することが知られている。したがって、本発明のヒトＴ細胞集団における免疫抑制活性の一部は、ＩＬ−１０を介して発揮されるものと考えられる。

以上から、本発明のヒトＴ細胞集団は、細胞障害活性と免疫抑制活性の両方を有するヒトＴ細胞集団である。ＣＤ４陽性ＣＤ８陽性のＴ細胞は、従来、幼若なＴ細胞集団として知られており、上記活性を有するものは全く知られていなかった。よって、少なくとも、ＣＤ４陽性ＣＤ８陽性のＡグループは新規なヒトＴ細胞集団であるといえる。したがって、本発明のヒトＴ細胞集団は、免疫機構の解明を目的とした研究用材料に用いることができる。また、本発明のヒトＴ細胞集団は、免疫抑制活性を有することから、免疫寛容を誘導することによって治療可能な疾患、例えば、リウマチ、Ｉ型糖尿病、クローン病などの自己免疫疾患、食物アレルギー、花粉症、アトピー性皮膚炎などのアレルギー性疾患や、移植時における拒絶反応や移植片対宿主反応の緩和などを目的とした医薬組成物に、また、細胞障害活性によって、各種の癌の治療、各種のウイルス疾患の治療を目的とした医薬組成物とすることができる。当該組成物中における本発明のヒトＴ細胞集団の含有量や、当該組成物の投与量は、適用疾患の種類や症状、投与経路、剤形を考慮して適宜決定すればよい。また、サイトカイン、ケモカイン、ホルモンなどの生理活性物質、抗体、免疫抑制剤、抗ガン剤、抗アレルギー剤などから選ばれる上記疾患用の治療薬や本発明のヒトＴ細胞集団の作用効果を高める物質と組み合わせて用いることができる。

本発明のヒトＴ細胞集団を含む医薬組成物を製造するにあたり、治療目的や投与経路等に応じて適宜剤形を選択することができる。ただし、医薬組成物に含まれるヒトＴ細胞集団が生きたままの状態で投与が望まれることから、通常、ヒトＴ細胞集団は、適宜の添加剤とともに、液体中に懸濁するかゲルに包埋して、これをそのまま使用するか、さらに所望により、適宜のマイクロカプセルやリポソームなどに封入し、注射などにより非経口的に投与される。また、ジメチルスルホキシドやグリセリンを含む培地や生理食塩水に浮遊させたものを凍結保存し、使用前に融解して用いることもできる。

以下、実施例で本発明の詳細を説明する。

臍帯血からのヒトＴ細胞集団の取得
分娩時に切除した、インフォームドコンセントを交わした妊婦７名（Ｕ１乃至Ｕ７）の臍帯から血液を採取し、それを、それぞれ、ＲＰＭＩ１６４０培地で約２倍容に希釈し、常法に従い、フィコールパック上に重層し、遠心分離し、単核球を含む層を採取し、生理食塩水で洗浄して単核球細胞を採取した。これに「ＣＤ３４アイソレーションキット」（ミルテニー・バイオテック社販売）を適用し、ＣＤ３４陽性単核球細胞を除去し、ＣＤ３４陰性単核球細胞を採取した。採取されたＣＤ３４陰性単核球細胞を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊させ、予めマウスストローマ細胞株ＳＴ２細胞（ＲＣＢ０２２４、理研バイオリソースセンター）を培養してウェル底部に付着させておいた市販の６ウェルマイクロプレート（１ウェルにつきマウスストローマ細胞数１乃至２×１０^６個）に、３×１０^６個ずつ播種した。１乃至２週間培養後、浮遊細胞を培地とともに回収し、新鮮なストローマ細胞を付着させた６ウェルマイクロプレートに移し、引き続き培養した。これを適宜の回数繰り返し、合計３週間以上培養し、均一なリンパ球形態を示す増殖性のブラスト細胞を出現させ、さらに上記と同様の方法で１乃至２週間培養した後、ブラスト化した細胞を精製するために、常法にしたがい、フィコールパックによりフィコール層と培養液層の境界付近に集積した細胞を採取して、ヒトＴ細胞集団Ｕ１乃至Ｕ７を取得した。

細胞膜抗原の解析
ヒトリンパ球に関連する細胞膜抗原に対する抗体を用いるフローサイトメトリー法で実施例１で取得されたヒトＴ細胞集団を解析した。下記表１に記載の抗原に対する抗体、すなわち、マウス抗ＣＤ３抗体（株式会社ニチレイバイオサイエンス販売）、マウス抗ＣＤ４抗体（株式会社ニチレイバイオサイエンス販売）、マウス抗ＣＤ８α抗体（ベックマンコールター社製造）、マウス抗ＣＤ２５抗体（ベックマンコールター社製造）、マウス抗ＣＤ４５ＲＡ抗体（ベックマンコールター社製造）、マウス抗ＣＤ４５ＲＯ抗体（株式会社ニチレイバイオサイエンス販売）、マウス抗ＣＤ２８抗体（株式会社ニチレイバイオサイエンス販売）、マウス抗ＣＤ５６抗体（ベックマンコールター社製造）、マウス抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（株式会社ニチレイバイオサイエンス販売）、マウス抗ＴＣＲαβ抗体（日本ベクトンディッキンソン製造）、マウス抗グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）抗体（アールアンドディーシステム社製造）、マウス抗ＣＤ１５２抗体（ベックマンコールター社製造）、マウス抗ＣＤ１６抗体（日本ベクトンディッキンソン社製造）、マウス抗ＣＤ５７抗体（日本ベクトンディッキンソン社製造）、又は、陰性対照としてのＭＯＰＣ−２１マウスミエローマＩｇＧ抗体（アイシーエヌ社製造）で被験細胞（Ｕ１乃至Ｕ７）を３０分間処理し、常法にしたがい、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）或いはフィコエリスリン（ＰＥ）を結合させた２次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ）で３０分間処理した。被験細胞はフローサイトメーター（商品名『ＥＰＩＣＳＸＬ』、ベックマンコールター社製造）で分析した。結果を表１に示す。なお、表中の「ＭＦＩ」は蛍光強度の平均値を示し、「％」は陽性率（被験細胞のうち、陰性対照を基準に設定した閾値以上の蛍光強度を示す細胞数の割合）を示し、「−」は試験していないことを示す。

表１の結果から明らかなように、取得された細胞集団は、ＣＤ３及びＴＣＲαβが約９７乃至１００％の陽性率を示すことから、本質的にＴ細胞からなる細胞集団であり、ＣＤ２５が約９３乃至９９％、ＣＤ２８が約７５乃至９９％、ＨＬＡ−ＤＲが約５９乃至９４％の陽性率を示すことから、ほとんどのＴ細胞が活性化されていると考えられる。また、ナチュラルキラーＴ細胞に特徴的な細胞膜抗原であるＣＤ１６が約０．７乃至１．２％、ＣＤ５６が約１．１乃至３．５％、ＣＤ５７が約０．７乃至１．８％の陽性率を示し、実質的に陰性であることから、本発明のヒトＴ細胞集団中に、従来のナチュラルキラーＴ細胞は存在しないと考えられる。また、ＧＩＴＲが約４７乃至８０％の陽性率を示し、制御性Ｔ細胞様の特徴を有していた。なお、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ−４）は実質的に陰性の結果であるものの、細胞内においてはその発現が確認されている（表に示していない）。

抗ＣＤ４抗体及び抗ＣＤ８抗体を用いた２重染色解析
常法にしたがって、フィコエリスリン標識マウス抗ＣＤ４抗体及びフルオレセインイソチオシアネート標識マウス抗ＣＤ８抗体（日本ベクトンディッキンソン社製造）を用いて実施例１で取得された７種の本発明のヒトＴ細胞集団（Ｕ１乃至Ｕ７）を２重染色し、実施例２と同様な方法により、フローサイトメトリー分析を行なった。なお、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３及びＵ５については１回目の測定から１〜２週間後に再度測定した。その結果を表２に示す。なお、上段は１回目の測定値、下段は２回目の測定値を示す。また、代表的な例として、ヒトＴ細胞集団Ｕ３（１回目）のフローサイトメトリーの図を図１に示す。

表２の結果が示すとおり、試験したヒトＴ細胞集団には、ＣＤ４陽性ＣＤ８陽性のグループ（Ａグループ）は、７．９乃至５１．６％、ＣＤ４陽性ＣＤ８弱陽性（Ｂグループ）は、１．１乃至７１．７％、ＣＤ４陰性ＣＤ８陽性（Ｃグループ）は、１１．８乃至５９．２％存在し、これらの合計は９６％以上であった。また、ＣＤ４陰性ＣＤ８陰性の細胞はほとんど存在しないことが判明した。また、同じヒトＴ細胞集団であっても、１〜２週間培養すると、３グループの比率は多少変化するという現象が認められた。

マウスストローマ細胞に対する細胞障害活性
常法にしたがって、標的細胞として胎齢１３乃至１６日のＣＤ−１マウスの胎仔組織から採取した正常マウス胎仔ストローマ細胞、又は、市販のマウスストローマ細胞株ＳＴ２（ＲＣＢ０２２４、理研バイオリソースセンター）、ＯＰ９（ＲＣＢ１１２４、理研バイオリソースセンター）、ＭＣ３Ｔ３−Ｇ２／ＰＡ６（ＲＣＢ１１２７、理研バイオリソースセンター）のうちのいずれかを４８ウェルマイクロプレートに４×１０^４個ずつ播種し、一夜培養した後、これに、効果細胞として実施例１で取得されたヒトＴ細胞集団Ｕ３を４×１０^４個（Ｅ／Ｔ比＝１／１）、８×１０^４個（Ｅ／Ｔ比＝２／１）、１．６×１０^５個（Ｅ／Ｔ比＝４／１）ずつ播種し、１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含む１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地で２４時間共培養し、これを被験ウェルとした。各被験ウェルから培養上清を除去し、上記培地で２回洗浄してウェル中のヒトＴ細胞集団と、剥離したストローマ死細胞を除去した。各ウェルに上記培地０．４ｍｌを添加し、さらに「アラマーブルー」（和光純薬工業株式会社販売）３０μｌを添加して、１８時間培養した。培養上清０．２ｍｌを９６ウェル平底マイクロプレートに移し、代謝活性を蛍光プレートリーダー（励起波長５４４ｎｍ、検出波長５９０ｎｍ）で測定した。なお、対照ウェルとして、標的細胞としての各ストローマ細胞のみを培養する以外は同様に処理したウェルを用意した。細胞障害活性を、下記の数式１にしたがって算出した。結果を表３に示す。

式１

数式１

表３の結果から明らかなように、本発明のヒトＴ細胞集団は、ＳＴ２細胞に対して、Ｅ／Ｔ比が１／１において細胞障害活性を発揮し、それ以外のマウスストローマ細胞に対してもＥ／Ｔ比が４／１で細胞障害活性を発揮した。この結果は、本発明のヒトＴ細胞集団は、その取得のために共培養に用いたマウスストローマ細胞に対して強い細胞障害活性を発揮するものの、それ以外のマウスストローマ細胞に対しても細胞障害活性を発揮することから、細胞特異性の低い細胞障害活性を有していることを示唆している。

他の細胞に対する細胞障害活性
本発明のヒトＴ細胞集団が、マウスストローマ細胞以外の細胞に対して、細胞障害活性を発揮するかどうか調べるために、以下の実験を行なった。すなわち、標的細胞としてマウス膀胱癌ＭＢＴ−２（ＲＣＢ０５４４、理研バイオリソースセンター）、マウスメラノーマ細胞Ｂ１６細胞（ＲＣＢ１２８３、理研バイオリソースセンター）、正常ヒト皮膚繊維芽細胞ＮＨＤＦ細胞（倉敷紡績株式会社販売）、ヒト子宮頚部カルシノーマＨｅＬａ細胞（ＲＣＢ０００７、理研バイオリソースセンター）、ヒト表皮カルシノーマＡ４３１細胞（ＲＣＢ０２０２、理研バイオリソースセンター）、ヒト皮膚悪性メラノーマＧ３６１細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−１４２４）、ヒト大腸癌由来ＷｉＤｒ細胞（ＪＲＣＢ０２２４、ヒューマンサイエンス研究資源バンク）のいずれかを、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊させ、これを９６ウェル平底マイクロプレートに、１ウェルにつき４×１０^４個ずつ播種した。これに実施例４と同様の方法で、それぞれの標的細胞に実施例１で取得されたヒトＴ細胞集団Ｕ３をＥ／Ｔ比が１／１乃至４／１で播種し、実施例４と同様の方法で細胞障害活性を測定した。その結果を表４に示す。

表４の結果から明らかなとおり、本発明のヒトＴ細胞集団は、どの標的細胞に対しても、Ｅ／Ｔ比が２／１では１７％以下の細胞障害活性しか発揮しなかったが、マウス癌細胞株ＭＢＴ−２細胞、及び、ヒト癌細胞ＷｉＤｒ細胞、Ｇ３６１細胞及びＡ４３１細胞に対してＥ／Ｔ比が４／１で２２乃至９２％の細胞障害活性を発揮した。一方、マウス癌細胞Ｂ１６細胞及びヒト癌細胞ＨｅＬａ細胞やヒト正常細胞ＮＨＤＦ細胞に対してはＥ／Ｔ比が４／１で１１％以下の細胞障害活性しか発揮しなかった。実施例４と実施例５の結果から、本発明のヒトＴ細胞集団は、細胞特異性の低い細胞障害活性を有していることが判明した。

ＣＤ４及びＣＤ８を指標にしたグループ分け
従来知られるＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性制御性Ｔ細胞やＣＤ８陽性細胞障害性Ｔ細胞と、本発明のヒトＴ細胞集団の相違点を検討するために、ＣＤ４及びＣＤ８を指標とした細胞分別法によりグループ分けを行った。すなわち、実施例１で取得されたヒトＴ細胞集団Ｕ３をＩＬ−２存在下でＳＴ２細胞との共培養を２週間行って増殖させた後、常法にしたがってフィコールパックで精製し、２ｍＭエチレンジアミン４酢酸及び０．５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に細胞濃度６．７×１０^７個／ｍｌに浮遊させた。常法に従い、フィコエリスリン標識抗ＣＤ４抗体とフルオレセインイソチオシアネート標識抗ＣＤ８抗体を等量ずつ上記細胞浮遊液に細胞に対して過剰量添加し、３０分間氷上で静置した。これに、２０倍量の上記リン酸緩衝液を加え、遠心分離して余分な抗体を除去し、再度上記リン酸緩衝液を加えて細胞濃度２．０×１０^７個／ｍｌの細胞浮遊液を調製した。このうち、７．４×１０^７個の細胞を、常法にしたがって、セルソーター『ＦＡＣＳＡｒｉａ』（日本ベクトン・ディッキンソン社製造）を用いて分別したところ、ＣＤ４陽性ＣＤ８陽性のＡグループが０．７×１０^７個（純度９７．９％）、ＣＤ４陽性ＣＤ８弱陽性のＢグループが１．１×１０^７個（純度９９．４％）、及び、ＣＤ４陰性ＣＤ８陽性のＣグループが１．９×１０^７個（純度９９．６％）分別採取された。なお、ＣＤ４陰性ＣＤ８陰性の細胞の割合は極めて低く、分別採取できなかった。

各グループでの細胞障害活性
効果細胞として実施例１で取得されたヒトＴ細胞集団Ｕ３、又は、実施例６で分別採取された３グループを、標的細胞としてＳＴ２細胞を用いる以外は実施例４と同様にして行ない、細胞障害活性（％）を求めた。結果を表５に示す。

表５の結果から明らかなように、どのグループもＳＴ２細胞に対して細胞障害活性を発揮した。特に、ＡとＣグループの細胞障害活性が高く、Ｂグループはやや低い傾向にあった。一般に、細胞障害活性はＣＤ４陰性ＣＤ８陽性を示すＴ細胞の特徴の一つとして考えられているが、この結果は、本発明のヒトＴ細胞集団における細胞障害活性は、その全てがＣＤ８陽性細胞障害性Ｔ細胞をはじめとするＣＤ４陰性ＣＤ８陽性のＴ細胞によるものでないことを示している。

免疫抑制活性の測定
常法の同種混合リンパ球反応法により、実施例１で取得されたヒトＴ細胞集団Ｕ３、又は、実施例６で分別採取された３グループの免疫抑制活性を測定した。
応答細胞としてのＣＤ４陽性ＣＤ２５陰性Ｔ細胞を以下の方法で採取した。常法のフィコールパック法によりヒト末梢血から単核球細胞を採取し、これに抗ＣＤ２５モノクローナル抗体を結合させたマグネティックマイクロビーズ（ミルテニー・バイオテック社販売）を適用してＣＤ２５陽性細胞を除去することによってＣＤ２５陰性細胞を採取し、さらにこのＣＤ２５陰性細胞から、抗ＣＤ４モノクローナル抗体を結合させたマグネティックマイクロビーズ（ミルテニー・バイオテック社販売）を適用してＣＤ４陽性細胞を採取した。

刺激細胞としての樹状細胞を以下の方法で採取した。臍帯血から、抗ＣＤ１４モノクローナル抗体を結合させたマグネティックマイクロビーズ（ミルテニー・バイオテック社販売）を適用してＣＤ１４陽性の単球を採取し、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及びインターロイキン−４（ＩＬ−４）の存在下で１乃至２週間培養した後、樹状細胞を採取し、それをリポ多糖で２日間培養し、同種混合リンパ球反応法に使用する直前に常法にしたがってマイトマイシンＣ処理した。

上記応答細胞を１×１０^５個及び刺激細胞を５×１０^３個ずつ、マイクロプレートのウェル中に播種し、これに実施例１で取得されたヒトＴ細胞集団Ｕ３、又は、実施例６で分別採取された３グループをそれぞれ１×１０^５個ずつ播種し、７日間培養した。培養が終了する１６時間前に培養培地中に^３Ｈ−チミジンを適当量添加し、被験ウェルとした。常法にしたがい、^３Ｈ−チミジンの取り込み量を測定し、下記数式２にしたがって、免疫抑制活性を求めた。なお、対照ウェルとして、ヒトＴ細胞集団を添加しない以外は同様に処理したウェルを用意した。結果を表６に示す。

式２

数式２

表６に示す結果から明らかなように、本発明のヒトＴ細胞集団及び３グループ全てが免疫抑制活性を有していた。この結果は、既知のＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性制御性Ｔ細胞と細胞膜抗原が同じＢグループのみならず、細胞膜抗原が異なるＡ及びＣグループであっても免疫抑制活性を有することを示している。したがって、本発明のヒトＴ細胞集団における免疫抑制活性は、その全てがＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性制御性Ｔ細胞をはじめとするＣＤ４陽性ＣＤ８弱陽性のＴ細胞によるものでないことを示している。

ＦＯＸＰ３の発現解析
転写因子ＦＯＸＰ３はＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性制御性Ｔ細胞において特徴的に発現する転写因子として知られている。本発明のヒトＴ細胞集団とＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性制御性Ｔ細胞におけるＦＯＸＰ３の発現状況を以下の実験で比較した。

ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性制御性Ｔ細胞の準備
ゴッドフレー等の方法（「ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）」、１０５巻、７５０乃至７５８頁、２００５年）により、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性制御性Ｔ細胞を準備した。すなわち、実施例１で採取した臍帯血由来ＣＤ３４陰性単核球細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊させ、それを予め抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体を付着させたマイクロプレートに入れ（１ウェルにつき１００μｌの５μｇ／ｍｌ抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体でウェルを処理）、３日間培養した。さらに、５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加して１乃至２週間培養し、常法にしたがって、抗ＣＤ４抗体及び抗ＣＤ２５抗体を用いた２重染色法によるフローサイトメトリーにより分析したところ、約９５％の細胞がＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性を示した。これをＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性制御性Ｔ細胞標品として以下の実験に供した。

ＲＴ−ＰＣＲ法によるＦＯＸＰ３発現解析
上記で調製されたＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性制御性Ｔ細胞標品と実施例１で取得されたヒトＴ細胞集団Ｕ３におけるＦＯＸＰ３の発現量を比較した。すなわち、これらの細胞から、それぞれ、「ＲＮｅａｓｙＫｉｔ」（キアゲン社製造）を使用してトータルＲＮＡを調製し、それを鋳型にして、逆転写酵素により第一ストランドｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡ１ｎｇを鋳型にして、配列表における配列番号１及び２に記載のオリゴヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、常法のＰＣＲ法で特異的に増幅させた。得られたＰＣＲ産物は、常法にしたがって、アガロース電気泳動により分離し、エチジウムブロマイド染色処理し、ＦＯＸＰ３の特異的な増幅断片（４０９ｂｐ、３０４ｂｐ）のバンドを調べた。結果を図２に示す。なお、ＦＯＸＰ３はスプライシングの異なる２種の蛋白質を有し（ＧｅｎｂａｎｋＮＭ＿０１４００９及びＤＱ０１０３２７）、本例においては、４０９ｂｐ及び３０４ｂｐの増幅断片２本のバンドが出現する。なお、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性制御性Ｔ細胞については、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体を付着したマイクロプレートで培養した場合も示す。

図２における各レーンのバンドの濃淡により、ＦＯＸＰ３ｍＲＮＡの発現量が比較できる。「１」のレーンはＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性制御性Ｔ細胞におけるＦＯＸＰ３ｍＲＮＡの発現量を示しており、上記ゴッドフレー等の文献に示されるとおり、抗ＣＤ３／２８抗体で処理するとさらに発現量が増加した（「２」のレーン）。一方、本発明のヒトＴ細胞集団（「３」のレーン）でのＦＯＸＰ３ｍＲＮＡの発現量は、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性制御性Ｔ細胞のそれよりも少なく、また、データを示していないが、本発明のヒトＴ細胞集団は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体の処理により、ＦＯＸＰ３の発現量がほとんど増加しなかった。この結果は、本発明のヒトＴ細胞集団は、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性制御性Ｔ細胞と同様にＦＯＸＰ３を発現しているものの、発現量はやや少ないことを示している。

ウエスタンブロッティング法によるＦＯＸＰ３発現解析
実施例１で取得されたヒトＴ細胞集団Ｕ３、又は、実施例６で分別採取された３グループから、同数の細胞を分取し、これに、それぞれ４．６％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ６．８）、２０％（ｗ／ｖ）グリセリン、１．４Ｍβ−メルカプトエタノールを含有する水溶液で処理して細胞抽出物とし、これを常法の１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した。常法にしたがって、電気泳動後のゲルをニトロセルロース膜にブロッティングし、得られたニトロセルロース膜を、ヒツジ抗ヒトＦＯＸＰ３抗体（エービーカム社製造）で処理し、さらに、２次抗体としてのペルオキシダーゼ標識抗ヒツジ抗体（ダコー社製造）で処理した。得られた抗体処理後のニトロセルロース膜を、化学発光検出試薬キット（商品名「ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌＷｅｓｔＰｉｃｏ」、ピアス社製造）に供し、ルミノールの化学発光によりＦＯＸＰ３のバンドを染色した。結果を図３に示す。

図３において、「４」のレーンはヒトＴ細胞集団Ｕ３、「５」のレーンはそのＡグループ、「６」のレーンはそのＢグループ、「７」のレーンはそのＣグループのウエスタンブロッティングの結果を示す。この結果から明らかなように、ＦＯＸＰ３は、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性制御性Ｔ細胞と細胞膜抗原が同じであるＢグループのみならず、細胞膜抗原が異なるＡとＣグループにおいても発現していた。この結果は実施例８の結果を支持するものであり、本発明のヒトＴ細胞集団の免疫抑制活性は、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性制御性Ｔ細胞と同様に、ＦＯＸＰ３の発現と相関性が高く、ＡとＣグループにもＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性制御性Ｔ細胞様の細胞が含まれていることを示している。

サイトカイン又はマイトーゲンなどによる増殖性
本発明のヒトＴ細胞集団は単独培養では増殖性を示さない。そこで、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体処理、各種サイトカイン又はマイトーゲン処理における増殖性を調べるために以下の実験を行なった。実施例１で取得されたヒトＴ細胞集団Ｕ３、又は、実施例９で調製されたＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性制御性Ｔ細胞標品を、それぞれ９６ウェルマイクロプレートのウェルに４×１０^４個／ウェルずつ播種し、これに、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、ポークウィードマイトーゲン（ＰＷＭ）、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）をそれぞれ添加した後、５日間培養した。対照ウェルとして、ヒトＴ細胞集団を単独培養したウェルを用意した。常法により、各ウェルの^３Ｈ−チミジンの取り込み量を測定した。細胞増殖の評価方法は、対照における^３Ｈ−チミジンの取り込み量（ｃｐｍ）で示した。結果を表７に示す。

表７の結果から明らかなように、本発明のヒトＴ細胞集団は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体処理によって増殖しなかった。このことは、既知の制御性Ｔ細胞と同様に、抗原刺激に対してアナジー（免疫不応答）状態になっていると考えられる。しかしながら、本発明のヒトＴ細胞集団は、既知の制御性Ｔ細胞と異なり、ＩＬ−２又はＩＬ−１５処理によって増殖し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体とＩＬ−２の処理により、著しい増殖性を示した。この結果は、本発明のヒトＴ細胞集団は、従来の制御性Ｔ細胞とは異なる性質を持つ細胞を含む細胞集団であることを示している。さらに、本発明のヒトＴ細胞集団は、Ｔ細胞の増殖因子である、ＩＬ−４、ＩＬ−７などのサイトカイン、マイトーゲンなどによって増殖しないことから、通常のＴ細胞とは異なる性質を持つと考えられる。

ＩＬ−１０の産生
実施例１で取得された本発明のヒトＴ細胞集団Ｕ３を２×１０^５個／ｍｌの細胞濃度に調製し、１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加し、２４ウェルマイクロプレートのウェル又は抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体結合２４ウェルマイクロプレートのウェルに１ｍｌずつ播種し、１６時間培養した。また、本発明のヒトＴ細胞集団Ｕ３を３×１０^５個／ｍｌの細胞濃度に調製し、１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加し、これを、コンフルエント状態にまで培養したＳＴ２細胞を敷き詰めた６ウェルマイクロプレートに、２ｍｌずつ播種し、４０時間培養した。これらを遠心分離により培地上清を採取し、抗ＩＬ−１０抗体を用いたアッセイキット（イーバイオサイエンス社製造）により、ＩＬ−１０濃度を測定した。結果を表８に示す。

表８の結果から明らかなように、本発明のヒトＴ細胞集団は、ＩＬ−２存在下でＩＬ−１０を産生するところ、さらにストローマ細胞との共培養によりＩＬ−１０の産生量は著しく増加した。また、単独培養系においても、ＩＬ−２存在下で抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体刺激によりＩＬ−１０の産生量は著しく増加した。ＩＬ−１０は主として免疫抑制を担うサイトカインであり、Ｔ細胞においては２型ヘルパーＴ細胞によって産生され、１型ヘルパーＴ細胞によるインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）等のサイトカインの産生抑制、あるいはマクロファージによるＩＬ−１等の炎症性サイトカインの産生抑制することが知られている。よって、本発明のヒトＴ細胞集団は、ＩＬ−１０の産生を介して免疫抑制活性を発揮する可能性が考えられた。

末梢血からのヒトＴ細胞集団の取得
１８名の健常人から採取した末梢血をそれぞれＦＣＳフリーのＲＰＭＩ培地で２倍希釈し、常法のフィコールパック法により単核球細胞を採取した。これを上記培地で細胞濃度１×１０^６個／ｍｌに調製し、実施例１と同様にマウスストローマ細胞ＳＴ２をコンフルエントに培養した６穴培養プレートに３ｍｌずつ播種し、実施例１と同様にして共培養を４乃至５週間を行った。出現したブラスト化細胞をフィコールパック法により精製し、４名の健常人の末梢血からヒトＴ細胞集団Ｐ１乃至Ｐ５の取得に成功した。なお、Ｐ２とＰ３は同一人物由来の血液から取得されたヒトＴ細胞集団である。

細胞膜抗原の解析
実施例２と同様の方法で、実施例１２で取得されたヒトＴ細胞集団Ｐ１乃至Ｐ５について細胞膜抗原を調べた。なお、マウス抗ＴＣＲγδ抗体はＴｃｅｌｌＳｃｉｅｎｃｅ社製造のものを用いた。結果を表９に示す。なお、括弧内の数値はＩＬ−２存在下でＳＴ２細胞との共培養を９乃至１４日間増殖培養した後に測定した数値（Ｐ３はＩＬ−２存在下での培養を行っていない）を示し、「−」は測定を行っていないことを示す。

表９の結果から明らかなように、本発明のヒトＴ細胞集団Ｐ１乃至Ｐ５は、ＣＤ３及びＴＣＲαβが陽性率９０％以上であることから、本質的にＴ細胞からなる細胞集団であり、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＨＬＡ−ＤＲの陽性率も比較的高いことから、含まれるＴ細胞はほぼ全部が活性化していると考えられた。また、ナチュラルキラーＴ細胞に特徴的な細胞膜抗原であるＣＤ１６、ＣＤ５６及びＣＤ５７についてはほぼ陰性であり、この細胞集団中に従来のナチュラルキラー細胞は含まれていないと考えられた。また、ＧＩＴＲの陽性率が約５０％以上であり、制御性Ｔ細胞様の特徴を有していた。また、表には示していないが、細胞内におけるＣＤ１５２（ＣＴＬＡ−４）の発現が認められている。以上の結果と実施例２の表２の結果から、末梢血から取得されたヒトＴ細胞集団と、臍帯血から取得されたヒトＴ細胞集団とは、細胞膜抗原については同様の特徴を有していると考えられる。

なお、末梢血から取得されたヒトＴ細胞集団は、ＩＬ−２存在下で培養を続けると、ＣＤ２５の陽性率が低くなる傾向がある。ＣＤ２５はＩＬ−２受容体であり、ＩＬ−２との結合により負の制御がかかることが知られている。また、ＩＬ−２存在下での培養により、ヒトＴ細胞集団Ｐ１及びＰ４では、ＴＣＲγδの陽性率が高くなる傾向がある。

抗ＣＤ４抗体及び抗ＣＤ８抗体を用いた２重染色解析
実施例３と同様にして、実施例１２で取得されたヒトＴ細胞集団Ｐ１乃至Ｐ５に対して２重染色を行った。結果を表１０に示す。なお、Ｐ１及びＰ４については測定日を変えて行った２回の測定値を示す。また、括弧内の数値はＩＬ−２存在下でＳＴ２細胞との共培養を９乃至１４日間増殖培養した後に測定した数値（Ｐ３はＩＬ−２存在下での培養を行っていない）を示す。

表１０の結果が示すとおり、試験したヒトＴ細胞集団Ｐ１乃至Ｐ５には、Ａグループは１０．３乃至２１．２％、Ｂグループは６．６乃至４６．１％、Ｃグループは３６．７乃至７９．４％存在し、これらの合計は９３．５％以上であった。また、Ｐ１及びＰ４には、臍帯血から取得されたヒトＴ細胞集団とは異なり、ＣＤ４弱陽性ＣＤ８弱陽性を示す細胞集団が混在しており、当該細胞集団はＩＬ−２存在下の培養により、増加する傾向が認められた。典型的な例として、Ｐ１についてのフローサイトメトリー図を図４に示す。さらに、ＣＤ４、ＣＤ８及びＴＣＲγδの３重染色法によるフローサイトメトリー図である図５の結果から、上記のＣＤ４弱陽性ＣＤ８弱陽性を示す細胞集団は、ＴＣＲγδ陽性を示す細胞集団であることが明らかとなった。

細胞障害活性
本発明のヒトＴ細胞集団Ｐ１について、商品名『抗ＴＣＲγ／δマイクロビーズキット』（ミルテニー・バイオテック社販売）を用いてＤグループの細胞集団を除去した後、実施例４及び実施例５と同様に、マウスストローマ細胞、ヒト正常細胞、ヒト癌細胞に対して、Ｅ／Ｔ比が４／１又は８／１で細胞障害活性を発揮するかどうか調べた。細胞株としては、ＳＴ２細胞、ＮＨＤＦ細胞、ＺＲ−７５−１細胞（ヒト乳癌由来：ＲＣＢ１９０６、理研バイオリソースセンター）、ＭＫＮ４５細胞（ヒト胃癌由来：ＲＣＢ１００１、理研バイオリソースセンター）、Ｇ３６１細胞、ＬｏＶｏ細胞（ヒト大腸癌由来：ＲＣＢ１６３９、理研バイオリソースセンター）、ＣＯＬＯ３２０ＤＭ細胞（ヒト大腸癌：ＡＴＣＣＣＣＬ−２２０）、及びＷｉＤｒ細胞を用いた。その結果を表１１に示す。なお、表１１中、「−」は測定をしていないことを示す。

表１１の結果から明らかなとおり、ヒトＴ細胞集団Ｐ１はＥ／Ｔ比が４／１又は８／１でマウスストローマ細胞やヒト癌細胞に対して細胞障害活性を示し、ヒト正常細胞ＮＨＤＦ細胞に対してはＥ／Ｔ比が８／１であっても細胞障害活性を示さなかった。この結果から、末梢血から取得されたヒトＴ細胞集団は、臍帯血から取得されたヒトＴ細胞集団と同様に、正常細胞に対しては細胞障害活性を示さず、癌細胞に対しては細胞特異性の低い細胞障害活性を有していることが判明した。

ＣＤ４及びＣＤ８を指標にしてグループ分けされた各グループの細胞障害活性
実施例１２で得られたヒトＴ細胞集団Ｐ１を、ＩＬ−２存在下でＳＴ２細胞との共培養を２週間行って増殖させた後、実施例６と同様にグループ分けを行ったところ、６．５×１０^７個の細胞から、Ａグループが３．０×１０^６個（純度９７．１％）、Ｂグループが４．６×１０^６個（純度９４．６％）、Ｃグループが１．７×１０^７個（純度９９．３％）、Ｄグループ（ＣＤ４弱陽性ＣＤ８弱陽性）が６．１×１０^６個（純度９１．２％）の４グループに分別採取された。これらについて、実施例７と同様にして、細胞障害活性（％）を求めた。結果を表１２に示す。

表１２の結果から明らかなとおり、本発明のヒトＴ細胞集団Ｐ１と、それに含まれるすべてのグループは、ＳＴ２細胞に対して細胞障害活性を発揮し、特にＡとＣグループの細胞障害活性が強かった。この結果は、臍帯血から取得されたヒトＴ細胞集団による実施例７の表５の結果とほぼ同様の結果であるといえる。また、末梢血から取得されたＰ１に特有のＤグループの細胞集団の細胞障害活性は他のグループよりも強く、ＴＣＲγδ陽性であることから、従来の細胞障害性Ｔ細胞であると考えられる。

免疫抑制活性の測定
実施例８と同様にして、ヒトＴ細胞集団Ｐ１又は実施例１６で分別採取された４グループの免疫抑制活性を測定した。なお、ヒトＴ細胞集団Ｐ１は、ＩＬ−２存在下でＳＴ２細胞との共培養を２週間行って増殖されたものを用いた。結果を表１３に示す。

表１３に示す結果から明らかなように、末梢血から取得されたヒトＴ細胞集団Ｐ１は臍帯血から取得されたヒトＴ細胞集団よりも、免疫抑制活性についてはやや弱く、特にＢグループの免疫抑制活性が弱い傾向にあった。Ｂグループの細胞集団は、セルソーティング法による細胞分別によりダメージを受けやすく、活性が低下したものと考えられる。このことを考慮すると、末梢血から取得されたヒトＴ細胞集団と臍帯血から取得されたヒトＴ細胞集団とは、ほぼ同様の免疫抑制活性を示すといえる。なお、Ｐ１に特有のＤグループは、免疫抑制活性については各グループ中最も弱く、従来の細胞障害性Ｔ細胞であるとする実施例１６の結果と一致している。

サイトカインなどによる増殖
実施例１０と同様にして、末梢血から採取したヒトＴ細胞集団Ｐ１について、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体及び／又は各種サイトカイン処理により細胞増殖を示すかどうかを^３Ｈ−チミジンの取り込み量（ｃｐｍ）を測定した。なお、ヒトＴ細胞集団Ｐ１は、ＩＬ−２存在下でＳＴ２細胞との共培養を２週間行って増殖されたものを用いた。結果を表１４に示す。

表１４の結果から明らかなように、末梢血から取得されたヒトＴ細胞集団Ｐ１は、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、又は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体とＩＬ−２の処理によって、著しい増殖性を示し、臍帯血から取得されたヒトＴ細胞集団（実施例１０の表７）と同様の特性を示した。しかしながら、臍帯血から取得されたヒトＴ細胞集団とは異なり、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体処理によって増殖したことから、完全にアナジー状態になっていない細胞や、Ｔ細胞の増殖因子であるＩＬ−４又はＩＬ−７によって増殖する細胞を含んでいることが判明した。

ＲＴ−ＰＣＲ法によるＦＯＸＰ３発現解析
実施例９と同様に、末梢血から取得されたヒトＴ細胞集団Ｐ１乃至５からｍＲＮＡを調製し、ＦＯＸＰ３のｍＲＮＡレベルでの発現状況を調べた。その結果、本発明のヒトＴ細胞集団Ｐ１乃至Ｐ５はＦＯＸＰ３を発現しているものの、臍帯血から取得されたヒトＴ細胞集団よりもＦＯＸＰ３の発現量は少ないという結果が得られた。この結果は、末梢血から取得されたヒトＴ細胞集団は、臍帯血から取得されたヒトＴ細胞集団よりも免疫抑制活性が弱いという結果を支持するものと考えられる。

ＩＬ−１０の産生
実施例１１と同様に、末梢血から取得されたヒトＴ細胞集団Ｐ１について、各培養条件におけるＩＬ−１０の産生量を測定した。なお、ヒトＴ細胞集団Ｐ１は、ＩＬ−２存在下でＳＴ２細胞との共培養を２週間行って増殖されたものを用いた。結果を表１５に示す。

表１５の結果から明らかなように、本発明のヒトＴ細胞集団Ｐ１は、ＩＬ−２存在下でＩＬ−１０を産生するところ、さらにストローマ細胞との共培養により、ＩＬ−１０の産生量は著しく増加した。また、単独培養系においてもＩＬ−２存在下で抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体刺激により、ＩＬ−１０の産生量は著しく増加した。この結果と実施例１１の表８の結果とを比較すると、末梢血から採取したヒトＴ細胞集団は、臍帯血から取得されたヒトＴ細胞集団よりもＩＬ−１０の産生能においてやや劣っていることが明らかとなった。

叙述したとおり、本発明のヒトＴ細胞集団は、細胞障害活性と免疫抑制活性の両方を有する新規なヒトＴ細胞集団であり、免疫抑制活性により、自己免疫疾患、アレルギー性疾患などの治療、移植医療に、また、細胞障害活性により、癌治療などに有用である。

Claims

ヒトの血液から採取される単核球細胞をストローマ細胞と共培養することによって取得され、かつ、下記の特徴を有するヒトＴ細胞集団：
（１）ＣＤ３、ＣＤ２５、ＣＤ２８及びＴ細胞抗原受容体αβが陽性である、
（２）本質的に、ＣＤ４陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞、ＣＤ４陽性ＣＤ８弱陽性Ｔ細胞およびＣＤ４陰性ＣＤ８陽性Ｔ細胞の３つのグループからなる、
（３）共培養したストローマ細胞に対して細胞障害活性を発揮する、及び、
（４）活性化Ｔ細胞に対して免疫抑制活性を発揮する。
インターロイキン−１０を産生することを特徴とする請求項１に記載のヒトＴ細胞集団。
ヒトの血液が臍帯血又は末梢血であることを特徴とする請求項１又は２に記載のヒトＴ細胞集団。
ストローマ細胞がマウスストローマ細胞であることを特徴とする請求項１又は２に記載のヒトＴ細胞集団。
請求項１又２に記載のヒトＴ細胞集団を含む医薬組成物。