JPWO2007089043A1 - リポソーム製剤 - Google Patents
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Abstract
本発明は、優れた標的指向性を有する癌治療用製剤を提供する。アロマターゼ阻害薬、抗アンドロゲン薬、リアーゼ阻害薬、GnRH作動薬、GnRH拮抗薬、血管新生阻害薬、チロシンキナーゼ阻害剤、セリン・スレオニンキナーゼ阻害剤、抗癌活性を有する抗体、アンサマイトシン、カペシタビン、セルモロイキン、ドセタキセル水和物、塩酸ゲムシタビン、オキサリプラチン、プレドニゾロン、テガフール・ウラシル配合剤、ジノスタチンスチラマーまたは三酸化砒素を含有する本発明の糖鎖修飾リポソームなどは、優れた標的指向性を有する癌治療用製剤などとして使用することができる。
Description
本発明は、抗癌活性を有する薬剤を含有するリポソーム、該リポソームを含有するリポソーム製剤などに関する。
米国の国家ナノテク戦略(NNI)によって実現を目指す具体的目標の一例として、「癌細胞や標的組織を狙い撃ちする薬物や遺伝子送達システム(DDS:ドラッグデリバリーシステム)」を掲げた。日本の総合科学技術会議のナノテクノロジー・材料分野推進戦略でも、重点領域として「医療用極小システム・材料、生物のメカニズムを活用し制御するナノバイオロジー」があり、その5年間の研究開発目標の1つとして「健康寿命延伸のための生体機能材料・ピンポイント治療等技術の基本シーズ確立」が掲げられている。一方、高齢化社会となるに伴い癌の罹患率・死亡率は年々増えており、新規な治療材料である標的指向DDSの開発が待望されている。その他の病気においても副作用のない標的指向DDSナノ材料の重要性が注目されており、その市場規模は近い将来に10兆円を超えると予測されている。また、これらの材料は治療とともに診断への利用においても期待されている。
医薬品の治療効果は、薬物が特定の標的部位に到達し、そこで作用することにより発現される。その一方で、医薬品による副作用とは、薬物が不必要な部位に作用してしまうことである。従って、薬物を有効かつ安全に使用するためにもドラッグデリバリーシステムの開発が求められている。その中でも特に標的指向(ターゲティング)DDSとは、薬物を「体内の必要な部位に」、「必要な量を」、「必要な時間だけ」送り込むといった概念である。そのための代表的な材料としての微粒子性キャリアーであるリポソームが注目されている。この粒子に標的指向機能をもたせるために、リポソームの脂質の種類、組成比、粒子径、表面電荷を変化させるなどの受動的ターゲティング法が試みられているが、いまだ本法は不十分であり更なる改良が求められている。
一方、高機能のターゲティングを可能にするために、能動的ターゲティング法も試みられている。これは”ミサイルドラッグ”ともよばれ理想的なターゲティング法であるが、国内外においていまだ完成されたものはなく今後の発展が大いに期待されているものである。本法は、リポソーム膜面上にリガンドを結合させ、標的組織の細胞膜面上に存在するレセプターに特異的に認識させることによって、積極的にターゲティングを可能にさせる方法である。この能動的ターゲティング法での標的となる細胞膜面上に存在するレセプターのリガンドとしては、抗原、抗体、ペプチド、糖脂質や糖蛋白質などが考えられる。これらのうち、糖脂質や糖蛋白質の糖鎖は、生体組織の発生や形態形成、細胞の増殖や分化、生体防御や受精機構、癌化とその転移機構などの様々な細胞間コミュニケーションにおいて情報分子としての重要な役割を果たしていることが明らかにされつつある。
また、その標的となる各組織の細胞膜面上に存在するレセプターとしてのセレクチン、DC−SIGN、DC−SGNR、コレクチン、マンノース結合蛋白質等のC−タイプレクチン、シグレック等のIタイプレクチン、マンノース−6−リン酸受容体などのPタイプレクチン、Rタイプレクチン、Lタイプレクチン、Mタイプレクチン、ガレクチンなどの各種のレクチン(糖鎖認識蛋白質)についての研究も進んできたことから、各種の分子構造を有する糖鎖は新しいDDSリガンドとして注目されてきている(Adv.Drug Delivery Rev.43巻、225−244頁、2000年、Trends in Glycoscience and Glycotechnology 13巻、319−329頁、2001年)。
外膜表面に糖鎖を結合したリポソームについて以下が知られている。糖鎖がリンカー蛋白質を介してリポソーム膜に結合されており、糖鎖が、ルイスX型三糖鎖、シアリルルイスX型四糖鎖、3’−シアリルラクトサミン三糖鎖、6’−シアリルラクトサミン三糖鎖から選ばれたものであり、リポソーム膜および/またはリンカー蛋白質にトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンが任意に結合しており親水性化されていることを特徴とする糖鎖修飾リポソーム(特開2003−226638号公報、米国特許出願公開第2003/0143267号明細書)、シアリルルイスX糖鎖またはこれと同様にE−セクレチン、P−セクレチン等に反応することができる糖鎖が糖鎖の種類と密度が制御されて結合しているリポソームであって、炎症性疾患の病巣部位に標的指向性を有し、病巣部位に特異的に取り込まれ、病巣部位で封入された薬剤を放出し、病巣を治療しうる標的指向性リポソーム(国際公開第2005/011633号パンフレット)が報告されている。さらに、各種組織の細胞表面上に存在する各種のレクチン(糖鎖認識蛋白質)に対して特異的な結合活性を有する糖鎖を結合したリポソームであって、実際の生体内の細胞、組織を識別して薬剤あるいは遺伝子を効率的に輸送しうるリポソーム、抗癌剤ドキソルビシンを封入した糖鎖修飾リポソームも報告されている(WO 2005/011632号公報)。
さらに、新しいタイプのDDS材料研究として、投与が最も簡便・安価に行える経口投与で使用可能なDDS材料開発も重要課題である。たとえば、ペプチド性および蛋白質性医薬品などは一般的に水溶性で高分子量であり消化管の小腸粘膜透過性が低いため酵素分解を受けるなどにより経口投与してもほとんど腸管吸収されない。そこでこれらの高分子量の医薬品や遺伝子などを腸管から血液中へ送達するためのDDS材料としてリガンド結合リポソームの研究が注目されつつある(J.Controlled Release 65巻、19−29頁、2000年)。
リガンドとして糖鎖を用いた腸管吸収制御性リポソームについて以下が知られている。ラクトース二糖鎖、2’−フコシルラクトース三糖鎖、ジフコシルラクトース四糖類および3−フコシルラクトース三糖鎖から選ばれた糖鎖により修飾されたリポソームであって、糖鎖がリンカー蛋白質を介してリポソームに結合していてもよい、腸管吸収制御性リポソーム(米国特許出願公開第2003/0143267号明細書、特開2003−226647号公報)、糖鎖がリポソーム膜に結合されている糖鎖結合リポソームであって、使用する糖鎖の種類とリポソーム上の糖鎖結合量を適宜設定することにより、腸管吸収性が制御されたリポソーム(WO 2005/011632号公報)が報告されている。
医薬品の治療効果は、薬物が特定の標的部位に到達し、そこで作用することにより発現される。その一方で、医薬品による副作用とは、薬物が不必要な部位に作用してしまうことである。従って、薬物を有効かつ安全に使用するためにもドラッグデリバリーシステムの開発が求められている。その中でも特に標的指向(ターゲティング)DDSとは、薬物を「体内の必要な部位に」、「必要な量を」、「必要な時間だけ」送り込むといった概念である。そのための代表的な材料としての微粒子性キャリアーであるリポソームが注目されている。この粒子に標的指向機能をもたせるために、リポソームの脂質の種類、組成比、粒子径、表面電荷を変化させるなどの受動的ターゲティング法が試みられているが、いまだ本法は不十分であり更なる改良が求められている。
一方、高機能のターゲティングを可能にするために、能動的ターゲティング法も試みられている。これは”ミサイルドラッグ”ともよばれ理想的なターゲティング法であるが、国内外においていまだ完成されたものはなく今後の発展が大いに期待されているものである。本法は、リポソーム膜面上にリガンドを結合させ、標的組織の細胞膜面上に存在するレセプターに特異的に認識させることによって、積極的にターゲティングを可能にさせる方法である。この能動的ターゲティング法での標的となる細胞膜面上に存在するレセプターのリガンドとしては、抗原、抗体、ペプチド、糖脂質や糖蛋白質などが考えられる。これらのうち、糖脂質や糖蛋白質の糖鎖は、生体組織の発生や形態形成、細胞の増殖や分化、生体防御や受精機構、癌化とその転移機構などの様々な細胞間コミュニケーションにおいて情報分子としての重要な役割を果たしていることが明らかにされつつある。
また、その標的となる各組織の細胞膜面上に存在するレセプターとしてのセレクチン、DC−SIGN、DC−SGNR、コレクチン、マンノース結合蛋白質等のC−タイプレクチン、シグレック等のIタイプレクチン、マンノース−6−リン酸受容体などのPタイプレクチン、Rタイプレクチン、Lタイプレクチン、Mタイプレクチン、ガレクチンなどの各種のレクチン(糖鎖認識蛋白質)についての研究も進んできたことから、各種の分子構造を有する糖鎖は新しいDDSリガンドとして注目されてきている(Adv.Drug Delivery Rev.43巻、225−244頁、2000年、Trends in Glycoscience and Glycotechnology 13巻、319−329頁、2001年)。
外膜表面に糖鎖を結合したリポソームについて以下が知られている。糖鎖がリンカー蛋白質を介してリポソーム膜に結合されており、糖鎖が、ルイスX型三糖鎖、シアリルルイスX型四糖鎖、3’−シアリルラクトサミン三糖鎖、6’−シアリルラクトサミン三糖鎖から選ばれたものであり、リポソーム膜および/またはリンカー蛋白質にトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンが任意に結合しており親水性化されていることを特徴とする糖鎖修飾リポソーム(特開2003−226638号公報、米国特許出願公開第2003/0143267号明細書)、シアリルルイスX糖鎖またはこれと同様にE−セクレチン、P−セクレチン等に反応することができる糖鎖が糖鎖の種類と密度が制御されて結合しているリポソームであって、炎症性疾患の病巣部位に標的指向性を有し、病巣部位に特異的に取り込まれ、病巣部位で封入された薬剤を放出し、病巣を治療しうる標的指向性リポソーム(国際公開第2005/011633号パンフレット)が報告されている。さらに、各種組織の細胞表面上に存在する各種のレクチン(糖鎖認識蛋白質)に対して特異的な結合活性を有する糖鎖を結合したリポソームであって、実際の生体内の細胞、組織を識別して薬剤あるいは遺伝子を効率的に輸送しうるリポソーム、抗癌剤ドキソルビシンを封入した糖鎖修飾リポソームも報告されている(WO 2005/011632号公報)。
さらに、新しいタイプのDDS材料研究として、投与が最も簡便・安価に行える経口投与で使用可能なDDS材料開発も重要課題である。たとえば、ペプチド性および蛋白質性医薬品などは一般的に水溶性で高分子量であり消化管の小腸粘膜透過性が低いため酵素分解を受けるなどにより経口投与してもほとんど腸管吸収されない。そこでこれらの高分子量の医薬品や遺伝子などを腸管から血液中へ送達するためのDDS材料としてリガンド結合リポソームの研究が注目されつつある(J.Controlled Release 65巻、19−29頁、2000年)。
リガンドとして糖鎖を用いた腸管吸収制御性リポソームについて以下が知られている。ラクトース二糖鎖、2’−フコシルラクトース三糖鎖、ジフコシルラクトース四糖類および3−フコシルラクトース三糖鎖から選ばれた糖鎖により修飾されたリポソームであって、糖鎖がリンカー蛋白質を介してリポソームに結合していてもよい、腸管吸収制御性リポソーム(米国特許出願公開第2003/0143267号明細書、特開2003−226647号公報)、糖鎖がリポソーム膜に結合されている糖鎖結合リポソームであって、使用する糖鎖の種類とリポソーム上の糖鎖結合量を適宜設定することにより、腸管吸収性が制御されたリポソーム(WO 2005/011632号公報)が報告されている。
アロマターゼ阻害薬、抗アンドロゲン薬、リアーゼ阻害薬、GnRH作動薬、GnRH拮抗薬、血管新生阻害薬、チロシンキナーゼ阻害剤、セリン・スレオニンキナーゼ阻害剤、抗癌活性を有する抗体、アンサマイトシン、カペシタビン、セルモロイキン、ドセタキセル水和物、塩酸ゲムシタビン、オキサリプラチン、プレドニゾロン、テガフール・ウラシル配合剤、ジノスタチンスチラマーまたは三酸化砒素などの抗癌活性を有する薬剤について、優れた標的指向性を有する製剤、腸管吸収性制御性を有する製剤などが望まれている。
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、上記薬剤を含有させた糖鎖修飾リポソームが、血中、肝臓、脾臓、肺、脳、小腸、心臓、胸腺、腎臓、膵臓、筋肉、大腸、骨、骨髄、眼、卵巣、胎盤、前立腺、下垂体、乳腺、血管、皮膚、胆のう、胆管、膀胱、脂肪組織、癌組織、炎症組織、リンパ節などの組織または器官に対する優れた指向性、腸管吸収性制御性などを示すことを見出した。これらの知見に基づいてさらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
〔1〕 アロマターゼ阻害薬、抗アンドロゲン薬、リアーゼ阻害薬、GnRH作動薬、GnRH拮抗薬、血管新生阻害薬、チロシンキナーゼ阻害剤、セリン・スレオニンキナーゼ阻害剤、抗癌活性を有する抗体、アンサマイトシン、カペシタビン、セルモロイキン、ドセタキセル水和物、塩酸ゲムシタビン、オキサリプラチン、プレドニゾロン、テガフール・ウラシル配合剤、ジノスタチンスチラマーおよび三酸化砒素から選ばれる少なくとも一種を含有してなる、糖鎖がリポソーム膜に結合している糖鎖修飾リポソーム、
〔1a〕 ドセタキセル水和物を含有してなる、糖鎖がリポソーム膜に結合している糖鎖修飾リポソーム、
〔2〕 リポソームの構成脂質が、フォスファチジルコリン類(モル比0〜70%)、フォスファチジルエタノールアミン類(モル比0〜30%)、フォスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩類およびジセチルリン酸類からなる群から選択される一種以上の脂質(モル比0〜30%)、ガングリオシド類、糖脂質類、フォスファチジルグリセロール類およびスフィンゴミエリン類からなる群から選択される一種以上の脂質(モル比0〜40%)、ならびにコレステロール類(モル比0〜70%)を含む、上記〔1〕記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔3〕 ガングリオシド類、糖脂質類、フォスファチジルグリセロール類、スフィンゴミエリン類およびコレステロール類からなる群から選択される少なくとも一種の脂質がリポソーム表面上で集合しラフトを形成している上記〔2〕記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔4〕 糖鎖の種類および密度が制御されて結合されている、上記〔1〕から〔3〕のいずれか1項に記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔5〕 リポソームの粒径が30〜500nmである、上記〔1〕から〔4〕のいずれか1項に記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔6〕 リポソームの粒径が50〜350nmである、上記〔5〕記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔7〕 リポソームのゼータ電位が−50〜10mVである、上記〔1〕から〔6〕のいずれか1項に記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔8〕 リポソームのゼータ電位が−40〜0mVである、上記〔7〕記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔9〕 リポソームのゼータ電位が−30〜−10mVである、上記〔8〕記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔10〕 糖鎖がリンカー蛋白質を介してリポソーム膜に結合されている、上記〔1〕から〔9〕のいずれか1項に記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔11〕 リンカー蛋白質が生体由来蛋白質である上記〔10〕記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔12〕 リンカー蛋白質がヒト由来蛋白質である上記〔11〕記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔13〕 リンカー蛋白質がヒト由来血清蛋白質である上記〔12〕記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔14〕 リンカー蛋白質がヒト血清アルブミンまたはウシ血清アルブミンである上記〔11〕記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔15〕 リンカー蛋白質がリポソーム表面上に形成されているガングリオシド類、糖脂質類、フォスファチジルグリセロール類、スフィンゴミエリン類およびコレステロール類からなる群から選択される少なくとも一種の脂質からなるラフト上に結合している上記〔1〕から〔14〕のいずれか1項に記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔16〕 リポソーム膜および/またはリンカー蛋白質に親水性化合物が結合することにより親水性化されている、上記〔1〕から〔15〕のいずれか1項に記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔17〕 親水性化合物が低分子化合物である、上記〔16〕記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔18〕 親水性化合物が糖鎖に対する立体障害となりにくく標的細胞膜面上のレクチンによる糖鎖分子認識反応の進行を妨げない、上記〔16〕または〔17〕記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔19〕 親水性化合物が水酸基を有する上記〔16〕から〔18〕のいずれか1項に記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔20〕 親水性化合物がアミノアルコール類である上記〔16〕から〔19〕のいずれか1項に記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔21〕 親水性化合物がリポソーム膜表面に直接結合している上記〔16〕から〔20〕のいずれか1項に記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔22〕 親水性化合物により親水性化され、該親水性化合物が、一般式(1)
X−R1(R2OH)n 式(1)
で表される上記〔16〕記載の糖鎖修飾リポソームであって、R1は、C1からC40の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、R2は存在しないかもしくはC1からC40の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Xはリポソーム脂質またはリンカー蛋白質と直接または架橋用の二価試薬と結合する反応性官能基を示し、nは自然数を示す、糖鎖修飾リポソーム、
〔23〕 親水性化合物により親水性化され、該親水性化合物が、一般式(2)
H2N−R3−(R4OH)n 式(2)
で示される上記〔16〕記載の糖鎖修飾リポソームであって、R3は、C1からC40の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、R4は存在しないかもしくはC1からC40の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、nは自然数を示す、糖鎖修飾リポソーム、
〔24〕 親水性化合物により親水性化され、該親水性化合物が、一般式(3)
H2N−R5(OH)n 式(3)
で示される上記〔16〕記載の糖鎖修飾リポソームであって、R5は、C1からC40の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、nは自然数を示す、糖鎖修飾リポソーム、
〔25〕 リポソーム膜および/またはリンカー蛋白質にトリス(ヒドロキシアルキル)アミノアルカンである親水性化合物を共有結合により結合させることによりリポソーム膜および/またはリンカー蛋白質が親水性化されている、上記〔16〕記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔26〕 リポソーム膜および/またはリンカー蛋白質にトリス(ヒドロキシメチル)アミノエタン、トリス(ヒドロキシエチル)アミノエタン、トリス(ヒドロキシプロピル)アミノエタン、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、トリス(ヒドロキシエチル)アミノメタン、トリス(ヒドロキシプロピル)アミノメタン、トリス(ヒドロキシメチル)アミノプロパン、トリス(ヒドロキシエチル)アミノプロパン、トリス(ヒドロキシプロピル)アミノプロパンからなる群から選択される親水性化合物を共有結合により結合させることによりリポソーム膜および/またはリンカー蛋白質が親水性化されている、上記〔25〕記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔27〕 糖鎖修飾リポソームが、各組織の細胞膜面上に存在するレセプターとしてのセレクチン、DC−SIGN、DC−SGNR、コレクチンおよびマンノース結合レクチンを含むC−タイプレクチン、シグレックを含むIタイプレクチン、マンノース−6−リン酸受容体を含むPタイプレクチン、Rタイプレクチン、Lタイプレクチン、Mタイプレクチン、ガレクチンからなる群から選択されるレクチンを標的とする上記〔1〕から〔26〕のいずれか1項に記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔28〕 糖鎖修飾リポソームがE−セレクチン、P−セレクチンおよびL−セレクチンからなる群から選択されるセレクチンを標的とする上記〔27〕記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔29〕 糖鎖の結合密度が、リンカー蛋白質を用いる場合は、リポソーム1粒子当り1〜30000個であり、リンカー蛋白質を用いない場合は、リポソーム1粒子当り1〜500000個である、上記〔1〕から〔28〕のいずれか1項に記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔30〕 リンカー蛋白質を含み、糖鎖の結合密度が前記リンカー蛋白質1分子当り1〜60個である、上記〔1〕から〔28〕のいずれか1項に記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔31〕 リポソームが腸管吸収機能を有するものである上記〔1〕から〔30〕のいずれか1項に記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔32〕 血中、血液細胞、肝臓、脾臓、肺、脳、小腸、心臓、胸腺、腎臓、膵臓、筋肉、大腸、骨、骨髄、眼、卵巣、胎盤、前立腺、下垂体、乳腺、血管、皮膚、胆のう、胆管、膀胱、脂肪組織、癌組織、炎症組織およびリンパ節からなる群から選択される組織または器官に指向性の高い、上記〔1〕から〔31〕のいずれか1項に記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔33〕 糖鎖が、アルファ1,2マンノビオース二糖鎖、アルファ1,3マンノビオース二糖鎖、アルファ1,4マンノビオース二糖鎖、アルファ1,6マンノビオース二糖鎖、アルファ1,3アルファ1,6マンノトリオース三糖鎖、オリゴマンノース3五糖鎖、オリゴマンノース4b六糖鎖、オリゴマンノース5七糖鎖、オリゴマンノース6八糖鎖、オリゴマンノース7九糖鎖、オリゴマンノース8十糖鎖、オリゴマンノース9十一糖鎖、3’−シアリルラクトース三糖鎖、6’−シアリルラクトース三糖鎖、3’−シアリルラクトサミン三糖鎖、6’−シアリルラクトサミン三糖鎖、ルイスX型三糖鎖、シアリルルイスX型四糖鎖、ラクトース二糖鎖、2’−フコシルラクトース三糖鎖、ジフコシルラクトース四糖鎖および3−フコシルラクトース三糖鎖からなる群から選択される、上記〔1〕から〔32〕のいずれか1項に記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔34〕 上記〔1〕から〔33〕のいずれか1項に記載のリポソームを含有してなる、リポソーム製剤、
〔35〕 経口投与製剤である、上記〔34〕記載のリポソーム製剤、
〔36〕 非経口投与製剤である、上記〔34〕記載のリポソーム製剤、
〔37〕 アロマターゼ阻害薬、抗アンドロゲン薬、リアーゼ阻害薬、GnRH作動薬、GnRH拮抗薬、血管新生阻害薬、チロシンキナーゼ阻害剤、セリン・スレオニンキナーゼ阻害剤、抗癌活性を有する抗体、アンサマイトシン、カペシタビン、セルモロイキン、ドセタキセル水和物、塩酸ゲムシタビン、オキサリプラチン、プレドニゾロン、テガフール・ウラシル配合剤、ジノスタチンスチラマーおよび三酸化砒素から選ばれる少なくとも一種を含有してなる、リポソーム膜が親水性化されており、表面に糖鎖が結合していないリポソーム、
〔37a〕 ドセタキセル水和物を含有してなる、リポソーム膜が親水性化されており、表面に糖鎖が結合していないリポソーム、
〔38〕 リポソームの構成脂質が、フォスファチジルコリン類(モル比0〜70%)、フォスファチジルエタノールアミン類(モル比0〜30%)、フォスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩類およびジセチルリン酸類からなる群から選択される1種以上の脂質(モル比0〜30%)、ガングリオシド類、糖脂質類、フォスファチジルグリセロール類およびスフィンゴミエリン類からなる群から選択される1種以上の脂質(モル比0〜40%)、ならびにコレステロール類(モル比0〜70%)を含む、上記〔37〕記載のリポソーム、
〔39〕 さらに、蛋白質を含む上記〔37〕または〔38〕記載のリポソーム、
〔40〕 リポソーム膜および/またはリンカー蛋白質に親水性化合物が結合することにより親水性化されている、上記〔37〕から〔39〕のいずれか1項に記載のリポソーム、
〔41〕 親水性化合物が低分子物質である、上記〔40〕記載のリポソーム、
〔42〕 親水性化合物が糖鎖に対する立体障害となりにくく標的細胞膜面上のレクチンによる糖鎖分子認識反応の進行を妨げない、上記〔40〕または〔41〕記載のリポソーム、
〔43〕 親水性化合物が水酸基を有する上記〔40〕から〔42〕のいずれか1項に記載のリポソーム、
〔44〕 親水性化合物がアミノアルコール類である上記〔40〕から〔43〕のいずれか1項に記載のリポソーム、
〔45〕 親水性化合物がリポソーム膜表面に直接結合している上記〔40〕から〔44〕のいずれか1項に記載のリポソーム、
〔46〕 低分子の親水性化合物が少なくとも1つの水酸基を有する化合物である、上記〔40〕記載のリポソーム、
〔47〕 親水性化合物が、一般式(1)
X−R1(R2OH)n 式(1)
で表される上記〔40〕記載のリポソームであって、R1は、C1からC40の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、R2は存在しないかもしくはC1からC40の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Xはリポソーム脂質またはリンカー蛋白質と直接または架橋用の二価試薬と結合する反応性官能基を示し、nは自然数を示す、リポソーム、
〔48〕 親水性化合物が、一般式(2)
H2N−R3−(R4OH)n 式(2)
で示される上記〔40〕記載のリポソームであって、R3は、C1からC40の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、R4は存在しないかもしくはC1からC40の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、nは自然数を示す、リポソーム、
〔49〕 親水性化合物が、一般式(3)
H2N−R5(OH)n 式(3)
で示される上記〔40〕記載のリポソームであって、R5は、C1からC40の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、nは自然数を示す、リポソーム、
〔50〕 リポソーム膜および/またはリンカー蛋白質にトリス(ヒドロキシアルキル)アミノアルカンである親水性化合物を共有結合により結合させることによりリポソーム膜および/またはリンカー蛋白質が親水性化されている、上記〔40〕記載のリポソーム、
〔51〕 リポソーム膜および/またはリンカー蛋白質にトリス(ヒドロキシメチル)アミノエタン、トリス(ヒドロキシエチル)アミノエタン、トリス(ヒドロキシプロピル)アミノエタン、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、トリス(ヒドロキシエチル)アミノメタン、トリス(ヒドロキシプロピル)アミノメタン、トリス(ヒドロキシメチル)アミノプロパン、トリス(ヒドロキシエチル)アミノプロパン、トリス(ヒドロキシプロピル)アミノプロパンからなる群から選択される親水性化合物を共有結合により結合させることによりリポソーム膜および/またはリンカー蛋白質が親水性化されている、上記〔50〕記載のリポソーム、
〔52〕 上記〔37〕から〔51〕のいずれか1項に記載のリポソームを含有してなるリポソーム製剤、
〔53〕 経口投与製剤である、上記〔52〕記載のリポソームを含有してなるリポソーム製剤、
〔54〕 非経口投与製剤である、上記〔52〕記載のリポソームを含有してなるリポソーム製剤などを提供する。
アロマターゼ阻害薬、抗アンドロゲン薬、リアーゼ阻害薬、GnRH作動薬、GnRH拮抗薬、血管新生阻害薬、チロシンキナーゼ阻害剤、セリン・スレオニンキナーゼ阻害剤、抗癌活性を有する抗体、アンサマイトシン、カペシタビン、セルモロイキン、ドセタキセル水和物、塩酸ゲムシタビン、オキサリプラチン、プレドニゾロン、テガフール・ウラシル配合剤、ジノスタチンスチラマーまたは三酸化砒素を含有する糖鎖修飾リポソームは、血中、肝臓、脾臓、肺、脳、小腸、心臓、胸腺、腎臓、膵臓、筋肉、大腸、骨、骨髄、眼、卵巣、胎盤、前立腺、下垂体、乳腺、血管、皮膚、胆のう、胆管、膀胱、脂肪組織、癌組織、炎症組織、リンパ節などの組織または器官に対し、優れた指向性を有するので、標的とする組織または器官に対して上記薬剤を効率的に輸送しうる製剤などとして利用することができる。このように、本発明の糖鎖修飾リポソームは、高い標的指向性を有するので、上記薬剤を癌組織など標的とする組織または器官に効果的に集積させることができる。したがって、薬剤の全身投与量を増加させることなく病巣部の薬剤濃度を上げることができ、癌の成長を効率的に抑制することができる。また、癌組織など標的とする組織または器官における薬剤濃度を低下させることなく全身への投与薬剤量を減らすこともできるので、治療効果を減少させることなく薬剤による副作用を減らすことができる。
また、本発明の上記糖鎖修飾リポソームは、腸管吸収性を制御することができるので、上記薬剤を腸管経由で生体組織に移行させる製剤などとして利用することができる。
さらに、アロマターゼ阻害薬、抗アンドロゲン薬、リアーゼ阻害薬、GnRH作動薬、GnRH拮抗薬、血管新生阻害薬、チロシンキナーゼ阻害剤、セリン・スレオニンキナーゼ阻害剤、抗癌活性を有する抗体、アンサマイトシン、カペシタビン、セルモロイキン、ドセタキセル水和物、塩酸ゲムシタビン、オキサリプラチン、プレドニゾロン、テガフール・ウラシル配合剤、ジノスタチンスチラマーまたは三酸化砒素を含有するリポソームは、該リポソームに糖鎖が結合していない場合であっても、体内で非常に安定であるため、上記薬剤の体内での半減期が長くなり、標的とする組織または器官に上記薬剤を効果的に到達させることができる。したがって、本発明のリポソームは、標的とする組織または器官に対して上記薬剤を効果的に到達させうる製剤などとして利用することができる。
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、上記薬剤を含有させた糖鎖修飾リポソームが、血中、肝臓、脾臓、肺、脳、小腸、心臓、胸腺、腎臓、膵臓、筋肉、大腸、骨、骨髄、眼、卵巣、胎盤、前立腺、下垂体、乳腺、血管、皮膚、胆のう、胆管、膀胱、脂肪組織、癌組織、炎症組織、リンパ節などの組織または器官に対する優れた指向性、腸管吸収性制御性などを示すことを見出した。これらの知見に基づいてさらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
〔1〕 アロマターゼ阻害薬、抗アンドロゲン薬、リアーゼ阻害薬、GnRH作動薬、GnRH拮抗薬、血管新生阻害薬、チロシンキナーゼ阻害剤、セリン・スレオニンキナーゼ阻害剤、抗癌活性を有する抗体、アンサマイトシン、カペシタビン、セルモロイキン、ドセタキセル水和物、塩酸ゲムシタビン、オキサリプラチン、プレドニゾロン、テガフール・ウラシル配合剤、ジノスタチンスチラマーおよび三酸化砒素から選ばれる少なくとも一種を含有してなる、糖鎖がリポソーム膜に結合している糖鎖修飾リポソーム、
〔1a〕 ドセタキセル水和物を含有してなる、糖鎖がリポソーム膜に結合している糖鎖修飾リポソーム、
〔2〕 リポソームの構成脂質が、フォスファチジルコリン類(モル比0〜70%)、フォスファチジルエタノールアミン類(モル比0〜30%)、フォスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩類およびジセチルリン酸類からなる群から選択される一種以上の脂質(モル比0〜30%)、ガングリオシド類、糖脂質類、フォスファチジルグリセロール類およびスフィンゴミエリン類からなる群から選択される一種以上の脂質(モル比0〜40%)、ならびにコレステロール類(モル比0〜70%)を含む、上記〔1〕記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔3〕 ガングリオシド類、糖脂質類、フォスファチジルグリセロール類、スフィンゴミエリン類およびコレステロール類からなる群から選択される少なくとも一種の脂質がリポソーム表面上で集合しラフトを形成している上記〔2〕記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔4〕 糖鎖の種類および密度が制御されて結合されている、上記〔1〕から〔3〕のいずれか1項に記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔5〕 リポソームの粒径が30〜500nmである、上記〔1〕から〔4〕のいずれか1項に記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔6〕 リポソームの粒径が50〜350nmである、上記〔5〕記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔7〕 リポソームのゼータ電位が−50〜10mVである、上記〔1〕から〔6〕のいずれか1項に記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔8〕 リポソームのゼータ電位が−40〜0mVである、上記〔7〕記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔9〕 リポソームのゼータ電位が−30〜−10mVである、上記〔8〕記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔10〕 糖鎖がリンカー蛋白質を介してリポソーム膜に結合されている、上記〔1〕から〔9〕のいずれか1項に記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔11〕 リンカー蛋白質が生体由来蛋白質である上記〔10〕記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔12〕 リンカー蛋白質がヒト由来蛋白質である上記〔11〕記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔13〕 リンカー蛋白質がヒト由来血清蛋白質である上記〔12〕記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔14〕 リンカー蛋白質がヒト血清アルブミンまたはウシ血清アルブミンである上記〔11〕記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔15〕 リンカー蛋白質がリポソーム表面上に形成されているガングリオシド類、糖脂質類、フォスファチジルグリセロール類、スフィンゴミエリン類およびコレステロール類からなる群から選択される少なくとも一種の脂質からなるラフト上に結合している上記〔1〕から〔14〕のいずれか1項に記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔16〕 リポソーム膜および/またはリンカー蛋白質に親水性化合物が結合することにより親水性化されている、上記〔1〕から〔15〕のいずれか1項に記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔17〕 親水性化合物が低分子化合物である、上記〔16〕記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔18〕 親水性化合物が糖鎖に対する立体障害となりにくく標的細胞膜面上のレクチンによる糖鎖分子認識反応の進行を妨げない、上記〔16〕または〔17〕記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔19〕 親水性化合物が水酸基を有する上記〔16〕から〔18〕のいずれか1項に記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔20〕 親水性化合物がアミノアルコール類である上記〔16〕から〔19〕のいずれか1項に記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔21〕 親水性化合物がリポソーム膜表面に直接結合している上記〔16〕から〔20〕のいずれか1項に記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔22〕 親水性化合物により親水性化され、該親水性化合物が、一般式(1)
X−R1(R2OH)n 式(1)
で表される上記〔16〕記載の糖鎖修飾リポソームであって、R1は、C1からC40の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、R2は存在しないかもしくはC1からC40の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Xはリポソーム脂質またはリンカー蛋白質と直接または架橋用の二価試薬と結合する反応性官能基を示し、nは自然数を示す、糖鎖修飾リポソーム、
〔23〕 親水性化合物により親水性化され、該親水性化合物が、一般式(2)
H2N−R3−(R4OH)n 式(2)
で示される上記〔16〕記載の糖鎖修飾リポソームであって、R3は、C1からC40の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、R4は存在しないかもしくはC1からC40の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、nは自然数を示す、糖鎖修飾リポソーム、
〔24〕 親水性化合物により親水性化され、該親水性化合物が、一般式(3)
H2N−R5(OH)n 式(3)
で示される上記〔16〕記載の糖鎖修飾リポソームであって、R5は、C1からC40の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、nは自然数を示す、糖鎖修飾リポソーム、
〔25〕 リポソーム膜および/またはリンカー蛋白質にトリス(ヒドロキシアルキル)アミノアルカンである親水性化合物を共有結合により結合させることによりリポソーム膜および/またはリンカー蛋白質が親水性化されている、上記〔16〕記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔26〕 リポソーム膜および/またはリンカー蛋白質にトリス(ヒドロキシメチル)アミノエタン、トリス(ヒドロキシエチル)アミノエタン、トリス(ヒドロキシプロピル)アミノエタン、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、トリス(ヒドロキシエチル)アミノメタン、トリス(ヒドロキシプロピル)アミノメタン、トリス(ヒドロキシメチル)アミノプロパン、トリス(ヒドロキシエチル)アミノプロパン、トリス(ヒドロキシプロピル)アミノプロパンからなる群から選択される親水性化合物を共有結合により結合させることによりリポソーム膜および/またはリンカー蛋白質が親水性化されている、上記〔25〕記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔27〕 糖鎖修飾リポソームが、各組織の細胞膜面上に存在するレセプターとしてのセレクチン、DC−SIGN、DC−SGNR、コレクチンおよびマンノース結合レクチンを含むC−タイプレクチン、シグレックを含むIタイプレクチン、マンノース−6−リン酸受容体を含むPタイプレクチン、Rタイプレクチン、Lタイプレクチン、Mタイプレクチン、ガレクチンからなる群から選択されるレクチンを標的とする上記〔1〕から〔26〕のいずれか1項に記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔28〕 糖鎖修飾リポソームがE−セレクチン、P−セレクチンおよびL−セレクチンからなる群から選択されるセレクチンを標的とする上記〔27〕記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔29〕 糖鎖の結合密度が、リンカー蛋白質を用いる場合は、リポソーム1粒子当り1〜30000個であり、リンカー蛋白質を用いない場合は、リポソーム1粒子当り1〜500000個である、上記〔1〕から〔28〕のいずれか1項に記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔30〕 リンカー蛋白質を含み、糖鎖の結合密度が前記リンカー蛋白質1分子当り1〜60個である、上記〔1〕から〔28〕のいずれか1項に記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔31〕 リポソームが腸管吸収機能を有するものである上記〔1〕から〔30〕のいずれか1項に記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔32〕 血中、血液細胞、肝臓、脾臓、肺、脳、小腸、心臓、胸腺、腎臓、膵臓、筋肉、大腸、骨、骨髄、眼、卵巣、胎盤、前立腺、下垂体、乳腺、血管、皮膚、胆のう、胆管、膀胱、脂肪組織、癌組織、炎症組織およびリンパ節からなる群から選択される組織または器官に指向性の高い、上記〔1〕から〔31〕のいずれか1項に記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔33〕 糖鎖が、アルファ1,2マンノビオース二糖鎖、アルファ1,3マンノビオース二糖鎖、アルファ1,4マンノビオース二糖鎖、アルファ1,6マンノビオース二糖鎖、アルファ1,3アルファ1,6マンノトリオース三糖鎖、オリゴマンノース3五糖鎖、オリゴマンノース4b六糖鎖、オリゴマンノース5七糖鎖、オリゴマンノース6八糖鎖、オリゴマンノース7九糖鎖、オリゴマンノース8十糖鎖、オリゴマンノース9十一糖鎖、3’−シアリルラクトース三糖鎖、6’−シアリルラクトース三糖鎖、3’−シアリルラクトサミン三糖鎖、6’−シアリルラクトサミン三糖鎖、ルイスX型三糖鎖、シアリルルイスX型四糖鎖、ラクトース二糖鎖、2’−フコシルラクトース三糖鎖、ジフコシルラクトース四糖鎖および3−フコシルラクトース三糖鎖からなる群から選択される、上記〔1〕から〔32〕のいずれか1項に記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔34〕 上記〔1〕から〔33〕のいずれか1項に記載のリポソームを含有してなる、リポソーム製剤、
〔35〕 経口投与製剤である、上記〔34〕記載のリポソーム製剤、
〔36〕 非経口投与製剤である、上記〔34〕記載のリポソーム製剤、
〔37〕 アロマターゼ阻害薬、抗アンドロゲン薬、リアーゼ阻害薬、GnRH作動薬、GnRH拮抗薬、血管新生阻害薬、チロシンキナーゼ阻害剤、セリン・スレオニンキナーゼ阻害剤、抗癌活性を有する抗体、アンサマイトシン、カペシタビン、セルモロイキン、ドセタキセル水和物、塩酸ゲムシタビン、オキサリプラチン、プレドニゾロン、テガフール・ウラシル配合剤、ジノスタチンスチラマーおよび三酸化砒素から選ばれる少なくとも一種を含有してなる、リポソーム膜が親水性化されており、表面に糖鎖が結合していないリポソーム、
〔37a〕 ドセタキセル水和物を含有してなる、リポソーム膜が親水性化されており、表面に糖鎖が結合していないリポソーム、
〔38〕 リポソームの構成脂質が、フォスファチジルコリン類(モル比0〜70%)、フォスファチジルエタノールアミン類(モル比0〜30%)、フォスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩類およびジセチルリン酸類からなる群から選択される1種以上の脂質(モル比0〜30%)、ガングリオシド類、糖脂質類、フォスファチジルグリセロール類およびスフィンゴミエリン類からなる群から選択される1種以上の脂質(モル比0〜40%)、ならびにコレステロール類(モル比0〜70%)を含む、上記〔37〕記載のリポソーム、
〔39〕 さらに、蛋白質を含む上記〔37〕または〔38〕記載のリポソーム、
〔40〕 リポソーム膜および/またはリンカー蛋白質に親水性化合物が結合することにより親水性化されている、上記〔37〕から〔39〕のいずれか1項に記載のリポソーム、
〔41〕 親水性化合物が低分子物質である、上記〔40〕記載のリポソーム、
〔42〕 親水性化合物が糖鎖に対する立体障害となりにくく標的細胞膜面上のレクチンによる糖鎖分子認識反応の進行を妨げない、上記〔40〕または〔41〕記載のリポソーム、
〔43〕 親水性化合物が水酸基を有する上記〔40〕から〔42〕のいずれか1項に記載のリポソーム、
〔44〕 親水性化合物がアミノアルコール類である上記〔40〕から〔43〕のいずれか1項に記載のリポソーム、
〔45〕 親水性化合物がリポソーム膜表面に直接結合している上記〔40〕から〔44〕のいずれか1項に記載のリポソーム、
〔46〕 低分子の親水性化合物が少なくとも1つの水酸基を有する化合物である、上記〔40〕記載のリポソーム、
〔47〕 親水性化合物が、一般式(1)
X−R1(R2OH)n 式(1)
で表される上記〔40〕記載のリポソームであって、R1は、C1からC40の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、R2は存在しないかもしくはC1からC40の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Xはリポソーム脂質またはリンカー蛋白質と直接または架橋用の二価試薬と結合する反応性官能基を示し、nは自然数を示す、リポソーム、
〔48〕 親水性化合物が、一般式(2)
H2N−R3−(R4OH)n 式(2)
で示される上記〔40〕記載のリポソームであって、R3は、C1からC40の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、R4は存在しないかもしくはC1からC40の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、nは自然数を示す、リポソーム、
〔49〕 親水性化合物が、一般式(3)
H2N−R5(OH)n 式(3)
で示される上記〔40〕記載のリポソームであって、R5は、C1からC40の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、nは自然数を示す、リポソーム、
〔50〕 リポソーム膜および/またはリンカー蛋白質にトリス(ヒドロキシアルキル)アミノアルカンである親水性化合物を共有結合により結合させることによりリポソーム膜および/またはリンカー蛋白質が親水性化されている、上記〔40〕記載のリポソーム、
〔51〕 リポソーム膜および/またはリンカー蛋白質にトリス(ヒドロキシメチル)アミノエタン、トリス(ヒドロキシエチル)アミノエタン、トリス(ヒドロキシプロピル)アミノエタン、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、トリス(ヒドロキシエチル)アミノメタン、トリス(ヒドロキシプロピル)アミノメタン、トリス(ヒドロキシメチル)アミノプロパン、トリス(ヒドロキシエチル)アミノプロパン、トリス(ヒドロキシプロピル)アミノプロパンからなる群から選択される親水性化合物を共有結合により結合させることによりリポソーム膜および/またはリンカー蛋白質が親水性化されている、上記〔50〕記載のリポソーム、
〔52〕 上記〔37〕から〔51〕のいずれか1項に記載のリポソームを含有してなるリポソーム製剤、
〔53〕 経口投与製剤である、上記〔52〕記載のリポソームを含有してなるリポソーム製剤、
〔54〕 非経口投与製剤である、上記〔52〕記載のリポソームを含有してなるリポソーム製剤などを提供する。
アロマターゼ阻害薬、抗アンドロゲン薬、リアーゼ阻害薬、GnRH作動薬、GnRH拮抗薬、血管新生阻害薬、チロシンキナーゼ阻害剤、セリン・スレオニンキナーゼ阻害剤、抗癌活性を有する抗体、アンサマイトシン、カペシタビン、セルモロイキン、ドセタキセル水和物、塩酸ゲムシタビン、オキサリプラチン、プレドニゾロン、テガフール・ウラシル配合剤、ジノスタチンスチラマーまたは三酸化砒素を含有する糖鎖修飾リポソームは、血中、肝臓、脾臓、肺、脳、小腸、心臓、胸腺、腎臓、膵臓、筋肉、大腸、骨、骨髄、眼、卵巣、胎盤、前立腺、下垂体、乳腺、血管、皮膚、胆のう、胆管、膀胱、脂肪組織、癌組織、炎症組織、リンパ節などの組織または器官に対し、優れた指向性を有するので、標的とする組織または器官に対して上記薬剤を効率的に輸送しうる製剤などとして利用することができる。このように、本発明の糖鎖修飾リポソームは、高い標的指向性を有するので、上記薬剤を癌組織など標的とする組織または器官に効果的に集積させることができる。したがって、薬剤の全身投与量を増加させることなく病巣部の薬剤濃度を上げることができ、癌の成長を効率的に抑制することができる。また、癌組織など標的とする組織または器官における薬剤濃度を低下させることなく全身への投与薬剤量を減らすこともできるので、治療効果を減少させることなく薬剤による副作用を減らすことができる。
また、本発明の上記糖鎖修飾リポソームは、腸管吸収性を制御することができるので、上記薬剤を腸管経由で生体組織に移行させる製剤などとして利用することができる。
さらに、アロマターゼ阻害薬、抗アンドロゲン薬、リアーゼ阻害薬、GnRH作動薬、GnRH拮抗薬、血管新生阻害薬、チロシンキナーゼ阻害剤、セリン・スレオニンキナーゼ阻害剤、抗癌活性を有する抗体、アンサマイトシン、カペシタビン、セルモロイキン、ドセタキセル水和物、塩酸ゲムシタビン、オキサリプラチン、プレドニゾロン、テガフール・ウラシル配合剤、ジノスタチンスチラマーまたは三酸化砒素を含有するリポソームは、該リポソームに糖鎖が結合していない場合であっても、体内で非常に安定であるため、上記薬剤の体内での半減期が長くなり、標的とする組織または器官に上記薬剤を効果的に到達させることができる。したがって、本発明のリポソームは、標的とする組織または器官に対して上記薬剤を効果的に到達させうる製剤などとして利用することができる。
図1は、アルファ1,2マンノビオース二糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図2は、アルファ1,3マンノビオース二糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図3は、アルファ1,4マンノビオース二糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図4は、アルファ1,6マンノビオース二糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図5は、アルファ1,3アルファ1,6マンノトリオース三糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図6は、オリゴマンノース3五糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図7は、オリゴマンノース4b六糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図8は、オリゴマンノース5七糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図9は、オリゴマンノース6八糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図10は、オリゴマンノース7九糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図11は、オリゴマンノース8十糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図12は、オリゴマンノース9十一糖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図13は、13種のリポソーム複合体の静脈内投与60分後の血中への分布量を示す図である。
図14は、13種のリポソーム複合体の静脈内投与60分後の肝臓への分布量を示す図である。
図15は、13種のリポソーム複合体の静脈内投与60分後の脾臓への分布量を示す図である。
図16は、13種のリポソーム複合体の静脈内投与60分後の肺への分布量を示す図である。
図17は、13種のリポソーム複合体の静脈内投与60分後の脳への分布量を示す図である。
図18は、13種のリポソーム複合体の静脈内投与60分後の癌組織への分布量を示す図である。
図19は、13種のリポソーム複合体の静脈内投与60分後のリンパ節への分布量を示す図である。
図20は、13種のリポソーム複合体の静脈内投与60分後の胸腺への分布量を示す図である。
図21は、13種のリポソーム複合体の静脈内投与60分後の心臓への分布量を示す図である。
図22は、13種のリポソーム複合体の静脈内投与60分後の小腸への分布量を示す図である。
図23は、3’−シアリルラクトース三糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図24は、6’−シアリルラクトース三糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図25は、3’’−シアリルラクトサミン三糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図26は、6’−シアリルラクトサミン三糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図27は、4種のリポソーム複合体の腸管内投与10分後の血中への移行量を示す図である。
図28は、4種のリポソーム複合体の腸管内投与10分後の血中への移行量を示す図である。
図29は、4種のリポソーム複合体の腸管内投与10分後の血中への移行量を示す図である。
図30は、4種のリポソーム複合体の腸管内投与10分後の血中への移行量を示す図である。
図31は、4種のリポソーム複合体の腸管内投与10分後の血中への移行量を示す図である。
図32は、比較試料としてのtris(hydroxymethyl)aminomethaneを結合したリポソームの模式図である。
図33は、ルイスX型三糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図34は、シアリルルイスX型四糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図35は、ラクトース二糖鎖により修飾されたリポソームの構造例を示す模式図である。
図36は、2’−フコシルラクトース三糖鎖により修飾されたリポソームの構造例を示す模式図である。
図37は、ジフコシルラクトース四糖鎖により修飾されたリポソームの構造例を示す模式図である。
図38は、3−フコシルラクトース三糖鎖により修飾されたリポソームの構造例を示す模式図である。
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明は、アロマターゼ阻害薬、抗アンドロゲン薬、リアーゼ阻害薬、GnRH作動薬、GnRH拮抗薬、血管新生阻害薬、チロシンキナーゼ阻害剤、セリン・スレオニンキナーゼ阻害剤、抗癌活性を有する抗体、アンサマイトシン、カペシタビン、セルモロイキン、ドセタキセル水和物、塩酸ゲムシタビン、オキサリプラチン、プレドニゾロン、テガフール・ウラシル配合剤、ジノスタチンスチラマー、三酸化砒素などの抗癌活性を有する薬剤を含有してなる、糖鎖がリポソーム膜に結合している糖鎖修飾リポソーム(「本発明の糖鎖修飾リポソーム」と略記することがある)に関する。ここで、癌は、腫瘍や白血病等のあらゆる新生物による疾患を含む。
上記「アロマターゼ阻害薬」としては、例えばアナストロゾール(anastrozole)、レトロゾール((letrozole)、ファドロゾール(fadrozole)、エクセメスタン(exemestane)などが挙げられる。
上記「抗アンドロゲン薬」としては、例えばビカルタミド(bicaltamide)、フルタミド(flutamide)などが挙げられる。
上記「リアーゼ阻害薬」としては、例えばケトコナゾール(ketoconazole)などが挙げられる。
上記「GnRH作動薬」としては、例えば?
酢酸ゴセレリン(goserelin acetate)、酢酸リュープロレリン(leuprorelin acetate)などが挙げられる。
上記「GnRH拮抗薬」としては、例えばセトロレリクス(cetrorelix)、ガニレリックス(ganirelix)、アバレリックス(abarelix)、オザレリックス(ozarelix)などが挙げられる。
上記「血管新生阻害薬」としては、例えばフマギリン(fumagillin)などが挙げられる。
上記「チロシンキナーゼ阻害剤」としては、例えばゲフィチニブ(gefitinib)エルロチニブ(erulotinib)、メシル酸イマチニブ((imatinib mesilate)、ラパチニブ(lapatinib)、スニチニブ(sunitinib)、ダサチニブ(dasatinib)などが挙げられる。
上記「セリン・スレオニンキナーゼ阻害剤」としては、例えばソラフェニブ(sorafenib)などが挙げられる。
上記「抗癌活性を有する抗体」としては、例えばリツキシマブ(rituximab)、ベバシズマブ(bevacizumab)、セツキシマブ(cetuximab)、トラスツズマブ(trastuzumab)、パーツズマブ(pertuzumab)などが挙げられる。
本発明の糖鎖修飾リポソームは、表面に種々の糖鎖を有する標的指向性リポソームおよび腸管吸収制御性リポソームを含む。本発明において、標的指向性とは生体内に投与したときに特定の組織や器官または癌等の疾患部位等の標的部位に特異的に到達し取り込まれ得る性質をいう。また、腸管吸収制御性とは、腸管経由で生体内に取り込まれる性質、すなわち腸管吸収性を有し、さらに取り込まれる速度、程度等を制御し得る性質をいう。
リポソームとは、通常、膜状に集合した脂質層および内部の水層から構成される閉鎖小胞を意味する。本発明の糖鎖修飾リポソームは、図1〜12、23〜26および32〜38に示されるように、その表面、すなわち脂質層、に糖鎖が結合している。糖鎖は直接リポソームの脂質層に結合していてもよいし、リンカー蛋白質を介して結合していてもよい。糖鎖は、その種類と密度が制御されて結合している。
糖鎖は、本発明の腸管吸収制御性リポソームおよび本発明の標的指向性リポソームの標的組織や器官または癌などに応じて種々のものを用いることができる。
病変部の血管内皮細胞に発現するE−セレクチン、P−セレクチンと白血球の細胞膜上に発現している糖鎖であるシアリルルイスXが強く結合することが知られている。本リポソ−ムはこのシアリルルイスX糖鎖またはこれと同様にE−セレクチン、P−セレクチン等のレクチン様の糖鎖結合部位を有する蛋白質に反応することができる糖鎖が糖鎖の種類と密度が制御されて結合しているリポソームであり、血管内皮細胞がE−セレクチン、P−セレクチン等を発現している癌等の病巣部位に特異的に集積すると考えられる。またE−セレクチン、P−セレクチン等を発現している部位は炎症や血管新生が生じている部位であり、そのような部位の血管は内皮細胞の細胞間隙が拡大しており、集積したリポソームがその隙間から病巣部位およびその周囲に拡散するものと考えられる。拡散したリポソームは病巣部位およびその周囲の各種細胞に取り込まれ(endocytosis)、細胞内で内包している薬剤を放出する。このようなメカニズムで癌などに効果を発揮する。
以下、本発明で用いられる糖鎖、リポソームなど各要素について、より具体的に説明する。
(糖鎖)
本発明のリポソームに結合させる糖鎖として、上述のようにE−セレクチン、P−セレクチン等のレクチン様の糖鎖結合部位を有する蛋白質に反応することができる糖鎖が挙げられる。ここで、E−セレクチン、P−セレクチン等とは、セレクチン(例、E−セレクチン、P−セレクチン、L−セレクチン)、DC−SIGN、DC−SGNR、コレクチン、マンノース結合蛋白質等のC−タイプレクチン、シグレック等のIタイプレクチン、マンノース−6−リン酸受容体などのPタイプレクチン、Rタイプレクチン、Lタイプレクチン、Mタイプレクチン、ガレクチンなどの各種のレクチン(糖鎖認識蛋白質)をいう。本発明のリポソームが標的とする細胞は、細胞により発現するレクチン様の糖鎖結合部位を有する蛋白質の種類が異なるので、該蛋白質の種類に応じて糖鎖を選択することにより特定の細胞に特異的に指向性を有するリポソームを得ることができる。
例えば、腸管吸収制御性リポソームに用いられる糖鎖として、3’−シアリルラクトース三糖鎖(図23に構造式を示す。以下、同様)、6’−シアリルラクトース三糖鎖(図24)、3’−シアリルラクトサミン糖鎖(図25)および6’−シアリルラクトサミン糖鎖(図26)が挙げられる。標的指向性リポソームに用いられる糖鎖として、アルファ1,2マンノビオース二糖鎖(図1)、アルファ1,3マンノビオース二糖鎖(図2)、アルファ1,4マンノビオース二糖鎖(図3)、アルファ1,6マンノビオース二糖鎖(図4)、アルファ1,3アルファ1,6マンノトリオース三糖鎖(図5)、オリゴマンノース3五糖鎖(図6)、オリゴマンノース4b六糖鎖(図7)、オリゴマンノース5七糖鎖(図8)、オリゴマンノース6八糖鎖(図9)、オリゴマンノース7九糖鎖(図10)、オリゴマンノース8十糖鎖(図11)、オリゴマンノース9十一糖鎖(図12)、ルイスX型三糖鎖(図33)、シアリルルイスX型四糖鎖(図34)、ラクトース二糖鎖(図35)、2’−フコシルラクトース三糖鎖(図36)、ジフコシルラクトース四糖鎖(図37)、3−フコシルラクトース三糖鎖(図38)が挙げられる。
(リポソーム)
本発明に用いられるリポソームについては、膜安定性をよくすること、封入される薬物などのもれをなくすこと、膜面の親水性化処理をできるようにすること、蛋白質を各種密度で結合できるようにすること、糖鎖を各種密度で結合できるようにすること、などを可能にするために、鋭意努力をして、以下のような各種の脂質と糖脂質などを構成成分とするリポソームを作製した。本発明のリポソームを構成する脂質としては、例えば、フォスファチジルコリン類、フォスファチジルエタノールアミン類、フォスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩類、ジセチルリン酸類、ガングリオシド類、糖脂質類、フォスファチジルグリセロール類、スフィンゴミエリン類、コレステロール類等が挙げられ、フォスファチジルコリン類としては、ジミリストイルフォスファチジルコリン、ジパルミトイルフォスファチジルコリン、ジステアロイルフォスファチジルコリン等が、また、フォスファチジルエタノールアミン類としては、ジミリストイルフォスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルフォスファチジルエタノールアミン等が、フォスファチジン酸類もしくは長鎖アルキルリン酸塩類としては、ジミリストイルフォスファチジン酸、ジパルミトイルフォスファチジン酸、ジステアロイルフォスファチジン酸、ジセチルリン酸等が、ガングリオシド類としては、ガングリオシドGM1、ガングリオシドGD1a、ガングリオシドGT1b等が、糖脂質類としては、ガラクトシルセラミド、グルコシルセラミド、ラクトシルセラミド、フォスファチド、グロボシド等が、フォスファチジルグリセロール類としては、ジミリストイルフォスファチジルグリセロール、ジパルミトイルフォスファチジルグリセロール、ジステアロイルフォスファチジルグリセロール等が好ましい。このうち、フォスファチジン酸類もしくは長鎖アルキルリン酸塩類、ガングリオシド類もしくは糖脂質類、コレステロール類はリポソームの安定性を上昇させる効果を有するので、構成脂質として添加するのが望ましい。
例えば、本発明のリポソームを構成する脂質として、フォスファチジルコリン類(モル比0〜70%)、フォスファチジルエタノールアミン類(モル比0〜30%)、フォスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩およびジセチルリン酸類からなる群から選択される1種以上の脂質(モル比0〜30%)、ガングリオシド類、糖脂質類、フォスファチジルグリセロール類およびスフィンゴミエリン類からなる群から選択される1種以上の脂質(モル比0〜40%)、ならびにコレステロール類(モル比0〜70%)を含むものが挙げられる。リポソーム自体は、周知の方法に従い製造することができるが、これには、薄膜法、逆層蒸発法、エタノール注入法、脱水−再水和法等を挙げることができる。
また、超音波照射法、エクストルージョン法、フレンチプレス法、ホモジナイゼーション法等を用いて、リポソームの粒子径を調節することも可能である。本発明で用いられるリポソーム自体の製法について、具体的に述べると、例えば、まず、フォスファチジルコリン類、コレステロール、フォスファチジルエタノールアミン類、フォスファチジン酸類、ガングリオシド類、糖脂質類もしくはフォスファチジルグリセロール類を配合成分とする脂質と界面活性剤コール酸ナトリウムとの混合ミセルを調製する。そして、これにより得られる混合ミセルの限外濾過を行うことによりリポソームを作製することができる。
リポソームを負に荷電させるためには、フォスファチジン酸類もしくはジセチルホスフェート等の長鎖アルキルリン酸塩類を配合するのが好ましい。親水性化反応部位を提供するためには、フォスファチジルエタノールアミン類を配合するのが好ましい。リンカー蛋白質の結合部位を提供するためには、ガングリオシド類または糖脂質類またはフォスファチジルグリセロール類を配合するのが好ましい。
ガングリオシド類、糖脂質類、フォスファチジルグリセロール類、スフィンゴミエリン類およびコレステロール類からなる群から選択される少なくとも1種の脂質はリポソーム中で集合し、リンカー蛋白質を結合させる足場(ラフト)として機能する。本発明のリポソームは、このような蛋白質を結合させうるラフトが形成されることによりさらに安定化される。すなわち、本発明のリポソームは、リンカー蛋白質を結合させるためのガングリオシド、糖脂質、フォスファチジルグリセロール類、スフィンゴミエリン類およびコレステロール類からなる群から選択される少なくとも1種の脂質のラフトが形成されたリポソームを含む。
本発明において使用するリポソームは、通常のものでも使用できるが、その表面は親水性化されていることが望ましい。上述のようにしてリポソームを作製した後にリポソーム表面を親水性化する。リポソーム表面の親水性化は、リポソーム表面に親水性化合物を結合させることにより行う。親水性化に用いる化合物としては、低分子の親水性化合物、好ましくは少なくとも1つのOH基を有する低分子の親水性化合物、さらに好ましくは、少なくとも2つのOH基を有する低分子の親水性化合物が挙げられる。また、さらに少なくとも1つのアミノ基を有する低分子の親水性化合物、すなわち分子中に少なくとも1つのOH基と少なくとも1つのアミノ基を有する親水性化合物が挙げられる。このような親水性化合物は、低分子なので、糖鎖に対する立体障害となりにくく標的細胞膜面上のレクチンによる糖鎖分子認識反応の進行を妨げることはない。また、親水性化合物には、本発明の糖鎖修飾リポソームにおいて、レクチン等の特定の標的を指向するために用いられるレクチンが結合し得る糖鎖は含まれない。このような親水性化合物として、例えば、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンなどを含むトリス(ヒドロキシアルキル)アミノアルカン等のアミノアルコール類等が挙げられ、さらに具体的には、トリス(ヒドロキシメチル)アミノエタン、トリス(ヒドロキシエチル)アミノエタン、トリス(ヒドロキシプロピル)アミノエタン、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、トリス(ヒドロキシエチル)アミノメタン、トリス(ヒドロキシプロピル)アミノメタン、トリス(ヒドロキシメチル)アミノプロパン、トリス(ヒドロキシエチル)アミノプロパン、トリス(ヒドロキシプロピル)アミノプロパン等が挙げられる。さらに、OH基を有する低分子化合物にアミノ基を導入した化合物も本発明の親水性化合物として用いることができる。該化合物は限定されないが、例えば、セロビオース等のレクチンが結合しない糖鎖にアミノ基を導入した化合物が挙げられる。例えば、リポソーム膜の脂質フォスファチジルエタノールアミン上に架橋用の2価試薬とトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンとを用いてリポソーム表面を親水性化する。親水性化合物の一般式は、下記式(1)、式(2)、式(3)等で示される。
X−R1(R2OH)n 式(1)
H2N−R3−(R4OH)n 式(2)
H2N−R5(OH)n 式(3)
ここで、R1、R3およびR5は、C1からC40、好ましくはC1からC20、さらに好ましくはC1からC10の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、R2、R4は存在しないかもしくはC1からC40、好ましくはC1からC20、さらに好ましくはC1からC10の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示す。Xはリポソーム脂質と直接または架橋用の二価試薬と結合する反応性官能基を示し、例えば、COOH、NH、NH2、CHO、SH、NHS−エステル、マレイミド、イミドエステル、活性ハロゲン、EDC、ピリジルジスルフィド、アジドフェニル、ヒドラジド等が挙げられる。nは自然数を示す。
このような親水性化合物で親水性化を行ったリポソームの表面は、薄く親水性化合物で覆われている。但し、その親水性化合物の覆いの厚みは小さいので、リポソームに糖鎖を結合させた場合であっても、糖鎖等の反応性を抑制することはない。
リポソームの親水性化は、従来公知の方法、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、無水マレイン酸共重合体等を共有結合により結合させたリン脂質を用いてリポソームを作成する方法(特開2000−302685号)等の方法を採用することによっても行うことができる。
このうち、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを用いてリポソーム表面を親水性化することが特に好ましい。
本発明のトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを用いる手法は、ポリエチレングリコールなどを用いる従来の親水性化方法と比較していくつかの点で好ましい。例えば、本発明のように糖鎖をリポソーム上に結合してその分子認識機能を標的指向性に利用するものでは、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンが低分子量物質であるので、従来のポリエチレングリコールなどの高分子量物質を用いる方法に比べて、糖鎖に対する立体障害となりにくく標的細胞膜面上のレクチン(糖鎖認識蛋白質)による糖鎖分子認識反応の進行を妨げないので特に好ましい。すなわち、本明細書において、親水性化に用いられる低分子量物質または低分子化合物とは、リポソーム表面に結合させた場合に、ポリエチレングリコールなどの高分子量物質に比べて糖鎖に対する立体障害となりにくく、標的細胞膜面上のレクチン(糖鎖認識蛋白質)による糖鎖分子認識反応の進行を妨げない物質を意味する。
また、本発明によるリポソームは該親水化処理後においても粒径分布や成分組成、分散特性が良好であり、長時間の保存性や生体内安定性も優れているのでリポソーム製剤化して利用するために好ましい。
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを用いてリポソーム表面を親水性化するには、例えばジミリストイルフォスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルフォスファチジルエタノールアミン等の脂質を用いて、常法により得たリポソーム溶液にビススルフォスクシニミヂルスベラート、ジスクシニミヂルグルタレート、ジチオビススクシニミヂルプロピオネート、ジスクシニミヂルスベラート、3,3’−ジチオビススルフォスクシニミヂルプロピオネート、エチレングリコールビススクシニミヂルスクシネート、エチレングリコールビススルフォスクシニミヂルスクシネート等の2価試薬を加えて反応させることにより、リポソーム膜上のジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン等の脂質に2価試薬を結合させ、次いでトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを、該2価試薬の一方の結合手と反応させることにより、リポソーム表面にトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを結合せしめる。
このように、リポソームを親水性化処理したリポソームは、生体内で極めて安定であり、後述のように標的指向性を有する糖鎖を結合しなくても、生体内での半減期が長いためドラッグデリバリーシステムにおけるドラッグ担体として好適に用いることができる。本発明は、表面を低分子化合物で親水性化したリポソームをも包含する。
本発明は、上記の親水性化化合物を用いて親水性化した糖鎖の結合していないリポソームそのものをも包含する。このような親水性化したリポソームは、リポソーム自体の安定性が高まり、また糖鎖を結合したときに糖鎖の認識性が高まるという利点がある。
本発明で用いられるリポソームは、例えば、リポソームの構成脂質が、フォスファチジルコリン類(モル比0〜70%)、フォスファチジルエタノールアミン類(モル比0〜30%)、フォスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩およびジセチルリン酸類からなる群から選択される1種以上の脂質(モル比0〜30%)、ガングリオシド類、糖脂質類、フォスファチジルグリセロール類およびスフィンゴミエリン類からなる群から選択される1種以上の脂質(モル比0〜40%)、ならびにコレステロール類(モル比0〜70%)を含む、リポソームである。
本発明は、さらにリポソームに上記に親水性化化合物を結合させて、リポソームを親水性化する方法をも包含する。また、糖鎖の結合していない親水性化したリポソームをも包含する(「糖鎖の結合していない親水性化したリポソーム」を「本発明のリポソーム」と略記することがある。また、「糖鎖の結合していない親水性化したリポソーム」と「本発明の糖鎖結合リポソーム」とをまとめて、「本発明のリポソーム」と略記することもある)。糖鎖の結合していないリポソームに糖鎖を結合することにより、本発明の標的指向性リポソームまたは腸管吸収性リポソームを製造することができる。
本発明のリポソームは、非常に安定であり、リポソームを形成した後に蛋白質を結合させたり、リンカー蛋白質を結合させたり、糖鎖を結合させるという後処理が可能である。従って、リポソームを大量に製造した後に、目的に応じてそれぞれ異なる蛋白質を結合させたり、リンカー蛋白質や糖鎖を結合させることにより、目的に応じた種々のリポソームを製造することが可能である。
本発明のリポソームには、糖鎖がリンカー蛋白質を介して、あるいはリポソームを構成する脂質に直接結合している。本発明のリポソームは、好ましくは、糖脂質や糖タンパク質等の複合糖質型リガンドを有し、低分子化合物で親水化処理されているリポソームである。
本発明のリポソーム、糖鎖等結合リポソームの粒径は、30〜500nm、好ましくは50〜350nmである。また、本発明のリポソームは、負に荷電していることが望ましい。負に荷電していることにより、生体中の負に荷電している細胞との相互作用を防ぐことができる。本発明のリポソーム表面のゼータ電位は、生理食塩水中において、37℃で、−50〜10mV、好ましくは−40〜0mV、さらに好ましくは−30〜−10mVである。上述のように、フォスファチジン酸類もしくはジセチルホスフェート等の長鎖アルキルリン酸塩類を配合することにより、リポソームを負に荷電させることができる。
粒径、ゼータ電位は、ゼータ電位・粒子径・分子量測定装置(Model Nano ZS,Malvern Instruments Ltd.,UK)を用いて測定することができる。
(リポソームへの糖鎖の結合)
本発明においては、上記のようにして作製したリポソームに、上記の糖鎖のいずれかを直接結合させてもよいし、さらに、糖鎖をリンカー蛋白質を介して結合させてもよい。この際、リポソームに結合させる糖鎖の種類は1種類に限らず、複数の糖鎖を結合させてもよい。この場合の複数の糖鎖は同じ組織または器官の細胞表面に共通して存在する異なるレクチンに対して結合活性を有する複数の糖鎖であってもよいし、異なる組織または器官の細胞表面に存在する異なるレクチンに対して結合活性を有する糖鎖であってもよい。前者のような複数の糖鎖を選択することにより、特定の標的組織または器官を確実に指向することができ、後者のような複数の糖鎖を選択することにより、1種類のリポソームに複数の標的を指向させることができ、マルチパーパスな標的指向性リポソームを得ることができる。
なお、糖鎖をリポソームに結合させるには、リポソームの製造時にリンカー蛋白質および/または糖鎖を混合し、リポソームを製造させつつ糖鎖をその表面に結合させることも可能であるが、あらかじめリポソーム、リンカー蛋白質および糖鎖を別途準備し、製造が完了したリポソームにリンカー蛋白質および/または糖鎖を結合させたほうが望ましい。これは、リポソームにリンカー蛋白質および/または糖鎖を結合させることにより、結合させる糖鎖の密度を制御できるからである。
糖鎖のリポソームへの直接結合は、以下に述べるような方法で行うことができる。
糖鎖を糖脂質として混合してリポソームを製造するか、製造後のリポソームのリン脂質に糖鎖を結合するとともに糖鎖密度を制御する。
リンカー蛋白質を用いて糖鎖を結合させる場合、リンカー蛋白質としては、生体由来の蛋白質、特にヒト由来蛋白質を用いるのが好ましい。生体由来の蛋白質は限定されないが、アルブミン等の血液中に存在する蛋白質、その他生体に存在する生理活性物質等が挙げられる。例えば、ヒト血清アルブミン(HSA)、ウシ血清アルブミン(BSA)等の動物の血清アルブミンが挙げられるが、特にヒト血清アルブミンを使用する場合は、各組織に対する取り込みが多いことがマウスについての実験により確かめられている。なお、リンカー蛋白質として、抗癌活性を有する蛋白質を用いてもよい。この場合、蛋白質がリポソームと糖鎖を結合させるためのリンカー蛋白質および抗癌活性を有する蛋白質を兼ねることもある。抗癌活性を有する蛋白質としては、抗癌活性を有する抗体等が挙げられる。
リンカー蛋白質は、好ましくは、リポソーム表面上に形成されている、ガングリオシド類、糖脂質類、フォスファチジルグリセロール類、スフィンゴミエリン類およびコレステロール類からなる群から選択される少なくとも1種の脂質からなる足場(ラフト)上に結合される。
糖鎖をリンカー蛋白質を介してリポソームへ結合させるには以下に述べる方法で行えばよい。
まずリポソーム表面に蛋白質を結合させる。リポソームを、NaIO4、Pb(O2CCH3)4、NaBiO3等の酸化剤で処理して、リポソーム膜面に存在するガングリオシドを酸化し、次いで、NaBH3CN、NaBH4等の試薬を用いて、リンカー蛋白質とリポソーム膜面上のガングリオシドを、還元的アミノ化反応により結合させる。このリンカー蛋白質も、親水性化するのが好ましく、これにはリンカー蛋白質にヒドロキシ基を有する化合物を結合させるが、例えば、ビススルフォスクシニミヂルスベラート、ジスクシニミヂルグルタレート、ジチオビススクシニミヂルプロピオネート、ジスクシニミヂルスベラート、3,3’−ジチオビススルフォスクシニミヂルプロピオネート、エチレングリコールビススクシニミヂルスクシネート、エチレングリコールビススルフォスクシニミヂルスクシネート等の2価試薬を用いて、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン等の上述の親水性化に用いる化合物をリポソーム上のリンカー蛋白質と結合させればよい。
これを具体的に述べると、まず、リンカー蛋白質の全てのアミノ基に架橋用2価試薬の一端を結合する。そして、各種糖鎖の還元末端をグリコシルアミノ化反応して得られる糖鎖グリコシルアミン化合物を調製し、この糖鎖のアミノ基とリポソーム上の上記で結合された架橋2価試薬の一部分の他の未反応末端とを結合する。
糖鎖および/または親水性化合物とリポソームとの共有結合、または糖鎖および/または親水性化合物とリンカー蛋白質との共有結合は、リポソームが細胞内に取り込まれたときに切断することも可能である。例えば、リンカー蛋白質と糖鎖がジスルフィド結合を介して共有結合されている場合、細胞内で還元されて糖鎖が切断される。糖鎖が切断されることによりリポソーム表面が疎水性になり、生体膜と結合し膜安定性が乱れリポソーム中に含まれる薬剤が放出される。
次に、このようにして得られる糖鎖結合リポソーム膜面上蛋白質の表面に糖鎖が結合していない未反応で残っている大部分の2価試薬未反応末端を用いて親水性化処理を行う。つまり、このリポソーム上蛋白質に結合している2価試薬の未反応末端とトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン等の上述の親水性化に用いる化合物との結合反応を行い、リポソーム表面全体を親水性化する。
リポソーム表面およびリンカー蛋白質の親水性化は、各種組織への移行性、および血中における滞留性および各種組織への移行性を向上させる。これは、リポソーム表面およびリンカー蛋白質表面が親水性化されることによって、糖鎖以外の部分が、各組織等においてはあたかも生体内水分であるかのようにみえ、これにより、標的以外の組織等に認識されず、糖鎖のみがその標的組織のレクチン(糖鎖認識蛋白質)により認識されることに起因するものと思われる。
次いで、糖鎖をリポソーム上のリンカー蛋白質に結合させる。これには、糖鎖を構成する糖類の還元末端を、NH4HCO3、NH2COONH4等のアンモニウム塩を用いてグリコシルアミノ化し、次いで、ビススルフォスクシニミヂルスベラート、ジスクシニミヂルグルタレート、ジチオビススクシニミヂルプロピオネート、ジスクシニミヂルスベラート、3,3’−ジチオビススルフォスクシニミヂルプロピオネート、エチレングリコールビススクシニミヂルスクシネート、エチレングリコールビススルフォスクシニミヂルスクシネート等の2価試薬を用いて、リポソーム膜面上に結合したリンカー蛋白質と、上記グリコシルアミノ化された糖類とを結合させ、図1〜12、23〜26および33〜38に示されるようなリポソームを得る。なお、これらの糖鎖は市販されている。
さらに、糖鎖を結合させた場合の糖鎖の結合密度は、リポソームに結合させるリンカー蛋白質1分子当り1〜60個、好ましくは1〜40個、さらに好ましくは1〜20個である。また、リポソーム1粒子当りは、リンカー蛋白質を用いる場合は、1〜30000個、好ましくは1〜20000個、さらに好ましくは1〜10000個、あるいは100〜30000個、好ましくは100〜20000個、さらに好ましくは100〜10000個、あるいは500〜30000個、好ましくは500〜20000個、さらに好ましくは500〜10000個である。リンカー蛋白質を用いない場合は、リポソーム1粒子当り最高1〜500000個、好ましくは1〜300000個、さらに好ましくは1〜100000個以上の糖鎖を結合させることができる。
本発明においては、使用する糖鎖の構造と糖鎖結合量を種々選択することにより、各標的細胞、組織に対する指向性を制御することができる。
また、糖鎖の種類と糖鎖結合量によっては腸管での吸収制御性を高めることもできる。腸管吸収制御性を高める糖鎖と特定の組織または器官への指向性を有する糖鎖の両方をリポソームに結合させることにより、特定組織または器官への指向性と腸管吸収制御性の両方の特性を併せ持ったリポソームを作製することができる。
上述のように、本発明の標的指向性リポソームは糖鎖の種類と糖鎖結合量により特異的に結合するレクチンが決まり、特定の組織または器官に特異的に到達する。また、糖鎖構造と糖鎖結合量を選択することにより癌組織等の疾患部位に到達させることも可能である。
本発明においては、使用する糖鎖の構造と糖鎖結合量を種々選択することにより、各標的細胞、組織に対する指向性を制御することができる。本発明の糖鎖修飾リポソームは、糖鎖により、血中、肝臓、脾臓、肺、脳、小腸、心臓、胸腺、腎臓、膵臓、筋肉、大腸、骨、骨髄、眼、卵巣、胎盤、前立腺、下垂体、乳腺、血管、皮膚、胆のう、胆管、膀胱、脂肪組織、癌組織、炎症組織およびリンパ節等の組織または器官を指向する。例えば、図13、16、17、18、21および22が示すように、アルファ1,2マンノビオース二糖鎖、アルファ1,3マンノビオース二糖鎖、アルファ1,4マンノビオース二糖鎖、アルファ1,6マンノビオース二糖鎖、アルファ1,3アルファ1,6マンノトリオース三糖鎖、オリゴマンノース3五糖鎖、オリゴマンノース4b六糖鎖、オリゴマンノース5七糖鎖、オリゴマンノース6八糖鎖、オリゴマンノース7九糖鎖、オリゴマンノース8十糖鎖およびオリゴマンノース9十一糖鎖を結合したリポソームはすべて血中、肺、脳、癌組織、心臓および小腸への指向性が高い。また、図14が示すように、アルファ1,2マンノビオース二糖鎖、オリゴマンノース3五糖鎖、オリゴマンノース4b六糖鎖を結合したリポソームは肝臓への指向性が高い。また、図15が示すようにアルファ1,2マンノビオース二糖鎖、アルファ1,3マンノビオース二糖鎖、アルファ1,3アルファ1,6マンノトリオース三糖鎖を結合したリポソームは脾臓への指向性が高い。また、図19が示すようにアルファ1,2マンノビオース二糖鎖、アルファ1,4マンノビオース二糖鎖、アルファ1,6マンノビオース二糖鎖を結合したリポソームはリンパ節への指向性が高い。さらに、オリゴマンノース6八糖鎖を結合したリポソームは胸腺への指向性が高い。
また、本発明の図23〜26に示されるリポソームは、全般的に腸管吸収性は極めて高いものの、さらに、リポソーム上の糖鎖の密度の調節を行うことにより、腸管吸収性を制御し、より効率的に標的部位へ薬剤を移行させることが可能となり、副作用の軽減化を図ることができる。例えば、図27〜30においては、上記4種の糖鎖修飾リポソームにおける糖鎖結合量を3段階に変更した場合における、腸管から血中への移行性(すなわち腸管吸収性)を示す。
なお、この糖鎖結合量の変更は、リンカー蛋白質結合リポソームに対して糖鎖を3段階の濃度(1)50μg、2)200μg、3)1mg)で結合せしめることにより行ったものである。これによれば、6’−シアリルラクトース三糖鎖、6’−シアリルラクトサミン糖鎖の場合、糖鎖密度を高くするにつれ、腸管吸収性が順次低下するが、3’−シアリルラクトース三糖鎖、3’−シアリルラクトサミン糖鎖の場合は腸管吸収性が逆に上昇する。これらのことは、腸管吸収性は、リポソーム上の糖鎖の結合量により、糖鎖の種類毎に異なることを示す。したがって、糖鎖の種類毎にリポソーム上の糖鎖結合量を適宜設定することにより、腸管吸収性を制御することが可能となる.
(薬剤を含有するリポソーム、リポソーム製剤など)
本発明のリポソームには、アロマターゼ阻害薬、抗アンドロゲン薬、リアーゼ阻害薬、GnRH作動薬、GnRH拮抗薬、血管新生阻害薬、チロシンキナーゼ阻害剤、セリン・スレオニンキナーゼ阻害剤、抗癌活性を有する抗体、アンサマイトシン、カペシタビン、セルモロイキン、ドセタキセル水和物、塩酸ゲムシタビン、オキサリプラチン、プレドニゾロン、テガフール・ウラシル配合剤、ジノスタチンスチラマー、三酸化砒素などの抗癌活性を有する薬剤が含有されており、特定の組織または器官にリポソームが到達し、その組織または器官の細胞にリポソームが取り込まれ、前記抗癌活性を有する薬剤を放出し、抗癌作用を奏し、癌(例、脳腫瘍、下垂体腺腫、神経膠腫、聴神経鞘腫、網膜肉腫、甲状腺癌、咽頭癌、喉頭癌、舌癌、胸腺腫、中皮腫、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、胃癌、食道癌、十二指腸癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、肝細胞癌、膵癌、膵内分泌腫瘍、胆管癌、胆嚢癌、陰茎癌、腎臓癌、腎盂癌、尿管癌、腎細胞癌、精巣腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、外陰癌、子宮癌、子宮頚部癌、子宮体部癌、子宮肉腫、絨毛性疾患、膣癌、卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、皮膚癌、悪性黒色腫、菌状息肉症、基底細胞腫、軟部肉腫、悪性リンパ腫、ホジキン病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、成人T細胞白血病、慢性骨髄増殖性疾患、膵内分泌腫瘍、線維性組織球腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、原発不明癌など)の予防・治療作用を有する。糖鎖結合リポソームの場合は、糖鎖の有する標的指向性により特定の組織または器官にリポソームが到達する。また、糖鎖が結合していない場合であっても、本発明のリポソームは、体内で非常に安定なため、前記抗癌活性を有する薬剤の体内での半減期が長くなるので、特定の組織または器官に効果的に到達し得る。なお、前記抗癌活性を有する抗体は、直接または間接の抗癌活性を有していればよい。
本発明の糖鎖修飾リポソームに上記薬剤を含有させて投与した場合、薬剤を単独で投与した場合に比較し、薬剤が癌組織等の標的部位に集積する。単独投与の場合に比べ、2倍以上、好ましくは5倍以上、さらに好ましくは10倍以上、特に好ましくは50倍以上集積し得る。
なお、抗癌活性を有する薬剤は、リポソームの中に封入させてもよいし、リポソーム表面に結合させてもよい。リポソーム表面に結合させる場合には、例えば、抗体などの蛋白質は上記のリンカー蛋白質の結合方法と同じ方法で表面に結合させることが可能であり、他の化合物もその化合物が有する官能基を利用することにより、公知の方法で、結合させることができる。リポソーム内部への封入は、以下の方法により行う。リポソームへ薬剤等を封入するには、周知の方法を用いればよく、例えば、薬剤等の含有溶液とフォスファチジルコリン類、フォスファチジルエタノールアミン類、フォスファチジン酸類もしくは長鎖アルキルリン酸塩類、ガングリオシド類、糖脂質類もしくはフォスファチジルグリセロール類およびコレステロール類を含む脂質を用いてリポソームを形成することにより、薬剤等はリポソーム内に封入される。
したがって、本発明で用いられるリポソームに抗癌活性を有する薬剤を含有させることによって得られるリポソーム製剤は、癌組織などの各種組織への移行性が選択的に制御されたものであり、治療薬剤の標的細胞、組織への集中による効力の増強あるいは他の細胞、組織に対する薬剤の取り込みの減少による副作用の軽減化等を図ることができるものである。
本発明のリポソームまたは糖鎖修飾リポソームは、医薬組成物として、種々の形態で投与することができる。このような投与形態としては、点眼剤等による点眼投与、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与、あるいは注射剤、点滴剤、座薬などによる非経口投与を挙げることができる。かかる組成物は、公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤、賦形剤を含む。たとえば、錠剤用の担体、賦形剤としては、ゲル化剤、乳糖、ステアリン酸マグネシウムなどが使用される。注射剤は、本発明の糖鎖結合リポソームを通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが使用され、適当な溶解補助剤、たとえばアルコール、プロピレングリコールなどのポリアルコール、非イオン界面活性剤などと併用しても良い。油性液としては、ゴマ油、大豆油などが使用され、溶解補助剤としては安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用しても良い。
本発明の医薬組成物の哺乳動物に対する投与経路は、限定されず、点眼、経口投与、静脈注射、筋肉注射等がある。投与量は、疾患の重篤度等により適宜決定できるが、本発明の組成物の医薬的に有効量を患者に投与する。ここで、「医薬的に有効量を投与する」とは、各種疾患を治療するのに適切なレベルの薬剤を患者に投与することをいう。本発明の医薬組成物の投与回数は適宜患者の症状に応じて選択される。
表面に糖鎖を有するリポソームは、非経口投与(静注投与)および経口投与に適し、投与量は、標的指向性を有さない従来のリポソーム製剤に対して、数分の1から数千分の1でよい。例えば、体重1kg当り、リポソームに含ませる薬剤の量で0.0001〜1000mg、好ましくは、0.0001〜10mg、さらに好ましくは、0.0001〜0.1mgなどが用いられる。また、本発明のリポソームは、標的指向性を有する糖鎖を含まず親水性化合物を結合させたリポソームも含むが、該リポソームの場合も親水性処理により生体内での安定性が高く、半減期も長いので、低用量で充分な効果を有する。
図2は、アルファ1,3マンノビオース二糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図3は、アルファ1,4マンノビオース二糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図4は、アルファ1,6マンノビオース二糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図5は、アルファ1,3アルファ1,6マンノトリオース三糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図6は、オリゴマンノース3五糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図7は、オリゴマンノース4b六糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図8は、オリゴマンノース5七糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図9は、オリゴマンノース6八糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図10は、オリゴマンノース7九糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図11は、オリゴマンノース8十糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図12は、オリゴマンノース9十一糖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図13は、13種のリポソーム複合体の静脈内投与60分後の血中への分布量を示す図である。
図14は、13種のリポソーム複合体の静脈内投与60分後の肝臓への分布量を示す図である。
図15は、13種のリポソーム複合体の静脈内投与60分後の脾臓への分布量を示す図である。
図16は、13種のリポソーム複合体の静脈内投与60分後の肺への分布量を示す図である。
図17は、13種のリポソーム複合体の静脈内投与60分後の脳への分布量を示す図である。
図18は、13種のリポソーム複合体の静脈内投与60分後の癌組織への分布量を示す図である。
図19は、13種のリポソーム複合体の静脈内投与60分後のリンパ節への分布量を示す図である。
図20は、13種のリポソーム複合体の静脈内投与60分後の胸腺への分布量を示す図である。
図21は、13種のリポソーム複合体の静脈内投与60分後の心臓への分布量を示す図である。
図22は、13種のリポソーム複合体の静脈内投与60分後の小腸への分布量を示す図である。
図23は、3’−シアリルラクトース三糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図24は、6’−シアリルラクトース三糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図25は、3’’−シアリルラクトサミン三糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図26は、6’−シアリルラクトサミン三糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図27は、4種のリポソーム複合体の腸管内投与10分後の血中への移行量を示す図である。
図28は、4種のリポソーム複合体の腸管内投与10分後の血中への移行量を示す図である。
図29は、4種のリポソーム複合体の腸管内投与10分後の血中への移行量を示す図である。
図30は、4種のリポソーム複合体の腸管内投与10分後の血中への移行量を示す図である。
図31は、4種のリポソーム複合体の腸管内投与10分後の血中への移行量を示す図である。
図32は、比較試料としてのtris(hydroxymethyl)aminomethaneを結合したリポソームの模式図である。
図33は、ルイスX型三糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図34は、シアリルルイスX型四糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図35は、ラクトース二糖鎖により修飾されたリポソームの構造例を示す模式図である。
図36は、2’−フコシルラクトース三糖鎖により修飾されたリポソームの構造例を示す模式図である。
図37は、ジフコシルラクトース四糖鎖により修飾されたリポソームの構造例を示す模式図である。
図38は、3−フコシルラクトース三糖鎖により修飾されたリポソームの構造例を示す模式図である。
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明は、アロマターゼ阻害薬、抗アンドロゲン薬、リアーゼ阻害薬、GnRH作動薬、GnRH拮抗薬、血管新生阻害薬、チロシンキナーゼ阻害剤、セリン・スレオニンキナーゼ阻害剤、抗癌活性を有する抗体、アンサマイトシン、カペシタビン、セルモロイキン、ドセタキセル水和物、塩酸ゲムシタビン、オキサリプラチン、プレドニゾロン、テガフール・ウラシル配合剤、ジノスタチンスチラマー、三酸化砒素などの抗癌活性を有する薬剤を含有してなる、糖鎖がリポソーム膜に結合している糖鎖修飾リポソーム(「本発明の糖鎖修飾リポソーム」と略記することがある)に関する。ここで、癌は、腫瘍や白血病等のあらゆる新生物による疾患を含む。
上記「アロマターゼ阻害薬」としては、例えばアナストロゾール(anastrozole)、レトロゾール((letrozole)、ファドロゾール(fadrozole)、エクセメスタン(exemestane)などが挙げられる。
上記「抗アンドロゲン薬」としては、例えばビカルタミド(bicaltamide)、フルタミド(flutamide)などが挙げられる。
上記「リアーゼ阻害薬」としては、例えばケトコナゾール(ketoconazole)などが挙げられる。
上記「GnRH作動薬」としては、例えば?
酢酸ゴセレリン(goserelin acetate)、酢酸リュープロレリン(leuprorelin acetate)などが挙げられる。
上記「GnRH拮抗薬」としては、例えばセトロレリクス(cetrorelix)、ガニレリックス(ganirelix)、アバレリックス(abarelix)、オザレリックス(ozarelix)などが挙げられる。
上記「血管新生阻害薬」としては、例えばフマギリン(fumagillin)などが挙げられる。
上記「チロシンキナーゼ阻害剤」としては、例えばゲフィチニブ(gefitinib)エルロチニブ(erulotinib)、メシル酸イマチニブ((imatinib mesilate)、ラパチニブ(lapatinib)、スニチニブ(sunitinib)、ダサチニブ(dasatinib)などが挙げられる。
上記「セリン・スレオニンキナーゼ阻害剤」としては、例えばソラフェニブ(sorafenib)などが挙げられる。
上記「抗癌活性を有する抗体」としては、例えばリツキシマブ(rituximab)、ベバシズマブ(bevacizumab)、セツキシマブ(cetuximab)、トラスツズマブ(trastuzumab)、パーツズマブ(pertuzumab)などが挙げられる。
本発明の糖鎖修飾リポソームは、表面に種々の糖鎖を有する標的指向性リポソームおよび腸管吸収制御性リポソームを含む。本発明において、標的指向性とは生体内に投与したときに特定の組織や器官または癌等の疾患部位等の標的部位に特異的に到達し取り込まれ得る性質をいう。また、腸管吸収制御性とは、腸管経由で生体内に取り込まれる性質、すなわち腸管吸収性を有し、さらに取り込まれる速度、程度等を制御し得る性質をいう。
リポソームとは、通常、膜状に集合した脂質層および内部の水層から構成される閉鎖小胞を意味する。本発明の糖鎖修飾リポソームは、図1〜12、23〜26および32〜38に示されるように、その表面、すなわち脂質層、に糖鎖が結合している。糖鎖は直接リポソームの脂質層に結合していてもよいし、リンカー蛋白質を介して結合していてもよい。糖鎖は、その種類と密度が制御されて結合している。
糖鎖は、本発明の腸管吸収制御性リポソームおよび本発明の標的指向性リポソームの標的組織や器官または癌などに応じて種々のものを用いることができる。
病変部の血管内皮細胞に発現するE−セレクチン、P−セレクチンと白血球の細胞膜上に発現している糖鎖であるシアリルルイスXが強く結合することが知られている。本リポソ−ムはこのシアリルルイスX糖鎖またはこれと同様にE−セレクチン、P−セレクチン等のレクチン様の糖鎖結合部位を有する蛋白質に反応することができる糖鎖が糖鎖の種類と密度が制御されて結合しているリポソームであり、血管内皮細胞がE−セレクチン、P−セレクチン等を発現している癌等の病巣部位に特異的に集積すると考えられる。またE−セレクチン、P−セレクチン等を発現している部位は炎症や血管新生が生じている部位であり、そのような部位の血管は内皮細胞の細胞間隙が拡大しており、集積したリポソームがその隙間から病巣部位およびその周囲に拡散するものと考えられる。拡散したリポソームは病巣部位およびその周囲の各種細胞に取り込まれ(endocytosis)、細胞内で内包している薬剤を放出する。このようなメカニズムで癌などに効果を発揮する。
以下、本発明で用いられる糖鎖、リポソームなど各要素について、より具体的に説明する。
(糖鎖)
本発明のリポソームに結合させる糖鎖として、上述のようにE−セレクチン、P−セレクチン等のレクチン様の糖鎖結合部位を有する蛋白質に反応することができる糖鎖が挙げられる。ここで、E−セレクチン、P−セレクチン等とは、セレクチン(例、E−セレクチン、P−セレクチン、L−セレクチン)、DC−SIGN、DC−SGNR、コレクチン、マンノース結合蛋白質等のC−タイプレクチン、シグレック等のIタイプレクチン、マンノース−6−リン酸受容体などのPタイプレクチン、Rタイプレクチン、Lタイプレクチン、Mタイプレクチン、ガレクチンなどの各種のレクチン(糖鎖認識蛋白質)をいう。本発明のリポソームが標的とする細胞は、細胞により発現するレクチン様の糖鎖結合部位を有する蛋白質の種類が異なるので、該蛋白質の種類に応じて糖鎖を選択することにより特定の細胞に特異的に指向性を有するリポソームを得ることができる。
例えば、腸管吸収制御性リポソームに用いられる糖鎖として、3’−シアリルラクトース三糖鎖(図23に構造式を示す。以下、同様)、6’−シアリルラクトース三糖鎖(図24)、3’−シアリルラクトサミン糖鎖(図25)および6’−シアリルラクトサミン糖鎖(図26)が挙げられる。標的指向性リポソームに用いられる糖鎖として、アルファ1,2マンノビオース二糖鎖(図1)、アルファ1,3マンノビオース二糖鎖(図2)、アルファ1,4マンノビオース二糖鎖(図3)、アルファ1,6マンノビオース二糖鎖(図4)、アルファ1,3アルファ1,6マンノトリオース三糖鎖(図5)、オリゴマンノース3五糖鎖(図6)、オリゴマンノース4b六糖鎖(図7)、オリゴマンノース5七糖鎖(図8)、オリゴマンノース6八糖鎖(図9)、オリゴマンノース7九糖鎖(図10)、オリゴマンノース8十糖鎖(図11)、オリゴマンノース9十一糖鎖(図12)、ルイスX型三糖鎖(図33)、シアリルルイスX型四糖鎖(図34)、ラクトース二糖鎖(図35)、2’−フコシルラクトース三糖鎖(図36)、ジフコシルラクトース四糖鎖(図37)、3−フコシルラクトース三糖鎖(図38)が挙げられる。
(リポソーム)
本発明に用いられるリポソームについては、膜安定性をよくすること、封入される薬物などのもれをなくすこと、膜面の親水性化処理をできるようにすること、蛋白質を各種密度で結合できるようにすること、糖鎖を各種密度で結合できるようにすること、などを可能にするために、鋭意努力をして、以下のような各種の脂質と糖脂質などを構成成分とするリポソームを作製した。本発明のリポソームを構成する脂質としては、例えば、フォスファチジルコリン類、フォスファチジルエタノールアミン類、フォスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩類、ジセチルリン酸類、ガングリオシド類、糖脂質類、フォスファチジルグリセロール類、スフィンゴミエリン類、コレステロール類等が挙げられ、フォスファチジルコリン類としては、ジミリストイルフォスファチジルコリン、ジパルミトイルフォスファチジルコリン、ジステアロイルフォスファチジルコリン等が、また、フォスファチジルエタノールアミン類としては、ジミリストイルフォスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルフォスファチジルエタノールアミン等が、フォスファチジン酸類もしくは長鎖アルキルリン酸塩類としては、ジミリストイルフォスファチジン酸、ジパルミトイルフォスファチジン酸、ジステアロイルフォスファチジン酸、ジセチルリン酸等が、ガングリオシド類としては、ガングリオシドGM1、ガングリオシドGD1a、ガングリオシドGT1b等が、糖脂質類としては、ガラクトシルセラミド、グルコシルセラミド、ラクトシルセラミド、フォスファチド、グロボシド等が、フォスファチジルグリセロール類としては、ジミリストイルフォスファチジルグリセロール、ジパルミトイルフォスファチジルグリセロール、ジステアロイルフォスファチジルグリセロール等が好ましい。このうち、フォスファチジン酸類もしくは長鎖アルキルリン酸塩類、ガングリオシド類もしくは糖脂質類、コレステロール類はリポソームの安定性を上昇させる効果を有するので、構成脂質として添加するのが望ましい。
例えば、本発明のリポソームを構成する脂質として、フォスファチジルコリン類(モル比0〜70%)、フォスファチジルエタノールアミン類(モル比0〜30%)、フォスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩およびジセチルリン酸類からなる群から選択される1種以上の脂質(モル比0〜30%)、ガングリオシド類、糖脂質類、フォスファチジルグリセロール類およびスフィンゴミエリン類からなる群から選択される1種以上の脂質(モル比0〜40%)、ならびにコレステロール類(モル比0〜70%)を含むものが挙げられる。リポソーム自体は、周知の方法に従い製造することができるが、これには、薄膜法、逆層蒸発法、エタノール注入法、脱水−再水和法等を挙げることができる。
また、超音波照射法、エクストルージョン法、フレンチプレス法、ホモジナイゼーション法等を用いて、リポソームの粒子径を調節することも可能である。本発明で用いられるリポソーム自体の製法について、具体的に述べると、例えば、まず、フォスファチジルコリン類、コレステロール、フォスファチジルエタノールアミン類、フォスファチジン酸類、ガングリオシド類、糖脂質類もしくはフォスファチジルグリセロール類を配合成分とする脂質と界面活性剤コール酸ナトリウムとの混合ミセルを調製する。そして、これにより得られる混合ミセルの限外濾過を行うことによりリポソームを作製することができる。
リポソームを負に荷電させるためには、フォスファチジン酸類もしくはジセチルホスフェート等の長鎖アルキルリン酸塩類を配合するのが好ましい。親水性化反応部位を提供するためには、フォスファチジルエタノールアミン類を配合するのが好ましい。リンカー蛋白質の結合部位を提供するためには、ガングリオシド類または糖脂質類またはフォスファチジルグリセロール類を配合するのが好ましい。
ガングリオシド類、糖脂質類、フォスファチジルグリセロール類、スフィンゴミエリン類およびコレステロール類からなる群から選択される少なくとも1種の脂質はリポソーム中で集合し、リンカー蛋白質を結合させる足場(ラフト)として機能する。本発明のリポソームは、このような蛋白質を結合させうるラフトが形成されることによりさらに安定化される。すなわち、本発明のリポソームは、リンカー蛋白質を結合させるためのガングリオシド、糖脂質、フォスファチジルグリセロール類、スフィンゴミエリン類およびコレステロール類からなる群から選択される少なくとも1種の脂質のラフトが形成されたリポソームを含む。
本発明において使用するリポソームは、通常のものでも使用できるが、その表面は親水性化されていることが望ましい。上述のようにしてリポソームを作製した後にリポソーム表面を親水性化する。リポソーム表面の親水性化は、リポソーム表面に親水性化合物を結合させることにより行う。親水性化に用いる化合物としては、低分子の親水性化合物、好ましくは少なくとも1つのOH基を有する低分子の親水性化合物、さらに好ましくは、少なくとも2つのOH基を有する低分子の親水性化合物が挙げられる。また、さらに少なくとも1つのアミノ基を有する低分子の親水性化合物、すなわち分子中に少なくとも1つのOH基と少なくとも1つのアミノ基を有する親水性化合物が挙げられる。このような親水性化合物は、低分子なので、糖鎖に対する立体障害となりにくく標的細胞膜面上のレクチンによる糖鎖分子認識反応の進行を妨げることはない。また、親水性化合物には、本発明の糖鎖修飾リポソームにおいて、レクチン等の特定の標的を指向するために用いられるレクチンが結合し得る糖鎖は含まれない。このような親水性化合物として、例えば、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンなどを含むトリス(ヒドロキシアルキル)アミノアルカン等のアミノアルコール類等が挙げられ、さらに具体的には、トリス(ヒドロキシメチル)アミノエタン、トリス(ヒドロキシエチル)アミノエタン、トリス(ヒドロキシプロピル)アミノエタン、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、トリス(ヒドロキシエチル)アミノメタン、トリス(ヒドロキシプロピル)アミノメタン、トリス(ヒドロキシメチル)アミノプロパン、トリス(ヒドロキシエチル)アミノプロパン、トリス(ヒドロキシプロピル)アミノプロパン等が挙げられる。さらに、OH基を有する低分子化合物にアミノ基を導入した化合物も本発明の親水性化合物として用いることができる。該化合物は限定されないが、例えば、セロビオース等のレクチンが結合しない糖鎖にアミノ基を導入した化合物が挙げられる。例えば、リポソーム膜の脂質フォスファチジルエタノールアミン上に架橋用の2価試薬とトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンとを用いてリポソーム表面を親水性化する。親水性化合物の一般式は、下記式(1)、式(2)、式(3)等で示される。
X−R1(R2OH)n 式(1)
H2N−R3−(R4OH)n 式(2)
H2N−R5(OH)n 式(3)
ここで、R1、R3およびR5は、C1からC40、好ましくはC1からC20、さらに好ましくはC1からC10の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、R2、R4は存在しないかもしくはC1からC40、好ましくはC1からC20、さらに好ましくはC1からC10の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示す。Xはリポソーム脂質と直接または架橋用の二価試薬と結合する反応性官能基を示し、例えば、COOH、NH、NH2、CHO、SH、NHS−エステル、マレイミド、イミドエステル、活性ハロゲン、EDC、ピリジルジスルフィド、アジドフェニル、ヒドラジド等が挙げられる。nは自然数を示す。
このような親水性化合物で親水性化を行ったリポソームの表面は、薄く親水性化合物で覆われている。但し、その親水性化合物の覆いの厚みは小さいので、リポソームに糖鎖を結合させた場合であっても、糖鎖等の反応性を抑制することはない。
リポソームの親水性化は、従来公知の方法、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、無水マレイン酸共重合体等を共有結合により結合させたリン脂質を用いてリポソームを作成する方法(特開2000−302685号)等の方法を採用することによっても行うことができる。
このうち、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを用いてリポソーム表面を親水性化することが特に好ましい。
本発明のトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを用いる手法は、ポリエチレングリコールなどを用いる従来の親水性化方法と比較していくつかの点で好ましい。例えば、本発明のように糖鎖をリポソーム上に結合してその分子認識機能を標的指向性に利用するものでは、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンが低分子量物質であるので、従来のポリエチレングリコールなどの高分子量物質を用いる方法に比べて、糖鎖に対する立体障害となりにくく標的細胞膜面上のレクチン(糖鎖認識蛋白質)による糖鎖分子認識反応の進行を妨げないので特に好ましい。すなわち、本明細書において、親水性化に用いられる低分子量物質または低分子化合物とは、リポソーム表面に結合させた場合に、ポリエチレングリコールなどの高分子量物質に比べて糖鎖に対する立体障害となりにくく、標的細胞膜面上のレクチン(糖鎖認識蛋白質)による糖鎖分子認識反応の進行を妨げない物質を意味する。
また、本発明によるリポソームは該親水化処理後においても粒径分布や成分組成、分散特性が良好であり、長時間の保存性や生体内安定性も優れているのでリポソーム製剤化して利用するために好ましい。
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを用いてリポソーム表面を親水性化するには、例えばジミリストイルフォスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルフォスファチジルエタノールアミン等の脂質を用いて、常法により得たリポソーム溶液にビススルフォスクシニミヂルスベラート、ジスクシニミヂルグルタレート、ジチオビススクシニミヂルプロピオネート、ジスクシニミヂルスベラート、3,3’−ジチオビススルフォスクシニミヂルプロピオネート、エチレングリコールビススクシニミヂルスクシネート、エチレングリコールビススルフォスクシニミヂルスクシネート等の2価試薬を加えて反応させることにより、リポソーム膜上のジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン等の脂質に2価試薬を結合させ、次いでトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを、該2価試薬の一方の結合手と反応させることにより、リポソーム表面にトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを結合せしめる。
このように、リポソームを親水性化処理したリポソームは、生体内で極めて安定であり、後述のように標的指向性を有する糖鎖を結合しなくても、生体内での半減期が長いためドラッグデリバリーシステムにおけるドラッグ担体として好適に用いることができる。本発明は、表面を低分子化合物で親水性化したリポソームをも包含する。
本発明は、上記の親水性化化合物を用いて親水性化した糖鎖の結合していないリポソームそのものをも包含する。このような親水性化したリポソームは、リポソーム自体の安定性が高まり、また糖鎖を結合したときに糖鎖の認識性が高まるという利点がある。
本発明で用いられるリポソームは、例えば、リポソームの構成脂質が、フォスファチジルコリン類(モル比0〜70%)、フォスファチジルエタノールアミン類(モル比0〜30%)、フォスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩およびジセチルリン酸類からなる群から選択される1種以上の脂質(モル比0〜30%)、ガングリオシド類、糖脂質類、フォスファチジルグリセロール類およびスフィンゴミエリン類からなる群から選択される1種以上の脂質(モル比0〜40%)、ならびにコレステロール類(モル比0〜70%)を含む、リポソームである。
本発明は、さらにリポソームに上記に親水性化化合物を結合させて、リポソームを親水性化する方法をも包含する。また、糖鎖の結合していない親水性化したリポソームをも包含する(「糖鎖の結合していない親水性化したリポソーム」を「本発明のリポソーム」と略記することがある。また、「糖鎖の結合していない親水性化したリポソーム」と「本発明の糖鎖結合リポソーム」とをまとめて、「本発明のリポソーム」と略記することもある)。糖鎖の結合していないリポソームに糖鎖を結合することにより、本発明の標的指向性リポソームまたは腸管吸収性リポソームを製造することができる。
本発明のリポソームは、非常に安定であり、リポソームを形成した後に蛋白質を結合させたり、リンカー蛋白質を結合させたり、糖鎖を結合させるという後処理が可能である。従って、リポソームを大量に製造した後に、目的に応じてそれぞれ異なる蛋白質を結合させたり、リンカー蛋白質や糖鎖を結合させることにより、目的に応じた種々のリポソームを製造することが可能である。
本発明のリポソームには、糖鎖がリンカー蛋白質を介して、あるいはリポソームを構成する脂質に直接結合している。本発明のリポソームは、好ましくは、糖脂質や糖タンパク質等の複合糖質型リガンドを有し、低分子化合物で親水化処理されているリポソームである。
本発明のリポソーム、糖鎖等結合リポソームの粒径は、30〜500nm、好ましくは50〜350nmである。また、本発明のリポソームは、負に荷電していることが望ましい。負に荷電していることにより、生体中の負に荷電している細胞との相互作用を防ぐことができる。本発明のリポソーム表面のゼータ電位は、生理食塩水中において、37℃で、−50〜10mV、好ましくは−40〜0mV、さらに好ましくは−30〜−10mVである。上述のように、フォスファチジン酸類もしくはジセチルホスフェート等の長鎖アルキルリン酸塩類を配合することにより、リポソームを負に荷電させることができる。
粒径、ゼータ電位は、ゼータ電位・粒子径・分子量測定装置(Model Nano ZS,Malvern Instruments Ltd.,UK)を用いて測定することができる。
(リポソームへの糖鎖の結合)
本発明においては、上記のようにして作製したリポソームに、上記の糖鎖のいずれかを直接結合させてもよいし、さらに、糖鎖をリンカー蛋白質を介して結合させてもよい。この際、リポソームに結合させる糖鎖の種類は1種類に限らず、複数の糖鎖を結合させてもよい。この場合の複数の糖鎖は同じ組織または器官の細胞表面に共通して存在する異なるレクチンに対して結合活性を有する複数の糖鎖であってもよいし、異なる組織または器官の細胞表面に存在する異なるレクチンに対して結合活性を有する糖鎖であってもよい。前者のような複数の糖鎖を選択することにより、特定の標的組織または器官を確実に指向することができ、後者のような複数の糖鎖を選択することにより、1種類のリポソームに複数の標的を指向させることができ、マルチパーパスな標的指向性リポソームを得ることができる。
なお、糖鎖をリポソームに結合させるには、リポソームの製造時にリンカー蛋白質および/または糖鎖を混合し、リポソームを製造させつつ糖鎖をその表面に結合させることも可能であるが、あらかじめリポソーム、リンカー蛋白質および糖鎖を別途準備し、製造が完了したリポソームにリンカー蛋白質および/または糖鎖を結合させたほうが望ましい。これは、リポソームにリンカー蛋白質および/または糖鎖を結合させることにより、結合させる糖鎖の密度を制御できるからである。
糖鎖のリポソームへの直接結合は、以下に述べるような方法で行うことができる。
糖鎖を糖脂質として混合してリポソームを製造するか、製造後のリポソームのリン脂質に糖鎖を結合するとともに糖鎖密度を制御する。
リンカー蛋白質を用いて糖鎖を結合させる場合、リンカー蛋白質としては、生体由来の蛋白質、特にヒト由来蛋白質を用いるのが好ましい。生体由来の蛋白質は限定されないが、アルブミン等の血液中に存在する蛋白質、その他生体に存在する生理活性物質等が挙げられる。例えば、ヒト血清アルブミン(HSA)、ウシ血清アルブミン(BSA)等の動物の血清アルブミンが挙げられるが、特にヒト血清アルブミンを使用する場合は、各組織に対する取り込みが多いことがマウスについての実験により確かめられている。なお、リンカー蛋白質として、抗癌活性を有する蛋白質を用いてもよい。この場合、蛋白質がリポソームと糖鎖を結合させるためのリンカー蛋白質および抗癌活性を有する蛋白質を兼ねることもある。抗癌活性を有する蛋白質としては、抗癌活性を有する抗体等が挙げられる。
リンカー蛋白質は、好ましくは、リポソーム表面上に形成されている、ガングリオシド類、糖脂質類、フォスファチジルグリセロール類、スフィンゴミエリン類およびコレステロール類からなる群から選択される少なくとも1種の脂質からなる足場(ラフト)上に結合される。
糖鎖をリンカー蛋白質を介してリポソームへ結合させるには以下に述べる方法で行えばよい。
まずリポソーム表面に蛋白質を結合させる。リポソームを、NaIO4、Pb(O2CCH3)4、NaBiO3等の酸化剤で処理して、リポソーム膜面に存在するガングリオシドを酸化し、次いで、NaBH3CN、NaBH4等の試薬を用いて、リンカー蛋白質とリポソーム膜面上のガングリオシドを、還元的アミノ化反応により結合させる。このリンカー蛋白質も、親水性化するのが好ましく、これにはリンカー蛋白質にヒドロキシ基を有する化合物を結合させるが、例えば、ビススルフォスクシニミヂルスベラート、ジスクシニミヂルグルタレート、ジチオビススクシニミヂルプロピオネート、ジスクシニミヂルスベラート、3,3’−ジチオビススルフォスクシニミヂルプロピオネート、エチレングリコールビススクシニミヂルスクシネート、エチレングリコールビススルフォスクシニミヂルスクシネート等の2価試薬を用いて、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン等の上述の親水性化に用いる化合物をリポソーム上のリンカー蛋白質と結合させればよい。
これを具体的に述べると、まず、リンカー蛋白質の全てのアミノ基に架橋用2価試薬の一端を結合する。そして、各種糖鎖の還元末端をグリコシルアミノ化反応して得られる糖鎖グリコシルアミン化合物を調製し、この糖鎖のアミノ基とリポソーム上の上記で結合された架橋2価試薬の一部分の他の未反応末端とを結合する。
糖鎖および/または親水性化合物とリポソームとの共有結合、または糖鎖および/または親水性化合物とリンカー蛋白質との共有結合は、リポソームが細胞内に取り込まれたときに切断することも可能である。例えば、リンカー蛋白質と糖鎖がジスルフィド結合を介して共有結合されている場合、細胞内で還元されて糖鎖が切断される。糖鎖が切断されることによりリポソーム表面が疎水性になり、生体膜と結合し膜安定性が乱れリポソーム中に含まれる薬剤が放出される。
次に、このようにして得られる糖鎖結合リポソーム膜面上蛋白質の表面に糖鎖が結合していない未反応で残っている大部分の2価試薬未反応末端を用いて親水性化処理を行う。つまり、このリポソーム上蛋白質に結合している2価試薬の未反応末端とトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン等の上述の親水性化に用いる化合物との結合反応を行い、リポソーム表面全体を親水性化する。
リポソーム表面およびリンカー蛋白質の親水性化は、各種組織への移行性、および血中における滞留性および各種組織への移行性を向上させる。これは、リポソーム表面およびリンカー蛋白質表面が親水性化されることによって、糖鎖以外の部分が、各組織等においてはあたかも生体内水分であるかのようにみえ、これにより、標的以外の組織等に認識されず、糖鎖のみがその標的組織のレクチン(糖鎖認識蛋白質)により認識されることに起因するものと思われる。
次いで、糖鎖をリポソーム上のリンカー蛋白質に結合させる。これには、糖鎖を構成する糖類の還元末端を、NH4HCO3、NH2COONH4等のアンモニウム塩を用いてグリコシルアミノ化し、次いで、ビススルフォスクシニミヂルスベラート、ジスクシニミヂルグルタレート、ジチオビススクシニミヂルプロピオネート、ジスクシニミヂルスベラート、3,3’−ジチオビススルフォスクシニミヂルプロピオネート、エチレングリコールビススクシニミヂルスクシネート、エチレングリコールビススルフォスクシニミヂルスクシネート等の2価試薬を用いて、リポソーム膜面上に結合したリンカー蛋白質と、上記グリコシルアミノ化された糖類とを結合させ、図1〜12、23〜26および33〜38に示されるようなリポソームを得る。なお、これらの糖鎖は市販されている。
さらに、糖鎖を結合させた場合の糖鎖の結合密度は、リポソームに結合させるリンカー蛋白質1分子当り1〜60個、好ましくは1〜40個、さらに好ましくは1〜20個である。また、リポソーム1粒子当りは、リンカー蛋白質を用いる場合は、1〜30000個、好ましくは1〜20000個、さらに好ましくは1〜10000個、あるいは100〜30000個、好ましくは100〜20000個、さらに好ましくは100〜10000個、あるいは500〜30000個、好ましくは500〜20000個、さらに好ましくは500〜10000個である。リンカー蛋白質を用いない場合は、リポソーム1粒子当り最高1〜500000個、好ましくは1〜300000個、さらに好ましくは1〜100000個以上の糖鎖を結合させることができる。
本発明においては、使用する糖鎖の構造と糖鎖結合量を種々選択することにより、各標的細胞、組織に対する指向性を制御することができる。
また、糖鎖の種類と糖鎖結合量によっては腸管での吸収制御性を高めることもできる。腸管吸収制御性を高める糖鎖と特定の組織または器官への指向性を有する糖鎖の両方をリポソームに結合させることにより、特定組織または器官への指向性と腸管吸収制御性の両方の特性を併せ持ったリポソームを作製することができる。
上述のように、本発明の標的指向性リポソームは糖鎖の種類と糖鎖結合量により特異的に結合するレクチンが決まり、特定の組織または器官に特異的に到達する。また、糖鎖構造と糖鎖結合量を選択することにより癌組織等の疾患部位に到達させることも可能である。
本発明においては、使用する糖鎖の構造と糖鎖結合量を種々選択することにより、各標的細胞、組織に対する指向性を制御することができる。本発明の糖鎖修飾リポソームは、糖鎖により、血中、肝臓、脾臓、肺、脳、小腸、心臓、胸腺、腎臓、膵臓、筋肉、大腸、骨、骨髄、眼、卵巣、胎盤、前立腺、下垂体、乳腺、血管、皮膚、胆のう、胆管、膀胱、脂肪組織、癌組織、炎症組織およびリンパ節等の組織または器官を指向する。例えば、図13、16、17、18、21および22が示すように、アルファ1,2マンノビオース二糖鎖、アルファ1,3マンノビオース二糖鎖、アルファ1,4マンノビオース二糖鎖、アルファ1,6マンノビオース二糖鎖、アルファ1,3アルファ1,6マンノトリオース三糖鎖、オリゴマンノース3五糖鎖、オリゴマンノース4b六糖鎖、オリゴマンノース5七糖鎖、オリゴマンノース6八糖鎖、オリゴマンノース7九糖鎖、オリゴマンノース8十糖鎖およびオリゴマンノース9十一糖鎖を結合したリポソームはすべて血中、肺、脳、癌組織、心臓および小腸への指向性が高い。また、図14が示すように、アルファ1,2マンノビオース二糖鎖、オリゴマンノース3五糖鎖、オリゴマンノース4b六糖鎖を結合したリポソームは肝臓への指向性が高い。また、図15が示すようにアルファ1,2マンノビオース二糖鎖、アルファ1,3マンノビオース二糖鎖、アルファ1,3アルファ1,6マンノトリオース三糖鎖を結合したリポソームは脾臓への指向性が高い。また、図19が示すようにアルファ1,2マンノビオース二糖鎖、アルファ1,4マンノビオース二糖鎖、アルファ1,6マンノビオース二糖鎖を結合したリポソームはリンパ節への指向性が高い。さらに、オリゴマンノース6八糖鎖を結合したリポソームは胸腺への指向性が高い。
また、本発明の図23〜26に示されるリポソームは、全般的に腸管吸収性は極めて高いものの、さらに、リポソーム上の糖鎖の密度の調節を行うことにより、腸管吸収性を制御し、より効率的に標的部位へ薬剤を移行させることが可能となり、副作用の軽減化を図ることができる。例えば、図27〜30においては、上記4種の糖鎖修飾リポソームにおける糖鎖結合量を3段階に変更した場合における、腸管から血中への移行性(すなわち腸管吸収性)を示す。
なお、この糖鎖結合量の変更は、リンカー蛋白質結合リポソームに対して糖鎖を3段階の濃度(1)50μg、2)200μg、3)1mg)で結合せしめることにより行ったものである。これによれば、6’−シアリルラクトース三糖鎖、6’−シアリルラクトサミン糖鎖の場合、糖鎖密度を高くするにつれ、腸管吸収性が順次低下するが、3’−シアリルラクトース三糖鎖、3’−シアリルラクトサミン糖鎖の場合は腸管吸収性が逆に上昇する。これらのことは、腸管吸収性は、リポソーム上の糖鎖の結合量により、糖鎖の種類毎に異なることを示す。したがって、糖鎖の種類毎にリポソーム上の糖鎖結合量を適宜設定することにより、腸管吸収性を制御することが可能となる.
(薬剤を含有するリポソーム、リポソーム製剤など)
本発明のリポソームには、アロマターゼ阻害薬、抗アンドロゲン薬、リアーゼ阻害薬、GnRH作動薬、GnRH拮抗薬、血管新生阻害薬、チロシンキナーゼ阻害剤、セリン・スレオニンキナーゼ阻害剤、抗癌活性を有する抗体、アンサマイトシン、カペシタビン、セルモロイキン、ドセタキセル水和物、塩酸ゲムシタビン、オキサリプラチン、プレドニゾロン、テガフール・ウラシル配合剤、ジノスタチンスチラマー、三酸化砒素などの抗癌活性を有する薬剤が含有されており、特定の組織または器官にリポソームが到達し、その組織または器官の細胞にリポソームが取り込まれ、前記抗癌活性を有する薬剤を放出し、抗癌作用を奏し、癌(例、脳腫瘍、下垂体腺腫、神経膠腫、聴神経鞘腫、網膜肉腫、甲状腺癌、咽頭癌、喉頭癌、舌癌、胸腺腫、中皮腫、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、胃癌、食道癌、十二指腸癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、肝細胞癌、膵癌、膵内分泌腫瘍、胆管癌、胆嚢癌、陰茎癌、腎臓癌、腎盂癌、尿管癌、腎細胞癌、精巣腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、外陰癌、子宮癌、子宮頚部癌、子宮体部癌、子宮肉腫、絨毛性疾患、膣癌、卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、皮膚癌、悪性黒色腫、菌状息肉症、基底細胞腫、軟部肉腫、悪性リンパ腫、ホジキン病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、成人T細胞白血病、慢性骨髄増殖性疾患、膵内分泌腫瘍、線維性組織球腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、原発不明癌など)の予防・治療作用を有する。糖鎖結合リポソームの場合は、糖鎖の有する標的指向性により特定の組織または器官にリポソームが到達する。また、糖鎖が結合していない場合であっても、本発明のリポソームは、体内で非常に安定なため、前記抗癌活性を有する薬剤の体内での半減期が長くなるので、特定の組織または器官に効果的に到達し得る。なお、前記抗癌活性を有する抗体は、直接または間接の抗癌活性を有していればよい。
本発明の糖鎖修飾リポソームに上記薬剤を含有させて投与した場合、薬剤を単独で投与した場合に比較し、薬剤が癌組織等の標的部位に集積する。単独投与の場合に比べ、2倍以上、好ましくは5倍以上、さらに好ましくは10倍以上、特に好ましくは50倍以上集積し得る。
なお、抗癌活性を有する薬剤は、リポソームの中に封入させてもよいし、リポソーム表面に結合させてもよい。リポソーム表面に結合させる場合には、例えば、抗体などの蛋白質は上記のリンカー蛋白質の結合方法と同じ方法で表面に結合させることが可能であり、他の化合物もその化合物が有する官能基を利用することにより、公知の方法で、結合させることができる。リポソーム内部への封入は、以下の方法により行う。リポソームへ薬剤等を封入するには、周知の方法を用いればよく、例えば、薬剤等の含有溶液とフォスファチジルコリン類、フォスファチジルエタノールアミン類、フォスファチジン酸類もしくは長鎖アルキルリン酸塩類、ガングリオシド類、糖脂質類もしくはフォスファチジルグリセロール類およびコレステロール類を含む脂質を用いてリポソームを形成することにより、薬剤等はリポソーム内に封入される。
したがって、本発明で用いられるリポソームに抗癌活性を有する薬剤を含有させることによって得られるリポソーム製剤は、癌組織などの各種組織への移行性が選択的に制御されたものであり、治療薬剤の標的細胞、組織への集中による効力の増強あるいは他の細胞、組織に対する薬剤の取り込みの減少による副作用の軽減化等を図ることができるものである。
本発明のリポソームまたは糖鎖修飾リポソームは、医薬組成物として、種々の形態で投与することができる。このような投与形態としては、点眼剤等による点眼投与、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与、あるいは注射剤、点滴剤、座薬などによる非経口投与を挙げることができる。かかる組成物は、公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤、賦形剤を含む。たとえば、錠剤用の担体、賦形剤としては、ゲル化剤、乳糖、ステアリン酸マグネシウムなどが使用される。注射剤は、本発明の糖鎖結合リポソームを通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが使用され、適当な溶解補助剤、たとえばアルコール、プロピレングリコールなどのポリアルコール、非イオン界面活性剤などと併用しても良い。油性液としては、ゴマ油、大豆油などが使用され、溶解補助剤としては安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用しても良い。
本発明の医薬組成物の哺乳動物に対する投与経路は、限定されず、点眼、経口投与、静脈注射、筋肉注射等がある。投与量は、疾患の重篤度等により適宜決定できるが、本発明の組成物の医薬的に有効量を患者に投与する。ここで、「医薬的に有効量を投与する」とは、各種疾患を治療するのに適切なレベルの薬剤を患者に投与することをいう。本発明の医薬組成物の投与回数は適宜患者の症状に応じて選択される。
表面に糖鎖を有するリポソームは、非経口投与(静注投与)および経口投与に適し、投与量は、標的指向性を有さない従来のリポソーム製剤に対して、数分の1から数千分の1でよい。例えば、体重1kg当り、リポソームに含ませる薬剤の量で0.0001〜1000mg、好ましくは、0.0001〜10mg、さらに好ましくは、0.0001〜0.1mgなどが用いられる。また、本発明のリポソームは、標的指向性を有する糖鎖を含まず親水性化合物を結合させたリポソームも含むが、該リポソームの場合も親水性処理により生体内での安定性が高く、半減期も長いので、低用量で充分な効果を有する。
本発明を以下の参考例、実施例および実験例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの例によって限定されるものではない。
参考例1 リポソームの調製
リポソームは既報の手法(Yamazaki,N.,Kodama,M.and Gabius,H.−J.(1994)Methods Enzymol.242,56−65)により、改良型コール酸透析法を用いて調製した。すなわち、ジパルミトイルフォスファチジルコリン、コレステロール、ジセチルフォスフェート、ガングリオシド及びジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミンをモル比でそれぞれ35:40:5:15:5の割合の合計脂質量45.6mgにコール酸ナトリウムを46.9mg添加し、クロロホルム/メタノール溶液3mlに溶解した。この溶液を蒸発させ、沈殿物を真空中で乾燥させることによって脂質膜を得た。得られた脂質膜をTAPS緩衝液(pH8.4)3mlに懸濁、超音波処理して、透明なミセル懸濁液を得た。さらに、ミセル懸濁液をPM10膜(Amicon Co.,USA)とPBS緩衝液(pH7.2)を用いた限外濾過にかけ均一リポソーム(平均粒径100nm)10mlを調製した。
参考例2 リポソーム脂質膜面上の親水性化処理
参考例1で調製したリポソーム溶液10mlをXM300膜(Amicon Co.,USA)とCBS緩衝液(pH8.5)を用いた限外濾過にかけ溶液のpHを8.5にした。次に、架橋試薬bis(sulfosuccinimidyl)suberate(BS3;Pierce Co.,USA)10mlを加え、25℃で2時間攪拌した。その後、更に7℃で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミンとBS3との化学結合反応を完結した。そして、このリポソーム液をXM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過にかけた。次に、CBS緩衝液(pH8.5)1mlに溶かしたtris(hydroxymethyl)aminomethane 40mgをリポソーム液10mlに加えて、25℃で2時間攪拌後、7℃で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質に結合したBS3とtris(hydroxymethyl)aminomethaneとの化学結合反応を完結した。これにより、リポソーム膜の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン上にtris(hydroxymethyl)aminomethaneの水酸基が配位して水和親水性化された。
参考例3 リポソーム膜面上へのヒト血清アルブミン(HSA)の結合
既報の手法(Yamazaki,N.,Kodama,M.and Gabius,H.−J.(1994)Methods Enzymol.242,56−65)により、カップリング反応法を用いて行った。すなわち、この反応は2段階化学反応で行い、まずはじめに、参考例2で得られた10mlのリポソーム膜面上に存在するガングリオシドを1mlのTAPS緩衝液(pH8.4)に溶かしたメタ過ヨウ素酸ナトリウム43mgを加えて室温で2時間攪拌して過ヨウ素酸酸化した後、XM300膜とPBS緩衝液(pH8.0)で限外濾過することにより酸化されたリポソーム10mlを得た。このリポソーム液に、20mgのヒト血清アルブミン(HSA)を加えて25℃で2時間攪拌し、次にPBS(pH8.0)に2M NaBH3CN 100μlを加えて10℃で一晩攪拌してリポソーム上のガングリオシドとHSAとのカップリング反応でHSAを結合した。そして、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過をした後、HSA結合リポソーム液10mlを得た。
参考例4 リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上へのアルファ1,2マンノビオース二糖鎖の結合
アルファ1,2マンノビオース二糖鎖(Calbiochem Co.,USA)50μgを0.25gのNH4HCO3を溶かした0.5ml水溶液に加え、37℃で3日間攪拌した後、0.45μmのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してアルファ1,2マンノビオース二糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを得た。次に、参考例3で得たリポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’−dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate)(DTSSP;Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液に上記のアルファ1,2マンノビオース二糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにアルファ1,2マンノビオース二糖鎖の結合を行った。その結果、図1で示されるアルファ1,2マンノビオース二糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム(略称:A2)2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)が得られた。
参考例5 リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上へのアルファ1,3マンノビオース二糖鎖の結合
アルファ1,3マンノビオース二糖鎖(Calbiochem Co.,USA)50μgを0.25gのNH4HCO3を溶かした0.5ml水溶液に加え、37℃で3日間攪拌した後、0.45μmのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してアルファ1,3マンノビオース二糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを得た。次に、参考例3で得たリポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’−dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate)(DTSSP;Pierce CO.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液に上記のアルファ1,3マンノビオース二糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにアルファ1,3マンノビオース二糖鎖の結合を行った。その結果、図2で示されるアルファ1,3マンノビオース二糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム(略称:A3)2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)が得られた。
参考例6 リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上へのアルファ1,4マンノビオース二糖鎖の結合
アルファ1,4マンノビオース二糖鎖(Calbiochem Co.,USA)50μgを0.25gのNH4HCO3を溶かした0.5ml水溶液に加え、37℃で3日間攪拌した後、0.45μmのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してアルファ1,4マンノビオース二糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを得た。次に、参考例3で得たリポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’−dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate)(DTSSP;Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液に上記のアルファ1,4マンノビオース二糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにアルファ1,4マンノビオース二糖鎖の結合を行った。その結果、図3で示されるアルファ1,4マンノビオース二糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム(略称:A4)2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)が得られた。
参考例7 リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上へのアルファ1,6マンノビオース二糖鎖の結合
アルファ1,6マンノビオース二糖鎖(Calbiochem Co.,USA)50μgを0.25gのNH4HCO3を溶かした0.5ml水溶液に加え、37℃で3日間攪拌した後、0.45μmのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してアルファ1,6マンノビオース二糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを得た。次に、参考例3で得たリポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’−dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate)(DTSSP;Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液に上記のアルファ1,6マンノビオース二糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにアルファ1,6マンノビオース二糖鎖の結合を行った。その結果、図4で示されるアルファ1,6マンノビオース二糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム(略称:A6)2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)が得られた。
参考例8 リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上へのアルファ1,3アルファ1,6マンノトリオース三糖鎖の結合
アルファ1,3アルファ1,6マンノトリオース三糖鎖(Calbiochem Co.,USA)50μgを0.25gのNH4HCO3を溶かした0.5ml水溶液に加え、37℃で3日間攪拌した後、0.45μmのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してアルファ1,3アルファ1,6マンノトリオース三糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを得た。次に、参考例3で得たリポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’−dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate)(DTSSP;Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液に上記のアルファ1,3アルファ1,6マンノトリオース三糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにアルファ1,3アルファ1,6マンノトリオース三糖鎖の結合を行った。その結果、図5で示されるアルファ1,3アルファ1,6マンノトリオース三糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム(略称:A36)2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)が得られた。
参考例9 リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上へのオリゴマンノース3五糖鎖の結合
オリゴマンノース3五糖鎖(Calbiochem Co.,USA)50μgを0.25gのNH4HCO3を溶かした0.5ml水溶液に加え、37℃で3日間攪拌した後、0.45μmのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してオリゴマンノース3五糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを得た。次に、参考例3で得たリポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’−dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate)(DTSSP;Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液に上記のオリゴマンノース3五糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにオリゴマンノース3五糖鎖の結合を行った。その結果、図6で示されるオリゴマンノース3五糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム(略称:Man3)2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)が得られた。
参考例10 リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上へのオリゴマンノース4b六糖鎖の結合
オリゴマンノース4b六糖鎖(Calbiochem Co.,USA)50μgを0.25gのNH4HCO3を溶かした0.5ml水溶液に加え、37℃で3日間攪拌した後、0.45μmのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してオリゴマンノース4b六糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを得た。次に、参考例3で得たリポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’−dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate)(DTSSP;Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液に上記のオリゴマンノース4b六糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにオリゴマンノース4b六糖鎖の結合を行った。その結果、図7で示されるオリゴマンノース4b六糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム(略称:Man4b)2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)が得られた。
参考例11 リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上へのオリゴマンノース5七糖鎖の結合
オリゴマンノース5七糖鎖(Calbiochem Co.,USA)50μgを0.25gのNH4HCO3を溶かした0.5ml水溶液に加え、37℃で3日間攪拌した後、0.45μmのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してオリゴマンノース5七糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを得た。次に、参考例3で得たリポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’−dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate)(DTSSP;Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液に上記のオリゴマンノース5七糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにオリゴマンノース5七糖鎖の結合を行った。その結果、図8で示されるオリゴマンノース5七糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム(略称:Man5)2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)が得られた。
参考例12 リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上へのオリゴマンノース6八糖鎖の結合
オリゴマンノース6八糖鎖(Calbiochem Co.,USA)50μgを0.25gのNH4HCO3を溶かした0.5ml水溶液に加え、37℃で3日間攪拌した後、0.45μmのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してオリゴマンノース6八糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを得た。次に、参考例3で得たリポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’−dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate)(DTSSP;Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液に上記のオリゴマンノース6八糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにオリゴマンノース6八糖鎖の結合を行った。その結果、図9で示されるオリゴマンノース6八糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム(略称:Man6)2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)が得られた。
参考例13 リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上へのオリゴマンノース7九糖鎖の結合
オリゴマンノース7九糖鎖(Calbiochem Co.,USA)50μgを0.25gのNH4HCO3を溶かした0.5ml水溶液に加え、37℃で3日間攪拌した後、0.45μmのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してオリゴマンノース7九糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを得た。次に、参考例3で得たリポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’−dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate)(DTSSP;Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液に上記のオリゴマンノース7九糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにオリゴマンノース7九糖鎖の結合を行った。その結果、図10で示されるオリゴマンノース7九糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム(略称:Man7)2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)が得られた。
参考例14 リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上へのオリゴマンノース8十糖鎖の結合
オリゴマンノース8十糖鎖(Calbiochem Co.,USA)50μgを0.25gのNH4HCO3を溶かした0.5ml水溶液に加え、37℃で3日間攪拌した後、0.45μmのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してオリゴマンノース8十糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを得た。次に、参考例3で得たリポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’−dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate)(DTSSP;Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液に上記のオリゴマンノース8十糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにオリゴマンノース8十糖鎖の結合を行った。その結果、図11で示されるオリゴマンノース8十糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム(略称:Man8)2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)が得られた。
参考例15 リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上へのオリゴマンノース9十一糖鎖の結合
オリゴマンノース9十一糖鎖(Calbiochem Co.,USA)50μgを0.25gのNH4HCO3を溶かした0.5ml水溶液に加え、37℃で3日間攪拌した後、0.45μmのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してオリゴマンノース9十一糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを得た。次に、参考例3で得たリポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’−dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate)(DTSSP;Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液に上記のオリゴマンノース9十一糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにオリゴマンノース9十一糖鎖の結合を行った。その結果、図12で示されるオリゴマンノース9十一糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム(略称:Man9)2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)が得られた。
参考例16 リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上へのtris(hydroxymethyl)aminomethaneの結合
比較試料としてのリポソームを調製するために、参考例3で得たリポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’−dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate)(DTSSP;Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液にtris(hydroxymethyl)aminomethane(Wako Co.,Japan)13mgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにtris(hydroxymethyl)aminomethaneの結合を行った。その結果、図31で示されるtris(hydroxymethyl)aminomethaneとヒト血清アルブミンとリポソームとが結合した比較試料としてのリポソーム(略称:TRIS)2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μ、平均粒径100nm)が得られた。
参考例17 リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上の親水性化処理
参考例4〜15において調製された12種類の糖鎖が結合したリポソームについて、それぞれ別々に以下の手順によりリポソーム上のHSA蛋白質表面の水和性化処理を行った。12種の糖鎖結合リポソーム2mlに、別々に、tris(hydroxymethyl)aminomethane 13mgを加えて、25℃で2時間、その後7℃で一晩攪拌した後、XM300膜とPBS緩衝液(pH7.2)で限外濾過し未反応物を除去して、最終産物である水和性化処理された12種類の糖鎖結合リポソーム複合体(略称:A2、A3、A4、A6、A36、Man3、Man4、Man5、Man6、Man7、Man8、Man9)を各2mlを得た。
参考例18 各種の糖鎖結合リポソーム複合体によるレクチン結合活性阻害効果の測定
参考例4〜15および参考例17で調製した12種の糖鎖結合リポソーム複合体のin vitroでのレクチン結合活性は、常法(Yamazaki,N.(1999)Drug Delivery System,14,498−505)に従いレクチン固定化マイクロプレートを用いた阻害実験で測定した。すなわち、レクチン(ConA;R&D Systems Co.,USA)を96穴マイクロプレートに固化定した。このレクチン固定化プレートに、比較リガンドであるビオチン化したフェチュイン0.1μgとともに、濃度の異なる各種の糖鎖結合リポソーム複合体(蛋白質量として、0.01μg、0.04μg、0.11μg、0.33μg、1μg)を加え、4℃で2時間インキュベートした。PBS(pH7.2)で3回洗浄した後、horseradish peroxidase(HRPO)結合ストレプトアビジンを添加し、さらに4℃で1時間インキュベート、PBS(pH7.2)で3回洗浄し、ペルオキシダーゼ基質を添加して室温で静置、405nmの吸光度をマイクロプレートリーダー(Molecular Devices Corp.,USA)で測定した。フェチュインのビオチン化は、sulfo−NHS−biotin reagent(Pierce Co.,USA)処理後、Centricon−30(Amicon Co.,USA)により精製した。HRPO結合ストレプトアビジンは、HRPOの酸化とNaBH3CNを用いた還元アミノ化法によるストレプトアビジンの結合により調製した。この測定結果を表1に示す。
参考例19 クロラミンT法による各種糖鎖結合リポソームの125I標識
クロラミンT(Wako Pure Chemical Co.,Japan)溶液並びに二亜硫酸ナトリウム溶液をそれぞれ3mg/ml並びに5mg/mlとなるように用時調製して用いた。参考例4から16において調製した12種の糖鎖結合リポソーム並びにtris(hydroxymethyl)aminomethane結合リポソームとを50μlずつ別々にエッペンチューブに入れ、続いて125I−NaI(NEN Life Science Product,Inc.USA)を15μl、クロラミンT溶液を10μl加え反応させた。5分ごとにクロラミンT溶液10μlを加え、この操作を2回繰り返した後15分後に還元剤として二亜硫酸ナトリウム100μl加え、反応を停止させた。次に、Sephadex G−50(Phramacia Biotech.Sweden)カラムクロマト上に乗せ、PBSで溶出、標識体を精製した。最後に、非標識−リポソーム複合体を添加して比活性(4x106Bq/mg protein)を調製して13種類の125I標識リポソーム液を得た。
参考例20 各種の糖鎖結合リポソーム複合体の担癌マウスでの各組織への分布量の測定
Ehrlich ascites tumor(EAT)細胞(約2×107個)を雄性ddYマウス(7週齢)大腿部皮下に移植し、癌組織が0.3〜0.6gに発育(6〜8日後)したものを本実験に用いた。この担癌マウスに参考例19により125I標識した12種の糖鎖並びにtris(hydroxymethyl)aminomethane結合リポソーム複合体0.2mlを蛋白質量として3μg/一匹の割合となるように尾静脈に注入投与し、60分後に組織(血液、肝臓、脾臓、肺、脳、癌組織、癌の周囲の炎症組織、リンパ節)を摘出、各組織の放射能をガンマカウンタ(Aloka ARC 300)で測定した。なお、各組織への放射能分布量は、投与全放射能に対する各組織1g当たりの放射能の割合(%投与量/g組織)で表示した。この結果を図13〜図22に示す。
参考例21 リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上への3’−シアリルラクトース三糖鎖の結合(糖鎖結合量が異なるもの3種類)
3’−シアリルラクトース三糖鎖(Wako Pure Chemical Co.,Japan)(1)50μg、又は、2)200μg、又は、3)1mg)を0.25gのNH4HCO3を溶かした0.5ml水溶液に加え、37℃で3日間攪拌した後、0.45μmのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結して3’−シアリルラクトース三糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを得た。次に、参考例3で得たリポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’−dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate)(DTSSP;Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液に上記の3’−シアリルラクトース三糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPに3’−シアリルラクトース三糖鎖の結合を行った。その結果、糖鎖結合量が異なるもの3種類の図22で示される3’−シアリルラクトース三糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム(略称:1)3SL−1、2)3SL−2,3)3SL−3)各2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)が得られた。
参考例22 リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上への6’−シアリルラクトース三糖鎖の結合(糖鎖結合量が異なるもの3種類)
6’−シアリルラクトース三糖鎖(Wako Pure Chemical Co.,Japan)(1)50μg、又は、2)200μg、又は、3)1mg)を0.25gのNH4HCO3を溶かした0.5ml水溶液に加え、37℃で3日間攪拌した後、0.45μmのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結して6’−シアリルラクトース三糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを得た。次に、参考例3で得たリポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’−dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate)(DTSSP;Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液に上記の6’−シアリルラクトース三糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPに6’−シアリルラクトース三糖鎖の結合を行った。その結果、糖鎖結合量が異なるもの3種類の図23で示される6’−シアリルラクトース三糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム(略称:1)6SL−1、2)6SL−2,3)6SL−3)各2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)が得られた。
参考例23 リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上への3’−シアリルラクトサミン糖鎖の結合(糖鎖結合量が異なるもの3種類)
3’−シアリルラクトサミン糖鎖(Wako Pure Chemical Co.,Japan)(1)50μg、又は、2)200μg、又は、3)1mg)を0.25gのNH4HCO3を溶かした0.5ml水溶液に加え、37℃で3日間攪拌した後、0.45μmのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結して3’−シアリルラクトサミン糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを得た。次に、参考例3で得たリポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’−dithiobis(sulfosuccinimidyl)propionate(DTSSP;Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液に上記の3’−シアリルラクトサミン糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPに3’−シアリルラクトサミン糖鎖の結合を行った。その結果、糖鎖結合量が異なるもの3種類の図24で示される3’−シアリルラクトサミン糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム(略称:1)3SLN−1、2)3SLN−2,3)3SLN−3)各2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)が得られた。
参考例24 リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上への6’−シアリルラクトサミン糖鎖の結合(糖鎖結合量が異なるもの3種類)
6’−シアリルラクトサミン糖鎖(Wako Pure Chemical Co.,Japan)(1)50μg、又は、2)200μg、又は、3)1mg)を0.25gのNH4HCO3を溶かした0.5ml水溶液に加え、37℃で3日間攪拌した後、0.45μmのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結して6’−シアリルラクトサミン糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを得た。次に、参考例3で得たリポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’−dithiobis(sulfosuccinimidyl)propionate(DTSSP;Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液に上記の6’−シアリルラクトサミン糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPに6’−シアリルラクトサミン糖鎖の結合を行った。その結果、糖鎖結合量が異なるもの3種類の図25で示される6’−シアリルラクトサミン糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム(略称:1)6SLN−1、2)6SLN−2,3)6SLN−3)各2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)が得られた。
参考例25 リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上の親水性化処理
参考例21〜24の手段により調製された各12種類の糖鎖が結合したリポソームについて、それぞれ別々に以下の手順によりリポソーム上のHSA蛋白質表面の親水性化処理を行った。12種の糖鎖結合リポソーム2mlに、別々に、tris(hydroxymethyl)aminomethane 13mgを加えて、25℃で2時間、その後7℃で一晩攪拌した後、XM300膜とPBS緩衝液(pH7.2)で限外濾過し未反応物を除去して、最終産物である親水性化処理された12種類の糖鎖結合リポソーム複合体(略称:3SL−2、3SL−2、3SL−3、6SL−1、6SL−2、6SL−3、3SLN−1、3SLN−2、3SLN−3、6SLN−1、6SLN−2、6SLN−3)各2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)を得た。
参考例26 各種の糖鎖結合リポソーム複合体によるレクチン結合活性阻害効果の測定
参考例21〜24および参考例16の手段により調製した各12種の糖鎖結合リポソーム複合体のin vitroでのレクチン結合活性は、常法(Yamazaki,N.(1999)Drug Delivery System,14,498−505)に従いレクチン固定化マイクロプレートを用いた阻害実験で測定した。すなわち、レクチン(E−selectin;R&D Systems Co.,USA)を96穴マイクロプレートに固化定した。このレクチン固定化プレートに、比較リガンドであるビオチン化したフコシル化フェチュイン0.1μgとともに、濃度の異なる各種の糖鎖結合リポソーム複合体(蛋白質量として、0.01μg、0.04μg、0.11μg、0.33μg、1μg)を加え、4℃で2時間インキュベートした。PBS(pH7.2)で3回洗浄した後、horseradish peroxidase(HRPO)結合ストレプトアビジンを添加し、さらに4℃で1時間インキュベート、PBS(pH7.2)で3回洗浄し、ペルオキシダーゼ基質を添加して室温で静置、405nmの吸光度をマイクロプレートリーダー(Molecular Devices Corp.,USA)で測定した。フコシル化フェチュインのビオチン化は、sulfo−NHS−biotin reagent(Pierce Co.,USA)処理後、Centricon−30(Amicon Co.,USA)により精製した。HRPO結合ストレプトアビジンは、HRPOの酸化とNaBH3CNを用いた還元アミノ化法によるストレプトアビジンの結合により調製した。この測定結果を表2に示す。
参考例27 クロラミンT法による各種糖鎖結合リポソームの125I標識
クロラミンT(Wako Pure Chemical Co.,Japan)溶液並びに二亜硫酸ナトリウム溶液をそれぞれ3mg/ml並びに5mg/mlとなるように用時調製して用いた。参考例21から24および参考例16により調製した13種の糖鎖結合リポソーム並びにtris(hydroxymethyl)aminomethane結合リポソームとを50μlずつ別々にエッペンチューブに入れ、続いて125I−NaI(NEN Life Science Product,Inc.USA)を15μl、クロラミンT溶液を10μl加え反応させた。5分ごとにクロラミンT溶液10μlを加え、この操作を2回繰り返した後15分後に還元剤として二亜硫酸ナトリウム100μl加え、反応を停止させた。次に、Sephadex G−50(Phramacia Biotech.Sweden)カラムクロマト上に乗せ、PBSで溶出、標識体を精製した。最後に、非標識−リポソーム複合体を添加して比活性(4x106Bq/mg protein)を調製して13種類の125I標識リポソーム液を得た。
参考例28 各種の糖鎖結合リポソーム複合体のマウスでの腸管から血中への移行量の測定
一昼夜水分以外絶食した雄性ddYマウス(7週齢)に、参考例27により125I標識された13種の糖鎖結合並びにtris(hydroxymethyl)aminomethane結合リポソーム複合体0.2mlを蛋白質量として3μg/一匹の割合になるように、マウス用経口ゾンデで腸管内に強制投与した後、10分後にネンブタール麻酔下で下大動脈より血液1mlを採血した。そして、血中の125I放射能をガンマーカウンター(Alola ARC300)で測定した。さらに、各種のリポソーム複合体の生体内安定性を調べる目的で、各血液の血清をSephadex G−50で再クロマトしたが、いずれも大半の放射能が高分子量のボイドフラクションにみられ、各種のリポソーム複合体は生体内においても安定性を有していた。なお、腸管から血中への放射能移行量は、投与全放射能に対する血液1ml当たりの放射能の割合(%投与量/ml血液)で表示した。この結果を図27から図31に示す。
実施例1
(1)ドセタキセル水和物封入リポソームの調製
コール酸透析法を用いてドセタキセル水和物封入リポソームを調製した。すなわち、ジパルミトイルフォスファチジルコリン、コレステロール、ジセチルフォスフェート、ガングリオシド及びジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミンをモル比でそれぞれ35:40:5:15:5の割合で合計脂質量45.6mgになるように混合し、コール酸ナトリウム46.9mgを添加し、クロロホルム/メタノール溶液3mlに溶解した。この溶液を蒸発させ、沈殿物を真空中で乾燥させることによって脂質膜を得た。得られた脂質膜をN−トリス(ヒドロキシメチル)メチル−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝生理食塩液(TAPS,pH8.4)8mlに懸濁、超音波処理し、透明なミセル懸濁液8mlを得た。このミセル懸濁液にPBS緩衝液(pH7.2)で20mg/2mlになるよう完全に溶解したドセタキセル水和物を攪拌しながらゆっくりと滴下して均一に混合した後、このドセタキセル水和物入りミセル懸濁液をPM10膜(AmiconCo.,USA)とPBS緩衝生理食塩液(pH7.2)を用いた限外濾過にかけ均一なドセタキセル水和物封入リポソーム粒子懸濁液10ml(以下、DC−1液と略す)を調製した。
(2)抗癌剤ドセタキセル封入リポソーム脂質膜面上の親水性化処理
DC−1液10mlをXM300膜(Amicon Co.,USA)と炭酸水素ナトリウム緩衝生理食塩液(CBS,pH8.5)を用いた限外濾過にかけ溶液のpHを8.5にした。次に、架橋試薬bis(sulfosuccinimidyl)suberate(BS3;Pierce Co.,USA)10mgを加え、25℃で2時間攪拌した。その後、更に7℃で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミンとBS3との化学結合反応を完結した。そして、このリポソーム液をXM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過にかけた。次に、CBS緩衝液(pH8.5)1mlに溶かしたtris(hydroxymethyl)aminomethane 40mgをリポソーム液10mlに加えて、25℃で2時間攪拌後、7℃で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質に結合したBS3とtris(hydroxymethyl)aminomethaneとの化学結合反応を完結した。これにより、ドセタキセル水和物封入リポソーム膜の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン上にtris(hydroxymethyl)aminomethaneの水酸基が配位して水和親水性化された。以下、これをDC−2液とよぶ。
(3)ドセタキセル水和物封入リポソーム膜面上へのヒト血清アルブミン
(HSA)の結合
DC−2液に、Yamazaki,N.,Kodama,M.and Gabius,H.−J.(1994)Methods Enzymol.242,56−65記載の方法に従いカップリング反応法を用い、ヒト血清アルブミン(HSA)を結合した。すなわち、この反応は2段階化学反応で行い、まずDC−2液10mlのリポソーム膜面上に存在するガングリオシドを1mlのTAPS緩衝液(pH8.4)に溶かしたメタ過ヨウ素酸ナトリウム43mgを加えて室温で2時間攪拌して過ヨウ素酸酸化した後、XM300膜とPBS緩衝液(pH8.0)で限外濾過することにより酸化されたリポソーム10mlを得た。このリポソーム液に、20mgのヒト血清アルブミン(HSA)を加えて25℃で2時間攪拌し、次にPBS(pH8.0)に2M NaBH3CN 100μlを加えて10℃で一晩攪拌してリポソーム上のガングリオシドとHSAとのカップリング反応でHSAを結合した。次に、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過をした後、HSA結合ドセタキセル水和物封入リポソーム液10ml(以下、DC−3液と略す)を得た。
(4)ドセタキセル水和物封入リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン
(HSA)上へのアルファ1,6マンノビオース二糖鎖の結合とリンカー蛋白質
(HSA)の親水性化処理
アルファ1,6マンノビオース二糖鎖(Calbiochem Co.,USA)150μgを0.25gのNH4HCO3を溶かした0.5ml水溶液に加え、37℃で3日間攪拌した後、0.45μmのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してアルファ1,6マンノビオース二糖鎖のグリコシルアミン化合物150μgを得た。次にDC−3液10mlに架橋試薬3,3’−dithiobis(sulfosuccinimidyl)propionate(DTSSP;Pierce Co.,USA)10mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム10mlを得た。次に、このリポソーム液に上記のアルファ1,6マンノビオース二糖鎖のグリコシルアミン化合物150μgを加えて、25℃で2時間攪拌し、tris(hydroxymethyl)aminomethane(Wako Co.,Japan)120mgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とHEPES緩衝液(pH7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにアルファ1,6マンノビオース二糖鎖の結合と親水性化処理を行った。その結果、アルファ1,6マンノビオース二糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリンカー蛋白質(HSA)の親水性化処理をしたドセタキセル水和物封入リポソーム(以下、DC−A6と略す)10ml(総脂質量20mg、総蛋白量2mg)が得られた。
(5)ドセタキセル水和物封入リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン
(HSA)上へのtris(hydroxymethyl)aminomethaneの結合によるリンカー蛋白質(HSA)の親水性化処理
DC−3液10mlに架橋試薬3,3’−dithiobis(sulfosuccinimidyl)propionate(DTSSP;Pierce Co.,USA)10mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム10mlを得た。次に、このリポソーム液にtris(hydroxymethyl)aminomethane(Wako Co.,Japan)120mgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにtris(hydroxymethyl)aminomethaneの結合を行った。その結果、tris(hydroxymethyl)aminomethaneとヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリンカー蛋白質(HSA)の親水性化処理をした抗癌剤ドセタキセル封入リポソーム(以下、DC−TRISと略す)10ml(総脂質量20mg、総蛋白量2mg)が得られた。
実験例1
(1)化合物定量法
実施例1で得られたDC−A6およびDC−TRISに含まれるドセタキセル水和物量、およびDC−A6およびDC−TRIS投与後の動物組織に含まれるドセタキセル水和物量をAnal.Chem.2005年,77巻,4677−4683頁記載の方法に従い、以下のように測定した。
HPLCシステムはLC−10ADvpシステム(島津製作所)を、MS/MSシステムはAPI4000(AB/MDS SCIEX)を使用した。
無投与群の血漿(コントロール)50μLにドセタキセル水和物希釈標準5μLおよび内部標準液5μLを加えて同様に処理した試料を標準検量線用試料とした。
DC−A6、DC−TRIS、血漿試料、組織抽出液または標準検量線用試料50μLに0.2%蟻酸含有メタノール5μL、パクリタキセルの0.2%蟻酸含有メタノール溶液(内部標準液,I.S.)5μLおよびアセトニトリル0.15mLを添加し、攪拌した後、4℃で3000rpm、10分間遠心分離した。遠心上清100μLを採取し、HPLC移動相(A)を0.1mL加え攪拌、4℃で3000rpm、10分間遠心分離した試料溶液をLC/MS/MS分析に供した。
標準検量線用試料は以下の終濃度となるように調製した;5000、2000、1000、500、100、50および20μg/mL。
HPLCによるクロマト分離には分離カラムとしてCAPCELL PAK C18 MGII(粒子径;5μm、内径;2.0mm,長さ;20mm、Shiseido)を用い、グラジエントモードで実施した。移動相(A)には10mmol/L蟻酸アンモニウム/蟻酸(500:1、v/v)を、移動相(B)にはメタノール/蟻酸(500:1、v/v)を用い、流速0.2mL/min.で送液した。グラジエントプログラムは移動相(B)濃度を0分(分析開始時)から1分まで50%、その後3分までに90%に直線的に上昇させた。その後5分まで90%で送液し、5.1分後に50%まで低下させ、分析終了時間(8分)まで同条件で送液させた。なお、スイッチングバルブを用い、分析時間3.0−6分の溶出液をMS/MSに導入させた。カラム温度は40℃、サンプル注入量は15μLで分析を実施した。
MS/MS分析はイオン化モードとしてターボイオンスプレーを用い、陽イオンモードでのselected reaction monitoring(SRM)によりイオンを検出した。イオンスプレーにはゼロエアーを用い、電圧は4.2kVで実施した。イオンの衝突誘起分解には窒素を用いた。モニターイオンとしてプリカーサーイオン、フラグメントイオンをそれぞれドセタキセル;808.4Da→526.9Da、パクリタキセル(I.S.:内部標準);854.5Da→569.4Daに設定した。
ドセタキセルとI.S.であるパクリタキセルとのピーク面積比を用い、標準検量線の回帰式(1/濃度の重み付け)から各試料のドセタキセル水和物の濃度を算出した。
(2)動物実験および検体調製法
DC−A6およびDC−TRISに含まれるドセタキセル水和物の組織(腫瘍を含む)動態は、ヒト癌細胞ヌードマウス移植系を用いて測定した。500万個のヒト乳癌細胞BT−474(ATCCより購入)を、マトリゲル溶液に懸濁してBALB/c系雌ヌードマウス(6週齢)の胸部皮下に移植した(Proc.NAS,vol.87,6698−6720,1990)。移植直後および移植後7日目に、腫瘍の生着率を高める目的で、ジプロピオン酸エストラジオール(5mg/mL溶液)50μLを、後足に筋肉内投与した。移植後21−28日目まで腫瘍径を測定し、腫瘍サイズを揃えたマウスを一群当たり3匹実験に使用した。
実施例1で得られたDC−A6、実施例1で得られたDC−TRIS、生理食塩水(溶媒対照)、および製剤対照〔タキソテール注(商品名)、ドセタキセル水和物注射液、サノフィ・アベンティスより購入、添付文書に従い調製〕を、各々0.5mg/kgの用量で、マウス尾静脈から投与した。投与後、0.5,1,2,4,8および24時間後にマウスを屠殺し、血液、肝臓、腎臓、筋肉および腫瘍を採取した。血液は採取後、速やかに遠心分離(4℃、10,000 x g)し、血漿成分を分離した。これを血漿試料とした。他臓器は速やかに4倍量(重量比)の生理食塩水を加え、4℃、3分間のポリトロン処理で完全なホモジネートとした。これらを組織抽出液としドセタキセル水和物量の測定に供した。
(3)結果
DC−A6およびDC−TRISに含まれるドセタキセル水和物の含有量を定量した。結果、DC−A6およびDC−TRISに含まれるドセタキセル水和物は、いずれも63μg/mLであった。
次に、DC−A6またはDC−TRISを投薬した動物の、腫瘍を含む組織内のドセタキセル水和物含有量を測定した。DC−A6投薬群およびDC−TRIS投薬群のいずれも0.5時間目以降の腫瘍試料からドセタキセル水和物が検出され、血液中から腫瘍へと速やかに移行することが明らかとなった。
これより本発明のリポソームは、優れた標的指向性を有する癌治療用製剤などとして使用することができる。
参考例1 リポソームの調製
リポソームは既報の手法(Yamazaki,N.,Kodama,M.and Gabius,H.−J.(1994)Methods Enzymol.242,56−65)により、改良型コール酸透析法を用いて調製した。すなわち、ジパルミトイルフォスファチジルコリン、コレステロール、ジセチルフォスフェート、ガングリオシド及びジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミンをモル比でそれぞれ35:40:5:15:5の割合の合計脂質量45.6mgにコール酸ナトリウムを46.9mg添加し、クロロホルム/メタノール溶液3mlに溶解した。この溶液を蒸発させ、沈殿物を真空中で乾燥させることによって脂質膜を得た。得られた脂質膜をTAPS緩衝液(pH8.4)3mlに懸濁、超音波処理して、透明なミセル懸濁液を得た。さらに、ミセル懸濁液をPM10膜(Amicon Co.,USA)とPBS緩衝液(pH7.2)を用いた限外濾過にかけ均一リポソーム(平均粒径100nm)10mlを調製した。
参考例2 リポソーム脂質膜面上の親水性化処理
参考例1で調製したリポソーム溶液10mlをXM300膜(Amicon Co.,USA)とCBS緩衝液(pH8.5)を用いた限外濾過にかけ溶液のpHを8.5にした。次に、架橋試薬bis(sulfosuccinimidyl)suberate(BS3;Pierce Co.,USA)10mlを加え、25℃で2時間攪拌した。その後、更に7℃で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミンとBS3との化学結合反応を完結した。そして、このリポソーム液をXM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過にかけた。次に、CBS緩衝液(pH8.5)1mlに溶かしたtris(hydroxymethyl)aminomethane 40mgをリポソーム液10mlに加えて、25℃で2時間攪拌後、7℃で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質に結合したBS3とtris(hydroxymethyl)aminomethaneとの化学結合反応を完結した。これにより、リポソーム膜の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン上にtris(hydroxymethyl)aminomethaneの水酸基が配位して水和親水性化された。
参考例3 リポソーム膜面上へのヒト血清アルブミン(HSA)の結合
既報の手法(Yamazaki,N.,Kodama,M.and Gabius,H.−J.(1994)Methods Enzymol.242,56−65)により、カップリング反応法を用いて行った。すなわち、この反応は2段階化学反応で行い、まずはじめに、参考例2で得られた10mlのリポソーム膜面上に存在するガングリオシドを1mlのTAPS緩衝液(pH8.4)に溶かしたメタ過ヨウ素酸ナトリウム43mgを加えて室温で2時間攪拌して過ヨウ素酸酸化した後、XM300膜とPBS緩衝液(pH8.0)で限外濾過することにより酸化されたリポソーム10mlを得た。このリポソーム液に、20mgのヒト血清アルブミン(HSA)を加えて25℃で2時間攪拌し、次にPBS(pH8.0)に2M NaBH3CN 100μlを加えて10℃で一晩攪拌してリポソーム上のガングリオシドとHSAとのカップリング反応でHSAを結合した。そして、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過をした後、HSA結合リポソーム液10mlを得た。
参考例4 リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上へのアルファ1,2マンノビオース二糖鎖の結合
アルファ1,2マンノビオース二糖鎖(Calbiochem Co.,USA)50μgを0.25gのNH4HCO3を溶かした0.5ml水溶液に加え、37℃で3日間攪拌した後、0.45μmのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してアルファ1,2マンノビオース二糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを得た。次に、参考例3で得たリポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’−dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate)(DTSSP;Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液に上記のアルファ1,2マンノビオース二糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにアルファ1,2マンノビオース二糖鎖の結合を行った。その結果、図1で示されるアルファ1,2マンノビオース二糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム(略称:A2)2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)が得られた。
参考例5 リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上へのアルファ1,3マンノビオース二糖鎖の結合
アルファ1,3マンノビオース二糖鎖(Calbiochem Co.,USA)50μgを0.25gのNH4HCO3を溶かした0.5ml水溶液に加え、37℃で3日間攪拌した後、0.45μmのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してアルファ1,3マンノビオース二糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを得た。次に、参考例3で得たリポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’−dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate)(DTSSP;Pierce CO.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液に上記のアルファ1,3マンノビオース二糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにアルファ1,3マンノビオース二糖鎖の結合を行った。その結果、図2で示されるアルファ1,3マンノビオース二糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム(略称:A3)2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)が得られた。
参考例6 リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上へのアルファ1,4マンノビオース二糖鎖の結合
アルファ1,4マンノビオース二糖鎖(Calbiochem Co.,USA)50μgを0.25gのNH4HCO3を溶かした0.5ml水溶液に加え、37℃で3日間攪拌した後、0.45μmのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してアルファ1,4マンノビオース二糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを得た。次に、参考例3で得たリポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’−dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate)(DTSSP;Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液に上記のアルファ1,4マンノビオース二糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにアルファ1,4マンノビオース二糖鎖の結合を行った。その結果、図3で示されるアルファ1,4マンノビオース二糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム(略称:A4)2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)が得られた。
参考例7 リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上へのアルファ1,6マンノビオース二糖鎖の結合
アルファ1,6マンノビオース二糖鎖(Calbiochem Co.,USA)50μgを0.25gのNH4HCO3を溶かした0.5ml水溶液に加え、37℃で3日間攪拌した後、0.45μmのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してアルファ1,6マンノビオース二糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを得た。次に、参考例3で得たリポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’−dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate)(DTSSP;Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液に上記のアルファ1,6マンノビオース二糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにアルファ1,6マンノビオース二糖鎖の結合を行った。その結果、図4で示されるアルファ1,6マンノビオース二糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム(略称:A6)2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)が得られた。
参考例8 リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上へのアルファ1,3アルファ1,6マンノトリオース三糖鎖の結合
アルファ1,3アルファ1,6マンノトリオース三糖鎖(Calbiochem Co.,USA)50μgを0.25gのNH4HCO3を溶かした0.5ml水溶液に加え、37℃で3日間攪拌した後、0.45μmのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してアルファ1,3アルファ1,6マンノトリオース三糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを得た。次に、参考例3で得たリポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’−dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate)(DTSSP;Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液に上記のアルファ1,3アルファ1,6マンノトリオース三糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにアルファ1,3アルファ1,6マンノトリオース三糖鎖の結合を行った。その結果、図5で示されるアルファ1,3アルファ1,6マンノトリオース三糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム(略称:A36)2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)が得られた。
参考例9 リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上へのオリゴマンノース3五糖鎖の結合
オリゴマンノース3五糖鎖(Calbiochem Co.,USA)50μgを0.25gのNH4HCO3を溶かした0.5ml水溶液に加え、37℃で3日間攪拌した後、0.45μmのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してオリゴマンノース3五糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを得た。次に、参考例3で得たリポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’−dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate)(DTSSP;Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液に上記のオリゴマンノース3五糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにオリゴマンノース3五糖鎖の結合を行った。その結果、図6で示されるオリゴマンノース3五糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム(略称:Man3)2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)が得られた。
参考例10 リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上へのオリゴマンノース4b六糖鎖の結合
オリゴマンノース4b六糖鎖(Calbiochem Co.,USA)50μgを0.25gのNH4HCO3を溶かした0.5ml水溶液に加え、37℃で3日間攪拌した後、0.45μmのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してオリゴマンノース4b六糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを得た。次に、参考例3で得たリポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’−dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate)(DTSSP;Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液に上記のオリゴマンノース4b六糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにオリゴマンノース4b六糖鎖の結合を行った。その結果、図7で示されるオリゴマンノース4b六糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム(略称:Man4b)2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)が得られた。
参考例11 リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上へのオリゴマンノース5七糖鎖の結合
オリゴマンノース5七糖鎖(Calbiochem Co.,USA)50μgを0.25gのNH4HCO3を溶かした0.5ml水溶液に加え、37℃で3日間攪拌した後、0.45μmのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してオリゴマンノース5七糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを得た。次に、参考例3で得たリポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’−dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate)(DTSSP;Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液に上記のオリゴマンノース5七糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにオリゴマンノース5七糖鎖の結合を行った。その結果、図8で示されるオリゴマンノース5七糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム(略称:Man5)2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)が得られた。
参考例12 リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上へのオリゴマンノース6八糖鎖の結合
オリゴマンノース6八糖鎖(Calbiochem Co.,USA)50μgを0.25gのNH4HCO3を溶かした0.5ml水溶液に加え、37℃で3日間攪拌した後、0.45μmのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してオリゴマンノース6八糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを得た。次に、参考例3で得たリポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’−dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate)(DTSSP;Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液に上記のオリゴマンノース6八糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにオリゴマンノース6八糖鎖の結合を行った。その結果、図9で示されるオリゴマンノース6八糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム(略称:Man6)2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)が得られた。
参考例13 リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上へのオリゴマンノース7九糖鎖の結合
オリゴマンノース7九糖鎖(Calbiochem Co.,USA)50μgを0.25gのNH4HCO3を溶かした0.5ml水溶液に加え、37℃で3日間攪拌した後、0.45μmのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してオリゴマンノース7九糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを得た。次に、参考例3で得たリポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’−dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate)(DTSSP;Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液に上記のオリゴマンノース7九糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにオリゴマンノース7九糖鎖の結合を行った。その結果、図10で示されるオリゴマンノース7九糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム(略称:Man7)2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)が得られた。
参考例14 リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上へのオリゴマンノース8十糖鎖の結合
オリゴマンノース8十糖鎖(Calbiochem Co.,USA)50μgを0.25gのNH4HCO3を溶かした0.5ml水溶液に加え、37℃で3日間攪拌した後、0.45μmのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してオリゴマンノース8十糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを得た。次に、参考例3で得たリポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’−dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate)(DTSSP;Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液に上記のオリゴマンノース8十糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにオリゴマンノース8十糖鎖の結合を行った。その結果、図11で示されるオリゴマンノース8十糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム(略称:Man8)2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)が得られた。
参考例15 リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上へのオリゴマンノース9十一糖鎖の結合
オリゴマンノース9十一糖鎖(Calbiochem Co.,USA)50μgを0.25gのNH4HCO3を溶かした0.5ml水溶液に加え、37℃で3日間攪拌した後、0.45μmのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してオリゴマンノース9十一糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを得た。次に、参考例3で得たリポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’−dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate)(DTSSP;Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液に上記のオリゴマンノース9十一糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにオリゴマンノース9十一糖鎖の結合を行った。その結果、図12で示されるオリゴマンノース9十一糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム(略称:Man9)2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)が得られた。
参考例16 リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上へのtris(hydroxymethyl)aminomethaneの結合
比較試料としてのリポソームを調製するために、参考例3で得たリポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’−dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate)(DTSSP;Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液にtris(hydroxymethyl)aminomethane(Wako Co.,Japan)13mgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにtris(hydroxymethyl)aminomethaneの結合を行った。その結果、図31で示されるtris(hydroxymethyl)aminomethaneとヒト血清アルブミンとリポソームとが結合した比較試料としてのリポソーム(略称:TRIS)2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μ、平均粒径100nm)が得られた。
参考例17 リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上の親水性化処理
参考例4〜15において調製された12種類の糖鎖が結合したリポソームについて、それぞれ別々に以下の手順によりリポソーム上のHSA蛋白質表面の水和性化処理を行った。12種の糖鎖結合リポソーム2mlに、別々に、tris(hydroxymethyl)aminomethane 13mgを加えて、25℃で2時間、その後7℃で一晩攪拌した後、XM300膜とPBS緩衝液(pH7.2)で限外濾過し未反応物を除去して、最終産物である水和性化処理された12種類の糖鎖結合リポソーム複合体(略称:A2、A3、A4、A6、A36、Man3、Man4、Man5、Man6、Man7、Man8、Man9)を各2mlを得た。
参考例18 各種の糖鎖結合リポソーム複合体によるレクチン結合活性阻害効果の測定
参考例4〜15および参考例17で調製した12種の糖鎖結合リポソーム複合体のin vitroでのレクチン結合活性は、常法(Yamazaki,N.(1999)Drug Delivery System,14,498−505)に従いレクチン固定化マイクロプレートを用いた阻害実験で測定した。すなわち、レクチン(ConA;R&D Systems Co.,USA)を96穴マイクロプレートに固化定した。このレクチン固定化プレートに、比較リガンドであるビオチン化したフェチュイン0.1μgとともに、濃度の異なる各種の糖鎖結合リポソーム複合体(蛋白質量として、0.01μg、0.04μg、0.11μg、0.33μg、1μg)を加え、4℃で2時間インキュベートした。PBS(pH7.2)で3回洗浄した後、horseradish peroxidase(HRPO)結合ストレプトアビジンを添加し、さらに4℃で1時間インキュベート、PBS(pH7.2)で3回洗浄し、ペルオキシダーゼ基質を添加して室温で静置、405nmの吸光度をマイクロプレートリーダー(Molecular Devices Corp.,USA)で測定した。フェチュインのビオチン化は、sulfo−NHS−biotin reagent(Pierce Co.,USA)処理後、Centricon−30(Amicon Co.,USA)により精製した。HRPO結合ストレプトアビジンは、HRPOの酸化とNaBH3CNを用いた還元アミノ化法によるストレプトアビジンの結合により調製した。この測定結果を表1に示す。
クロラミンT(Wako Pure Chemical Co.,Japan)溶液並びに二亜硫酸ナトリウム溶液をそれぞれ3mg/ml並びに5mg/mlとなるように用時調製して用いた。参考例4から16において調製した12種の糖鎖結合リポソーム並びにtris(hydroxymethyl)aminomethane結合リポソームとを50μlずつ別々にエッペンチューブに入れ、続いて125I−NaI(NEN Life Science Product,Inc.USA)を15μl、クロラミンT溶液を10μl加え反応させた。5分ごとにクロラミンT溶液10μlを加え、この操作を2回繰り返した後15分後に還元剤として二亜硫酸ナトリウム100μl加え、反応を停止させた。次に、Sephadex G−50(Phramacia Biotech.Sweden)カラムクロマト上に乗せ、PBSで溶出、標識体を精製した。最後に、非標識−リポソーム複合体を添加して比活性(4x106Bq/mg protein)を調製して13種類の125I標識リポソーム液を得た。
参考例20 各種の糖鎖結合リポソーム複合体の担癌マウスでの各組織への分布量の測定
Ehrlich ascites tumor(EAT)細胞(約2×107個)を雄性ddYマウス(7週齢)大腿部皮下に移植し、癌組織が0.3〜0.6gに発育(6〜8日後)したものを本実験に用いた。この担癌マウスに参考例19により125I標識した12種の糖鎖並びにtris(hydroxymethyl)aminomethane結合リポソーム複合体0.2mlを蛋白質量として3μg/一匹の割合となるように尾静脈に注入投与し、60分後に組織(血液、肝臓、脾臓、肺、脳、癌組織、癌の周囲の炎症組織、リンパ節)を摘出、各組織の放射能をガンマカウンタ(Aloka ARC 300)で測定した。なお、各組織への放射能分布量は、投与全放射能に対する各組織1g当たりの放射能の割合(%投与量/g組織)で表示した。この結果を図13〜図22に示す。
参考例21 リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上への3’−シアリルラクトース三糖鎖の結合(糖鎖結合量が異なるもの3種類)
3’−シアリルラクトース三糖鎖(Wako Pure Chemical Co.,Japan)(1)50μg、又は、2)200μg、又は、3)1mg)を0.25gのNH4HCO3を溶かした0.5ml水溶液に加え、37℃で3日間攪拌した後、0.45μmのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結して3’−シアリルラクトース三糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを得た。次に、参考例3で得たリポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’−dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate)(DTSSP;Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液に上記の3’−シアリルラクトース三糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPに3’−シアリルラクトース三糖鎖の結合を行った。その結果、糖鎖結合量が異なるもの3種類の図22で示される3’−シアリルラクトース三糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム(略称:1)3SL−1、2)3SL−2,3)3SL−3)各2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)が得られた。
参考例22 リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上への6’−シアリルラクトース三糖鎖の結合(糖鎖結合量が異なるもの3種類)
6’−シアリルラクトース三糖鎖(Wako Pure Chemical Co.,Japan)(1)50μg、又は、2)200μg、又は、3)1mg)を0.25gのNH4HCO3を溶かした0.5ml水溶液に加え、37℃で3日間攪拌した後、0.45μmのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結して6’−シアリルラクトース三糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを得た。次に、参考例3で得たリポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’−dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate)(DTSSP;Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液に上記の6’−シアリルラクトース三糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPに6’−シアリルラクトース三糖鎖の結合を行った。その結果、糖鎖結合量が異なるもの3種類の図23で示される6’−シアリルラクトース三糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム(略称:1)6SL−1、2)6SL−2,3)6SL−3)各2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)が得られた。
参考例23 リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上への3’−シアリルラクトサミン糖鎖の結合(糖鎖結合量が異なるもの3種類)
3’−シアリルラクトサミン糖鎖(Wako Pure Chemical Co.,Japan)(1)50μg、又は、2)200μg、又は、3)1mg)を0.25gのNH4HCO3を溶かした0.5ml水溶液に加え、37℃で3日間攪拌した後、0.45μmのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結して3’−シアリルラクトサミン糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを得た。次に、参考例3で得たリポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’−dithiobis(sulfosuccinimidyl)propionate(DTSSP;Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液に上記の3’−シアリルラクトサミン糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPに3’−シアリルラクトサミン糖鎖の結合を行った。その結果、糖鎖結合量が異なるもの3種類の図24で示される3’−シアリルラクトサミン糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム(略称:1)3SLN−1、2)3SLN−2,3)3SLN−3)各2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)が得られた。
参考例24 リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上への6’−シアリルラクトサミン糖鎖の結合(糖鎖結合量が異なるもの3種類)
6’−シアリルラクトサミン糖鎖(Wako Pure Chemical Co.,Japan)(1)50μg、又は、2)200μg、又は、3)1mg)を0.25gのNH4HCO3を溶かした0.5ml水溶液に加え、37℃で3日間攪拌した後、0.45μmのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結して6’−シアリルラクトサミン糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを得た。次に、参考例3で得たリポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’−dithiobis(sulfosuccinimidyl)propionate(DTSSP;Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液に上記の6’−シアリルラクトサミン糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPに6’−シアリルラクトサミン糖鎖の結合を行った。その結果、糖鎖結合量が異なるもの3種類の図25で示される6’−シアリルラクトサミン糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム(略称:1)6SLN−1、2)6SLN−2,3)6SLN−3)各2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)が得られた。
参考例25 リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上の親水性化処理
参考例21〜24の手段により調製された各12種類の糖鎖が結合したリポソームについて、それぞれ別々に以下の手順によりリポソーム上のHSA蛋白質表面の親水性化処理を行った。12種の糖鎖結合リポソーム2mlに、別々に、tris(hydroxymethyl)aminomethane 13mgを加えて、25℃で2時間、その後7℃で一晩攪拌した後、XM300膜とPBS緩衝液(pH7.2)で限外濾過し未反応物を除去して、最終産物である親水性化処理された12種類の糖鎖結合リポソーム複合体(略称:3SL−2、3SL−2、3SL−3、6SL−1、6SL−2、6SL−3、3SLN−1、3SLN−2、3SLN−3、6SLN−1、6SLN−2、6SLN−3)各2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)を得た。
参考例26 各種の糖鎖結合リポソーム複合体によるレクチン結合活性阻害効果の測定
参考例21〜24および参考例16の手段により調製した各12種の糖鎖結合リポソーム複合体のin vitroでのレクチン結合活性は、常法(Yamazaki,N.(1999)Drug Delivery System,14,498−505)に従いレクチン固定化マイクロプレートを用いた阻害実験で測定した。すなわち、レクチン(E−selectin;R&D Systems Co.,USA)を96穴マイクロプレートに固化定した。このレクチン固定化プレートに、比較リガンドであるビオチン化したフコシル化フェチュイン0.1μgとともに、濃度の異なる各種の糖鎖結合リポソーム複合体(蛋白質量として、0.01μg、0.04μg、0.11μg、0.33μg、1μg)を加え、4℃で2時間インキュベートした。PBS(pH7.2)で3回洗浄した後、horseradish peroxidase(HRPO)結合ストレプトアビジンを添加し、さらに4℃で1時間インキュベート、PBS(pH7.2)で3回洗浄し、ペルオキシダーゼ基質を添加して室温で静置、405nmの吸光度をマイクロプレートリーダー(Molecular Devices Corp.,USA)で測定した。フコシル化フェチュインのビオチン化は、sulfo−NHS−biotin reagent(Pierce Co.,USA)処理後、Centricon−30(Amicon Co.,USA)により精製した。HRPO結合ストレプトアビジンは、HRPOの酸化とNaBH3CNを用いた還元アミノ化法によるストレプトアビジンの結合により調製した。この測定結果を表2に示す。
クロラミンT(Wako Pure Chemical Co.,Japan)溶液並びに二亜硫酸ナトリウム溶液をそれぞれ3mg/ml並びに5mg/mlとなるように用時調製して用いた。参考例21から24および参考例16により調製した13種の糖鎖結合リポソーム並びにtris(hydroxymethyl)aminomethane結合リポソームとを50μlずつ別々にエッペンチューブに入れ、続いて125I−NaI(NEN Life Science Product,Inc.USA)を15μl、クロラミンT溶液を10μl加え反応させた。5分ごとにクロラミンT溶液10μlを加え、この操作を2回繰り返した後15分後に還元剤として二亜硫酸ナトリウム100μl加え、反応を停止させた。次に、Sephadex G−50(Phramacia Biotech.Sweden)カラムクロマト上に乗せ、PBSで溶出、標識体を精製した。最後に、非標識−リポソーム複合体を添加して比活性(4x106Bq/mg protein)を調製して13種類の125I標識リポソーム液を得た。
参考例28 各種の糖鎖結合リポソーム複合体のマウスでの腸管から血中への移行量の測定
一昼夜水分以外絶食した雄性ddYマウス(7週齢)に、参考例27により125I標識された13種の糖鎖結合並びにtris(hydroxymethyl)aminomethane結合リポソーム複合体0.2mlを蛋白質量として3μg/一匹の割合になるように、マウス用経口ゾンデで腸管内に強制投与した後、10分後にネンブタール麻酔下で下大動脈より血液1mlを採血した。そして、血中の125I放射能をガンマーカウンター(Alola ARC300)で測定した。さらに、各種のリポソーム複合体の生体内安定性を調べる目的で、各血液の血清をSephadex G−50で再クロマトしたが、いずれも大半の放射能が高分子量のボイドフラクションにみられ、各種のリポソーム複合体は生体内においても安定性を有していた。なお、腸管から血中への放射能移行量は、投与全放射能に対する血液1ml当たりの放射能の割合(%投与量/ml血液)で表示した。この結果を図27から図31に示す。
実施例1
(1)ドセタキセル水和物封入リポソームの調製
コール酸透析法を用いてドセタキセル水和物封入リポソームを調製した。すなわち、ジパルミトイルフォスファチジルコリン、コレステロール、ジセチルフォスフェート、ガングリオシド及びジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミンをモル比でそれぞれ35:40:5:15:5の割合で合計脂質量45.6mgになるように混合し、コール酸ナトリウム46.9mgを添加し、クロロホルム/メタノール溶液3mlに溶解した。この溶液を蒸発させ、沈殿物を真空中で乾燥させることによって脂質膜を得た。得られた脂質膜をN−トリス(ヒドロキシメチル)メチル−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝生理食塩液(TAPS,pH8.4)8mlに懸濁、超音波処理し、透明なミセル懸濁液8mlを得た。このミセル懸濁液にPBS緩衝液(pH7.2)で20mg/2mlになるよう完全に溶解したドセタキセル水和物を攪拌しながらゆっくりと滴下して均一に混合した後、このドセタキセル水和物入りミセル懸濁液をPM10膜(AmiconCo.,USA)とPBS緩衝生理食塩液(pH7.2)を用いた限外濾過にかけ均一なドセタキセル水和物封入リポソーム粒子懸濁液10ml(以下、DC−1液と略す)を調製した。
(2)抗癌剤ドセタキセル封入リポソーム脂質膜面上の親水性化処理
DC−1液10mlをXM300膜(Amicon Co.,USA)と炭酸水素ナトリウム緩衝生理食塩液(CBS,pH8.5)を用いた限外濾過にかけ溶液のpHを8.5にした。次に、架橋試薬bis(sulfosuccinimidyl)suberate(BS3;Pierce Co.,USA)10mgを加え、25℃で2時間攪拌した。その後、更に7℃で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミンとBS3との化学結合反応を完結した。そして、このリポソーム液をXM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過にかけた。次に、CBS緩衝液(pH8.5)1mlに溶かしたtris(hydroxymethyl)aminomethane 40mgをリポソーム液10mlに加えて、25℃で2時間攪拌後、7℃で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質に結合したBS3とtris(hydroxymethyl)aminomethaneとの化学結合反応を完結した。これにより、ドセタキセル水和物封入リポソーム膜の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン上にtris(hydroxymethyl)aminomethaneの水酸基が配位して水和親水性化された。以下、これをDC−2液とよぶ。
(3)ドセタキセル水和物封入リポソーム膜面上へのヒト血清アルブミン
(HSA)の結合
DC−2液に、Yamazaki,N.,Kodama,M.and Gabius,H.−J.(1994)Methods Enzymol.242,56−65記載の方法に従いカップリング反応法を用い、ヒト血清アルブミン(HSA)を結合した。すなわち、この反応は2段階化学反応で行い、まずDC−2液10mlのリポソーム膜面上に存在するガングリオシドを1mlのTAPS緩衝液(pH8.4)に溶かしたメタ過ヨウ素酸ナトリウム43mgを加えて室温で2時間攪拌して過ヨウ素酸酸化した後、XM300膜とPBS緩衝液(pH8.0)で限外濾過することにより酸化されたリポソーム10mlを得た。このリポソーム液に、20mgのヒト血清アルブミン(HSA)を加えて25℃で2時間攪拌し、次にPBS(pH8.0)に2M NaBH3CN 100μlを加えて10℃で一晩攪拌してリポソーム上のガングリオシドとHSAとのカップリング反応でHSAを結合した。次に、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過をした後、HSA結合ドセタキセル水和物封入リポソーム液10ml(以下、DC−3液と略す)を得た。
(4)ドセタキセル水和物封入リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン
(HSA)上へのアルファ1,6マンノビオース二糖鎖の結合とリンカー蛋白質
(HSA)の親水性化処理
アルファ1,6マンノビオース二糖鎖(Calbiochem Co.,USA)150μgを0.25gのNH4HCO3を溶かした0.5ml水溶液に加え、37℃で3日間攪拌した後、0.45μmのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してアルファ1,6マンノビオース二糖鎖のグリコシルアミン化合物150μgを得た。次にDC−3液10mlに架橋試薬3,3’−dithiobis(sulfosuccinimidyl)propionate(DTSSP;Pierce Co.,USA)10mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム10mlを得た。次に、このリポソーム液に上記のアルファ1,6マンノビオース二糖鎖のグリコシルアミン化合物150μgを加えて、25℃で2時間攪拌し、tris(hydroxymethyl)aminomethane(Wako Co.,Japan)120mgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とHEPES緩衝液(pH7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにアルファ1,6マンノビオース二糖鎖の結合と親水性化処理を行った。その結果、アルファ1,6マンノビオース二糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリンカー蛋白質(HSA)の親水性化処理をしたドセタキセル水和物封入リポソーム(以下、DC−A6と略す)10ml(総脂質量20mg、総蛋白量2mg)が得られた。
(5)ドセタキセル水和物封入リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン
(HSA)上へのtris(hydroxymethyl)aminomethaneの結合によるリンカー蛋白質(HSA)の親水性化処理
DC−3液10mlに架橋試薬3,3’−dithiobis(sulfosuccinimidyl)propionate(DTSSP;Pierce Co.,USA)10mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム10mlを得た。次に、このリポソーム液にtris(hydroxymethyl)aminomethane(Wako Co.,Japan)120mgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにtris(hydroxymethyl)aminomethaneの結合を行った。その結果、tris(hydroxymethyl)aminomethaneとヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリンカー蛋白質(HSA)の親水性化処理をした抗癌剤ドセタキセル封入リポソーム(以下、DC−TRISと略す)10ml(総脂質量20mg、総蛋白量2mg)が得られた。
実験例1
(1)化合物定量法
実施例1で得られたDC−A6およびDC−TRISに含まれるドセタキセル水和物量、およびDC−A6およびDC−TRIS投与後の動物組織に含まれるドセタキセル水和物量をAnal.Chem.2005年,77巻,4677−4683頁記載の方法に従い、以下のように測定した。
HPLCシステムはLC−10ADvpシステム(島津製作所)を、MS/MSシステムはAPI4000(AB/MDS SCIEX)を使用した。
無投与群の血漿(コントロール)50μLにドセタキセル水和物希釈標準5μLおよび内部標準液5μLを加えて同様に処理した試料を標準検量線用試料とした。
DC−A6、DC−TRIS、血漿試料、組織抽出液または標準検量線用試料50μLに0.2%蟻酸含有メタノール5μL、パクリタキセルの0.2%蟻酸含有メタノール溶液(内部標準液,I.S.)5μLおよびアセトニトリル0.15mLを添加し、攪拌した後、4℃で3000rpm、10分間遠心分離した。遠心上清100μLを採取し、HPLC移動相(A)を0.1mL加え攪拌、4℃で3000rpm、10分間遠心分離した試料溶液をLC/MS/MS分析に供した。
標準検量線用試料は以下の終濃度となるように調製した;5000、2000、1000、500、100、50および20μg/mL。
HPLCによるクロマト分離には分離カラムとしてCAPCELL PAK C18 MGII(粒子径;5μm、内径;2.0mm,長さ;20mm、Shiseido)を用い、グラジエントモードで実施した。移動相(A)には10mmol/L蟻酸アンモニウム/蟻酸(500:1、v/v)を、移動相(B)にはメタノール/蟻酸(500:1、v/v)を用い、流速0.2mL/min.で送液した。グラジエントプログラムは移動相(B)濃度を0分(分析開始時)から1分まで50%、その後3分までに90%に直線的に上昇させた。その後5分まで90%で送液し、5.1分後に50%まで低下させ、分析終了時間(8分)まで同条件で送液させた。なお、スイッチングバルブを用い、分析時間3.0−6分の溶出液をMS/MSに導入させた。カラム温度は40℃、サンプル注入量は15μLで分析を実施した。
MS/MS分析はイオン化モードとしてターボイオンスプレーを用い、陽イオンモードでのselected reaction monitoring(SRM)によりイオンを検出した。イオンスプレーにはゼロエアーを用い、電圧は4.2kVで実施した。イオンの衝突誘起分解には窒素を用いた。モニターイオンとしてプリカーサーイオン、フラグメントイオンをそれぞれドセタキセル;808.4Da→526.9Da、パクリタキセル(I.S.:内部標準);854.5Da→569.4Daに設定した。
ドセタキセルとI.S.であるパクリタキセルとのピーク面積比を用い、標準検量線の回帰式(1/濃度の重み付け)から各試料のドセタキセル水和物の濃度を算出した。
(2)動物実験および検体調製法
DC−A6およびDC−TRISに含まれるドセタキセル水和物の組織(腫瘍を含む)動態は、ヒト癌細胞ヌードマウス移植系を用いて測定した。500万個のヒト乳癌細胞BT−474(ATCCより購入)を、マトリゲル溶液に懸濁してBALB/c系雌ヌードマウス(6週齢)の胸部皮下に移植した(Proc.NAS,vol.87,6698−6720,1990)。移植直後および移植後7日目に、腫瘍の生着率を高める目的で、ジプロピオン酸エストラジオール(5mg/mL溶液)50μLを、後足に筋肉内投与した。移植後21−28日目まで腫瘍径を測定し、腫瘍サイズを揃えたマウスを一群当たり3匹実験に使用した。
実施例1で得られたDC−A6、実施例1で得られたDC−TRIS、生理食塩水(溶媒対照)、および製剤対照〔タキソテール注(商品名)、ドセタキセル水和物注射液、サノフィ・アベンティスより購入、添付文書に従い調製〕を、各々0.5mg/kgの用量で、マウス尾静脈から投与した。投与後、0.5,1,2,4,8および24時間後にマウスを屠殺し、血液、肝臓、腎臓、筋肉および腫瘍を採取した。血液は採取後、速やかに遠心分離(4℃、10,000 x g)し、血漿成分を分離した。これを血漿試料とした。他臓器は速やかに4倍量(重量比)の生理食塩水を加え、4℃、3分間のポリトロン処理で完全なホモジネートとした。これらを組織抽出液としドセタキセル水和物量の測定に供した。
(3)結果
DC−A6およびDC−TRISに含まれるドセタキセル水和物の含有量を定量した。結果、DC−A6およびDC−TRISに含まれるドセタキセル水和物は、いずれも63μg/mLであった。
次に、DC−A6またはDC−TRISを投薬した動物の、腫瘍を含む組織内のドセタキセル水和物含有量を測定した。DC−A6投薬群およびDC−TRIS投薬群のいずれも0.5時間目以降の腫瘍試料からドセタキセル水和物が検出され、血液中から腫瘍へと速やかに移行することが明らかとなった。
これより本発明のリポソームは、優れた標的指向性を有する癌治療用製剤などとして使用することができる。
アロマターゼ阻害薬、抗アンドロゲン薬、リアーゼ阻害薬、GnRH作動薬、GnRH拮抗薬、血管新生阻害薬、チロシンキナーゼ阻害剤、セリン・スレオニンキナーゼ阻害剤、抗癌活性を有する抗体、アンサマイトシン、カペシタビン、セルモロイキン、ドセタキセル水和物、塩酸ゲムシタビン、オキサリプラチン、プレドニゾロン、テガフール・ウラシル配合剤、ジノスタチンスチラマーおよび三酸化砒素から選ばれる少なくとも一種を含有してなる、糖鎖がリポソーム膜に結合している糖鎖修飾リポソームは、使用する糖鎖の構造と糖鎖結合量により、各標的組織または器官の細胞表面に存在するレクチンまたはレクチン様の糖鎖結合部位を有する蛋白質に対する結合活性が異なるので、血中、肝臓、脾臓、肺、脳、小腸、心臓、胸腺、腎臓、膵臓、筋肉、大腸、骨、骨髄、眼、卵巣、胎盤、前立腺、下垂体、乳腺、血管、皮膚、胆のう、胆管、膀胱、脂肪組織、癌組織、炎症組織、リンパ節などの組織または器官に対して優れた指向性を有し、標的とする組織または器官に対して上記薬剤を効率的に輸送しうる抗癌剤などとして利用することができる。
また、本発明の上記糖鎖修飾リポソームは、使用する糖鎖の構造と糖鎖結合量により腸管吸収性が異なるので、糖鎖の種類毎にリポソーム上の糖鎖結合量を適宜設定することにより腸管吸収性を制御することができ、上記薬剤を腸管経由で生体組織に移行させる製剤などとして利用することができる。
さらに、アロマターゼ阻害薬、抗アンドロゲン薬、リアーゼ阻害薬、GnRH作動薬、GnRH拮抗薬、血管新生阻害薬、チロシンキナーゼ阻害剤、セリン・スレオニンキナーゼ阻害剤、抗癌活性を有する抗体、アンサマイトシン、カペシタビン、セルモロイキン、ドセタキセル水和物、塩酸ゲムシタビン、オキサリプラチン、プレドニゾロン、テガフール・ウラシル配合剤、ジノスタチンスチラマーおよび三酸化砒素から選ばれる少なくとも一種を含有してなるリポソームは、該リポソームに糖鎖が結合していない場合であっても、体内で非常に安定であるため、上記薬剤の体内での半減期が長くなり、血中、肝臓、脾臓、肺、脳、小腸、心臓、胸腺、腎臓、膵臓、筋肉、大腸、骨、骨髄、眼、卵巣、胎盤、前立腺、下垂体、乳腺、血管、皮膚、胆のう、胆管、膀胱、脂肪組織、癌組織、炎症組織、リンパ節などの組織または器官に上記薬剤を効果的に到達させることができる。したがって、本発明のリポソームは、上記の組織または器官に対して上記薬剤を効果的に到達させうる抗癌剤などとして利用することができる。
また、本発明の上記糖鎖修飾リポソームは、使用する糖鎖の構造と糖鎖結合量により腸管吸収性が異なるので、糖鎖の種類毎にリポソーム上の糖鎖結合量を適宜設定することにより腸管吸収性を制御することができ、上記薬剤を腸管経由で生体組織に移行させる製剤などとして利用することができる。
さらに、アロマターゼ阻害薬、抗アンドロゲン薬、リアーゼ阻害薬、GnRH作動薬、GnRH拮抗薬、血管新生阻害薬、チロシンキナーゼ阻害剤、セリン・スレオニンキナーゼ阻害剤、抗癌活性を有する抗体、アンサマイトシン、カペシタビン、セルモロイキン、ドセタキセル水和物、塩酸ゲムシタビン、オキサリプラチン、プレドニゾロン、テガフール・ウラシル配合剤、ジノスタチンスチラマーおよび三酸化砒素から選ばれる少なくとも一種を含有してなるリポソームは、該リポソームに糖鎖が結合していない場合であっても、体内で非常に安定であるため、上記薬剤の体内での半減期が長くなり、血中、肝臓、脾臓、肺、脳、小腸、心臓、胸腺、腎臓、膵臓、筋肉、大腸、骨、骨髄、眼、卵巣、胎盤、前立腺、下垂体、乳腺、血管、皮膚、胆のう、胆管、膀胱、脂肪組織、癌組織、炎症組織、リンパ節などの組織または器官に上記薬剤を効果的に到達させることができる。したがって、本発明のリポソームは、上記の組織または器官に対して上記薬剤を効果的に到達させうる抗癌剤などとして利用することができる。
Claims (54)
- アロマターゼ阻害薬、抗アンドロゲン薬、リアーゼ阻害薬、GnRH作動薬、GnRH拮抗薬、血管新生阻害薬、チロシンキナーゼ阻害剤、セリン・スレオニンキナーゼ阻害剤、抗癌活性を有する抗体、アンサマイトシン、カペシタビン、セルモロイキン、ドセタキセル水和物、塩酸ゲムシタビン、オキサリプラチン、プレドニゾロン、テガフール・ウラシル配合剤、ジノスタチンスチラマーおよび三酸化砒素から選ばれる少なくとも一種を含有してなる、糖鎖がリポソーム膜に結合している糖鎖修飾リポソーム。
- リポソームの構成脂質が、フォスファチジルコリン類(モル比0〜70%)フォスファチジルエタノールアミン類(モル比0〜30%)、フォスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩類およびジセチルリン酸類からなる群から選択される一種以上の脂質(モル比0〜30%)、ガングリオシド類、糖脂質類、フォスファチジルグリセロール類およびスフィンゴミエリン類からなる群から選択される一種以上の脂質(モル比0〜40%)、ならびにコレステロール類(モル比0〜70%)を含む、請求項1記載の糖鎖修飾リポソーム。
- ガングリオシド類、糖脂質類、フォスファチジルグリセロール類、スフィンゴミエリン類およびコレステロール類からなる群から選択される少なくとも一種の脂質がリポソーム表面上で集合しラフトを形成している請求項2記載の糖鎖修飾リポソーム。
- 糖鎖の種類および密度が制御されて結合されている、請求項1から3のいずれか1項に記載の糖鎖修飾リポソーム。
- リポソームの粒径が30〜500nmである、請求項1から4のいずれか1項に記載の糖鎖修飾リポソーム。
- リポソームの粒径が50〜350nmである、請求項5記載の糖鎖修飾リポソーム。
- リポソームのゼータ電位が−50〜10mVである、請求項1から6のいずれか1項に記載の糖鎖修飾リポソーム。
- リポソームのゼータ電位が−40〜0mVである、請求項7記載の糖鎖修飾リポソーム。
- リポソームのゼータ電位が−30〜−10mVである、請求項8記載の糖鎖修飾リポソーム。
- 糖鎖がリンカー蛋白質を介してリポソーム膜に結合されている、請求項1から9のいずれか1項に記載の糖鎖修飾リポソーム。
- リンカー蛋白質が生体由来蛋白質である請求項10記載の糖鎖修飾リポソーム。
- リンカー蛋白質がヒト由来蛋白質である請求項11記載の糖鎖修飾リポソーム。
- リンカー蛋白質がヒト由来血清蛋白質である請求項12記載の糖鎖修飾リポソーム。
- リンカー蛋白質がヒト血清アルブミンまたはウシ血清アルブミンである請求項11記載の糖鎖修飾リポソーム。
- リンカー蛋白質がリポソーム表面上に形成されているガングリオシド類、糖脂質類、フォスファチジルグリセロール類、スフィンゴミエリン類およびコレステロール類からなる群から選択される少なくとも一種の脂質からなるラフト上に結合している請求項1から14のいずれか1項に記載の糖鎖修飾リポソーム。
- リポソーム膜および/またはリンカー蛋白質に親水性化合物が結合することにより親水性化されている、請求項1から15のいずれか1項に記載の糖鎖修飾リポソーム。
- 親水性化合物が低分子化合物である、請求項16記載の糖鎖修飾リポソーム。
- 親水性化合物が糖鎖に対する立体障害となりにくく標的細胞膜面上のレクチンによる糖鎖分子認識反応の進行を妨げない、請求項16または17記載の糖鎖修飾リポソーム。
- 親水性化合物が水酸基を有する請求項16から18のいずれか1項に記載の糖鎖修飾リポソーム。
- 親水性化合物がアミノアルコール類である請求項16から19のいずれか1項に記載の糖鎖修飾リポソーム。
- 親水性化合物がリポソーム膜表面に直接結合している請求項16から20のいずれか1項に記載の糖鎖修飾リポソーム。
- 親水性化合物により親水性化され、該親水性化合物が、一般式(1)
X−R1(R2OH)n 式(1)
で表される請求項16記載の糖鎖修飾リポソームであって、R1は、C1からC40の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、R2は存在しないかもしくはC1からC40の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Xはリポソーム脂質またはリンカー蛋白質と直接または架橋用の二価試薬と結合する反応性官能基を示し、nは自然数を示す、糖鎖修飾リポソーム。 - 親水性化合物により親水性化され、該親水性化合物が、一般式(2)
H2N−R3−(R4OH)n 式(2)
で示される請求項16記載の糖鎖修飾リポソームであって、R3は、C1からC40の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、R4は存在しないかもしくはC1からC40の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、nは自然数を示す、糖鎖修飾リポソーム。 - 親水性化合物により親水性化され、該親水性化合物が、一般式(3)
H2N−R5(OH)n 式(3)
で示される請求項16記載の糖鎖修飾リポソームであって、R5は、C1からC40の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、nは自然数を示す、糖鎖修飾リポソーム。 - リポソーム膜および/またはリンカー蛋白質にトリス(ヒドロキシアルキル)アミノアルカンである親水性化合物を共有結合により結合させることによりリポソーム膜および/またはリンカー蛋白質が親水性化されている、請求項16記載の糖鎖修飾リポソーム。
- リポソーム膜および/またはリンカー蛋白質にトリス(ヒドロキシメチル)アミノエタン、トリス(ヒドロキシエチル)アミノエタン、トリス(ヒドロキシプロピル)アミノエタン、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、トリス(ヒドロキシエチル)アミノメタン、トリス(ヒドロキシプロピル)アミノメタン、トリス(ヒドロキシメチル)アミノプロパン、トリス(ヒドロキシエチル)アミノプロパン、トリス(ヒドロキシプロピル)アミノプロパンからなる群から選択される親水性化合物を共有結合により結合させることによりリポソーム膜および/またはリンカー蛋白質が親水性化されている、請求項25記載の糖鎖修飾リポソーム。
- 糖鎖修飾リポソームが、各組織の細胞膜面上に存在するレセプターとしてのセレクチン、DC−SIGN、DC−SGNR、コレクチンおよびマンノース結合レクチンを含むC−タイプレクチン、シグレックを含むIタイプレクチン、マンノース−6−リン酸受容体を含むPタイプレクチン、Rタイプレクチン、Lタイプレクチン、Mタイプレクチン、ガレクチンからなる群から選択されるレクチンを標的とする請求項1から26のいずれか1項に記載の糖鎖修飾リポソーム。
- 糖鎖修飾リポソームがE−セレクチン、P−セレクチンおよびL−セレクチンからなる群から選択されるセレクチンを標的とする請求項27記載の糖鎖修飾リポソーム。
- 糖鎖の結合密度が、リンカー蛋白質を用いる場合は、リポソーム1粒子当り1〜30000個であり、リンカー蛋白質を用いない場合は、リポソーム1粒子当り1〜500000個である、請求項1から28のいずれか1項に記載の糖鎖修飾リポソーム。
- リンカー蛋白質を含み、糖鎖の結合密度が前記リンカー蛋白質1分子当り1〜60個である、請求項1から28のいずれか1項に記載の糖鎖修飾リポソーム。
- リポソームが腸管吸収機能を有するものである請求項1から30のいずれか1項に記載の糖鎖修飾リポソーム。
- 血中、血液細胞、肝臓、脾臓、肺、脳、小腸、心臓、胸腺、腎臓、膵臓、筋肉、大腸、骨、骨髄、眼、卵巣、胎盤、前立腺、下垂体、乳腺、血管、皮膚、胆のう、胆管、膀胱、脂肪組織、癌組織、炎症組織およびリンパ節からなる群から選択される組織または器官に指向性の高い、請求項1から31のいずれか1項に記載の糖鎖修飾リポソーム。
- 糖鎖が、アルファ1,2マンノビオース二糖鎖、アルファ1,3マンノビオース二糖鎖、アルファ1,4マンノビオース二糖鎖、アルファ1,6マンノビオース二糖鎖、アルファ1,3アルファ1,6マンノトリオース三糖鎖、オリゴマンノース3五糖鎖、オリゴマンノース4b六糖鎖、オリゴマンノース5七糖鎖、オリゴマンノース6八糖鎖、オリゴマンノース7九糖鎖、オリゴマンノース8十糖鎖、オリゴマンノース9十一糖鎖、3’−シアリルラクトース三糖鎖、6’−シアリルラクトース三糖鎖、3’−シアリルラクトサミン三糖鎖、6’−シアリルラクトサミン三糖鎖、ルイスX型三糖鎖、シアリルルイスX型四糖鎖、ラクトース二糖鎖、2’−フコシルラクトース三糖鎖、ジフコシルラクトース四糖鎖および3−フコシルラクトース三糖鎖からなる群から選択される、請求項1から32のいずれか1項に記載の糖鎖修飾リポソーム。
- 請求項1から33のいずれか1項に記載のリポソームを含有してなる、リポソーム製剤。
- 経口投与製剤である、請求項34記載のリポソーム製剤。
- 非経口投与製剤である、請求項34記載のリポソーム製剤。
- アロマターゼ阻害薬、抗アンドロゲン薬、リアーゼ阻害薬、GnRH作動薬、GnRH拮抗薬、血管新生阻害薬、チロシンキナーゼ阻害剤、セリン・スレオニンキナーゼ阻害剤、抗癌活性を有する抗体、アンサマイトシン、カペシタビン、セルモロイキン、ドセタキセル水和物、塩酸ゲムシタビン、オキサリプラチン、プレドニゾロン、テガフール・ウラシル配合剤、ジノスタチンスチラマーおよび三酸化砒素から選ばれる少なくとも一種を含有してなる、リポソーム膜が親水性化されており、表面に糖鎖が結合していないリポソーム。
- リポソームの構成脂質が、フォスファチジルコリン類(モル比0〜70%)、フォスファチジルエタノールアミン類(モル比0〜30%)、フォスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩類およびジセチルリン酸類からなる群から選択される1種以上の脂質(モル比0〜30%)、ガングリオシド類、糖脂質類、フォスファチジルグリセロール類およびスフィンゴミエリン類からなる群から選択される1種以上の脂質(モル比0〜40%)、ならびにコレステロール類(モル比0〜70%)を含む、請求項37記載のリポソーム。
- さらに、蛋白質を含む請求項37または38記載のリポソーム。
- リポソーム膜および/またはリンカー蛋白質に親水性化合物が結合することにより親水性化されている、請求項37から39のいずれか1項に記載のリポソーム。
- 親水性化合物が低分子物質である、請求項40記載のリポソーム。
- 親水性化合物が糖鎖に対する立体障害となりにくく標的細胞膜面上のレクチンによる糖鎖分子認識反応の進行を妨げない、請求項40または41記載のリポソーム。
- 親水性化合物が水酸基を有する請求項40から42のいずれか1項に記載のリポソーム。
- 親水性化合物がアミノアルコール類である請求項40から43のいずれか1項に記載のリポソーム。
- 親水性化合物がリポソーム膜表面に直接結合している請求項40から44のいずれか1項に記載のリポソーム。
- 低分子の親水性化合物が少なくとも1つの水酸基を有する化合物である、請求項40記載のリポソーム。
- 親水性化合物が、一般式(1)
X−R1(R2OH)n 式(1)
で表される請求項40記載のリポソームであって、R1は、C1からC40の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、R2は存在しないかもしくはC1からC40の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Xはリポソーム脂質またはリンカー蛋白質と直接または架橋用の二価試薬と結合する反応性官能基を示し、nは自然数を示す、リポソーム。 - 親水性化合物が、一般式(2)
H2N−R3−(R4OH)n 式(2)
で示される請求項40記載のリポソームであって、R3は、C1からC40の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、R4は存在しないかもしくはC1からC40の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、nは自然数を示す、リポソーム。 - 親水性化合物が、一般式(3)
H2N−R5(OH)n 式(3)
で示される請求項40記載のリポソームであって、R5は、C1からC40の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、nは自然数を示す、リポソーム。 - リポソーム膜および/またはリンカー蛋白質にトリス(ヒドロキシアルキル)アミノアルカンである親水性化合物を共有結合により結合させることによりリポソーム膜および/またはリンカー蛋白質が親水性化されている、請求項40記載のリポソーム。
- リポソーム膜および/またはリンカー蛋白質にトリス(ヒドロキシメチル)アミノエタン、トリス(ヒドロキシエチル)アミノエタン、トリス(ヒドロキシプロピル)アミノエタン、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、トリス(ヒドロキシエチル)アミノメタン、トリス(ヒドロキシプロピル)アミノメタン、トリス(ヒドロキシメチル)アミノプロパン、トリス(ヒドロキシエチル)アミノプロパン、トリス(ヒドロキシプロピル)アミノプロパンからなる群から選択される親水性化合物を共有結合により結合させることによりリポソーム膜および/またはリンカー蛋白質が親水性化されている、請求項50記載のリポソーム。
- 請求項37から51のいずれか1項に記載のリポソームを含有してなるリポソーム製剤。
- 経口投与製剤である、請求項52記載のリポソームを含有してなるリポソーム製剤。
- 非経口投与製剤である、請求項52記載のリポソームを含有してなるリポソーム製剤。
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