JPWO2007063825A1 - Ｃｄ１６６に対するモノクローナル抗体およびその産生方法 - Google Patents
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Abstract
ＣＤ１６６は腫瘍表面に過剰に発現する免疫グロブリンスーパーファミリーに属する細胞接着分子である。このＣＤ１６６に特異的に吸着するモノクローナル抗体を得ることができれば、腫瘍細胞の増殖抑制、検出、薬品の特異的な供給が可能になる。しかし、哺乳類間では非常に類似しているため、ヒトのＣＤ１６６をマウス等に免疫することでＣＤ１６６に対する抗体を得ることができなかった。鶏由来のＣＤ１６６の精製された蛋白質をマウスの免疫することで、抗体を得ることができた。この抗体は、in vitroでもin viｖoでもヒト、マウスのＣＤ１６６に特異的に吸着し、また腫瘍の増殖を抑制する作用があることをマウスで確認できた。
Description
本発明は、腫瘍細胞上に高率に発現するCD166／ALCAM（Activated Leukocyte Cell Adhesion Molecule：以下「CD166」で統一する。）に特異的に結合するモノクローナル抗体およびその産生方法に関するものである。
癌治療用抗体は、癌細胞に作用し、従来の抗癌剤では難しい治療（「従来の抗癌剤では治療が難しい部位の治療」か、「従来の抗癌剤では治療が困難な癌の治療」か）や治療に伴う副作用の低減につながると期待されている。つまり、癌に特異的な治療用抗体の種類の増加や質の向上が進むほど、癌の治療実績は上がると考えられる。そのためには、癌に特異的に発現する蛋白質を知る必要がある。
その１つとして、従来ヒト上皮細胞接着分子（EpCAM）に特異的に結合するモノクローナル抗体の開示はあった（特許文献１参照）。
EpCAMは、上皮細胞表面の先端に非常に低レベルで発現する細胞接着分子であるが、上皮起源の腫瘍細胞上に高率に発現する。すなわち、EpCAMは腫瘍の特異なマーカーとなりえる。上記のモノクローナル抗体はこのEpCAMと特異的に結合することを利用し、ドラッグデリバリーなどに使おうというものである。
細胞接着分子（Cell
Adhesion Molecule）とは、細胞と細胞間または細胞と細胞骨格の接着を司る分子である。そして、その歴史は１９７６年にEdelmanらが鶏の神経細胞接着分子（Neural
Cell Adhesion Molecule）を研究したことに始まる。
Adhesion Molecule）とは、細胞と細胞間または細胞と細胞骨格の接着を司る分子である。そして、その歴史は１９７６年にEdelmanらが鶏の神経細胞接着分子（Neural
Cell Adhesion Molecule）を研究したことに始まる。
従来の研究では、細胞接着分子は、その大きさから、インテグリン、カドヘリン、セレクチン、免疫グロブリンスーパーファミリー（IgSF）の４つに分類されている。
この細胞接着分子は癌細胞に特異的に発現する分子が多く、最近研究がすすんでいる。その中で注目されている分子にＣＤ１６６がある。
CD１６６は免疫グロブリンスーパーファミリーに属する細胞接着分子である。この分子は、神経系の発生に重要な働きをするが、ある種の癌細胞にも過剰発現する。特にこの分子は、がん細胞の悪性化や転移を促進すると考えられている（非特許文献１乃至３）。
そこで、CD166に対するモノクローナル抗体があれば、転移抑制、ドラッグデリバリーシステムとして有用であると考えられる。本発明者はすでにＣＤ１６６に着目し、抗ＣＤ１６６ポリクローナル抗体や抗ＣＤ１６６モノクローナル抗体を作成しＣＤ１６６の検出を行っていた（特許文献２参照）。
特表２００４−５３３２４８号公報
特開２００５−１２７７５４号公報
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８１，２２１３−２２２０，（１９９５）
Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ，１５２，８０５−８１３，（１９９８）
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｕｍｍｕｎ．，２６７，８７０−８７４（２０００）
癌細胞はアポトーシスをせずに生き続けるという特徴と共に、細胞の接触阻止を乗り越えて増幅するという特徴を有する。なんらかの方法で、この特徴を低減させることができれば、癌細胞の増殖を抑制することができる。
接触阻止を克服して増殖するという特徴は、癌細胞の表面に発現する接着分子に原因がある点は予想されていた。免疫グロブリンスーパーファミリーに属するCD166は、癌細胞に過剰に発現するために、接触阻止に関係する蛋白質である可能性は高いと考えられていた。
従って、CD166に特異的に吸着する抗体があれば、癌細胞を検出し、薬をデリバリーし、増殖を抑制できる可能性がある。そして、本発明者は上記特許文献２で示すように、ＣＤ１６６蛋白質と結合するモノクローナル抗体の作成に成功はしていたが、その抗体が認識するアミノ酸配列を特定するには至らなかった。さらに、発明者は、そのモノクローナル抗体が癌細胞の増殖作用を抑制する効果までは確認できていなかった。
また、CD166の抗体（モノクローナル抗体）を得るには、以下のような課題があった。通常モノクローナル抗体の産生は、抗原をマウスに投与し、マウス体内で産生された抗体を不死化したハイブリドーマを作成することで得る。
しかし、哺乳類のCD166は類似性が高いので、ヒトのCD166蛋白質に特異的に吸着し、さらに細胞接着活性を抑制しうるモノクローナル抗体は、マウスの体内で容易に産生されない。
つまり上記のように以前作成した抗ＣＤ１６６抗体は、特異的な吸着の度合いが十分でないことが考えられた。
つまり上記のように以前作成した抗ＣＤ１６６抗体は、特異的な吸着の度合いが十分でないことが考えられた。
本発明は、かかる課題を解決するためになされたものであり、精製した鶏のCD166蛋白質をマウスに免疫することにより、より強く多くの動物種と交叉するモノクローナル抗体を作成した。
より具体的に、CD166は、Ｉｇドメインと呼ばれるジスフィド結合を有するアミノ酸配列のループが５つ有する。このドメインの中で糖鎖が結合する部分（アミノ酸配列でNATつまり、アスパラギン、アラニン、スレオニンの配列の部分）を含むアミノ酸配列を人工的に精製し、マウスに免疫を行う。
ここで、精製したアミノ酸配列は鶏由来のものを使う。このようにすることによって、マウスにとっては異物と認識しやすくなり、特異的な抗体を産生することになる。この抗体を用いてCD166に特異的に吸着するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。特に本発明では、Ｎ端末から４番目の免疫グロブリン様ループにある、糖鎖結合部分を狙ったモノクローナル抗体を得ることができた。
この抗体は癌細胞膜上のCD166に結合することにより、培養条件下での細胞間接着能を阻害し、さらには癌細胞の運動性を抑制した。実験的に癌罹マウス体中にこの抗体を投与すると、その後の癌の増殖抑制および転移が抑制された。このことより、本願発明の抗ＣＤ１６６モノクローナル抗体は、新規の癌治療抗体として、利用できる。
さらに、この抗体は患者体内において癌細胞と選択的に結合した。このことより、この抗体に抗癌剤や放射性同位元素を標識し投与すれば癌存在部に効率よく運搬され、新規のデリバリーシステムが開発されることが期待できる。このことは、癌治療効果の増大が期待できることを意味する。
ＣＤ１６６のアミノ酸配列および遺伝子配列は既に明らかになっている。例えばヒト由来のＣＤ１６６のアミノ酸配列およびその遺伝子配列は、データベース（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＫ／ＧｅｎＢａｎｋ ｄａｔａｂａｓｅｓ）にアクセッション番号Ｌ３８６０８（およびＮＭ＿００１６２７）として登録されている。
ここでは、上記に説明したように鶏のＣＤ１６６を用いる。鶏のＣＤ１６６のアミノ酸配列および遺伝子配列も、すでに明らかにされている。抗原となるアミノ酸配列は遺伝子配列から組み換え体によって得た。この抗原となるアミノ酸配列は、鶏のＣＤ１６６のアミノ酸配列から「ＮＡＴ」の部分を調べ、それを含むような配列を選び決定した。
選んだ配列に対応する遺伝子配列から常法により組み換え体によって、所望のアミノ酸配列分子を得る。これを抗原としてマウスに免疫し、抗体を産生させる。マウスの脾臓から得た細胞をハイブリドーマ化してモノクローナル抗体を得る。これにはハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ． ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ２５６，４９５−４９７（１９７５））を用いればよいが、これに限定されるものではない。
本発明の実施例を以下に説明する。しかし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、本明細書で使用するアミノ酸配列は、当該分野における慣用略語に基づくものであり、その例を以下に記載する。また、アミノ酸に関し光学異性体がある場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
アミノ酸の略語
３文字 ： １文字 ： 日本名
Ｇｌｙ ： Ｇ ： グリシン
Ａｌａ ： Ａ ： アラニン
Ｖａｌ ： Ｖ ： バリン
Ｌｅｕ ： Ｌ ： ロイシン
Ｉｌｅ ： Ｉ ： イソロイシン
Ｓｅｒ ： Ｓ ： セリン
Ｔｈｒ ： Ｔ ： スレオニン
Ｃｙｓ ： Ｃ ： システイン
Ｍｅｔ ： Ｍ ： メチオニン
Ｇｌｕ ： Ｅ ： グルタミン酸
Ａｓｐ ： Ｄ ： アスパラギン酸
Ｌｙｓ ： Ｋ ： リジン
Ａｒｇ ： Ｒ ： アルギニン
Ｈｉｓ ： Ｈ ： ヒスチジン
Ｐｈｅ ： Ｆ ： フェニルアラニン
Ｔｙｒ ： Ｙ ： チロシン
Ｔｒｐ ： Ｗ ： トリプトファン
Ｐｒｏ ： Ｐ ： プロリン
Ａｓｎ ： Ｎ ： アスパラギン
Ｇｌｎ ： Ｑ ： グルタミン
Ｓｅｃ ： Ｕ ： セレノシステイン
アミノ酸の略語
３文字 ： １文字 ： 日本名
Ｇｌｙ ： Ｇ ： グリシン
Ａｌａ ： Ａ ： アラニン
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Ａｓｎ ： Ｎ ： アスパラギン
Ｇｌｎ ： Ｑ ： グルタミン
Ｓｅｃ ： Ｕ ： セレノシステイン
実施例１：モノクローナル抗体の作製
鶏ＣＤ166（別名ＳＣ1、ＢＥＮ，ＡＬＣＡＭ）蛋白質のＮ末端から第4番目のイムノグロブリン様ループの一部を構成する、下記表１に記載する配列番号１および２のアミノ酸の合成ペプチドを抗原とし、オス6週齢のオスＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫した。
鶏ＣＤ166（別名ＳＣ1、ＢＥＮ，ＡＬＣＡＭ）蛋白質のＮ末端から第4番目のイムノグロブリン様ループの一部を構成する、下記表１に記載する配列番号１および２のアミノ酸の合成ペプチドを抗原とし、オス6週齢のオスＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫した。
初回免疫では、125μｇの合成ペプチドを完全アジュバントに混和させたものを皮内接種した。追加免疫として、初回免疫2週間後に125μｇの合成ペプチドを不完全アジュバントに混和させたものを、2週毎に計3回皮内接種した。
マウスの抗体価の上昇はELISA法でモニターした。そして、抗体価の上昇が見られたマウス個体の脾細胞と、骨髄腫細胞（ＮＳ−１）をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いてケーラーとミルスタインの方法（Nature、256巻、495頁、1975年）により融合させた。
その結果、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を用いた常法のハイブリドーマのスクリーニングと限界希釈法によるクローニングにより、ＣＤ166蛋白質を認識する２種類（ＡおよびＢと命名）の抗体産生ハイブリドーマを得た。以下、抗体産生ハイブリドーマＡの産生する抗体を抗体Ａと、抗体産生ハイブリドーマＢの産生する抗体を抗体Ｂと呼ぶ。
ここでいう抗体Ａとは配列番号１の合成ペプチドを免疫したマウス由来ハイブリドーマＡから産生されるモノクローナル抗体であり、抗体Ｂとは配列番号２の合成ペプチドを免疫したマウス由来ハイブリドーマＢから産生されるモノクローナル抗体である。抗体のサブクラスをしらべた結果、抗体ＡはＩｇＧ1、抗体ＢはＩｇＧ2であることが判明した。
上記2種のハイブリドーマをそれぞれヌードマウスの腹腔内に移植し、約3週間後に腹水を採取した。常法にしたがいIgGに特異的に結合する蛋白質であるプロテインＡにより腹水からＩｇＧを精製した。つまり、得られた2種のハイブリドーマは培養液中にも抗体の分泌が可能であると同時に、マウスにも可移植性であり腹水中にも抗体を分泌することが確認された。
ウエスタンブロット法により、得られたモノクローナル抗体はヒト肺癌細胞、ラット大腸癌、鶏胚子の膜分画より得たＣＤ166蛋白質を認識することが判明した。図１にこの結果を示す。
図１の結果は具体的には以下の手順で得た。ヒト肺癌細胞（A549）、ラット大腸癌細胞、鶏胚子の細胞膜分画由来CD166蛋白質を蒸留水で煮て高次構造をほどいた。それぞれの蛋白質を８％ ＳＤＳ（Sodium Dodecyl Sulfate：ドデシル硫酸ナトリウム）に混ぜて、ＳＤＳを吸着させた。
用意するゲルは、アクリルアミドとN、N’−メチレンビスアクリルアミドの混合溶液をAPS（過硫酸アンモニウム）でラジカル重合させたものである。重合開始剤はTEMED（テトラメチルエチレンジアミン）である。
SDSを吸着させたそれぞれのCD166を、ゲル中で電気泳動させた。以上の手順によって、それぞれのCD166のSDS-PAGE（SDSアクリルアミドゲル電気泳動）の手順は終了する。
次にそのゲル中の電気泳動した蛋白質をPVDF（ポリビリニデンジフルオライド）膜に吸着させた。そして、このPVDF膜を通常のマウスのIgG（免疫グロブリンＧ）と、本願の発明である抗体Aと抗体Bに反応させた。
その後に、HRP(過酸化酵素)標識を施した抗マウスIgG抗体と反応させ、ECL（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）によってX線フィルム上に撮影し、図１を得た。
抗マウスＩｇＧ抗体は、マウス由来のＩｇＧに特異的に吸着する。本発明で得た抗体ＡおよびＢは、上述のようにフローサイトメトリーによりＩｇＧのタイプであることがわかっているので、通常マウスのＩｇＧ、抗体Ａもしくは抗体Ｂがあれば、標識抗体として吸着する。ＨＲＰ標識は、ＥＣＬによって４２８ｎｍの波長で発光するため、Ｘ線写真撮影を行うと、黒線として観測される。すなわち、上記のＰＶＤＦ膜にマウス由来のＩｇＧがあれば、その部分が黒線として観測されることになる。
図１においては、CD166はおよそ１００から１２０ＫＤａ（キロダルトン）の大きさの部分に電気泳動している。ヒト肺癌細胞（図１で「ヒトＣＤ１６６」と記載）、ラット大腸癌細胞（「ラットＣＤ１６６」と記載）、鶏胚子の細胞膜分画由来ＣＤ１６６（「鶏ＣＤ１６６」と記載）のそれぞれは、抗体Ａ（「Ａ」と記載）と抗体Ｂ（「Ｂ」と記載）において、１００から１２０ＫＤａの範囲に黒い線が観測できた。図1の各レーンにおいて、矢印で示す部分が、抗体Ａ、ＢがＣＤ１６６と反応している黒い線である。この結果は、抗体Ａ、Ｂが、ＣＤ１６６と反応していることを示している。つまり、抗体Ａと抗体ＢはＣＤ１６６に吸着していることいえる。
一方、通常マウスのＩｇＧ（「Ｃｏｎｔｒｏｌ ＩｇＧ」と記載）には、黒線がなく、通常のＩｇＧはＣＤ１６６には吸着しないことがわかる。
実施例２
実施例１では、本願発明の抗体ＡおよびＢが、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＤ１６６に特異的に吸着することを確認した。そこで次にｉｎ ｖｉｖｏでの特異的な吸着を確認する。
実施例１では、本願発明の抗体ＡおよびＢが、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＤ１６６に特異的に吸着することを確認した。そこで次にｉｎ ｖｉｖｏでの特異的な吸着を確認する。
ヒト肺癌細胞（Ａ549細胞）１０６個をヌードマウスの頚部皮下に移植し、２１日目に正常マウスＩｇＧ、上記２種の抗ＣＤ１６６モノクローナル抗体（抗体Ａおよび抗体Ｂ）それぞれ１００μｇを尾静脈内投与した。
投与して１２時間後に腫瘍を摘出し凍結切片を作製した。ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体と反応させた結果を図２に示す。図２で、写真中の白いバーは、２０ミクロンの大きさである。ＦＩＴＣ標識抗体は、存在していれば、白く映る。従って、正常マウスＩｇＧは、凍結切片にはほとんど存在していないことがわかる。
一方、抗体ＡおよびＢは、白く映っている部分に存在し、ｉｎ ｖｉｖｏでも腫瘍部分に特異的に吸着することを確認できた。これによって本発明のモノクローナル抗体は、ＤＤＳ（Drug Delivery System）効果を有することも確認できた。
実施例３：抗ＣＤ166モノクローナル抗体の抗腫瘍効果
次に本発明の抗体ＡおよびＢの増殖抑制作用を、確認した。ヒト肺癌細胞（Ａ549細胞）106個をヌードマウスの頚部皮下に移植し、5、10、14日目に正常マウスＩｇＧ、上記2種の抗ＣＤ166モノクローナル抗体（抗体Ａおよび抗体Ｂ）をそれぞれ100μｇを腹腔内に接種した。
次に本発明の抗体ＡおよびＢの増殖抑制作用を、確認した。ヒト肺癌細胞（Ａ549細胞）106個をヌードマウスの頚部皮下に移植し、5、10、14日目に正常マウスＩｇＧ、上記2種の抗ＣＤ166モノクローナル抗体（抗体Ａおよび抗体Ｂ）をそれぞれ100μｇを腹腔内に接種した。
移植３週間目（２１日目）にそれぞれの抗体を接種したマウス群の腫瘍体積を計測した結果を図３に示す。図で（１）の棒は、癌細胞を接種しただけの場合で、正常マウスＩｇＧも、抗体Ａ，Ｂも与えていない場合の結果である。
（２）は、正常マウスＩｇＧを与えた場合の結果で、何も与えなかった場合とほぼ同じ結果である。一方、（３）と（４）はそれぞれ抗体ＡおよびＢを与えたマウス群の結果であるが、（１）や（２）の場合と比較して明らかに有意な差があった。すなわち、本発明の抗体ＡとＢは腫瘍の増殖を抑制する作用を有することを確認した。
また、この結果より、腫瘍細胞の表面に発現しているＣＤ１６６のＮ端末から４番目にあるループドメインの糖鎖結合部分に抗体を吸着させることで、腫瘍細胞の増殖を抑制できることも同時にわかった。
実施例４
本発明の抗体ＡおよびＢは、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ Ｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法にも応用できる。
本発明の抗体ＡおよびＢは、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ Ｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法にも応用できる。
通常使われる９６穴マイクロタイタープレート（ウェル）に本発明の抗体Ａを入れ、４℃で一晩放置することでウェルの内側に抗体Ａを固層化させた。別途、ヒト肺癌細胞A549の膜分画より精製したＣＤ１６６蛋白質をリン酸緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２）で100ｎｇ／１０μｌの濃度にし、この液をリン酸緩衝液で段階希釈（10倍づつの希釈法）により0.001〜100ｎｇ／１０μｌの溶液を用意した。
このＣＤ１６６を含む溶液をそれぞれのウェルに入れ、37℃で１時間インキュベートさせ、抗体と結合させた。その後リン酸緩衝液で各ウェルを3回洗浄した。
リン酸緩衝液で1０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗ＣＤ１６６ウサギポリクローナル抗体を各ウェルに分注し、37℃で１時間インキュベートした。その後リン酸緩衝液で３回洗浄した。以上のようにして、ＥＬＩＳＡ法のサンドイッチ法を行った。
各ウェルの波長４５０ｎｍにおける吸光度を、プレートリーダーにて測定した。ＣＤ１６６の濃度毎に整理したグラフを図４に示す。
図４は縦軸に４５０ｎｍの吸光度を、横軸にＣＤ１６６の濃度（ｎｇ／１０μｌ）を示す。吸光度は基準の光強度Ｉ０に対して、基準強度Ｉ０から透過光強度Ｉを引いたものの割合Ｉ０ ／ （Ｉ０−Ｉ）で示した。
ＣＤ１６６の含有量に応じて吸光度が変わっていることが確認できた。また、検出範囲は、０．０１から１０（ｎｇ／１０μｌ）であった。これによって、本発明の抗体はＥＬＩＳＡ法によるＣＤ１６６の測定にも利用できることを確かめた。なお、抗体Ｂも同様の結果を得られることを確認している。
また、本発明の抗体がＥＬＩＳＡ法で利用できることが確認できたので、本発明による抗体ＡもしくはＢを予め固層化したウェルと、ＨＲＰ標識抗ＣＤ１６６ウサギポリクローナル抗体の組み合わせで、ＥＬＩＳＡ法のキットを構成することができる。また、抗体アフィニティーカラムを作成することもできる。
実施例５
次に実施例４のＥＬＩＳＡ法で血液検査によって癌の進行度の測定ができる点を説明する。ＣＤ１６６は上述のように、癌細胞の表面に多く発現する分子であるが、癌の進行によって血液中のＣＤ１６６の含有量が増加してくる。これをＥＬＩＳＡ法で確認することで、癌の進行度合いを相対的に判断することができる。
次に実施例４のＥＬＩＳＡ法で血液検査によって癌の進行度の測定ができる点を説明する。ＣＤ１６６は上述のように、癌細胞の表面に多く発現する分子であるが、癌の進行によって血液中のＣＤ１６６の含有量が増加してくる。これをＥＬＩＳＡ法で確認することで、癌の進行度合いを相対的に判断することができる。
ヒト肺癌細胞Ａ５４９細胞をヌードマウス（１０匹）の頚部皮下に移植した。その後７日（初期）、１４日（中期）、２１日（末期）に、それぞれの血液を採取した。これらの血液を遠心分離にかけ、血清１００マイクロリットルを得た。この血清を実施例４のＥＬＩＳＡ法でＣＤ１６６の含有量を測定した。
結果を図５に示す。図５において、縦軸はＣＤ１６６の血中濃度（ｎｇ／１０μｌ）を実施例４で得たＣＤ１６６の含有量と吸光度の関係を用いて求めたもので、横軸は癌の進行度を表す。横軸の（１）は正常マウスの血清。（２）は肺癌移植して７日（初期）のマウスの血清、（３）は同１４日、（４）は同２１日のマウスの血清である。
癌の進行によってＣＤ１６６の血中濃度が上昇するのが、本発明の抗体Ａを用いたＥＬＩＳＡ法で確認することができた。これによって血液を用いた癌診断法に用いることができる。
実施例６
本実施例では、ヒトの血液中のＣＤ１６６を測定することで、癌の進行度を測定した。
本実施例では、ヒトの血液中のＣＤ１６６を測定することで、癌の進行度を測定した。
大阪府立大学の倫理委員会により承認されたガイドラインに従ってインフォームドコンセントを得た後、健常人の血清（Ａ）、肺癌Ｉ・ＩＩ期患者の血清（Ｂ）、肺癌ＩＩＩ期患者の血清（Ｃ）、肺癌ＩＶ期患者の血清（Ｄ）、大腸癌末期患者の結成（Ｅ）を用いて、以下の実験を行った。
前記血清（Ａ〜Ｅ）それぞれ５μｌを、実施例４のＥＬＩＳＡ法でＣＤ１６６の含有量を測定した。結果を図６に示す。図６において、縦軸はＣＤ１６６の血中濃度（ｎｇ／μｇ）を実施例４で得たＣＤ１６６の含有量と吸光度の関係を用いて求めたもので、横軸は上記Ａ〜Ｄを示す。
肺癌患者の血清のＣＤ１６６値（Ｂ〜Ｅ）は、健常人のＣＤ１６６値と比べて優位であった（Ｐ＜０．０５（スチューデントｔ−検定））。また、図６から、肺癌では癌の初期段階からすでにＣＤ１６６値が上昇していることがわかる（Ｂ）。一方、大腸癌では末期癌においては、ＣＤ１６６値は上昇していない（Ｅ）。
本実施例より、血液中のＣＤ１６６値の測定は、肺癌の検査方法として利用できることがわかった。
本発明は、医療機関において、腫瘍の治療に貢献できる。外科的なアプローチが困難な深部や細部の腫瘍にも適用できる。また、副作用の低減がはかれるため、癌患者の負担が軽くなる。
抗CD166／ALCAM抗体の投与により、癌の存在部が検出可能となるので、PET法などのような健康診断の一部として応用できる。
Claims (8)
- 細胞接着分子CD166／ALCAMに対し特異的に結合するモノクローナル抗体。
- 配列番号１に示すアミノ酸配列の少なくとも１部に特異的に結合する請求項１記載のモノクローナル抗体。
- 配列番号２に示すアミノ酸配列の少なくとも１部に特異的に結合する請求項１記載のモノクローナル抗体。
- サブクラスが免疫グロブリンＧであることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかの１に記載のモノクローナル抗体。
- 請求項１乃至３のいずれかの１に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
- キジ科動物のＣＤ１６６蛋白質で免疫したマウスから得た抗体をモノクローナル化するモノクローナル抗体の製造方法。
- 請求項１乃至３のモノクローナル抗体を用いたＣＤ１６６の含有量の測定方法。
- 血液中のＣＤ１６６の含有量から癌の進行状態を推定する癌診断方法。
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