JPWO2007058021A1 - 動物モデルとその作製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2005年11月16日付けで出願した特願2005−332113号に基づく優先権を主張する。この文献を本明細書に援用する。
本発明に係る脊椎動物モデルは、移植された細胞を腎被膜下に有する脊椎動物モデルであり、この移植された細胞は、観察マーカーを用いた脊椎動物の非侵襲的観察によって、容易に脊椎動物の細胞から区別され得る。このように、脊椎動物を非侵襲的に観察することによって、移植された細胞を脊椎動物の受容動物と区別できると、脊椎動物が生きた状態のまま、移植された細胞の状態を観察することができるようになる。
次に、本発明による細胞移植を行う部位は、腎臓の被膜下であることが、上述のように観察が容易であることのほか、(1)移植に必要な細胞が少量(106以下)でよい、(2)拒絶反応が起こりにくい、(3)成長因子等が豊富である、などの理由から好適である。腎臓のような動物個体が左右に1対有する臓器を使用することは、同一個体の左右の臓器上の移植部位に対してそれぞれ異なる移植片を移植して比較することにより、移植片の差異に起因した移植成績および治療薬に対する効果の差異を的確に評価できる、という点でも好ましい。
非侵襲的観察が可能な観察マーカーは、移植される細胞が有してもよく、あるいは移植される脊椎動物の細胞が観察マーカーを有していてもよい。後者の例として、身体の細胞にあらかじめ観察マーカーの遺伝子が組み込まれた遺伝子組み換え動物、例えば、発光遺伝子を導入された組み換えマウス、いわゆる「光るマウス」などを、受容動物として使用することが挙げられる。しかし、移植に際して適切な観察マーカーとそれに対応した観察方法を選択できるという点で、移植される細胞に対して非侵襲的観察マーカーを導入することがより好ましい。
さらに、移植される細胞は、供与生物や患者から採取された状態のまま、あるいは前述の観察マーカーの導入が行われた後の状態のままで用いてもよいが、移植に際し、観察マーカーを有する細胞を選別する操作を加えることもでき、この選別を行うことは、移植された細胞を受容動物の細胞から、より厳密に区別することができるようになるため望ましい。この場合、選別のためのマーカーは、前述の観察のためのマーカーと同一でもよいし、異なったマーカーを用いてもよい。そしてこのような選別マーカーとしては、前述した観察のためのマーカーの場合と同様の理由から、発光マーカーや蛍光マーカーのような可視化マーカーの使用が好適である。例えば蛍光マーカーを用いる場合、フロー・サイトメトリー(flow cytometry)が選別のために利用できる。しかしその他の選別マーカーとなり得る物質、例えば表面抗原や磁気ビーズなども、それらを手掛かりにして細胞を生きたまま選別できるような適切な選別方法、例えば細胞パンニング法や磁気分離法などとの組み合わせにおいて使用することができる。
移植される細胞が、ヒトもしくはその他の生物における病気の病変部に由来するものであれば、本発明によりその病気の病態動物モデルを作製することができる。そして作製された動物モデルを継続飼育して移植部位を観察することによって、その病気に由来する病変の変化を非侵襲的に追跡することができる。例えば移植される細胞として、ヒトの子宮内膜に由来する細胞を用いることにより、子宮内膜症の動物モデルが作製できるし、その他の病気、例えば腫瘍に由来する細胞を用いれば、腫瘍動物モデルが作製でき、そのような病気に由来する病変を非侵襲的に容易に観察することが可能となる。
ここで、ヒトの子宮内膜または子宮内膜症病変部から単離された細胞に由来する病変部を腎被膜下に有する、子宮内膜症の病態動物モデルは、マーカーが導入されていなくても、それ自身有効に利用できる。この病態モデルは、周期的な外因性性ステロイドホルモンを投与することにより、単離された子宮内膜細胞から再構築された組織が子宮内膜の月経周期変化に類似した変化を示す、すなわちヒト子宮内膜環境を再現するようになった初めてのモデル動物である。この動物モデルに対しては、外因性性ステロイドホルモンとして例えばエストロゲンやプロゲステロン等を、様々な方法、例えば皮下や腹腔内への注射、食餌投与、徐放剤の皮下移植などの方法で投与することができる。そして、ホルモン投与の調節により前述したような月経周期様のホルモン環境を再現させた、動物モデルの移植部位に対して、例えば組織学的観察のような解析を行えば、子宮内膜症の研究に役立てることができる。さらに、この子宮内膜症モデル動物に対し、例えば、子宮内膜症治療薬候補物質を投与し、病変の改善をもたらすような物質、病変部が退縮するような物質、あるいは、周期的ホルモン投与に抵抗性になり、ホルモンに対して反応を示さなくなるような物質を選択することにより、子宮内膜症治療薬の開発に役立てることができる。
ヒトから単離された子宮内膜組織片を、0.2%(w/v)のコラゲナーゼ(和光純薬、大阪)、0.05%(w/v)のDNaseI(GIBCO、米国カリフォルニア州)を含有するDMEM+培地(1%の抗生物質−抗真菌剤(GIBCO)、10%のウシ胎児血清(BioWest、米国フロリダ州)を含有するダルベッコ変法イーグル培地(DMEM、Sigma-Aldrich、米国ミズーリ州))中に、組織片1gに対して10mlの割合で移し、37℃にて1.5時間振盪して酵素的細胞分散処理を行った。さらに40μm孔径セルストレーナ(BD Biosciences、米国マサチューセッツ州)に細胞を通す機械的分散処理によって単一細胞の状態まで分散させた。
SDEC移植を受けたNOGマウスの一部に対して、さらに、エストロゲン(E2)徐放ペレット(Innovative Research of America、米国フロリダ州)を0錠、1錠もしくは2錠皮下移植することにより、異なる量の女性ホルモンを恒常的に投与して、飼育を継続した。所定の期間経過後に腎臓を摘出し、以下の肉眼所見及び免疫組織学的観察に用いた。
レンチウィルスに由来しVenus(YFP由来のGFP類縁体である蛍光マーカー蛋白質)の遺伝子を有する発現ベクターpCSII-EF-MCS-IRES2-Venus(非特許文献2: Miyoshi, H., Blomer, U., Takahashi, M., Gage, F.H. & Verma, I.M. Development of a self-inactivating lentivirus vector. J Virol. 72, 8150-8157 (1998)を参照)に対して、さらにその制限酵素BamHI切断部位へ、赤色発光性ルシフェラーゼCBR luc(コメツキムシ・ルシフェラーゼ由来の変異体である生物発光マーカー蛋白質)の遺伝子を導入して、マーカー遺伝子発現ベクターを構築した(図4)。
分取した遺伝子導入細胞を、上述の方法と同様にして、卵巣摘出NOGマウスの腎被膜下に移植して、マウスを飼育した。
マーカー遺伝子が導入されたSDECの移植を施したマウスの一部に対して、さらにE2徐放ペレットを0錠、1錠または2錠皮下移植することにより、前述と同様に恒常的ホルモン処理を行った。飼育を継続して、所定期間毎に上記と同様にして移植マウス腹部のBLI観察を実施した(図7a)。得られた生物発光画像のそれぞれに対して、特定領域を定めて発光強度を定量化した。その結果、時間の経過およびE2の投与用量の両方に応じて、病変部からの発光シグナルの強度が漸次増大することが観察された(図7b)。
マーカー遺伝子導入SDECを移植したマウスの一部に対して、E2徐放ペレット1錠の皮下移植により恒常的ホルモン処理を行った。さらにその一部に対して、エストロゲン受容体アンタゴニストであるICI 182,780(Tocris Cookson Inc.、米国ミズーリ州)を100 μg/mlの用量にて皮下注射を毎日実施することにより、抗ホルモン処理を行った。移植後1、2、3ヶ月目に病変部のBLI観察を行った結果、1ヶ月目から2ヶ月目の間にわたって発光シグナルの低下が見られた(図8)。このように、子宮内膜に由来する病変への抗ホルモン剤投与の効果が認められた。
マーカー遺伝子導入SDECを移植したマウスの一部に対して、E2徐放ペレット皮下移植により恒常的ホルモン処理を行った。さらにその一部に対して、前述と同様にしてP4製剤1mg用量の皮下注射による周期的ホルモン処理を行った(図9aに投与スキームの模式図を示す)。BLI観察を行ったところ、P4投与の周期的投与に応じて移植部位からの発光シグナルの増大と減少が観察された(図9bおよびc)。このように、子宮内膜由来の病変は、月経を模したホルモン濃度変化に対して子宮内膜と同様の応答を示したことから、移植マウスモデルを用いて子宮内膜の月経周期が機能的に再現できることが分かった。
以上のように、本発明の動物モデルが、移植された細胞の動態を長期にわたって継続的に観察するのに特に好適であり、例えば子宮内膜由来の細胞移植を行えば、子宮内膜症の病態を再現した動物モデルが作製できることが分かった。さらに、そのような動物モデルを本発明の方法で、生きたまま非侵襲的、継続的かつ定量的に観察することが可能であり、移植された細胞が由来する病気の病因解明や治療薬の開発等のために有効であること、例えば子宮内膜症動物モデルであれば、ホルモンや抗ホルモン剤の投与に応じた病態の変化を追跡できる動物モデルを提供できることが明らかとなった。
Claims (28)
- 移植された細胞を腎被膜下に有する、ヒト以外の脊椎動物モデルであって、
観察マーカーを用いて、前記移植された細胞が、前記脊椎動物の非侵襲的観察によって、前記脊椎動物の細胞から区別され得ることを特徴とする動物モデル。 - 前記移植された細胞の位置及び/または増殖が、前記脊椎動物の非侵襲的観察によって、リアルタイムに判断し得ることを特徴とする請求項1に記載の動物モデル。
- 前記移植された細胞が、分散された細胞であることを特徴とする、請求項1または2に記載の動物モデル。
- 前記移植された細胞が、非侵襲的観察が可能な前記観察マーカーを有することを特徴とする、請求項1〜3のいずれかに記載の動物モデル。
- 前記観察マーカーが、蛍光マーカーまたは発光マーカーであることを特徴とする、請求項1〜4のいずれかに記載の動物モデル。
- 前記脊椎動物が、免疫不全マウスであることを特徴とする、請求項1〜5のいずれかに記載の動物モデル。
- 前記免疫不全マウスが、NOGマウスであることを特徴とする、請求項6に記載の動物モデル。
- 前記移植された細胞が、ヒトの子宮内膜に由来することを特徴とする、請求項1〜7のいずれかに記載の動物モデル。
- 前記移植された細胞が、ヒトの病気の病変部に由来することを特徴とする、請求項1〜7のいずれかに記載の動物モデル。
- 前記病気が子宮内膜症であることを特徴とする、請求項9に記載の動物モデル。
- 請求項9に記載の動物モデルに対して、前記病気の治療薬候補物質を投与する投与工程を含むことを特徴とする、前記病気の治療薬のスクリーニング方法。
- 請求項8または10に記載の動物モデルに対して、子宮内膜症治療薬候補物質を投与する投与工程を含むことを特徴とする、子宮内膜症治療薬のスクリーニング方法。
- 細胞をヒト以外の脊椎動物の腎被膜下に移植する移植工程を含む、動物モデルの作製方法であって、
前記細胞が、腎被膜下に移植された後、前記脊椎動物の非侵襲的観察によって、前記脊椎動物の細胞から区別され得ることを特徴とする作製方法。 - 前記細胞の位置及び/または増殖が、腎被膜下に移植された後、前記脊椎動物の非侵襲的観察によって、リアルタイムに判断し得ることを特徴とする、請求項13に記載の作製方法。
- 前記細胞が、移植される際に分散されていることを特徴とする、請求項13または14に記載の作製方法。
- 前記細胞に、前記非侵襲的観察が可能な観察マーカーを導入する導入工程を含むことを特徴とする、請求項13〜15のいずれかに記載の作製方法。
- 前記観察マーカーが、蛍光マーカーまたは発光マーカーであることを特徴とする、請求項16に記載の作製方法。
- 前記観察マーカーをコードする遺伝子を有する発現ベクターを導入することにより、前記観察マーカーを前記移植された細胞に導入することを特徴とする、請求項16または17に記載の作製方法。
- 前記発現ベクターが、ウイルスベクターであることを特徴とする、請求項18に記載の作製方法。
- 前記移植前に、前記観察マーカーを指標として、前記観察マーカーが導入された細胞を選別する選別工程をさらに含むことを特徴とする、請求項16〜19のいずれかに記載の作製方法。
- 前記移植前に、前記細胞に選別マーカーを導入する第2の導入工程と、
前記選別マーカーを指標として、前記観察マーカーが導入された細胞を選別する選別工程をさらに含むことを特徴とする、請求項16〜19のいずれかに記載の作製方法。 - 前記細胞が、ヒトの子宮内膜に由来することを特徴とする、請求項13〜21のいずれかに記載の作製方法。
- 前記細胞が、ヒトの病気の病変部に由来することを特徴とする、請求項13〜21のいずれかに記載の作製方法。
- ヒト以外の脊椎動物モデルであって、
ヒトの子宮内膜から単離された細胞を、腎被膜下に有する、子宮内膜症の動物モデル。 - 前記脊椎動物が、免疫不全マウスであることを特徴とする、請求項24に記載の動物モデル。
- 前記免疫不全マウスが、NOGマウスであることを特徴とする、請求項25に記載の動物モデル。
- 請求項24〜26のいずれかに記載の動物モデルに対して、子宮内膜症治療薬候補物質を投与する投与工程を含むことを特徴とする、子宮内膜症治療薬のスクリーニング方法。
- 請求項8、10、24〜26のいずれかに記載の動物モデルに対して、外因性性ステロイドホルモンを投与する投与工程を含むことを特徴とする、ヒト子宮内膜環境を再現する方法。
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