JPWO2007046426A1

JPWO2007046426A1 - Ａｔｒ阻害剤

Info

Publication number: JPWO2007046426A1
Application number: JP2007541012A
Authority: JP
Inventors: 浩志西田; 康雄濱森; 小西　徹也; 徹也小西
Original assignee: NLLGATA TLO LNC
Current assignee: NLLGATA TLO LNC
Priority date: 2005-10-21
Filing date: 2006-10-18
Publication date: 2009-04-23
Also published as: CA2626681A1; CN101291668A; US20100048923A1; EP1946757A1; WO2007046426A1

Abstract

本発明は、ＡＴＲプロテインキナーゼの阻害剤として有用な、各種シザンドリン類及びゴミシン類などの三環性化合物を有効成分として含有するＡＴＲ阻害剤を提供することを目的とする。

Description

本発明は、ＡＴＲ（ａｔａｘｉａ−ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａｍｕｔａｔｅｄａｎｄｒａｄ３−ｒｅｌａｔｅｄ）の活性を阻害するＡＴＲ阻害剤に係り、詳しくは、三環性化合物を有効成分として含有するＡＴＲ阻害剤に関する。

ＡＴＭ（ａｔａｘｉａ−ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａｍｕｔａｔｅｄ）及びＡＴＲ（ａｔａｘｉａ−ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａｍｕｔａｔｅｄａｎｄｒａｄ３−ｒｅｌａｔｅｄ）プロテインキナーゼ（以下、単に、ＡＴＭ及びＡＴＲとも称する。）は、細胞のＤＮＡ損傷に係る修復において、重要な役割を演じることが知られている（非特許文献１）。紫外線（ＵＶ）や電離放射線（ＩＲ）照射により、細胞は、ＤＮＡ損傷を受け、チェックポイントシグナルカスケードが惹起され、ＤＮＡ損傷を修復したりアポトーシスを起こすように、細胞周期をＧ１／Ｓ、中間Ｓ期及びＧ２／Ｍ期にアレスト（ａｒｒｅｓｔ）される。ＡＴＭを欠損するＡＴ（ａｔａｘｉａ−ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ；血管拡張性失調症）患者由来の細胞は、Ｇ１／Ｓ及びＧ２／Ｍチェックポイントが欠落した発現型を示すため、ＩＲに感受的である。従って、ＡＴＭ及びその下流の経路は、染色体の維持に重要である。さらに、一過的又は安定的なＡＴＲの欠損により、染色体の安定性が著しく損なわれ、或いは初期胚の段階で致死に至る（非特許文献２）。興味深いことに、ＡＴＲによるｐ５３タンパク（以下、単にｐ５３と称する。）又はＮＢＳ１のリン酸化は、ＡＴＭの存在により遅延することが知られている。このことは、ＡＴＲがＤＮＡ損傷反応の点で、ＡＴＭの協調的な分子種であることを示唆する。事実、ＡＴＲは、ＤＮＡ損傷から防御するのに中心的な役割を演じる。これらの事項は、ＡＴＭ又はＡＴＲ活性の制御は、染色体の安定性を保持するのに必要であるのみならず、化学療法や放射線治療などの抗癌治療への適用が可能であることを示すものである。

非特許文献３は、カフェイン（３，７−ジヒドロ−１，３，７−トリメチル−１Ｈ−プリン−２，６−ジオン）で補助した化学療法により、非増殖性の骨肉腫に係る腫瘍の切除が最小限ですむことを開示する。カフェインは、化学療法で惹起されたＤＮＡ損傷に反応してＡＴＭ及びＡＴＲのプロテインキナーゼ活性を阻害すると考えられるが、カフェインは、相対的にＡＴＲよりもＡＴＭを阻害することが知られている。

近年、細胞にｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたり、組み換え体のキナーゼからキナーゼ活性部位を欠落させたタンパク質を過剰発現させるなどして、ＡＴＲ及びＡＴＭの主要な役割の解明がなされている（非特許文献４乃至６）。しかしながら、ステーブル（ｓｔａｂｌｅ）なＡＴＲのノックアウトマウスは致死的であるため、ＡＴＭに比較してＡＴＲの機能を報告した例はあまり知られていない。また、ＡＴＲの特異的な阻害剤が知られていない現状において、カフェインや、ＰＩ３キナーゼの阻害剤であるワートマンニンを用いて、化学的にＡＴＭ及びＡＴＲのプロテインキナーゼ活性を阻害する研究が広く行われている。従って、ＡＴＲの特異的な阻害剤の発見により、ＤＮＡ損傷応答反応における生化学的な情報、ひいては抗癌治療の研究に多くの利点がもたらされることになり、ＡＴＲの活性を阻害する薬物が望まれていた。

これらのなかで、ＡＴＭ及びＡＴＲは、細胞におけるＤＮＡ損傷に対する反応の間、ｐ５３の１５番目のセリン残基をリン酸化する。ｐ５３は、ＤＮＡ損傷で誘導されるＧ１／Ｓチェックポイントにおいて、中心的な役割を演じる。近年の知見により、ＵＶ光を曝露した場合、ｐ５３の１５番目のセリン残基が直接的にＡＴＭ又はＡＴＲからリン酸化されてＧ１期での細胞周期停止が起こることが示されている。従って、ｐ５３の１５番目のセリン残基のリン酸化は、ＵＶで誘導したＤＮＡ損傷の後においてＡＴＭ又はＡＴＲを起点としたＧ１／Ｓチェックポイントが機能しているか否かを評価する妥当な指標である。また、このリン酸化は、ＵＶに対する損傷反応において、ＡＴＲの活性を反映するものである。Ｇ２／Ｍチェックポイントは、Ｇ１／Ｓと同様に、ＤＮＡ損傷細胞において、ＡＴＲとＡＴＭとで制御される。Ｇ２／Ｍチェックポイントは、非常に重要であり、ｐ５３欠損又は突然変異腫瘍などの多くの癌細胞において良く保存されている。特に、ｐ５３の機能を欠いた細胞もまた、Ｇ２／Ｍチェックポイントの廃止は、ＤＮＡ損傷に対して感受的である。事実、Ｇ２／Ｍチェックポイントに関連する場合、ＡＴＲは、分裂細胞の染色体維持に重要である。これらの結果により、ＡＴＲプロテインキナーゼ活性の阻害を含むＧ２／Ｍチェックポイントに係る一群を阻害することが抗癌治療の候補になると示唆される。

一方、五味子（ＳｃｈｉｓａｎｄｒａｅＦｒｕｃｔｕｓ）に由来する、各種シザンドリン類及びゴミシン類は、ジベンゾシクロオクタジン誘導体であり、生薬製剤として最もよく使用されている化合物群である。この化合物群の一つの有用性として、非特許文献８は、ＳＭＭＣ−７７２１肝臓癌細胞において、シザンドリンＢがカスパーゼ−３依存性アポトーシスを誘導することを開示する。この化合物により腫瘍を含む多種類の細胞において、他のシグナル調節物質又は他の効果について、さらなる研究が望まれている。元来信じられているのは、中国における数千年の経験から、各種シザンドリン類及びゴミシン類を含む伝統的な生薬、五味子において、多くの可能性が残されている、ということである。抗癌剤の７０％以上は、天然物由来であり、或いはより少ない副作用を期待された類似物である。本願出願人は、抗癌治療増感剤という観点で、各種シザンドリン類及びゴミシン類をＤＮＡ損傷に係る反応におけるシグナル伝達経路に適用することを想到した。
特開平７−２０６７５１号公報特開平６−１９２１３３号公報特開平２−４８５９２号公報特開平５−１２３１８４号公報米国特許出願公開第２００５／０２８２９１０号明細書ＳｈｉｌｏｈＹ著、"ＡＴＭａｎｄＡＴＲ：ｎｅｔｗｏｒｋｉｎｇｃｅｌｌｕｌａｒｒｅｓｐｏｎｓｅｓｔｏＤＮＡｄａｍａｇｅ"、ＣｕｒｒＯｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．、２００１年、１１巻、７１−７頁ＣｏｒｔｅｚＤら著、"ＡＴＲａｎｄＡＴＲＩＰ：ｐａｒｔｎｅｒｓｉｎｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｓｉｇｎａｌｉｎｇ"、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００１年、２９４巻、１７１３〜６頁ＴｓｕｃｈｉｙａＨら著、"Ｃａｆｆｅｉｎｅ−ａｓｓｉｓｔｅｄｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙａｎｄｍｉｎｉｍｉｚｅｄｔｕｍｏｒｅｘｃｉｓｉｏｎｆｏｒｎｏｎｍｅｔａｓｔａｔｉｃｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ．"、ＡｎｔｉｃａｎｃｅｒＲｅｓ．、１９９８年、１８巻、６５７〜６６頁ＳｈａｃｋｅｌｆｏｒｄＲＥら著、"ＴｈｅＡｔａｘｉａｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａｇｅｎｅｐｒｏｄｕｃｔｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓ−ｉｎｄｕｃｅｄＧ１ａｎｄＧ２ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｈｕｍａｎｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．"、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００１年、２７６巻、２１９５１〜９頁ＷｒｉｇｈｔＪＡら著、"ＰｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｍｕｔａｎｔｓｏｆｈｕｍａｎＡＴＲｉｎｃｒｅａｓｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｔｏＵＶａｎｄｉｏｎｉｚｉｎｇｒａｄｉａｔｉｏｎａｎｄａｂｒｏｇａｔｅｃｅｌｌｃｙｃｌｅｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｃｏｎｔｒｏｌ．"、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、１９９８年、９５巻、７４４５〜５０頁ＳｈｉｇｅｔａＴら著、"ＤｅｆｅｃｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄｍｉｔｏｔｉｃｓｐｉｎｄｌｅｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｉｎｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓｃａｒｒｉｅｒｓｏｆＡＴＭｍｕｔａｔｉｏｎｓ．"、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．、１９９９年、５９巻、２６０２〜７頁ＳａｒｋａｒｉａＪＮら著、"ＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＡＴＭａｎｄＡＴＲｋｉｎａｓｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｂｙｔｈｅｒａｄｉｏｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇａｇｅｎｔ，ｃａｆｆｅｉｎｅ．"、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．、１９９９年、５９巻、４３７５〜８２頁ＷｕＹＦら著、"Ｄｏｗｎ−ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｏｆｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ７０ａｎｄｕｐ−ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｏｆＣａｓｐａｓｅ−３ｄｕｒｉｎｇｓｃｈｉｓａｎｄｒｉｎＢ−ｉｎｄｕｃｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｈｕｍａｎｈｅｐａｔｏｍａＳＭＭＣ−７２２１ｃｅｌｌｓ"、ＷｏｒｌｄＪ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ、２００４年、１０巻、２９４４〜４８頁Ｔｉｂｂｅｔｔｓら著、Ｇｅｎｅ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、２０００年、１４巻、２９８９〜３００２頁Ｃａｎｍａｎら著、Ｓｃｉｅｎｃｅ、、１９９８年２８１巻、１６７７〜９頁Ｒｏｕｅｔら著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅ．ＵＳＡ、１９９４年、９１巻、６０６４〜８頁Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、２００３年、５１巻、１１号、１２３３〜１２３６頁ＡｃｔａＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａＳｉｎｉｃａ、１９９８年、１９巻、４号、３１３〜３１６頁

そこで、本発明は、ＡＴＲプロテインキナーゼの阻害剤として有用な、各種シザンドリン類及びゴミシン類などの三環性化合物を有効成分として含有するＡＴＲ阻害剤を提供することを目的とする。

本発明によるＡＴＲ阻害剤は、下記式（１）
に示す化合物を有効成分として含有することを特徴とする。

また、本発明によるＡＴＲ阻害剤は、下記式（２）
に示す化合物を有効成分として含有することを特徴とする。

また、本発明によるＡＴＲ阻害剤は、
下記式（３）
に示す化合物を有効成分として含有することを特徴とする。

また、本発明によるＡＴＲ阻害剤は、
下記式（４）
に示す化合物を有効成分として含有することを特徴とする。

また、本発明によるＡＴＲ阻害剤は、
下記式（５）
に示す化合物を有効成分として含有することを特徴とする。

また、本発明によるＡＴＲ阻害剤は、
下記式（６）
に示す化合物を有効成分として含有することを特徴とする。

また、本発明によるＡＴＲ阻害剤は、
下記式（７）
に示す化合物を有効成分として含有することを特徴とする。

また、本発明によるＡＴＲ阻害剤は、
下記式（８）
に示す化合物を有効成分として含有することを特徴とする。

また、本発明によるＡＴＲ阻害剤は、
下記式（９）
に示す化合物を有効成分として含有することを特徴とする。

また、本発明によるＡＴＲ阻害剤は、
下記式（１０）
に示す化合物を有効成分として含有することを特徴とする。

なかでも、本発明によるＡＴＲ阻害剤として、上記式（１）乃至（５）に示す化合物を有効成分として含有することが好ましい。

本発明によるＡＴＲ阻害剤において、前記ＡＴＲ活性は、タンパクリン酸化活性であることが好ましい。

本発明によるＡＴＲ阻害剤において、前記タンパクリン酸化活性は、細胞周期関連タンパクをリン酸化する活性であることが好ましい。

本発明によるＡＴＲ阻害剤において、前記細胞周期関連タンパクは、ｐ５３であることが好ましい。

本発明によるＡＴＲ阻害剤において、前記細胞周期関連タンパクは、Ｂｒｃａ１及びＣｈｋ１からなる群から選択されたものであることが好ましい。

本発明によれば、ｉｎｖｉｔｒｏにおいてもｉｎｖｉｖｏにおいても、ＡＴＲ活性を特異的に阻害することが可能となる。

ＵＶ照射したＡ５４９細胞におけるシザンドリンＢによる生存率への影響を示すグラフである。ＵＶ照射したＡ５４９細胞におけるシザンドリンＢによる細胞周期に対する影響を示す図であって、（Ａ）は、全細胞数に対するリン酸化ヒストンＨ３量を示す図であり、（Ｂ）は、リン酸化ヒストンＨ３量を指標として、全細胞に占める分裂細胞数の割合をグラフ化したものである。電離放射線照射したＡ５４９細胞における分裂細胞数に対するシザンドリンＢの影響を示すグラフである。ＵＶ照射又は電離放射線照射したＡ５４９細胞におけるｐ５３リン酸化に及ぼすシザンドリンＢの影響を示す図である。ＵＶ照射したＡ５４９細胞におけるｐ５３リン酸化に及ぼすシザンドリンＢの濃度依存的影響を示す図である。ＵＶ照射したＡ５４９細胞におけるｐ５３リン酸化に及ぼす本発明によるＡＴＲ阻害剤の影響を示す図である。Ａ５４９細胞における細胞周期に対するシザンドリンＢの影響を示す図である。シザンドリンＢによるＡＴＲ及びＡＴＭの有するリン酸化活性に及ぼす影響を示すグラフであって、（Ａ）は、ＡＴＲに対応し、（Ｂ）は、ＡＴＭに対応するグラフである。ＵＶ照射したＡＴ２ＫＹ細胞における各種蛋白のリン酸化に及ぼすシザンドリンＢの影響を示す図である。ＡＴＲ又はＡＴＭ発現を阻害してＵＶ照射したＡ５４９細胞における各種蛋白のリン酸化に及ぼすシザンドリンＢの影響を示す図である。Ａ５４９細胞におけるＭＡＰＫのリン酸化に及ぼすシザンドリンＢの影響を示す図である。

本発明によるＡＴＲ阻害剤は、合成品、天然品など、種々の市販で利用可能な化合物を利用してもよく、特許文献１等に記載の公知の合成方法により製造したものであってもよく、さらに、五味子（ＳｃｈｉｓａｎｄｒａＣｈｉｎｅｎｓｉｓ）由来のＦｒｕｃｔｕｓＳｃｈｉｓａｎｄｒａｅ等の天然生薬から特許文献２等の公知の方法により抽出／精製したものであってもよい。

具体的には、上記式（１）で示すシザンドリンＢ（ＳｃｈｉｚａｎｄｒｉｎＢ；ＳｃｈＢ）としては、特許文献２に記載の通り、五味子（ＦｒｕｃｔｕｓＳｃｈｉｓａｎｄｒａｅ）を、ｎ−ヘキサンなどの炭化水素系溶剤又はメタノールなどのアルコール系溶剤で加熱下一定時間抽出した後、カラムクロマトグラフィーにかけて得た非水溶性物質と水溶性物質の混合物を含む溶液を濃縮乾固し、これに水酸化カリウムとメタノールの混液を加えて鹸化した原料に、メタノールを加えて撹拌溶解した後、水酸化カリウム水溶液で溶解した後、上述のメタノールを留去し、目的物質である非水溶性物質を析出させて得たものであってもよい。

また、上記式（２）で示すゴミシンＣ（ＧｏｍｉｓｉｎＣ；ＧＣ）としては、上述の特許文献３で示す方法の通り、石油エーテルなどの低極性溶媒で抽出した後、さらに石油エーテル、ｎ−ヘプタンなどの低極性水不溶性溶媒とメタノールなどの高極性水溶性溶媒とを用いた分配抽出を行ったのち、必要に応じて、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーなどで目的物質を分離したものであってもよい。

また、上記式（３）で示すゴミシンＧ（ＧｏｍｉｓｉｎＧ；ＧＧ）としては、上述の非特許文献１２に示す通り、Ｓｈｉｚａｎｄｒａａｒｉｓａｎｅｎｓｉｓの乾燥幹から酢酸エチルで抽出し、必要に応じてカラムクロマトグラフィーを用いて精製したものであってもよい。

また、上記式（４）で示すゴミシンＨ（ＧｏｍｉｓｉｎＨ；ＧＨ）としては、特許文献５に記載の通り、Ｓｃｈｉｚａｎｄｒａｃｈｉｎｅｎｓｉｓに由来するものであってもよい。

また、上記式（５）で示すゴミシンＪ（ＧｏｍｉｓｉｎＣ；ＧＪ）としては、特許文献１に示す通り、五味子から抽出したデオキシシザンドリンをアシル化して合成した下記式（Ｂ）に示す化合物を得た後、脱アルキル化（式中のＲ_１基）し、脱アシル化（式中、ＣＯＲ基）して得たものであってもよい。

（式中、Ｒ_１は、低級アルキル基を示し、Ｒは、水素原子又は低級アルキル基を示す。）

また、上記式（６）で示すシザンドリン（Ｓｃｈｉｚａｎｄｒｉｎ；Ｓｃｈ）としては、特許文献３に示す通り、石油エーテルなどの低極性溶媒で抽出した後、さらに石油エーテル、ｎ−ヘプタンなどの低極性水不溶性溶媒とメタノールなどの高極性水溶性溶媒とを用いた分配抽出を行ったのち、必要に応じて、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーなどで目的物質を分離したものであってもよい。

また、上記式（７）で示すゴミシンＡ（ＧｏｍｉｓｉｎＡ；ＧＡ）としては、上述の特許文献３に従った方法の他、特許文献４に記載の通り、下記式（Ａ）に示す化合物の５員環を還元してジヒドロキシ化した後、酸化反応、メタンスルホニル化反応を付して得られるｄｌ−シザンドリン（ＩＩＩ）から、光学異性体を分離して得たものであってもよい。

また、上記式（８）で示すゴミシンＢ（ＧｏｍｉｓｉｎＨ；ＧＢ）としては、非特許文献１２に示す通り、Ｓｈｉｚａｎｄｒａａｒｉｓａｎｅｎｓｉｓの乾燥幹から酢酸エチルで抽出し、必要に応じてカラムクロマトグラフィーを用いて精製したものであってもよい。

また、上記式（９）で示すゴミシンＮ（ＧｏｍｉｓｉｎＮ；ＧＮ）としては、特許文献５に記載の通り、Ｓｃｈｉｚａｎｄｒａｃｈｉｎｅｎｓｉｓに由来するものであってもよい。

また、上記式（１０）で示すシザンドリンＣ（ＳｃｈｉｚａｎｄｒｉｎＣ；ＳＣ）としては、非特許文献１３に示す通り、五味子の石油エーテル抽出物を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製したものであってもよい。

（実施例１）ＵＶ照射したＡ５４９細胞におけるシザンドリンＢによる生存率への影響
Ａ５４９細胞（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｉｓｓｕｅＴｙｐｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ社製）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン及び１００ユニット／ｍＬペニシリン含有ＤＭＥＭ培地（以下、増殖培地と称する。）中で５００個／６０ｍｍディッシュとなるように播種して一昼夜培養した後、最終濃度１μＭ及び１０μＭとなるように培地中にシザンドリンＢ（１０ｇ／ＬとなるようにシザンドリンＢ含有ＤＭＳＯ溶液を調製し、培地中で５ｇ／Ｌ未満のＤＭＳＯ濃度となるようにさらに培地で希釈して用いた。以下、同様。）を添加した。

添加１時間後、培地を除去し、Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて２０及び５０Ｊ／ｍ^２のＵＶ（波長２５４ｎｍを使用。以下同様。）を照射し、再度上述と同濃度のシザンドリンＢを有する培地（以下、シザンドリンＢ含有培地と称する。）に交換して１４日間継続培養後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、２％メチレンブルーを用いて、クローン形成法に従って、生存細胞数をカウントした。結果を図１に示す。図１中、横軸は、照射したＵＶの線量を示し、縦軸は、未処理群に対する処理群における生存細胞の比率を百分率で示す。図中、○は、シザンドリンＢを処理しない群を示し、▲は、１μＭのシザンドリンＢで処理した群を示し、■は、１０μＭのシザンドリンＢで処理した群を示す。なお、各群とも、平均±標準誤差（ｎ＝３）で示す。

（実施例２−１）ＵＶ照射したＡ５４９細胞におけるシザンドリンＢによる細胞周期に対する影響
Ａ５４９細胞を増殖培地中で３×１０^４個／ｃｍ^２となるように１０ｍｍディッシュに播種して一昼夜培養した後、最終濃度３０μＭとなるように培地中にシザンドリンＢを添加した。１時間後、培地を除去し、２０及び５０Ｊ／ｍ^２のＵＶを照射し、上述と同濃度のシザンドリンＢ含有培地で細胞を１時間培養した。その後、下述のヒストンＨ３リン酸化量の測定に従って、細胞中のヒストンＨ３リン酸化量を測定した。結果を図２に示す。図２（Ａ）は、シザンドリンＢで処理した際に得られたフローサイトメトリーの結果であって、図２（Ａ）中、丸で囲った部分は、Ｇ２／Ｍ期の細胞群を示し、その上方に記載の数値は、全細胞数に対するＧ２／Ｍ期の細胞群の数の割合を示す。また、図２（Ｂ）は、この割合をグラフで示したものである。

（実施例２−２）
実施例２−１において、２０及び５０Ｊ／ｍ^２のＵＶの代わりに２０Ｊ／ｍ^２のＵＶを照射し、最終濃度３０μＭのシザンドリンＢの代わりに、上記式（１）乃至（１０）に示す化合物、及び下記式（Ｃ）に示すアンジェロイルゴミシンＡ（ＡｎｇｅｌｏｙｌｇｏｍｉｓｉｎＡ；ＡＧＡ）（最終濃度３０μＭ）を用いた以外は、実施例２−１と同様に行い、全細胞数に対するＧ２／Ｍ期の細胞群の数の割合を得た。結果を表１に示す。

（実施例３）電離放射線照射したＡ５４９細胞における分裂細胞数に対するシザンドリンＢの影響
Ａ５４９細胞を増殖培地中で３×１０^４個／ｃｍ^２となるように１０ｃｍディッシュに播種して一昼夜培養した後、最終濃度３０μＭとなるように培地中にシザンドリンＢを添加した。１時間後、培地を除去し、３Ｇｙの電離放射線を照射し、上述と同濃度のシザンドリンＢ含有培地で細胞を１時間培養した。この細胞に関し、下述のヒストンＨ３リン酸化量の測定を行った。結果を図３に示す。それぞれの数値は、図２（Ｂ）と同様である。

（実施例４）ＵＶ照射又は電離放射線照射したＡ５４９細胞におけるｐ５３リン酸化に及ぼすシザンドリンＢの影響
Ａ５４９細胞を増殖培地中で３×１０^４個／ｃｍ^２となるように１０ｃｍディッシュに播種して一昼夜培養した後、最終濃度３０μＭとなるように培地中にシザンドリンＢを添加した。１時間後、培地を除去し、２０Ｊ／ｍ^２のＵＶを照射し３時間培養した（以下、この細胞群を、ＵＶ細胞群と称する。）。

また、同様に、一昼夜培養し最終濃度３０μＭとなるように培地中にシザンドリンＢを添加し１時間培養したＡ５４９細胞の培地を除去し、１０Ｇｙの電離放射線（γ線）を照射し、上述と同濃度のシザンドリンＢ含有培地で２時間培養した（以下、この細胞群をＩＲ細胞群と称する。）。

なお、ＵＶ細胞群及びＩＲ細胞群のいずれも、照射の１５分前から下述の細胞の回収まで、５０μｍのＮ−アセチル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−ノルロイシナル（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｌ−Ｌｅｕｃｙｌ−Ｌ−Ｌｅｕｃｙｌ−Ｌ−ｎｏｒｌｅｕｃｉｎａｌ）：以下、ＬＬｎＬと称する。）、Ｓｉｇｍａ社製、ＭＯ、米国）の存在下で細胞を培養した。その後、下述の蛋白調製に準じて細胞中の蛋白質を抽出した後、下述のイムノブロット分析に準じて、ｐ５３蛋白の１５番目のセリン残基のリン酸化体（Ｐ−ｐ５３（Ｓｅｒ１５））、ｐ５３蛋白（ｐ５３）、ＡＴＭ蛋白の１９８１番目のセリン残基のリン酸化体（Ｐ−ＡＴＭ（Ｓｅｒ１９８１））及びグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）に関して、イムノブロット分析を行った。結果を図４に示す。

（実施例５−１）ＵＶ照射したＡ５４９細胞におけるｐ５３リン酸化に及ぼすシザンドリンＢの濃度依存的影響
Ａ５４９細胞を増殖培地中で３×１０^４個／ｃｍ^２となるように１０ｃｍディッシュに播種して一昼夜培養した後、最終濃度１０、３０及び１００μＭとなるように培地中にシザンドリンＢを添加した。１時間後、培地を除去し、２０Ｊ／ｍ^２のＵＶを照射した。なお、実施例４と同様にＬＬｎＬを用いて細胞を処理した。その後、上述と同濃度のシザンドリンＢで１時間処理した細胞を、下述のイムノブロット分析に準じて、ｐ５３及びｐ５３の１５番目のセリン残基のリン酸化体（Ｐ−ｐ５３（Ｓｅｒ１５））の発現を検討した。結果を図５−１に示す。

（実施例５−２）
実施例５−１において、最終濃度１０、３０及び１００μｍとなるように培地中にシザンドリンＢを添加するのに代えて、上記式（１）乃至（１０）に示す化合物及び上記式（Ｃ）に示す化合物（最終濃度３０μＭ）をそれぞれ添加し、２０Ｊ／ｍ^２のＵＶを照射する代わりに、２５Ｊ／ｍ^２のＵＶを照射した以外は、実施例５−１と同様に行い、ｐ５３の１５番目のセリン残基のリン酸化体（Ｐ−ｐ５３（Ｓｅｒ１５））の発現を検討した。この際に得た電気泳動像を図５−２に示し、Ｐ−ｐ５３（Ｓｅｒ１５）に該当するバンド強度（チューブリンで標準化したもの）について、ＵＶ照射して得たものを１００％とした際の各化合物で得たバンド強度の相対比を表２に示す。

（実施例６）Ａ５４９細胞における細胞周期に対するシザンドリンＢの影響
Ａ５４９細胞を増殖培地中で３×１０^４個／ｃｍ^２となるように１０ｃｍディッシュに播種して一昼夜培養した後、最終濃度３０μＭとなるように培地中にシザンドリンＢを添加した。４時間後、下述のＦＡＣＳ分析に準じて、細胞周期を検討した。ＦＡＣＳ分析の結果を図６に示す。

（実施例７−１）シザンドリンＢによるＡＴＲ及びＡＴＭの有するリン酸化活性に及ぼす影響
基質として１μｇのリコンビナントＰＨＡＳ−Ｉタンパク（ＡｌｅｘｉｓＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）を、下述のリン酸化反応用ＡＴＲ混液及びＡＴＭ混液の調製に従って得たリン酸化反応用ＡＴＲ混液及びＡＴＭ混液に添加すると同時にシザンドリンＢを加え、適当な濃度の^３２Ｐ−ＡＴＰを有する３００μＭＡＴＰを添加して、３０℃で２０分間反応させた。この反応液の４倍の量のＳＤＳサンプルローディングバッファー（２００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、４００ｍＭＤＴＴ及び８％ＳＤＳ）で反応を停止し、この混液を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ゲルを乾燥後、上述の混液中の^３２Ｐ−ＰＨＡＳ−Ｉに対応するバンドに関し、オートラジオグラフィーで、γ線量をカウントした。結果を図７に示す。（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれＡＴＲ及びＡＴＭの相対活性を示し、横軸は、シザンドリンＢの濃度を示し、縦軸は、シザンドリンＢ無添加に対するカウントの相対値で示す。

（実施例７−２）本発明によるＡＴＲ阻害剤によるＡＴＲの有するリン酸化活性に及ぼす影響
実施例７−１において、シザンドリンＢの代わりに、上記式（１）乃至（５）に示す化合物及び上記式（Ｃ）に示す化合物を用いた以外は、実施例７−１と同様に行い、得た直線から、ＩＣ_５０値を算出した。この値を、表３に示す。

（実施例８）ＵＶ照射したＡＴ２ＫＹ細胞における各種蛋白のリン酸化に及ぼすシザンドリンＢの影響
ＡＴ２ＫＹ細胞（ヘルスサイエンス振興財団（大阪））を、１５％ＦＢＳ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン及び１００ユニット／ｍＬペニシリン含有ＲＰＭＩ１６４０培地中で３×１０^４個／ｃｍ^２となるように１０ｃｍディッシュに播種して一昼夜培養した。最終濃度３０μＭとなるように培地中にシザンドリンＢを添加した。添加１時間後、培地を除去し、２０Ｊ／ｍ^２のＵＶを照射した。その後、上述と同濃度のシザンドリンＢで４時間処理した細胞について、下述のイムノブロット分析に準じて、ｐ５３の１５番目のセリン残基のリン酸化体（Ｐ−ｐ５３（Ｓｅｒ１５））、Ｂｒｃａ１の１４２３番目のセリン残基のリン酸化体（Ｐ−Ｂｒｃａ１（Ｓ１４２３））及びＣｈｋ１の３４５番目のセリン残基のリン酸化体（Ｐ−Ｃｈｋ１（Ｓ３４５））の発現を検討した。結果を図８に示す。

（実施例９）ＡＴＲ又はＡＴＭ発現を阻害してＵＶ照射したＡ５４９細胞における各種蛋白のリン酸化に及ぼすシザンドリンＢの影響
Ａ５４９細胞を増殖培地中で３×１０^４個／ｃｍ^２となるように１０ｃｍディッシュに播種して一昼夜培養した。その後、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とを用いて、細胞に、下述のｓｉＲＮＡの調製に従って得た各二本鎖ｓｉＲＮＡ（ｓｉＧＦＰ、ｓｉＡＴＭ及びｓｉＡＴＲ）をトランスフェクトした。一晩培養した後、新鮮な増殖培地に交換して７２時間後、３０μｍのシザンドリンＢで１時間処理し、培地を除去し、２０Ｊ／ｍ^２のＵＶを照射した。その後、上述と同濃度のシザンドリンＢで３時間処理した細胞について、下述のイムノブロット分析に準じて、ｐ５３の１５番目のセリン残基のリン酸化体（Ｐ−ｐ５３（Ｓ１５））、Ｃｈｋ１の３４５番目のセリン残基のリン酸化体（Ｐ−Ｃｈｋ１（Ｓ３４５））、ＡＴＭ蛋白（ＡＴＭ）、ＡＴＭ蛋白の１９８１番目のセリン残基のリン酸化体（Ｐ−ＡＴＭ（Ｓｅｒ１９８１））及びＡＴＲ蛋白（ＡＴＲ）の発現を検討した。結果を図９に示す。なお、図９中、Ｐ−ｐ５３（Ｓ１５）及びＰ−Ｃｈｋ１（Ｓ３４５）欄の下に記した発現比率は、コントロールであるｓｉＧＦＰとＵＶとで処理して得たそれぞれの蛋白のバンド強度を１．０とした際のそれぞれのバンドの相対強度を示す。

（実施例１０）Ａ５４９細胞におけるＭＡＰＫのリン酸化に及ぼすシザンドリンＢの影響
Ａ５４９細胞を増殖培地中で３×１０^４個／ｃｍ^２となるように１０ｃｍディッシュに播種して一昼夜培養した後、無血清の増殖培地で１６時間さらに培養した。その後、細胞を、５０μＭＰＤ０９８０５９（Ｓｉｇｍａ社製）又は３０μＭシザンドリンＢで処理し、さらに、１００ｎｇ／ｍＬフォルボール１２−ミリスチン酸１３−酢酸（ＰＭＡ；Ｓｉｇｍａ社製）で５分間処理した。その後、細胞を下述のイムノブロット分析に準じて、４２ｋＤａ及び４４ｋＤａマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ｐ４２ＭＡＰＫ及びｐ４４ＭＡＰＫ）並びにこれらのリン酸化体の発現を検討した。結果を図１０に示す。

（ヒストンＨ３リン酸化量の測定）
細胞をＰＢＳで洗浄した後、７０％氷冷エタノールで固定した。これに、０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００含有ＰＢＳを添加し、氷上で３０分間載置した後、細胞を回収し、遠心分離（５００Ｇ、５分間）して得た細胞ペレットに、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び１μｇ抗ウサギ血清（ヒストンＨ３の１３番目のセリン残基のリン酸化体に特異的なもの）含有ＰＢＳ（１００μＬ）を添加して、室温で４時間載置した。その後、これを１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで洗浄し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで１００倍に希釈したＦＩＴＣでコンジュゲートしたヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を添加し、暗所で３０分間、載置した。さらに、下述のＦＡＣＳ分析に準じてＰＩ染色を行った後、フローサイトメトリー（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）でリン酸化ヒストンＨ３量を測定した。

（イムノブロット分析）
５０μｇの蛋白（下述の蛋白調製に準じて調製したもの）をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（１２．５％）を行い、泳動後の各蛋白を、定法に従いニトロセルロース膜に転写し、５％スキムミルク及び０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００含有トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ−Ｔ）を用い、室温で１時間、ブロッキング反応を行った。得た膜を、以下に示す所望の抗体で４℃１６時間インキュベートし、その後、西洋わさび由来ペルオキシダーゼでコンジュゲートした二次抗血清（上述の所望の抗体の由来動物に対するもの）で、室温１時間インキュベートした。その後、標的蛋白を、ＥＣＬｒｅａｃｔｉｏｎｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）及びｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｆｉｌｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）で可視化して、蛋白像を得た。

＜抗体＞
ｐ５３抗体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）
リン酸化ｐ５３抗体（Ｃｅｌｌｓｉｇｎａｌｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）
リン酸化ＡＴＭ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製）
リン酸化Ｃｈｋ１抗体（Ｃｅｌｌｓｉｇｎａｌｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）
ＡＴＲ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ社製）
チューブリン抗体（Ｓｉｇｍａ社製）
ＧＡＰＤＨ抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ社製）
リン酸化Ｂｒｃａ１抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ社製）
抗ＭＡＰＫ抗体及び抗リン酸化ＭＡＰＫ抗体（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ社製）

（蛋白調製）
細胞を、氷冷ＰＢＳで培養ディッシュから剥離し、冷ＰＢＳで２回洗浄した後、遠心分離して得た細胞ペレットに、下述のＵＴＢ緩衝液で可溶化して、細胞由来の蛋白混合物を調製した。蛋白量は、ＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙＫｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）で測定した。

＜ＵＴＢ緩衝液＞
８ｍＭ尿素
１５０ｍＭ２−メルカプトエタノール
５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）

（ＦＡＣＳ分析）
細胞をＰＢＳで洗浄した後、７０％氷冷エタノールで固定した。遠心分離により回収したペレットにＰＢＳを加え洗浄した後、再度遠心分離を行った。ペレットを最終濃度１００μＭのＰｒｏｐｉｄｉｕｍＩｏｄｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ社、以下ＰＩ）と４０μｇ／ｍＬのＲＮａｓｅＡを含む溶液（ＰＩＳｏｌｕｔｉｏｎ）で懸濁し３０分間室温にて培養した。その後フローサイトメトリー（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）で細胞周期の解析を行った。

（リン酸化反応用ＡＴＲ混液及びＡＴＭ混液の調製）
リン酸化反応用ＡＴＲ混液には、非特許文献９等の公知の方法を用いて製造されたＦｌａｇでタグ付けしたＡＴＲを用いた。詳しくは、非特許文献９に開示の方法は、ＡＴＲ遺伝子（配列番号４）のＢａｍＨ１−ＳｗａＩフラグメント（１ｋｂ）を、Ｆｌａｇ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）をＮ末端に有するＡＴＲに対応する遺伝子に置き換えてＰＣＲで増幅させた遺伝子産物を、ｐｃＤＮＡ３．１に導入したプラスミドから合成する方法である。また、リン酸化反応用ＡＴＭ混液には、非特許文献１０及び１１等の公知の方法及びＱｕｉｋｃｈａｎｇｅＳｉｔｅ−ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて製造されたＦｌａｇでタグ付けしたＡＴＭを用いた。

これらＦｌａｇでタグ付けしたＡＴＲ及びＡＴＭプラスミド（配列番号４及び５）を、下述のリン酸カルシウム法に準じて、２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１１２６８）にトランスフェクトし、２日間培養した。その後、上述のＵＴＢ緩衝液を下述のＩＰ緩衝液に変更して行った上述の蛋白調製に準じて得た蛋白混合物５ｍｇを、４℃４時間、２０μｇの抗Ｆｌａｇ−Ｍ２モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ社製）で、免疫沈降させた。これと、４℃１時間、プロテインＧセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）でコンジュゲートしたビーズとをインキュベートした。得た免疫複合体を、下記のＴＧＮ緩衝液で２回洗浄し、さらに、下記のキナーゼ緩衝液で１回洗浄し、リン酸化反応用ＡＴＲ混液及びＡＴＭ混液（配列番号６及び７）を得た。

＜ＩＰ緩衝液＞
１０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）
１ｍＭＥＤＴＡ
１ｍＭＥＧＴＡ
１５０ｍＭＮａＣｌ
０．５％ＮＰ−４０
１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
１ｍＭフェニルメタンスルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ）
２μｇ／ｍＬペプスタチン
２μｇ／ｍＬアプロチニン
１ｍＭｐ，ｐ’−ジクロロジフェニルトリクロロエタン（ＤＤＴ）

＜ＴＧＮ緩衝液＞
５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）
５０ｍＭグリセロリン酸
１５０ｍＭＮａＣｌ
１％Ｔｗｅｅｎ２０
１０％グリセロール

＜キナーゼ緩衝液＞
１０ｍＭＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）
５０ｍＭグリセロリン酸
５０ｍＭＮａＣｌ
１０ｍＭＭｇＣｌ_２
１０ｍＭＭｎＣｌ_２

＜リン酸カルシウム法＞
２９３Ｔ細胞を増殖培地中で２×１０^４／ｃｍ^２となるように１０ｃｍディッシュに播種して一昼夜培養した。その後、上述のＦｌａｇ−ＡＴＭ及びＦｌａｇ−ＡＴＲを最終濃度２５ｍＭのＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸）と２５ｍＭのＣａＣｌ_２とに混合して、細胞にトランスフェクトさせた。一晩培養後、新鮮な増殖培地に交換して２日間培養した。

（ｓｉＲＮＡの調製）
ＡＴＲ、ＡＴＭ及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に対する二本鎖ｓｉＲＮＡ（それぞれ配列表に記載の配列番号１、２及び３に対応）を、ＨＰＧｅｎｏｍｅＷｉｄｅｓｉＲＮＡ（キアゲン社製）に従って、それぞれ合成した。得た二本鎖ｓｉＲＮＡをそれぞれ、ｓｉＡＴＲ、ｓｉＡＴＭ及びｓｉＧＦＰとする。

（考察）
ＡＴＭ（ａｔａｘｉａｔｅｌａｎｇｉｅｃｔｓｉａｍｕｔａｔｅｄ）及びＡＴＲ（ａｔａｘｉａｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａａｎｄＲａｄ−３−ｒｅｌａｔｅｄ）は、細胞周期のＤＮＡ損傷に対する反応に係るシグナル伝達において、重要な役割を演じる。ＡＴＭ及びＡＴＲは、Ｃｈｋ１、ｐ５３、ＮＢＳ１、Ｂｒｃａ１、ＳＭＣ１などのいわゆるチェックポイント・タンパク質群や転写因子をリン酸化する。発癌の原因ともなる次の世代へのＤＮＡ損傷の持ち越しを防ぐために、上述のチェックポイントシグナルは、細胞周期全体を制御している。ＡＴＭ又はＡＴＲの不全は、ＵＶ若しくはＩＲ照射又は障害誘導性薬剤により誘導されたＤＮＡ損傷により、細胞の生存率を低下させる。このことは、損傷を受けたＤＮＡの修復、維持、及び管理において、ＡＴＭ及びＡＴＲが必要であることを、示す。本発明において、本願出願人は、ＳｃｈｉｓａｎｄｒａＣｈｉｎｅｎｓｉｓの成分であるシザンドリンＢがＵＶ照射後の細胞の生存率を濃度依存的に低下させることを、示した。このことは、ｉｎｖｉｖｏでのＤＮＡ損傷反応におけるチェックポイントシグナル伝達経路に対してシザンドリンＢが阻害効果を有することを示す。

ヒストンＨ３は、正常な分裂細胞においてその１０番目のセリン残基がリン酸化され、Ｇ２期からＭ期への移行の指標となるが、ＤＮＡ損傷により、Ｇ２期／Ｍ期チェックポイントが機能すると、リン酸化ヒストンＨ３陽性細胞の割合は減少する。図２によると、２０及び５０Ｊ／ｍ^２のＵＶ照射によりリン酸化ヒストンＨ３の割合が減少した。一方、５０Ｊ／ｍ^２のＵＶ照射では有意ではなかったが、２０Ｊ／ｍ^２のＵＶ照射により、上記式（１）で示すシザンドリンＢは、Ｇ２／Ｍチェックポイントを顕著に崩壊させた。事実、低線量のＵＶ照射において、ＤＮＡ損傷に対する反応中、シザンドリンＢは、Ｇ２／Ｍチェックポイントを完全に無効にした。また、上記式（１）乃至（１０）に示す化合物及び上記（Ｃ）に示す化合物によっても、Ｇ２／Ｍチェックポイントを完全に無効にした。一方、Ａ５４９細胞にＩＲ照射した場合、Ｇ２／Ｍチェックポイントの劇的な阻害は起きなかった。一般的に、ＩＲ照射は、ＡＴＭを活性化させ、ＵＶ照射は、ＡＴＲを活性化させ、細胞周期チェックポイントを機能させることが知られている。これらの結果により、シザンドリンＢは、低線量のＵＶ照射で誘導されたＤＮＡ損傷の過程中のＧ２／Ｍチェックポイントにおいて、ＡＴＭよりもむしろＡＴＲ活性に対して阻害効果を有することが、示唆された。同様の事項は、上記式（１）乃至（１０）に示す化合物など、本発明によるＡＴＲ阻害剤の他の化合物についても、適用可能である。

ｉｎｖｉｖｏにおけるＡＴＲキナーゼ活性に及ぼす、本発明によるＡＴＲ阻害剤の阻害活性を検証するため、ＩＲ又はＵＶ照射により誘導されるＤＮＡ損傷の後のｐ５３リン酸化を検討した。ｐ５３は、ｉｎｖｉｖｏにおいて、種々のプロテインキナーゼにより、複数の部位でリン酸化を受け、細胞にとって大変重要な転写因子として知られている。癌治療におけるＤＮＡ損傷反応時のｐ５３の機能を考えた場合、ｐ５３は、細胞がＵＶ照射、γＩＲ照射及びメチル化剤により障害された際、１５番目のセリン残基において、ＡＴＲ及びＡＴＭにより特異的にリン酸化される。本発明において、Ａ５４９細胞に対して２０Ｊ／ｍ^２のＵＶ照射を行った後、ｐ５３リン酸化は、シザンドリンＢにより減少したが、ＩＲ照射では減少しなかった。ＩＲ照射の後にＡＴＭの１９８１番目のセリン残基が顕著に活性化され、２０Ｊ／ｍ^２のＵＶ照射によりわずかながら活性化されたが、シザンドリンＢは、いずれのＤＮＡ損傷においても、ＡＴＭ活性に影響を及ぼさなかった。また、シザンドリンＢによる細胞周期の局所的な蓄積や偏りも認められなかった。また、上記式（１）乃至（１０）に示す化合物によっても、ｐ５３リン酸化の阻害が観察された。これらの結果により、２０Ｊ／ｍ^２のＵＶ照射によるｐ５３の１５番目のセリン残基のリン酸化の減少は、ＡＴＲによってのみ起こることが示された。

非特許文献７は、Ａ５４９アデノカルシノーマ細胞におけるＡＴＭ及びＡＴＲプロテインキナーゼに対するカフェインの阻害効果を開示する。本願出願人は、この文献と同一の方法により、ｉｎｖｉｔｒｏにおけるＡＴＭ及びＡＴＲのプロテインキナーゼ活性に及ぼすシザンドリンＢの影響を検討した。シザンドリンＢをキナーゼ緩衝液とインキュベートすると、ＡＴＭ及びＡＴＲの両者を阻害するが、シザンドリンＢは、ＡＴＭよりもＡＴＲプロテインキナーゼの阻害が顕著である。事実、シザンドリンＢによるＡＴＲに対するＩＣ_５０は、ＡＴＭの約２４０倍であった。また、上記式（１）乃至（５）に示す化合物によっても、ＡＴＲプロテインキナーゼ活性の阻害が顕著に観察された。細胞の生存率及びキナーゼ活性の結果が示すのは、細胞のＤＮＡ損傷を誘導するＵＶ照射の反応中、ＡＴＲプロテインキナーゼ活性が阻害されたということである。

シザンドリンＢのＤＮＡ損傷に係るチェックポイント対する影響を検討するため、ＡＴ患者由来の繊維芽細胞（ＡＴ２ＫＹ細胞）及びｓｉＲＮＡ処理細胞を用いた。ＡＴ２ＫＹ細胞をＵＶ照射すると、リン酸化ｐ５３のみならずチェックポイント経路におけるＡＴＭ及びＡＴＲの下流分子としての、Ｂｒｃａ１（Ｓｅｒ１４２３）及びＣｈｋ１（Ｓｅｒ３４５）のリン酸化体が増加した。さらに、コントロール及びＡＴＭに係るｓｉＲＮＡで処理した細胞においてのみ、シザンドリンＢによるｐ５３及びＣｈｋ１のリン酸化が減少した。また、ｓｉＡＴＲで処理した細胞では、チェックポイントのタンパク質に係るリン酸化の減少が観察されなかった。これらの結果から、シザンドリンＢは、ｉｎｖｉｖｏにおいて、ＡＴＲプロテインキナーゼ活性の阻害を介して、ＤＮＡ損傷に係るチェックポイントのシグナル伝達経路を阻害した。

ｉｎｖｉｖｏにおけるＡＴＲ阻害に対するシザンドリンＢの特異性を確認するため、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）とも称されるＥＲＫの血清刺激及びＰＭＡ処理による特異的な活性化システムによるリン酸化に対するシザンドリンＢの効果を検討した。ＥＲＫのリン酸化は、上述の参照方法により、強く促進された。シザンドリンＢにより、このＥＲＫリン酸化は、全く影響を受けなかった。従って、ＤＮＡ損傷に対する反応において、シザンドリンＢの有効性は、ＡＴＲ活性に高度に特異的であることが分かった。

本発明において、細胞に対するＵＶ照射で誘導されるＤＮＡ損傷応答反応（チェックポイント）におけるシザンドリンＢの効果を示した。ＡＴＲのノックアウトにより胚細胞は致死的であるので、ＡＴＲが哺乳類の発生に段階において重要な役割を演じることは予想されていた。これは、クロマチンの不安定化や、生体内で連続的に生成するラジカルに対するチェックポイントの欠損、さらには発生過程での細胞性ＤＮＡの複製ストレスによってもチェックポイントにＡＴＲが必須であることを示している。一方、ＡＴＲはＡＴＭのバックアップとしても機能するので、ＡＴ患者の細胞（遺伝的にＡＴＭが機能しない細胞）におけるチェックポイントを維持している。これらは、腫瘍発生を含む増殖性の細胞において、ＡＴＲプロテインキナーゼが大変重要であることを示している。シザンドリンＢは患者におけるＤＮＡ損傷チェックポイントをＡＴＲのキナーゼ活性阻害を介して阻止し得るので、本発明の知見により、放射線療法や化学療法などの抗癌治療に利点をもたらし得る。カフェインは、ＡＴＲに比べＡＴＭの活性を１／５のＩＣ_５０を有している。従って臨床における癌治療の際、シザンドリンＢ単独、又はカフェインとを組み合わせて放射線治療や抗癌剤療法を行うと、これらの感受性を顕著に増加させることが予想される。

非特許文献３は、化学療法剤又は放射線治療の補助として、臨床で試験的にカフェインを適用することを報告する。この文献は、カフェインで補助した治療により、化学療法剤又は放射線療法を個々に処理するよりも、骨肉腫の寸法を減少かつ最小限化したことを示す。この結果が示すのは、カフェインは、ＡＴＭ及びＡＴＲプロテインキナーゼ活性を阻害することであり、増殖する腫瘍の細胞周期のいずれにおいても、ＤＮＡ損傷に係るチェックポイントの阻害をもたらす。このことにより、シザンドリンＢで補助した化学療法及び放射線療法として、シザンドリンＢは、臨床で試験的に適用し得る可能性がある。さらなる検討に関し、カフェインの臨床試験と同時に、腫瘍を消失又は最小限化させることに関して効率化が可能かどうかについて、シザンドリンＢとの併用効果を試験する必要がある。特に、シザンドリンＢは、患者において、副作用が全くないかほとんどないことが期待される天然の植物抽出物中の成分である。上述のようなＡＴＭ又はＡＴＲ阻害剤は化学療法／放射線療法の投与量や線量を最低限に引き下げても、従来と同じかそれ以上の効果が期待されるので、化学療法／放射線療法に対してシザンドリンＢとカフェインとを組み合わせることにより、患者に対する副作用を最小限に抑えることが期待できる。

以上、本発明の好適な実施の形態により本発明を説明した。ここでは特定の具体例を示して本発明を説明したが、特許請求の範囲に定義された本発明の広範な趣旨および範囲から逸脱することなく、これら具体例に様々な修正および変更を加えることができることは明らかである。すなわち、具体例の詳細および添付の図面により本発明が限定されるものと解釈してはならない。

Claims

下記式（１）
に示す化合物を有効成分として含有することを特徴とするＡＴＲ阻害剤。
下記式（２）
に示す化合物を有効成分として含有することを特徴とするＡＴＲ阻害剤。
下記式（３）
に示す化合物を有効成分として含有することを特徴とするＡＴＲ阻害剤。
下記式（４）
に示す化合物を有効成分として含有することを特徴とするＡＴＲ阻害剤。
下記式（５）
に示す化合物を有効成分として含有することを特徴とするＡＴＲ阻害剤。
下記式（６）
に示す化合物を有効成分として含有することを特徴とするＡＴＲ阻害剤。
下記式（７）
に示す化合物を有効成分として含有することを特徴とするＡＴＲ阻害剤。
下記式（８）
に示す化合物を有効成分として含有することを特徴とするＡＴＲ阻害剤。
下記式（９）
に示す化合物を有効成分として含有することを特徴とするＡＴＲ阻害剤。
下記式（１０）
に示す化合物を有効成分として含有することを特徴とするＡＴＲ阻害剤。
前記ＡＴＲ活性は、タンパクリン酸化活性であることを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか一項に記載のＡＴＲ阻害剤。
前記タンパクリン酸化活性は、細胞周期関連タンパクをリン酸化する活性であることを特徴とする請求項１１に記載のＡＴＲ阻害剤。
前記細胞周期関連タンパクは、ｐ５３であることを特徴とする請求項１２に記載のＡＴＲ阻害剤。
前記細胞周期関連タンパクは、Ｂｒｃａ１及びＣｈｋ１からなる群から選択されたものであることを特徴とする請求項１２又は１３に記載のＡＴＲ阻害剤。