JPWO2007029302A1 - 生体高分子固定用基板及びそれを用いた生体高分子固定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】基板上の予め定められた位置に鎖状の生体高分子を伸長状態で固定する。【解決手段】予め定められた位置に貫通穴を複数有するマスク層２を平坦な活性面上にもつ生体高分子固定用の基板１に、鎖状の生体高分子７が含まれている溶液を接触させて、物理吸着又は化学結合により核酸分子７を貫通穴３内の活性面に固定させた後、マスク層２を溶媒にて溶解して除去し、貫通穴３内の活性面に固定された核酸分子７ａのみを残し、その後、活性面に固定された核酸分子７ａを伸長させる。【選択図】 図３Ａ

Description

本発明は、分子生物学、生化学、医学分野等でＤＮＡなどの鎖状生体高分子を直接観察するために基板に生体高分子を固定する方法と、その方法に用いる生体高分子固定用基板に関するものである。

走査型トンネル顕微鏡等の高空間分解能顕微鏡法を用いて、ＤＮＡなどの核酸分子等の鎖状生体高分子を単分子計測する科学分野において、基板に鎖状生体高分子を伸長させた状態で固定化することが必要であり、そのような試料作製法が存在する。

従来の試料作製法の１つとして、高配向性グラファイト等の基板に核酸分子溶液を滴下して核酸分子を固定した後、基板上の残存溶液を遠心力又は空気により吹き飛ばすことにより、核酸分子を伸長させていた。
また、核酸分子を基板上に固定した後、液体流れによるせん断力により核酸分子を伸長させたり、核酸分子の固定部位から後退する気液界面の表面張力を利用して核酸分子を基板で伸長させる方法も存在する（特許文献１、非特許文献１参照。）。
特開２００５−４９１７６号公報 D. C. G. Klein, L. Gurevich, J. W. Janssen, L. P. Kouwenhoven, J. D. Carbeck, and L. L. Sohn, "Ordered stretching of single molecules of deoxyribose nucleic acid between microfabricated polystyrene lines," Applied Physics letters, Volume 78, Number 16, 2001, pp. 2396-2398

従来技術に共通している点として、核酸分子の固定位置が全く任意であることが挙げられる。すなわち、走査型トンネル顕微鏡のように視野の狭い顕微鏡法においては、核酸分子の観察以前に核酸分子の発見までの所要時間を全く予測できないことを意味している。

図９は従来技術により、基板上に固定された核酸分子の模式図を示す。基板２０は平坦な表面をもち、その平坦な表面に核酸分子２２を含む溶液を接触させて固定した後、核酸分子２２を伸長させたものである。特に、基板２０の表面と接触する溶液の核酸分子濃度が低い場合には自己組織化の作用が小さいため、核酸分子２２の基板２０上での固定位置は全く無秩序になる。
そして、このように核酸分子の固定位置を制御できない方法では将来における産業応用の可能性も極めて少ないと言える。

本発明は基板上の予め定められた位置に鎖状の生体高分子を伸長状態で固定する方法と、その方法に用いるのに適する基板を提供することを目的とするものである。

本発明の生体高分子固定用基板は、平坦な表面をもち、その表面が生体高分子を物理吸着又は化学結合により固定することのできる活性面となっている基板と、前記活性面上に形成され、生体高分子を劣化させることのない溶媒によって除去することのできる材料からなり、予め定められた位置に開口幅１μｍ以下の貫通穴を複数有するマスク層とを備え、前記貫通穴底部の前記活性面に生体高分子を選択的に固定するようにしたものである。

本発明が対象とする生体高分子は、核酸分子（ＤＮＡ又はＲＮＡ）、ペプチド、タンパク質などであり、特に伸長して鎖状になる鎖状生体高分子である。
前記活性面の表面粗さは、生体高分子が伸長したときの分子半径よりも小さいことが好ましい。

前記活性面は特に限定されるものではないが、生体高分子を貫通穴内の薄膜に固定させる際に電場を利用できるようにするためには、活性面が導電性又は半導電性であり、マスク層が絶縁性であることが好ましい。

生体高分子を劣化させることのない溶媒とは、ＤＮＡやＲＮＡを変性されることのある強アルカリ性の溶媒を除く意味であり、弱アルカリ性、中性もしくは酸性の水溶液、又は有機溶媒である。マスク層を構成する材料はそのような溶媒で溶解することのできるものであれば特に限定されるものではない。

マスク層の一例は、半導体製造プロセスなどの微細加工の分野で使用されているレジスト層であり、電子ビーム露光、Ｘ線露光、光ビーム露光又はマスクを介した露光の後、現像液により所定の部分を除去することにより貫通穴が形成され、その後必要に応じてリンスとベーキングを経て形成されたものである。
マスク層の他の例は、貫通穴が形成された樹脂層であり、例えば成型により形成することができる。

本発明の方法は、以下の工程（Ａ）から（Ｃ）を備えて基板上の予め定められた位置に鎖状の生体高分子を伸長状態で固定する方法である。
（Ａ）本発明の生体高分子固定用基板に鎖状の生体高分子が含まれている溶液を接触させて、物理吸着又は化学結合により前記生体高分子を前記貫通穴内の前記活性面に固定させる工程、
（Ｂ）前記マスク層を溶媒にて溶解して除去し、前記貫通穴内の前記活性面に固定された前記生体高分子のみを残す工程、及び
（Ｃ）その後、前記活性面に固定された前記生体高分子を伸長させる工程。

活性面をもつ前記基板の好ましい一例は、鏡面研磨された表面をもつベース基板と、前記ベース基板の前記表面に形成され、生体高分子が固定されうる表面をもつ薄膜とから構成されており、前記薄膜の表面が活性面となっているものである。

工程（Ａ）の好ましい一例は、生体高分子固定用基板として活性面が導電性又は半導電性であり、マスク層が絶縁性であるものを使用し、活性面を一方の電極とし、生体高分子が含まれている溶液に対極を配置し、薄膜と溶液間に電圧を印加することにより電場によって生体高分子を貫通穴内の活性面に引き寄せるようにすることである。

工程（Ｃ）において生体高分子を伸長させる一例は、移動する気液界面から働く力によって生体高分子を伸長させる方法である。
工程（Ｃ）において生体高分子を伸長させる他の例は、電場により生体高分子を伸長させる方法である。

本発明の生体高分子固定用基板は、生体高分子が固定される位置がマスク層の貫通穴により予め定められているので、この基板を用いて生体高分子を固定すれば狭視野の顕微鏡を用いても発見が容易になる。

この基板は生体高分子が固定されうる活性面上に生体高分子を劣化させることのない溶媒によって除去することのできる材料からなる貫通穴を有するマスク層を備えているので、この基板を用いると、鎖状の生体高分子が含まれている溶液を接触させて生体高分子を活性面に固定させた後、そのマスク層を溶媒にて溶解して除去すれば貫通穴内の活性面に固定された生体高分子のみが残るので、その後に活性面に固定された生体高分子を伸長させることにより基板上の予め定められた位置に鎖状の生体高分子を伸長状態で固定することができる。

このように、核酸分子などの生体高分子を基板の予め定められた位置に直鎖状に伸長状態で固定できるため、狭い視野の顕微鏡を用いても容易に核酸分子を発見して観察することができる。

活性面の表面粗さを生体高分子が伸長したときの分子半径よりも小さくすれば、走査型トンネル顕微鏡のような高空間分解能顕微鏡法による生体高分子の単分子観察を行うための基板として適したものとなる。

活性面が導電性又は半導電性であり、マスク層が絶縁性である基板を使用し、電場によって生体高分子を貫通穴内の活性面に引き寄せるようにすれば、分子の複製操作を経ることなく少量分子数のままで濃縮固定が可能になる。その結果、例えば、走査型トンネル顕微鏡による観察のための核酸分子試料の提供が容易になる。

マスク層としてホトレジスト層を使用すれば、写真製版により予め定めた部分を所定の現像液によって選択的に除去することが容易であり、またそのような現像液の多くは生体高分子を劣化させることのない溶媒である。
マスク層として成型樹脂層を使用すれば、生体高分子を劣化させることのない有機溶媒により除去することができる。

図１は生体高分子固定用基板の一実施例を表わしたものである。
基板１は平坦な表面をもち、その表面が生体高分子を物理吸着又は化学結合により固定することのできる活性面となっている。基板１はベース基板として表面が鏡面研磨されたサファイア基板を用い、そのベース基板の鏡面研磨された表面に金膜が蒸着法により形成されており、その金膜の表面が活性面となっている。その金膜の膜厚は１５０ｎｍであり、基板温度を３５０℃にして蒸着したことにより金膜の表面が平坦化されており、ベース基板の表面の鏡面研磨と、金膜の蒸着時の加熱による平坦化によって、形成された金膜の算術平均粗さは０．１５ｎｍである。表面のこの算術平均粗さの大きさは、例えば生体高分子としてＤＮＡを固定し伸長させたときのリボヌクレオシドの分子半径よりも十分に小さい。

基板１の活性面上にマスク層２が形成されている。マスク層２は生体高分子を劣化させることのない溶媒によって除去することのできる材料からなり、マスク層２には予め定められた位置に開口幅１μｍ以下の貫通穴３が複数個形成されている。貫通穴３には生体高分子が固定されることになるが、走査型トンネル顕微鏡のような高空間分解能で狭視野の顕微鏡によってもその固定された生体高分子の位置を容易に探すことができるように、貫通穴３は規則的に配列されている。貫通穴３の底部には基板１の表面である活性面が露出し、その活性面に生体高分子が選択的に固定される。それらの貫通穴３に固定されたＤＮＡなどの生体高分子は、その後の伸長工程により、互いに干渉しないように同方向に向かって互いに平行に伸長させる。

マスク層２はこの実施例ではポジ型電子線レジスト層である。すなわち、基板１の表面にポジ型電子線レジストを塗布して形成し、電子線リソグラフィーによって１μｍ間隔に配置された内径５０〜４００ｎｍ、例えば１００ｎｍの貫通穴３を形成したものである。

マスク層２に形成される貫通穴３の形状は、図１の実施例の円形状貫通穴３に限らず、任意の形状にすることができる。例えば、図２の基板はそのような一例を示したものであり、マスク層２に線状の溝形状の貫通穴４が形成されたものを示している。

図２の基板では、貫通穴４の溝に沿って生体高分子が固定され、それらの貫通穴４に固定されたＤＮＡなどの生体高分子は、その後の伸長工程により、互いに干渉しないように溝の長さ方向と直交する方向に向かって互いに平行に伸長させる。

図１に示した基板を用いて核酸分子を固定する方法を図３Ａ〜図３Ｂに示す。
図３Ａはこの基板に鎖状の生体高分子である核酸分子７、例えばＤＮＡを含む溶液を接触させた状態を示している。核酸分子７はその溶液（図示略）中に浮遊しており、小さく折りたたまれた構造をもっている。基板に滴下された核酸分子７は物理吸着又は化学結合によって貫通穴３の底部の基板１の表面に固定される。

例えば、実施例では基板１がサファイア基板の表面を金膜で被ったものであるので、核酸分子７の末端をチオール化しておくことにより、核酸分子７は金チオール結合によって金膜表面に固定することができる。

貫通穴３の底部の基板１の表面に核酸分子７が固定される後、図３Ｂに示されるように、基板１の表面からレジスト層２を溶媒で除去すると、溶液中の余剰な核酸分子７や非特異的にレジスト層２に結合した核酸分子７も除去されて、貫通穴３のあった場所に位置特異的に固定された核酸分子７ａが残る。

図４Ａ〜図４Ｂに核酸分子を基板に固定する際に電場による核酸分子７の引き寄せをともなう核酸分子の固定方法を示す。
図４Ａ中の基板１ａはその表面の活性面が導電性又は半導電性であることを表わす。図１の実施例で示したサファイア基板の表面に金膜を形成した基板もこの基板１ａに該当する。また、基板全体が導電性又は半導電性の材質であって、その表面を鏡面研磨した基板もこの基板１ａに該当する。その基板１ａの表面に形成されたマスク層２ａは絶縁性であり、図１の実施例で示したレジスト層もこのマスク層２ａに該当するが、他の絶縁性のマスク層であってもよい。マスク層２ａには図１の実施例と同様に貫通穴３ａが形成されている。

核酸分子７を含む溶液（図示略）に対極として電極８を浸し、基板１ａの表面の活性面と電極８の間に電源９によって電圧を印加する。基板１ａの表面を正極とすると、負に帯電した核酸分子７を貫通穴３ａに特異的に集合させることができる。貫通穴３ａに集まった核酸分子７は物理吸着又は化学結合によって基板１ａの表面の活性面に固定される。

この場合も、例えば核酸分子７の末端をチオール化しておけば、基板１ａとして表面に金膜をもつサファイア基板を使用すると、貫通穴３ａに引き寄せられた核酸分子７は金チオール結合によって基板１ａに固定される。

次に、図４Ｂに示されるように、マスク層２ａを除去することによって、溶液中の余剰な核酸分子７や非特異的にマスク層２ａに結合した核酸分子７も除去されて、貫通穴３ａのあった場所に位置特異的に固定された核酸分子７ａが残る。

図５Ａ〜図５Ｃにより、基板１（又は基板１ａ）に固定された核酸分子７ａの伸長方法を説明する。
図５Ａは基板１の所定の位置（マスク層の貫通穴のあった位置）に核酸分子７ａが固定され、気液界面１０内にある状態を示している。

図５Ｂはその液体が流れるか蒸発することによって、その液体の後退によって気液界面１０から作用するメニスカス力又は液体のせん断力によって核酸分子７ａが直鎖状に伸長されて基板１に延びて行く状態を示している。核酸分子７ａは位置特異的に基板１に固定されているため、結果として図５Ｃに示されるように、核酸分子１１は伸長された状態で規則的に配置されて固定される。

図６は、図４Ａ〜図４Ｂに示した電場による核酸分子の引き寄せを行なった固定に続いて、電場によって核酸分子を伸長する方法を示したものである。マスク層２ａを除去した後、緩衝液（図には示されていないが、基板１ａ、核酸分子７ａ及び電極８ａはその緩衝液内にある。）を介して基板１ａと対極８ａを配置し、対極８ａを正極として電源９ａにより電圧を印加することによって、負に帯電した核酸分子７ａを正極に引き寄せて伸長する。その後、緩衝液を除去すれば、基板１ａ上に規則的に配列されて固定され、伸長された核酸分子７ａが得られる。

図７は核酸分子としてＤＮＡを固定した基板を、マスク層を除去する前の状態で示す原子間力顕微鏡像である。この例は、実施例１として示した金／サファイア基板１上に、開口幅１００ｎｍの貫通穴３が形成されたマスク層２としてレジストを形成した基板１を用いて、図４Ａ〜図４Ｂに示された電場による核酸分子７の引き寄せをともなう核酸分子の固定方法を適用した場合である。規則的に配列された白い点は、各貫通穴に固定された４８．５ｋｂｐ（ＤＮＡの長さを塩基対数で表して４８．５×１０³である。）のλＤＮＡを表している。

図８Ａは、図７に示した金／サファイア基板からマスク層２としてのレジストを除去し、さらに固定されたＤＮＡを伸長化した後の原子間力顕微鏡像である。
図８Ｂは図８Ａ中のＡ−Ｂ位置の断面形状を表わしたものであり、伸長されたＤＮＡを長さ方向に直交する方向に切断した形状を表わしている。この画像の高さ情報から、図８Ｂ中の白く伸びた画像は、ＤＮＡが伸長化されたものであると考えることができる。

実施例として挙げた金／サファイア基板による核酸分子の伸長固定方法は、核酸分子を導電性膜の上に固定できるため、走査型トンネル顕微鏡により核酸分子の塩基種を順に読み取って塩基配列を直接決定する塩基配列解析のためのＤＮＡ試料作製方法としても利用でき、医療分野におけるＤＮＡ分析の精度向上に寄与する。

本発明の基板及びそれを用いて生体高分子を伸長させて固定する方法は、分子生物学、生化学、医学分野等の分野において、走査型トンネル顕微鏡などの高分解能の顕微鏡によって生体高分子を観察するのに利用することができる。

一実施例の基板を示す概略斜視図である。 他の実施例の基板を示す概略斜視図である。 一実施例の基板を用いた核酸分子の固定方法の一実施例を示す概略斜視図であり、核酸分子を基板表面に固定する工程である。 同実施例を示す概略斜視図であり、マスク層を除去した後の状態である。 一実施例の基板を用いた核酸分子の固定方法の他の実施例を示す概略斜視図であり、核酸分子を基板表面に固定する工程である。 同実施例を示す概略斜視図であり、マスク層を除去した後の状態である。 基板に固定された核酸分子を伸長させる方法の一実施例を示す概略図であり、核酸分子が液体中にある状態を示す断面図である。 同実施例を示す概略図であり、その液体を後退させて拡散分子を伸長させる工程を示す断面図である。 同実施例を示す概略図であり、拡散分子を伸長させた後の基板を示す斜視図である。 基板に固定された核酸分子を伸長させる方法の他の実施例を示す概略断面図である。 核酸分子を固定した基板をマスク層を除去する前の状態で示す原子間力顕微鏡像である。 核酸分子を固定した基板からマスク層を除去し、さらにＤＮＡを伸長化した後の原子間力顕微鏡像である。 そのＡ−Ｂ線位置での断面形状を示すグラフである。 従来の方法により基板上に核酸分子を固定して伸長させた状態を示す概略斜視図である。

符号の説明

１，１ａ 基板
２，２ａ マスク層
３，３ａ，４ 貫通穴
７，７ａ，１１ 核酸分子
８．８ａ 電極
９，９ａ 電源
１０ 気液界面

Claims (11)

1. 平坦な表面をもち、その表面が生体高分子を物理吸着又は化学結合により固定することのできる活性面となっている基板と、
   前記活性面上に形成され、生体高分子を劣化させることのない溶媒によって除去することのできる材料からなり、予め定められた位置に開口幅１μｍ以下の貫通穴を複数有するマスク層とを備え、
   前記貫通穴底部の前記活性面に生体高分子を選択的に固定するための生体高分子固定用基板。
2. 前記活性面をもつ前記基板は、鏡面研磨された表面をもつベース基板と、
   前記ベース基板の前記表面に形成され、生体高分子が固定されうる表面をもつ薄膜とから構成されており、
   前記薄膜の表面が活性面となっている請求項１に記載の生体高分子固定用基板。
3. 前記活性面の表面粗さは、前記生体高分子が伸長したときの分子半径よりも小さい請求項１又は２に記載の生体高分子固定用基板。
4. 前記活性面は導電性又は半導電性であり、前記マスク層は絶縁性である請求項１から３のいずれかに記載の生体高分子固定用基板。
5. 前記マスク層は露光と現像の過程を経て前記貫通穴が形成されたレジスト層である請求項１から４のいずれかに記載の生体高分子固定用基板。
6. 前記マスク層は前記貫通穴が形成された樹脂層である請求項１から４のいずれかに記載の生体高分子固定用基板。
7. 以下の工程（Ａ）から（Ｃ）を備えて基板上の予め定められた位置に鎖状の生体高分子を伸長状態で固定する生体高分子固定方法。
   （Ａ）請求項１から６のいずれかに記載の生体高分子固定用基板に鎖状の生体高分子が含まれている溶液を接触させて、物理吸着又は化学結合により前記生体高分子を前記貫通穴内の前記活性面に固定させる工程、
   （Ｂ）前記マスク層を溶媒にて溶解して除去し、前記貫通穴内の前記活性面に固定された前記生体高分子のみを残す工程、及び
   （Ｃ）その後、前記活性面に固定された前記生体高分子を伸長させる工程。
8. 前記生体高分子固定用基板として前記活性面が導電性又は半導電性であり、前記マスク層が絶縁性であるものを使用し、
   前記工程（Ａ）において前記活性面を一方の電極とし、生体高分子が含まれている前記溶液に対極を配置し、前記活性面と前記溶液間に電圧を印加することにより電場によって前記生体高分子を前記貫通穴内の前記活性面に引き寄せる請求項７に記載の生体高分子固定方法。
9. 前記工程（Ｃ）において、移動する気液界面から働く力によって生体高分子を伸長させる請求項７又は８に記載の生体高分子固定方法。
10. 前記工程（Ｃ）において、電場により生体高分子を伸長させる請求項７又は８に記載の生体高分子固定方法。
11. 前記生体高分子は核酸分子である請求項７から１０のいずれかに記載の生体高分子固定方法。