JPWO2006109774A1 - 化粧料、フラーレンとγ−シクロデキストリンの複合体の製造方法、フラーレンとγ−シクロデキストリンの複合体溶液およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

フラーレンとγ−シクロデキストリンの複合体を含み、生体が紫外線を照射されることによって発生する活性酸素量を抑制する化粧料を、効率的に、かつ、安定して得る。
フラーレンと、フラーレンの質量の３倍以上８倍未満の質量のγ−シクロデキストリンとを乳鉢に投入し、乳鉢中で粉砕混合する。得られる固体混合物に溶剤を加える。混合液に超音波振動を与える。超音波振動が与えられた混合液を濾過する。この濾液が、フラーレンとγ−シクロデキストリンの複合体の溶液である。このフラーレンとγ−シクロデキストリンの複合体の溶液は、高濃度であっても細胞毒性が観測されず、また、活性酸素消去効果があった。このため、フラーレンとγ−シクロデキストリンの複合体、または、その溶液は、化粧料として有用である。

Description

本発明は、フラーレンとγ−シクロデキストリンを含有する化粧料、フラーレンとγ−シクロデキストリンの複合体の製造方法、および、フラーレンとγ−シクロデキストリンの複合体溶液の製造方法に関する。

フラーレンは水に溶けにくいため、フラーレンを官能基化することによって、または、フラーレンを包接することによって、水への溶解度を上げる研究が行われている。フラーレンを包接する物質として、γ―シクロデキストリン、ポリビニルピロリドン、または、水溶性カリックスアレーンなどが用いられてきた。

このうち、γ―シクロデキストリンは、Ｃ_６０の大きさに適した空孔を有し、Ｃ_６０とγ−シクロデキストリンが１：２である複合体（錯体）を形成する。このＣ_６０とγ―シクロデキストリンの複合体を水に溶かすと、高濃度の水溶液が得られる。Ｃ_６０とγ―シクロデキストリンの複合体を得る方法として、各種の方法が報告されている（非特許文献１、非特許文献２、および、非特許文献３参照）。

非特許文献１には、溶液中の反応によって、Ｃ_６０とγ―シクロデキストリンが１：２である水溶性の複合体が得られること、この場合、Ｃ_６０のトルエン溶液とγ―シクロデキストリンの水溶液とを混合して、２日間加熱する方法が優れていることが記載されている。

また、非特許文献２には、Ｃ_６０とγ―シクロデキストリンの混合物を、ボールミル中で２０時間粉砕し、その後、脱イオン水を加えてさらに１時間粉砕することによって、得られた上澄み液中にＣ_６０とγ―シクロデキストリンの複合体が溶解していることが記載されている。

さらに、非特許文献３には、高速振動粉砕装置を利用して、Ｃ_６０とＣ_６０の４倍量のγ―シクロデキストリンの混合物を１０分間高速振動粉砕し、得られた固体化合物に水を加えて濾過することによって、Ｃ_６０とγ―シクロデキストリンの複合体の水溶液を調製することが記載されている。

吉田（Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｚ）、他３名，"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｃ６０ ｗｉｔｈ γ-ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ"，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｎｇｌｉｓｈ，（ドイツ），１９９４年，第３３巻，ｐ．１５９７−１５９９ ブラウン（Ｂｒａｕｎ，Ｔ）、他４名，"Ｍｅｃｈａｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ： ａ ｎｏｖｅｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｆｕｌｌｅｒｅｎｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ． Ｗａｔｅｒ ｓｏｌｕｂｌｅ ｂｕｃｋｍｉｎｓｔｅｒｆｕｌｌｅｒｅｎｅ-γ-ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｖｉａ ａ ｓｏｌｉｄ-ｓｏｌｉｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ"，Ｓｏｌｉｄ Ｓｔａｔｅ Ｉｏｎｉｃｓ，（オランダ），１９９４年，第７４巻，ｐ．４７−５１ 小松（Ｋｏｍａｔｓｕ，Ｋ）、他３名，"Ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｆｕｌｌｅｒｅｎｅｓ ｂｙ ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ γ-ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ ａｎｄ ｓｕｌｆｏｃａｌｉｘ［８］ａｒｅｎｅ ｕｎｄｅｒ ｍｅｃｈａｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｈｉｇｈ-ｓｐｅｅｄ ｖｉｂｒａｔｉｏｎ ｍｉｌｌｉｎｇ"，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｐｅｒｋｉｎ ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ １，（イギリス），１９９９年，ｐ．２９６３−２９６６

しかしながら、非特許文献１に記載されている方法では、Ｃ_６０とγ―シクロデキストリンの複合体の水溶液の濃度は、高くても８×１０^−５ｍｏｌ／Ｌであり、非特許文献２に記載されている方法では、Ｃ_６０とγ―シクロデキストリンの複合体の水溶液の濃度は、１．５×１０^−４ｍｏｌ／Ｌである。なお、Ｃ_６０とγ―シクロデキストリンの複合体の水溶液を濃縮すると不安定になることが知られているため、低濃度の水溶液を濃縮して高濃度にするのは好ましくない。

また、非特許文献３に記載されている方法では、Ｃ_６０とγ―シクロデキストリンの複合体の水溶液の濃度が７×１０^−４ｍｏｌ／Ｌまで達するものの、Ｃ_６０とγ―シクロデキストリンの複合体の製造規模は、最大でも１ｇ程度である。

さらに、非特許文献１、非特許文献２、および、非特許文献３では、得られたＣ_６０とγ―シクロデキストリンの複合体の生体適合性については、言及されていない。

本発明は、上記の問題に鑑みてなされたもので、フラーレンとγ−シクロデキストリンの複合体を、効率的に、かつ、安定して得ることを目的とする。また、生体が紫外線を照射されることによって発生する活性酸素量を抑制する化粧料を提供することを目的とする。

本発明の第１の態様の化粧料は、少なくともフラーレンおよびγ−シクロデキストリンが溶解している溶液を有効成分とするものである。この溶液は、少なくともフラーレンとγ−シクロデキストリンの複合体が溶解しており、フラーレンとγ−シクロデキストリンの複合体の濃度は、６００ｐｐｍ以上または３０００ｐｐｍ以下とすることができる。

この構成によれば、生体が紫外線を照射されることによって発生する活性酸素量を抑制することができる。

本発明の第２の態様の化粧料は、凹面を有する部材の凹面と凸面を有する部材の凸面との間に、少なくともフラーレンおよびγ−シクロデキストリンを配置する配置工程と、凹面を有する部材と凸面を有する部材とでフラーレンおよびγ−シクロデキストリンを押圧しながら、凹面と凸面を相対的に移動させる粉砕混合工程と、を有する調製方法によって得られる固体混合物を有効成分とするものである。

本発明の第３の態様の化粧料は、凹面を有する部材の凹面と凸面を有する部材の凸面との間に、少なくともフラーレンおよびγ−シクロデキストリンを配置する配置工程と、凹面を有する部材と凸面を有する部材とでフラーレンおよびγ−シクロデキストリンを押圧しながら、凹面と凸面を相対的に移動させる粉砕混合工程と、粉砕混合工程で得られる固体混合物に溶剤を加える添加工程と、添加工程によって得られる第１の混合液に超音波振動を与える超音波処理工程と、超音波処理工程によって得られる第２の混合液を濾過する工程と、を有する調製方法によって得られる溶液を有効成分とするものである。

第２または第３の態様の化粧料において、配置工程で配置するフラーレンおよびγ−シクロデキストリンは、粉体または塊の形状を有しており、この粉体または塊の数平均粒径は、１ｎｍ以上１０ｎｍ以下であることが好ましく、１ｎｍ以上２ｎｍ以下であることがより好ましい。

第２または第３の態様の化粧料において、配置工程で配置するγ−シクロデキストリンの質量は、好ましくは配置工程で配置するフラーレンの質量の３倍以上８倍以下、より好ましくは５倍以上７倍以下とすることができる。

第２または第３の態様の化粧料において、凹面を有する部材は乳鉢で、凸面を有する部材は乳棒であってもよい。また、粉砕混合工程では、モース硬度６．５以上の凹面を有する部材とモース硬度６．５以上の凸面を有する部材とでフラーレンおよびγ−シクロデキストリンを押圧してもよい。

また、第１から第３の態様の化粧料において、フラーレンは、Ｃ_６０、Ｃ_７０、または、Ｃ_６０とＣ_７０の混合物を含んでいてもよい。

これらの構成によって、生体が紫外線を照射されることによって発生する活性酸素量を抑制する化粧料を容易に得ることができる。

本発明の第４の態様のフラーレンとγ−シクロデキストリンの複合体の製造方法は、凹面を有する部材の凹面と凸面を有する部材の凸面との間に、少なくともフラーレンおよびγ−シクロデキストリンを配置する配置工程と、凹面を有する部材と凸面を有する部材とでフラーレンおよびγ−シクロデキストリンを押圧しながら、凹面と凸面を相対的に移動させる粉砕混合工程と、を有するものである。

本発明の第５の態様のフラーレンとγ−シクロデキストリンの複合体溶液の製造方法は、凹面を有する部材の凹面と凸面を有する部材の凸面との間に、少なくともフラーレンおよびγ−シクロデキストリンを配置する配置工程と、凹面を有する部材と凸面を有する部材とでフラーレンおよびγ−シクロデキストリンを押圧しながら、凹面と凸面を相対的に移動させる粉砕混合工程と、粉砕混合工程で得られる固体混合物に溶剤を加える添加工程と、添加工程によって得られる第１の混合液に超音波振動を与える超音波処理工程と、超音波処理工程によって得られる第２の混合液を濾過する工程と、を有するものである。

これらの方法によれば、フラーレンとγ−シクロデキストリンの複合体、または、この複合体の高濃度の溶液を、効率的に、かつ、安定して得られる。

本発明の第６の態様のフラーレンとγ−シクロデキストリンの複合体溶液の製造方法は、凹面を有する部材の凹面と凸面を有する部材の凸面との間に、少なくともフラーレンおよびγ−シクロデキストリンを配置する配置工程と、凹面を有する部材と凸面を有する部材とでフラーレンおよびγ−シクロデキストリンを押圧しながら、凹面と凸面を相対的に移動させる粉砕混合工程と、粉砕混合工程で得られる固体混合物に溶剤を添加する溶剤添加工程と、溶剤添加工程によって得られる混合液を乾燥させる乾燥工程と、乾燥工程によって得られる固体混合物に溶剤を加える溶剤再添加工程と、溶剤再添加工程によって得られる混合液を乾燥させる再乾燥工程と、再乾燥工程により得られる固体混合物に水を添加する水溶化工程と、水溶化工程によって得られる混合液に超音波振動を与える超音波処理工程と、超音波処理工程によって得られる混合液を濾過する工程と、を有する。本発明の第６の態様において、溶剤再添加工程および再乾燥工程を２回以上繰り返してもよい。また、溶剤添加工程および溶剤再添加工程において、溶剤としてエタノールが用いられてもよい。
これらの方法によれば、フラーレンとγ−シクロデキストリンの複合体溶液を、より効率的に、かつ、安定的に高濃度化することができる。

本発明によれば、フラーレンとγ−シクロデキストリンの複合体が、効率的に、かつ、安定して得られる。また、生体が紫外線を照射されることによって発生する活性酸素量を抑制する化粧料が得られる。

Ｃ_６０とγ−シクロデキストリンの複合体水溶液のＵＶ／可視光吸収スペクトルを示すグラフである。 フラライトとγ−シクロデキストリンの複合体水溶液、および、ビタミンＣ水溶液の各種濃度における細胞生存率を示すグラフである。 フラライトとγ−シクロデキストリンの複合体、および、安定型ビタミンＣを投与したときの細胞内部に生じるパーオキシド・過酸化水素の量を示すグラフである。 実施例５の方法で得られたＣ_６０とγ−シクロデキストリンの複合体水溶液の吸収スペクトルを示すグラフである。 過酸化水素水滴下前の実施例５に係るＣ_６０とγ−シクロデキストリンの複合体水溶液の２００〜９００ｎｍの波長領域における吸収スペクトルを示すグラフである。 過酸化水素水の２００〜９００ｎｍの波長領域における吸収スペクトルを示すグラフである。 過酸化水素水滴下後の実施例５に係るＣ_６０とγ−シクロデキストリンの複合体水溶液における吸収ピーク（波長：３３２ｎｍ）の経時変化を示すグラフである。

本発明の実施の形態に係る化粧料の有効成分は、少なくともフラーレンおよびγ−シクロデキストリンが溶解している溶液、または、フラーレンとγ−シクロデキストリンの複合体である。フラーレンは、Ｃ_６０単体、Ｃ_７０単体、Ｃ_６０とＣ_７０の混合物、すなわち、フラライト、または、炭素原子数が７０を超えるハイヤーフラーレンであってもよいし、Ｃ_６０、Ｃ_７０、フラライト、または、ハイヤーフラーレンを高純度で、例えば、９９質量％以上含んだものであってもよい。

γ−シクロデキストリンは、Ｄ−グルコースが８単位からなる環状化合物である。γ−シクロデキストリンは、空洞直径が０．９ｎｍから１．０ｎｍであるため、Ｄ−グルコースが６単位からなるα−シクロデキストリン（空洞直径：０．６ｎｍ）、または、Ｄ−グルコースが７単位からなるβ−シクロデキストリン（空洞直径：０．７ｎｍから０．８ｎｍ）と比べて、Ｃ_６０（直径：０．７ｎｍ）またはＣ_７０を包接するのに適している。このため、γ−シクロデキストリンは、フラライトと錯体を形成しやすく、フラライトを効率的に水溶化できる。

フラーレンおよびγ−シクロデキストリンを溶解する溶媒としては、純水、精製水、もしくは、イオン交換水等の水、グリセリン等の多価アルコール、もしくは、ラウリルアルコール等の高級アルコールなどのアルコール類、または、アジピン酸ジイソブチル、オレイン酸デシル、もしくは、クエン酸トリエチル等のエステル類が挙げられる。

一般に、フラーレンおよびγ−シクロデキストリンは、フラーレンとγ−シクロデキストリンの複合体として溶解している。溶液中のフラーレンとγ−シクロデキストリンの複合体の濃度は、好ましくは３０ｐｐｍ以上、より好ましくは６００ｐｐｍ以上で、３０００ｐｐｍ以下である。

３０ｐｐｍ以上であれば、生体が紫外線を照射されることによって発生する活性酸素量を抑制する効果を発揮すると考えられる。６００ｐｐｍ以上であれば、後述するように、生体が紫外線を照射されることによって発生する活性酸素量を抑制することができる。また、３０００ｐｐｍ以下であれば、後述するように、細胞毒性がほとんどない。なお、フラーレンとγ−シクロデキストリンの複合体の水溶液の濃度は、３０ｐｐｍ、６００ｐｐｍ、および、３０００ｐｐｍが、それぞれ１×１０^−５ｍｏｌ／Ｌ、２×１０^−４ｍｏｌ／Ｌ、および、１×１０^−３ｍｏｌ／Ｌに相当する。

このフラーレンとγ−シクロデキストリンの複合体は、以下の調製方法によって得られる。すなわち、まず、フラーレンと、γ−シクロデキストリンとを凹面を有する部材の凹面と凸面を有する部材の凸面との間に配置する。フラーレンおよびγ−シクロデキストリンは、粉体または塊の形状を有しており、この粉体または塊の数平均粒径は、好ましくは１ｎｍ以上１０ｎｍ以下であり、より好ましくは１ｎｍ以上２ｎｍ以下である。なお、フラーレンとγ−シクロデキストリン以外の添加物が存在してもよい。また、γ−シクロデキストリンの質量は、好ましくはフラーレンの質量の３倍以上８倍以下、より好ましくは５倍以上７倍以下の質量である。

次に、凹面を有する部材と凸面を有する部材とでフラーレンおよびγ−シクロデキストリンを押圧しながら、凹面と凸面を相対的に移動させる。これにより、フラーレンおよびγ−シクロデキストリンは粉砕されると共に、徐々に均一化された混合物となる。この粉砕混合工程においては、モース硬度６．５以上の凹面を有する部材とモース硬度６．５以上の凸面を有する部材を用い、フラーレンおよびγ−シクロデキストリンを押圧するのが好ましい。

凹面を有する部材および凸面を有する部材としては、それぞれ乳鉢および乳棒が挙げられる。更に、使用できる乳鉢としては、鋳鉄製のもの、メノウ等のＳｉＯ_２を主成分とするもの、または、炭化タングステンを主材料とした合金等の超硬質合金製のものが挙げられる。乳棒も、乳鉢と同じ材料のものが使用できる。この混合時間は、数十分、典型的な例では、約１０分程度でよい。従来の方法の数十時間と比べて、はるかに短い時間で、しかも、複雑な、または、高価な装置を用いることなくフラーレンとγ−シクロデキストリンの複合体を得ることができる。

また、フラーレンとγ−シクロデキストリンの複合体の溶液を得るには、更に以下の工程を行う。すなわち、上述の粉砕混合工程で得られる固体混合物に溶剤を加える。次に、溶剤を加えて得られる第１の混合液に超音波振動を与える。次に、この超音波処理によって得られる第２の混合液を濾過する。濾過して得られる濾液がフラーレンとγ−シクロデキストリンの複合体の溶液である。

第１の混合液に超音波振動を与える方法としては、第１の混合液中に超音波振動子を入れ、この超音波振動子によって超音波を発振する方法、または、底面もしくは壁面の外側に超音波振動子が設けられた容器内の液体中に、第１の混合液が入った容器を入れ、この超音波振動子によって超音波を発振する方法などが挙げられる。第１の混合液に超音波振動を与える時間は、数分間、例えば、約５分間とすることができる。

（実施例１：Ｃ_６０とγ−シクロデキストリンの複合体および複合体溶液の製造）
純度９９．５％のバックミンスターフラーレンＣ_６０（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）１０ｍｇと、γ−シクロデキストリン（Ｗａｋｏ社製）７０ｍｇを乳鉢に入れ、この乳鉢中で乳棒を用いて約５分間混合した。その結果、黄土色の固体混合物が得られた。次に、濃度が２０ｇ／Ｌとなるように、この固体混合物に純水を添加した。純水は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製のＭｉｌｌｉ−Ｑ Ａｃａｄｅｍｉｃによって製造されたものを用いた（以下、この方法によって得られた純水を「Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水」ということがある）。

次に、この固体混合物にＭｉｌｌｉ−Ｑ水を添加して得られた混合液に、ブランソン社製の超音波振動装置（ＢＲＡＮＳＯＮＩＣ ５５１０Ｊ-ＭＨ）を用いて、約５分間超音波振動を与えた。以下の実施例においても、この超音波振動装置を用いた。その後、この超音波振動が与えられた混合液を濾過した。得られた濾液は、無色透明からわずかに赤紫色を呈する水溶液であった。

（実施例２：Ｃ_６０とγ−シクロデキストリンの複合体水溶液中のＣ_６０含有量分析）
実施例１の方法で得られた固体混合物４０ｍｇに、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水２ｍＬを加え、約５分間超音波振動を与えた。得られた混合液を、シリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製のＳｔｅｒｉｌｅ Ｍｉｌｌｅｘ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ 孔径０．２２μｍ）を用いて濾過した。得られた濾液、すなわち、Ｃ_６０とγ−シクロデキストリンの複合体水溶液を濃度が１／５となるようにＭｉｌｌｉ−Ｑ水で希釈した。この希釈水溶液の吸収スペクトルをＵＶ／可視分光計（日本分光社製、Ｕｂｅｓｔ−３０型）によって測定した。この吸収スペクトルを図１に示す。

図１に示すように、この水溶液は、Ｃ_６０に特徴的な紫外可視吸収を有しており、Ｃ_６０が溶解していることが確認された。また、λ_ｍａｘ＝３３２ｎｍにおけるＣ_６０とγ−シクロデキストリンの複合体水溶液の吸光度が希釈前で２．１１２であったことから、Ｃ_６０とγ−シクロデキストリンの複合体中のＣ_６０の含有量は、４．０６×１０^−５ｍｏｌ／Ｌと算出された。なお、この水溶液には、過剰のγ−シクロデキストリンも含まれている。

このＣ_６０の含有量の算出は、Ｌａｍｂｅｒｔ Ｂｅｅｒ法に基づく。すなわち、吸光度のＯＤ値Ａと、モル吸光係数ε（Ｌ／ｍｏｌ・ｃｍ）および濃度Ｃ（ｍｏｌ／Ｌ）との関係式：Ａ＝εＣＬ（Ｌは光路長（ｃｍ））に従って算出した。なお、この算出には、λ_ｍａｘ＝３３２ｎｍにおけるＣ_６０のシクロヘキサン溶液の既知のモル吸光係数ε＝５．１９×１０^４Ｌ／ｍｏｌ・ｃｍを用いた。

フラーレンとしてＣ_６０単体を用いたが、Ｃ_７０単体、または、Ｃ_６０とＣ_７０の混合物であるフラライトを用いても、同様な方法によって、フラーレンとγ−シクロデキストリンの複合体を極めて簡易に得ることができる。なお、可視光吸収がほとんどないＣ_６０とγ−シクロデキストリンの複合体は、一般に可視光吸収により活性酸素種が発生する可能性が指摘されている他のフラーレンとγ−シクロデキストリンの複合体と比べて、皮膚に塗布する化粧料として極めて好適と考えられる。

（実施例３：フラライトとγ−シクロデキストリンの複合体水溶液の生体適合性）
本実施例では、フラライトとγ−シクロデキストリンの複合体水溶液の生体適合性を細胞レベルから検証した。まず、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）−１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ）培地を用い、ヒト皮膚角化細胞（ＨａＣａＴ）を播種後２４時間培養した。次に、各種濃度のフラライトとγ−シクロデキストリンの複合体水溶液、および、ビタミンＣ水溶液をこの培地に投与し、２４時間培養した。次に、各種試料投与２４時間後の生細胞生存率を測定した。なお、生細胞生存率の測定は、市販のＷＳＴ−１試薬（同仁化学研究所製）を用いた。この結果を図２のグラフに示す。

グラフ縦軸は、ミトコンドリア脱水素酵素によって還元されて生じた黄色ホルマザリンの４５０ｎｍにおける吸光度を吸光プレートリーダーで測定し、その吸光度から算出した細胞生存率（Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（Ａ４５０））を示す。また、グラフ横軸のγ−ＣＤ／Ｆｕｌｌｅｒｅｎｅ、および、Ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄは、それぞれフラライトとγ−シクロデキストリンの複合体水溶液、および、ビタミンＣ水溶液を示す。また、グラフ横軸の数値は、フラライトとγ−シクロデキストリンの複合体水溶液、および、ビタミンＣ水溶液の濃度を示す。なお、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は対照データ、すなわち、濃度０のときのデータである。

図２に示すように、フラライトとγ−シクロデキストリンの複合体水溶液では、３０００ｐｐｍ（１×１０^−３ｍｏｌ／Ｌ）の高濃度でも生細胞生存率に影響を及ぼさないことが分かった。これに対して、３００ｐｐｍを超えるビタミンＣ水溶液では、細胞毒性が顕著に観測された。なお、フラライトとγ−シクロデキストリンの複合体に代えて、Ｃ_６０またはＣ_７０とγ−シクロデキストリンの複合体を用いた場合でも同様に、高濃度における生細胞生存率への影響がほとんどない。

（実施例４：フラライトとγ−シクロデキストリンの複合体水溶液の活性酸素発生の抑制）
本実施例では、フラライトとγ−シクロデキストリンの複合体水溶液の紫外線Ｂ波（ＵＶＢ）照射に伴う活性酸素発生の抑制効果について検証した。すなわち、細胞に紫外線Ｂ波を照射し細胞内にパーオキシド・過酸化水素を発生させて、フラライトとγ−シクロデキストリンの複合体が、発生したパーオキシド・過酸化水素の活性酸素を消去する量を測定および評価した。

この測定は、以下の手順で行った。まず、ヒト皮膚角化細胞（ＨａＣａＴ）に、レドックス指示薬としてのＣＤＣＦＨ−ＤＡ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−２'，７'−ｄｉｃｈｌｏｒｏｄｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ）、および、フラライトとγ−シクロデキストリンの複合体（γ−ＣＤ／Ｆｕｌｌｅｒｅｎｅ）溶液（濃度：２００μｍｏｌ／Ｌ（６００ｐｐｍ））、もしくは、市販の化粧品に含有される安定型ビタミンＣ（Ａｓｃ２ＰＮａ：ｓｏｄｉｕｍ Ｌ−ａｓｃｏｒｂｙｌ−２−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）溶液（濃度：１００μｍｏｌ／Ｌ）を導入し培養した。

次に、この培養されたＨａＣａＴに、紫外線Ｂ波を２０Ｊ／ｃｍ^２で照射し、ＣＤＣＦＨ−ＤＡが酸化されて発する蛍光の強度を、蛍光プレートリーダー装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ／Ｐｅｒｃｅｐｔｉｖｅ社製の２３５０型）で計測した。なお、２０Ｊ／ｃｍ^２の紫外線Ｂ波を照射した場合、細胞内部に生じるパーオキシド・過酸化水素の量は照射後４分で最大値となり、その後すぐに減少することから、速やかに計測操作を行った。この結果を図３に示す。グラフ縦軸の数値は、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」、すなわち、γ−ＣＤ／ＦｕｌｌｅｒｅｎｅおよびＡｓｃ２ＰＮａを導入しなかったときの蛍光の強度を１００％とした相対的な蛍光の強度を示している。

図３に示すように、ヒト皮膚角化細胞（ＨａＣａＴ）にあらかじめフラライトとγ−シクロデキストリンの複合体水溶液を投与しておくと、あらかじめＡｓｃ２ＰＮａを投与しておいた場合と同様に、フラライトとγ−シクロデキストリンの複合体水溶液中の細胞内で発生する活性酸素量が約６０％に減少することが観察された。すなわち、フラライトとγ−シクロデキストリンの複合体は、Ａｓｃ２ＰＮａと同等以上の活性酸素消去効果があることが分かった。

したがって、フラライトとγ−シクロデキストリンの複合体は、化粧料としての用途が有用であると考えられる。なお、フラライトとγ−シクロデキストリンの複合体に代えて、Ｃ_６０またはＣ_７０とγ−シクロデキストリンの複合体を用いた場合でも同様に、活性酸素消去効果がある。

以上より、本実施の形態に係るフラーレンとγ−シクロデキストリンの複合体の簡易な製造方法は、極めて単純かつ実用性の高い手法である。また、この製造方法によって得られたフラーレンとγ−シクロデキストリンの複合体水溶液は、生体適合濃度範囲内において紫外線Ｂ波照射に対する酸化ストレス抑制効果を発揮した。したがって、この製造方法が化粧料としてのフラーレンとγ−シクロデキストリンの複合体の適用性を具現化すると考えられる。

（実施例５：Ｃ６０とγ−シクロデキストリンの複合体および複合体溶液の製造）
純度９９．５％のバックミンスターフラーレンＣ_６０（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）１０ｍｇと、γ−シクロデキストリン（Ｗａｋｏ社製）７０ｍｇを乳鉢に入れ、この乳鉢中で乳棒を用いて約５分間混合した。得られた茶色の固体粉末混合物に、エタノール（約２０ｍＬ）を加えて混練した後、室温〜５０度程度で一昼夜乾燥させた。得られた灰黒色の固体混合物を粉砕し、エタノール（約２０ｍＬ）を加えて再混練した後、室温〜５０℃程度で一昼夜放置しエタノールを留去した。なお、上述した一連の粉砕・エタノール混練・乾燥作業をさらに繰り返してもよいし、エタノールを留去するために５０〜６０℃程度の乾燥器内で乾燥させてもよい。最終的に得られた黄土色〜淡紫色の固体混合物に純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）を添加し、２０ｇ／Ｌの濃度の混合液を得た。得られた混合液に、超音波振動装置を用いて、約５分間超音波振動を与えた。超音波処理が施された褐色の混合液をシリンジフィルタ（０．２２μｍ）で濾過した。得られた濾液は、淡紫色〜僅かに赤紫色を呈する水溶液であった。

本実施例では、フラーレンとしてＣ_６０単体を用いたが、Ｃ_７０単体、または、Ｃ_６０とＣ_７０の混合物であるフラライトを用いても、同様な方法によって、フラーレンとγ−シクロデキストリンの高濃度複合体水溶液を極めて簡易に得ることができる。

（Ｃ_６０とγ−シクロデキストリンの複合体水溶液中のＣ_６０含有量分析）
実施例５の方法で得られたＣ_６０とγ−シクロデキストリンの複合体水溶液をＭｉｌｌｉ−Ｑ水で１／２０に希釈した。この希釈水溶液の吸収スペクトルをＵＶ／可視分光計（日本分光社製、Ubest V-550型）によって測定した。この吸収スペクトルを図４に示す。

図４に示すように、この複合体水溶液は、Ｃ_６０に特徴的な紫外可視吸収を有しており、Ｃ_６０が水溶化していることが確認された。また、複合体水溶液のλ_ｍａｘ＝３３２ｎｍにおける吸光度は１．６８７９であった。λ_ｍａｘ＝３３２ｎｍにおけるＣ_６０シクロヘキサン中の既知のモル吸光係数ε＝５．１９×１０^４Ｌ／ｍｏｌ・ｃｍを用いると、Ｃ_６０とγ−シクロデキストリンの複合体中のＣ_６０の含有量は、６５．０×１０^−５ｍｏｌ／Ｌと算出された。なお、この水溶液には、過剰のγ−シクロデキストリンも含まれている。

（過酸化水素水添加によるＣ_６０とγ−シクロデキストリンの複合体水溶液の色変化）
上述したように、実施例５の方法で得られたＣ_６０とγ−シクロデキストリンの複合体水溶液（６５．０×１０^−５ｍｏｌ／Ｌ）は淡紫色〜僅かに赤紫色を呈する。Ｃ_６０とγ−シクロデキストリンの複合体水溶液が淡紫色〜僅かに赤紫色を呈するのは、Ｃ_６０とγ−シクロデキストリンの複合体が高濃度であることに起因する。Ｃ_６０とγ−シクロデキストリンの複合体が呈する色は、Ｃ_６０がラジカルを消去することに伴って変化する。このため、実施例５の方法で得られたＣ_６０とγ−シクロデキストリンの複合体水溶液は、ラジカルの存在あるいはラジカル消去を示す試薬として用いることができる。

以下、実施例５の方法で得られたＣ_６０とγ−シクロデキストリンの複合体水溶液に過酸化水素水を添加したときの色の経時変化を調べた結果を説明する。具体的には、実施例５の方法で得られたＣ_６０とγ−シクロデキストリンの複合体水溶液に過酸化水素水を一滴添加し、Ｃ_６０の特徴的な吸収ピーク（波長：３３２ｎｍ）の強度をモニターした。なお、参考として、図５および図６に、それぞれ、過酸化水素水滴下前の実施例５に係るＣ_６０とγ−シクロデキストリンの複合体水溶液および過酸化水素水の２００〜９００ｎｍの波長領域における吸収スペクトルを示す。図５および図６から分かるように、波長３３２ｎｍの吸収スペクトルはＣ_６０特有の吸収波長である。図７は、過酸化水素水滴下後の実施例５に係るＣ_６０とγ−シクロデキストリンの複合体水溶液における吸収ピーク（波長：３３２ｎｍ）の経時変化を示す。図７からわかるように、実施例５に係るＣ_６０とγ−シクロデキストリンの複合体水溶液の波長３３２ｎｍにける吸光度は過酸化水素水滴下後に単調に減少している。これは、Ｃ_６０が滴下された過酸化水素水に起因するラジカルを消去することにともない、Ｃ_６０が分解した結果であると考えられる。

本発明によれば、フラーレンとγ−シクロデキストリンの複合体が、効率的に、かつ、安定して得られる。また、生体が紫外線を照射されることによって発生する活性酸素量を抑制する化粧料が得られる。

Claims (18)

1. 少なくともフラーレンおよびγ−シクロデキストリンが溶解している溶液を有効成分とする化粧料。
2. 前記溶液は、少なくともフラーレンとγ−シクロデキストリンの複合体が溶解しており、前記フラーレンとγ−シクロデキストリンの複合体の濃度は、６００ｐｐｍ以上３０００ｐｐｍ以下であることを特徴とする請求項１記載の化粧料。
3. 凹面を有する部材の凹面と凸面を有する部材の凸面との間に、少なくともフラーレンおよびγ−シクロデキストリンを配置する配置工程と、
   前記凹面を有する部材と前記凸面を有する部材とで前記フラーレンおよび前記γ−シクロデキストリンを押圧しながら、前記凹面と前記凸面を相対的に移動させる粉砕混合工程と、
   を有する調製方法によって得られる固体混合物を有効成分とする化粧料。
4. 凹面を有する部材の凹面と凸面を有する部材の凸面との間に、少なくともフラーレンおよびγ−シクロデキストリンを配置する配置工程と、
   前記凹面を有する部材と前記凸面を有する部材とで前記フラーレンおよび前記γ−シクロデキストリンを押圧しながら、前記凹面と前記凸面を相対的に移動させる粉砕混合工程と、
   前記粉砕混合工程で得られる固体混合物に溶剤を加える添加工程と、
   前記添加工程によって得られる第１の混合液に超音波振動を与える超音波処理工程と、
   前記超音波処理工程によって得られる第２の混合液を濾過する工程と、
   を有する調製方法によって得られる溶液を有効成分とする化粧料。
5. 前記配置工程で配置するフラーレンおよびγ−シクロデキストリンは、粉体または塊の形状を有しており、この粉体または塊の数平均粒径は、１ｎｍ以上１０ｎｍ以下であることを特徴とする請求項３または４記載の化粧料。
6. 前記配置工程で配置するフラーレンおよびγ−シクロデキストリンは、粉体または塊の形状を有しており、この粉体または塊の数平均粒径は、１ｎｍ以上２ｎｍ以下であることを特徴とする請求項４または５記載の化粧料。
7. 前記配置工程で配置する前記γ−シクロデキストリンの質量は、前記配置工程で配置する前記フラーレンの質量の３倍以上８倍以下であることを特徴とする請求項３から６のいずれか１項記載の化粧料。
8. 前記配置工程で配置する前記γ−シクロデキストリンの質量は、前記配置工程で配置する前記フラーレンの質量の５倍以上７倍以下であることを特徴とする請求項３から６のいずれか１項記載の化粧料。
9. 前記凹面を有する部材は乳鉢で、前記凸面を有する部材は乳棒であることを特徴とする請求項３から８のいずれか１項記載の化粧料。
10. 前記粉砕混合工程において、モース硬度６．５以上の凹面を有する部材とモース硬度６．５以上の凸面を有する部材とで前記フラーレンおよび前記γ−シクロデキストリンを押圧することを特徴とする請求項３から９のいずれか１項記載の化粧料。
11. 前記フラーレンは、Ｃ_６０を含むことを特徴とする請求項１から１０のいずれか１項記載の化粧料。
12. 前記フラーレンは、Ｃ_７０を含むことを特徴とする請求項１から１１のいずれか１項記載の化粧料。
13. 凹面を有する部材の凹面と凸面を有する部材の凸面との間に、少なくともフラーレンおよびγ−シクロデキストリンを配置する配置工程と、
    前記凹面を有する部材と前記凸面を有する部材とで前記フラーレンおよび前記γ−シクロデキストリンを押圧しながら、前記凹面と前記凸面を相対的に移動させる粉砕混合工程と、
    を有することを特徴とするフラーレンとγ−シクロデキストリンの複合体の製造方法。
14. 凹面を有する部材の凹面と凸面を有する部材の凸面との間に、少なくともフラーレンおよびγ−シクロデキストリンを配置する配置工程と、
    前記凹面を有する部材と前記凸面を有する部材とで前記フラーレンおよび前記γ−シクロデキストリンを押圧しながら、前記凹面と前記凸面を相対的に移動させる粉砕混合工程と、
    前記粉砕混合工程で得られる固体混合物に溶剤を加える添加工程と、
    前記添加工程によって得られる第１の混合液に超音波振動を与える超音波処理工程と、
    前記超音波処理工程によって得られる第２の混合液を濾過する工程と、
    を有することを特徴とするフラーレンとγ−シクロデキストリンの複合体溶液の製造方法。
15. 凹面を有する部材の凹面と凸面を有する部材の凸面との間に、少なくともフラーレンおよびγ−シクロデキストリンを配置する配置工程と、
    前記凹面を有する部材と前記凸面を有する部材とで前記フラーレンおよび前記γ−シクロデキストリンを押圧しながら、前記凹面と前記凸面を相対的に移動させる粉砕混合工程と、
    前記粉砕混合工程で得られる固体混合物に溶剤を添加する溶剤添加工程と、
    前記溶剤添加工程によって得られる混合液を乾燥させる乾燥工程と、
    前記乾燥工程によって得られる固体混合物に溶剤を加える溶剤再添加工程と、
    前記溶剤再添加工程によって得られる混合液を乾燥させる再乾燥工程と、
    前記再乾燥工程により得られる固体混合物に水を添加する水溶化工程と、
    前記水溶化工程によって得られる混合液に超音波振動を与える超音波処理工程と、
    前記超音波処理工程によって得られる混合液を濾過する工程と、
    を有することを特徴とするフラーレンとγ−シクロデキストリンの複合体溶液の製造方法。
16. 前記溶剤再添加工程および再乾燥工程を２回以上繰り返すことを特徴とする請求項１５に記載のフラーレンとγ−シクロデキストリンの複合体溶液の製造方法。
17. 前記溶剤添加工程および前記溶剤再添加工程において、前記溶剤としてエタノールが用いられることを特徴とする請求項１５または１６に記載のフラーレンとγ−シクロデキストリンの複合体溶液の製造方法。
18. ラジカル種の存在を示す試薬として用いられることを特徴とする請求項１３から１７のいずれかに記載の複合体溶液の製造方法によって製造されたフラーレンとγ−シクロデキストリンの複合体溶液。
    

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