JPWO2006095474A1 - 非天然アミノ酸及び／又はヒドロキシ酸含有化合物の製造方法 - Google Patents

Abstract

タンパク質翻訳系において、選択された天然アミノ酸Ｘと該アミノ酸Ｘに対するｔＲＮＡとの結合を阻害する条件下で、非天然アミノ酸又はヒドロキシ酸化合物と前記アミノ酸Ｘに対するｔＲＮＡとの複合体を形成し、タンパク質翻訳反応条件下に翻訳を行なわせることを特徴とする、非天然アミノ酸及び／又はヒドロキシ酸含有化合物の製造方法、並びにそのキット。本発明により、単離されたｍＲＮＡ又はクローン化されたＤＮＡから得られたｍＲＮＡを用いて、簡便に、非天然アミノ酸及び／又はヒドロキシ酸含有化合物を製造することができる。

Description

本発明は、非天然アミノ酸及び／又はヒドロキシ酸含有化合物の製造方法及びそのキットに関する。

近年、部位特異的変異導入法による野生型タンパク質の改変により、自然にはみられない新たな活性を有するタンパク質、野生型タンパク質とは大きく構造の異なるタンパク質の創製が試みられている。

かかる部位特異的変異導入法によるタンパク質の改変は、野生型タンパク質のアミノ酸配列への天然アミノ酸の導入、例えば、野生型タンパク質に本来存在するアミノ酸を他の天然アミノ酸と置換すること、野生型タンパク質に天然アミノ酸を付加すること等に基づくものである。

一方、野生型タンパク質のアミノ酸配列への非天然アミノ酸の導入は、例えば、人工ＲＮＡを鋳型とし、非天然アミノ酸のコドンとして「ストップコドン」を利用すること〔非特許文献１を参照〕、人工ＲＮＡを鋳型とし、非天然アミノ酸の遺伝暗号として「４連塩基」を利用すること〔特許文献１、非特許文献２を参照〕等により行なわれている

しかし、「ストップコドン」を利用する場合、例えば、大腸菌においては、ストップコドンが３種あり（ＵＡＧ、ＵＡＡ、ＵＧＡ）、１つはストップコドンとして機能させる必要があるため、残りの２つしか使用できない。したがって、最大２種の非天然アミノ酸の導入しかできないという欠点がある。

また、「４連塩基」を利用する場合、実用的に使用するには、レアコドンを選択する必要があるため、最大でも１度に２種の非天然アミノ酸の導入しかできないという欠点がある。
国際公開第２００４／００９７０９号パンフレット Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４４巻、第１８２頁、１９８９年発行 ＲＮＡミーティング依頼講演４要旨、宍戸昌彦、「蛋白質生合成系の有機化学的拡張と合成生命体への挑戦」日本ＲＮＡ学会

本発明は、１つの側面では、天然のＲＮＡを鋳型として用いること、簡便に、アミノ酸配列へ非天然アミノ酸及び／又はヒドロキシ酸を導入すること、アミノ酸配列への非天然アミノ酸の導入に際し、任意のセンスコドンを利用すること、多数のコドンへの非天然アミノ酸及び／又はヒドロキシ酸の割り当てを行なうこと、天然アミノ酸と非天然アミノ酸及び／又はヒドロキシ酸との任意の組合せによる所望のポリペプチド及び／又はポリエステルを得ること等の少なくとも１つを達成する、非天然アミノ酸及び／又はヒドロキシ酸含有化合物の製造方法を提供することにある。また、本発明は、簡便に、アミノ酸配列へ非天然アミノ酸及び／又はヒドロキシ酸を導入すること、多数のコドンへの非天然アミノ酸及び／又はヒドロキシ酸の割り当てを行なうこと、天然アミノ酸と非天然アミノ酸及び／又はヒドロキシ酸との任意の組合せによる所望のポリペプチド及び／又はポリエステルを得ること等の少なくとも１つを達成する、非天然アミノ酸及び／又はヒドロキシ酸含有化合物の製造用キットを提供することにある。

すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕 タンパク質翻訳系において、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンからなる群より選択されたアミノ酸Ｘと該アミノ酸Ｘに対するｔＲＮＡとの結合を阻害する条件下で、非天然アミノ酸又はヒドロキシ酸化合物と前記アミノ酸Ｘに対するｔＲＮＡとの複合体を形成し、タンパク質翻訳反応条件下に翻訳を行なわせることを特徴とする、非天然アミノ酸及び／又はヒドロキシ酸含有化合物の製造方法、
〔２〕 アミノ酸Ｘに特異的なアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素に対する阻害物質により、アミノ酸Ｘに対するｔＲＮＡと、アミノ酸Ｘとの結合を阻害する、前記〔１〕記載の製造方法、
〔３〕 該阻害物質が、５’−Ｏ−［Ｎ−（アミノアシル）スルファモイル］アデノシン誘導体化合物である、前記〔２〕記載の製造方法、
〔４〕 （Ａ）タンパク質翻訳系において、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンからなる群より選択されたアミノ酸Ｘに対するｔＲＮＡと該アミノ酸Ｘとの結合を阻害する条件下に、さらに該アミノ酸Ｘ以外のアミノ酸Ｙに対するｔＲＮＡと該アミノ酸Ｙとを結合させる工程、並びに
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）で得られた産物と、鋳型となるｍＲＮＡとを用い、非天然アミノ酸又はヒドロキシ酸化合物とアミノ酸Ｘに対するｔＲＮＡとの複合体の存在下、タンパク質翻訳反応条件下に翻訳を行なわせる工程、
を含む、前記〔１〕〜〔３〕いずれか１項に記載の製造方法、
〔５〕 １）アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンからなる群より選択されたアミノ酸Ｘに特異的なアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素に対する阻害物質と、
２）非天然アミノ酸及び／又はヒドロキシ酸化合物と、
３）タンパク質翻訳系と、
を含有してなる、前記〔１〕〜〔４〕いずれか１項に記載の非天然アミノ酸及び／又はヒドロキシ酸含有化合物の製造方法に用いるためのキット、
〔６〕 阻害物質が、５’−Ｏ−［Ｎ−（アミノアシル）スルファモイル］アデノシン誘導体化合物である、前記〔５〕記載のキット、並びに
〔７〕 非天然アミノ酸及び／又はヒドロキシ酸化合物に代えて、非天然アミノ酸−ｔＲＮＡ及び／又はヒドロキシ酸化合物−ｔＲＮＡを含有してなる、前記〔５〕又は〔６〕記載のキット、
に関する。

本発明の非天然アミノ酸及び／又はヒドロキシ酸含有化合物の製造方法によれば、簡便に、アミノ酸配列へ非天然アミノ酸及び／又はヒドロキシ酸化合物を導入することができ、アミノ酸配列への非天然アミノ酸及び／又はヒドロキシ酸化合物の導入に際し、任意のセンスコドンを利用し、多数のコドンへ非天然アミノ酸を割り当てることができ、天然アミノ酸と非天然アミノ酸及び／又はヒドロキシ酸化合物との任意の組合せによる所望のポリペプチド及び／又はポリエステルを得ることができるという優れた効果を奏する。また、本発明の非天然アミノ酸及び／又はヒドロキシ酸含有化合物の製造方法に用いるためのキットによれば、簡便に、アミノ酸配列へ非天然アミノ酸及び／又はヒドロキシ酸化合物を導入することができ、多数のコドンへ非天然アミノ酸及び／又はヒドロキシ酸化合物を割り当てることができ、天然アミノ酸と非天然アミノ酸及び／又はヒドロキシ酸化合物との任意の組合せによる所望のポリペプチド及び／又はポリエステルを得ることができるという優れた効果を奏する。

図１は、Ｐｈｅ−ＳＡを用いるイン・ビトロ原核生物翻訳系又はＰｈｅ−ＳＡを用いないイン・ビトロ原核生物翻訳系におけるＤＨＦＲ［６］生産及びＤＨＦＲ［０］生産のウエスタンブロット解析の結果を示す図である。図中、レーン１は、対照、レーン２〜７は、５μＭ Ｐｈｅ−ＳＡ非存在下、レーン８−１３は、５μＭ Ｐｈｅ−ＳＡ存在下における結果を示す。また、レーン３、６、９及び１２は、３０分のプレインキュベーション、レーン４、７、１０及び１３は、６０分のプレインキュベーションの結果を示す。レーン２〜４及びレーン８〜１０は、ＤＨＦＲ［６］であり、レーン５〜７及びレーン１１〜１３は、ＤＨＦＲ［０］である。

図２は、インヒビターＰｈｅ−ＳＡ（５μＭ）とサプレッサーＮａｐ−ｔＲＮＡ^Ｐｈｅ _ＧＡＡ（０．５μｇ／μＬ））の存在又は非存在下での５０℃で３０分間のプレインキュベーション後に、翻訳されたＤＨＦＲ［１］のウエスタンブロット解析の結果を示す。図中、レーン１は、鋳型なし、レーン２は、鋳型が存在し、かつインヒビター非存在、レーン３は、鋳型及びインヒビター共に存在、レーン４は、鋳型、インヒビター及びサプレッサー存在の場合の結果である。

図３は、ＰｈｅコドンをＮａｐ導入対象コドンとした場合のＮａｐ含有ハイブリッドポリペプチドの形成を調べたＭＡＬＤＩマススペクトルの結果を示す図である。

図４は、ＩｌｅコドンをＮａｐ導入対象コドンとした場合のＮａｐ含有ハイブリッドポリペプチドの形成を調べたＭＡＬＤＩマススペクトルの結果を示す図である。

図５は、ＶａｌコドンをＮａｐ導入対象コドンとした場合のＮａｐ含有ハイブリッドポリペプチドの形成を調べたＭＡＬＤＩマススペクトルの結果を示す図である。上段は、Ｖａｌ−ＳＡ（−）、Ｎａｐ−ｔＲＮＡ_ＣＡＣ（−）条件下での結果を示し、下段は、Ｖａｌ−ＳＡ（＋）、Ｎａｐ−ｔＲＮＡ_ＣＡＣ（＋）条件下での結果を示す。

図６は、ＩｌｅコドンをＢｐｈ導入対象コドンとした場合のＢｐｈ含有ハイブリッドポリペプチドの形成を調べたＭＡＬＤＩマススペクトルの結果を示す図である。上段は、Ｉｌｅ−ＳＡ（−）、Ｂｐｈ−ｔＲＮＡ_ＧＡＵ（−）条件下での結果を示し、下段は、Ｉｌｅ−ＳＡ（＋）、Ｂｐｈ−ｔＲＮＡ_ＧＡＵ（＋）条件下での結果を示す。

図７は、ＶａｌコドンをＩｄｏ導入対象コドンとした場合のＩｄｏ含有ハイブリッドポリペプチドの形成を調べたＭＡＬＤＩマススペクトルの結果を示す図である。上段は、Ｖａｌ−ＳＡ（−）、Ｉｄｏ−ｔＲＮＡ_ＣＡＣ（−）条件下での結果を示し、下段は、Ｖａｌ−ＳＡ（＋）、Ｉｄｏ−ｔＲＮＡ_ＣＡＣ（＋）条件下での結果を示す。

図８は、ＰｈｅコドンをＰｈｅＯＨ導入対象コドンとした場合の産物について、希釈アンモニア水を用いたアルカリ加水分解により調べた結果を示す図である。図中、パネル（ａ）は、ＰｈｅＯＨ−ｔＲＮＡ非存在下、パネル（ｂ）は、ＰｈｅＯＨ−ｔＲＮＡ存在下、パネル（ｃ）は、ＰｈｅＯＨ−ｔＲＮＡ及びＰｈｅ−ＳＡ存在下、（ｄ）は、ＰｈｅＯＨ−ｔＲＮＡ及びＰｈｅ−ＳＡ存在下、かつプレインキュベーションの場合の結果を示す。

図９は、ＰｈｅコドンをＮａｐ導入対象コドンとした場合のＮａｐ含有ハイブリッドポリペプチドの形成を調べたＭＡＬＤＩマススペクトルの結果を示す図である。上段は、Ｐｈｅ−ＳＡ（−）、Ｎａｐ−ｔＲＮＡ_ＧＡＡ（−）条件下での結果を示し、下段は、Ｐｈｅ−ＳＡ（＋）、Ｎａｐ−ｔＲＮＡ_ＧＡＡ（＋）条件下での結果を示す。

図１０は、ＩｌｅコドンをＢｐｈ導入対象コドンとした場合のＢｐｈ含有ハイブリッドポリペプチドの形成を調べたＭＡＬＤＩマススペクトルの結果を示す図である。上段は、Ｉｌｅ−ＳＡ（−）、Ｂｐｈ−ｔＲＮＡ_ＧＡＵ（−）条件下での結果を示し、下段は、Ｉｌｅ−ＳＡ（＋）、Ｂｐｈ−ｔＲＮＡ_ＧＡＵ（＋）条件下での結果を示す。

図１１は、ＰｈｅコドンをＮａｐ導入対象コドン、ＩｌｅコドンをＢｐｈ導入対象コドンとした場合のＮａｐ及びＢｐｈ含有ハイブリッドポリペプチドの形成を調べたＭＡＬＤＩマススペクトルの結果を示す図である。上段は、ＳＡ（−）、非天然アミノ酸−ｔＲＮＡ（−）条件下での結果を示し、下段は、ＳＡ（＋）、非天然アミノ酸−ｔＲＮＡ（＋）条件下での結果を示す。

本明細書において、「天然アミノ酸」とは、生体内におけるコドンによりコードされるアミノ酸であり、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンを意味する。なお、本明細書においては、アラニンを、Ａｌａ又はＡ；アルギニンを、Ａｒｇ又はＲ、アスパラギンを、Ａｓｎ又はＮ；アスパラギン酸を、Ａｓｐ又はＤ、システインを、Ｃｙｓ又はＣ；グルタミン酸を、Ｇｌｕ又はＥ；グルタミンを、Ｇｌｎ又はＱ；グリシンを、Ｇｌｙ又はＧ；ヒスチジンを、Ｈｉｓ又はＨ、イソロイシンを、Ｉｌｅ又はＩ；ロイシンを、Ｌｅｕ又はＬ；リジンを、Ｌｙｓ又はＫ；メチオニンを、Ｍｅｔ又はＭ；フェニルアラニンを、Ｐｈｅ又はＦ；プロリンを、Ｐｒｏ又はＰ；セリンを、Ｓｅｒ又はＳ；スレオニンを、Ｔｈｒ又はＴ；トリプトファンを、Ｔｒｐ又はＷ；チロシンを、Ｔｙｒ又はＹ；バリンを、Ｖａｌ又はＶと表記する場合がある。

前記「非天然アミノ酸」とは、アミノ酸骨格を有する化合物であり、前記天然アミノ酸を除く化合物を意味する。さらに、前記「アミノ酸骨格」とは、アミノ酸中のカルボキシル基と、アミノ基と、該カルボキシル基と該アミノ基とを連結する部分とから構成される部分を意味する。

本発明の製造方法に用いられうる非天然アミノ酸としては、特に限定されないが、リボソームを介した導入を行なえる化合物であればよく、具体的には、例えば、β−アミノ酸等の主鎖長の異なる化合物、ナフチルアラニン、ビフェニルアラニン、アンスラリルアラニンのように広い芳香環面を持つ化合物、アジドチロシンのように高い反応基を有する化合物等が挙げられる。

なお、本発明においては、前記アミノ酸及び非天然アミノ酸のようにアミド結合を介して重合する化合物の他、例えば、エステル結合等を介して重合する化合物を用いることもできる。かかる化合物としては、リボソームを介した導入を行なえる化合物であればよく、特に限定されないが、例えば、α−ヒドロキシ酸、β−ヒドロキシ酸等のヒドロキシ酸化合物が挙げられ、より具体的には、フェニルアラニンヒドロキシ類縁体、３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピオン酸等が挙げられる。

本明細書において、非天然アミノ酸含有化合物とは、前記非天然アミノ酸の部分を、化学結合（アミド結合）を介して有する化合物を意味する。また、ヒドロキシ酸含有化合物とは、前記ヒドロキシ酸化合物の部分を、エステル結合等を介して有する化合物をいい、ヒドロキシ酸の誘導体をも包含する。

本発明は、１つの側面では、タンパク質翻訳系において、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンからなる群より選択されたアミノ酸Ｘと該アミノ酸Ｘに対するｔＲＮＡとの結合を阻害する条件下で、非天然アミノ酸又はヒドロキシ酸化合物と前記アミノ酸Ｘに対するｔＲＮＡとの複合体を形成し、タンパク質翻訳反応条件下に翻訳を行なわせることを特徴とする、非天然アミノ酸及び／又はヒドロキシ酸含有化合物の製造方法に関する。

本発明の非天然アミノ酸及び／又はヒドロキシ酸含有化合物の製造方法は、タンパク質合成過程におけるアミノ酸と該アミノ酸に対するｔＲＮＡとの結合、すなわち、ｔＲＮＡのアミノアシル化の過程において、選択されたアミノ酸に対するｔＲＮＡと該アミノ酸との結合を阻害することに１つの大きな特徴がある。

そのため、本発明の製造方法によれば、前記選択されたアミノ酸に代わる非天然アミノ酸又はヒドロキシ酸化合物と前記ｔＲＮＡとの複合体を形成させ、タンパク質翻訳系による翻訳を行なうことができる。

また、本発明の製造方法は、ｔＲＮＡのアミノアシル化の過程において、選択されたアミノ酸に対するｔＲＮＡと該アミノ酸との結合を阻害し、該選択されたアミノ酸に代わる非天然アミノ酸又はヒドロキシ酸化合物を前記ｔＲＮＡに結合させ、タンパク質翻訳系による翻訳を行なうことに１つの大きな特徴がある。

したがって、本発明の製造方法によれば、生体から単離した特定のポリペプチドをコードするＤＮＡ又はその転写産物であるｍＲＮＡをそのままの状態で鋳型として用いることができる。さらに、本発明の製造方法によれば、簡便な操作で、所望のアミノ酸配列へ非天然アミノ酸又はヒドロキシ酸化合物を導入することができる。また、本発明の製造方法によれば、アミノ酸配列への非天然アミノ酸の導入に際し、任意のセンスコドンを利用し、多数のコドンへ非天然アミノ酸又はヒドロキシ酸化合物を割り当てることができる。さらに、本発明の製造方法によれば、天然アミノ酸と非天然アミノ酸又はヒドロキシ酸化合物との任意の組合せによる所望のポリペプチド及び／又はポリエステルを簡便に得ることができる。

本発明の製造方法においては、天然のｔＲＮＡが用いられているため、天然アミノ酸に対するｔＲＮＡの種類にあわせ、最大２０種の非天然アミノ酸及び／又はヒドロキシ酸を用いることができる。

本発明の製造方法においては、アミノ酸Ｘに対するｔＲＮＡとアミノ酸Ｘとの結合の阻害は、例えば、前記アミノ酸Ｘに特異的なアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素に対する阻害物質により、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を阻害し、それにより、アミノ酸Ｘに対するｔＲＮＡと、アミノ酸Ｘとの結合を阻害すること等により行なわれうる。

前記のように、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を阻害する場合、特定のｔＲＮＡのアミノアシル化を阻害することができ、任意のセンスコドンを、非天然アミノ酸及び／又はヒドロキシ酸化合物に割り当てることができ、多数のコドンへの非天然アミノ酸及び／又はヒドロキシ酸化合物の割り当てが可能になる点で有利である。すなわち、本発明の製造方法においては、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を阻害することにより、天然アミノ酸と非天然アミノ酸及び／又はヒドロキシ酸化合物との任意の組合せで、所望のポリペプチド及び／又はポリエステル、およびタンパク質を合成することができる。

前記阻害物質としては、例えば、下記式（Ｉ）：

〔式中、Ｒは、アラニン残基、アルギニン残基、アスパラギン残基、アスパラギン酸残基、システイン残基、グルタミン酸残基、グルタミン残基、グリシン残基、ヒスチジン残基、イソロイシン残基、ロイシン残基、リジン残基、メチオニン残基、フェニルアラニン残基、プロリン残基、セリン残基、スレオニン残基、トリプトファン残基、チロシン残基及びバリン残基からなる群より選ばれたアミノ酸残基を示す〕
で示される５’−Ｏ−［Ｎ−（アミノアシル）スルファモイル］アデノシン誘導体化合物、５’−Ｏ−［Ｎ−（アミノアシル）スルファミド］アデノシン誘導体等；５’−Ｏ−［Ｎ−（アミノアシル）スルファメート］アデノシン誘導体等のアミノアシル−ＡＴＰ類縁体；ミュピロシン、フラノマイシン、シスペンタシン等のアミノアシル化反応阻害を目的とする抗生物質等が挙げられる。また、本発明においては、前記阻害物質として、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素に対する抗体又はその断片、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素に対するＤＮＡアプタマー等も使用されうる。

前記５’−Ｏ−［Ｎ−（アミノアシル）スルファモイル］アデノシン誘導体化合物としては、例えば、下記式（ＩＩ）：

で示される５’−Ｏ−［Ｎ−（フェニルアラニル）スルファモイル］アデノシン（Ｐｈｅ−ＳＡ）、下記式（ＩＩＩ）：

で示される５’−Ｏ−［Ｎ−（イソロイシニル）スルファモイル］アデノシン（Ｉｌｅ−ＳＡ）等が挙げられる。

本発明の製造方法においては、アミノ酸Ｘに対するｔＲＮＡと、アミノ酸Ｘとの結合の阻害は、前記アミノ酸Ｘに特異的なアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素に対する阻害物質の存在下に、タンパク質翻訳系を予めインキュベーションすること（プレインキュベーション）により行なわれうる。

前記プレインキュベーションの時間は、特に限定されないが、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を阻害するに十分な時間であればよい。例えば、前記Ｐｈｅ−ＳＡを用いる場合、インキュベーションは、デアシル化反応を十分に行なう観点から、３０分以上、好ましくは、６０分以上、より好ましくは、９０分以上であることが望ましく、タンパク質翻訳活性を十分に発揮させる観点から、１２０分以下、好ましくは、９０分以下、より好ましくは、６０分以下であることが望ましい。

前記プレインキュベーションの温度は、特に限定されないが、好ましくは、３７〜５０℃が望ましい。

本発明の製造方法に用いられる「タンパク質翻訳系」としては、ｔＲＮＡ、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、リボソーム、アミノ酸、ＡＴＰ、ＧＴＰ、Ｍｇ^２＋、Ｋ^＋、リリースファクター、リボソームリサイクリングファクター、エロンゲーションファクター等、真核生物のタンパク質翻訳系においては、クレアチンリン酸、クレアチンリンサンキナーゼ等、大腸菌のタンパク質翻訳系においては、ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸キナーゼ等を少なくとも含有した反応系が挙げられる。

前記５’−Ｏ−［Ｎ−（アミノアシル）スルファモイル］アデノシン誘導体化合物等の阻害物質は、大腸菌等の生細胞とともにインキュベーションされることにより、該細胞内に浸透し、対応するアミノ酸に特異的なアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を阻害することができる。従って、前記成分を含有する反応系である限り、本発明の製造方法に用いられる「タンパク質翻訳系」としては、生細胞を使用してもよいし、無細胞タンパク質翻訳系を使用してもよい。

前記のタンパク質翻訳系として使用され得る生細胞としては、大腸菌、酵母、植物培養細胞、昆虫培養細胞、動物培養細胞、超高熱菌等が挙げられる。かかる生細胞をタンパク質翻訳系として使用する態様は、簡便に大量の非天然アミノ酸及び／又はヒドロキシ酸含有化合物が得られるという点において有効である。また、前記「無細胞タンパク質翻訳系」としては、例えば、大腸菌由来の無細胞抽出液、超高熱菌由来の無細胞抽出液、小麦由来の無細胞抽出液、ウサギ由来の無細胞抽出液等が挙げられる。

本発明の製造方法において、非天然アミノ酸又はヒドロキシ酸化合物とアミノ酸Ｘに対するｔＲＮＡとの複合体は、タンパク質翻訳系において形成させうる。また、非天然アミノ酸又はヒドロキシ酸化合物とアミノ酸Ｘに対するｔＲＮＡとの複合体は、例えば、
１）非天然アミノ酸又はヒドロキシ酸化合物とジヌクレオチドｐｄＣｐＡとを結合させて、非天然アミノ酸−ｐｄＣｐＡ又はヒドロキシ酸化合物−ｐｄＣｐＡを得る工程、及び
２）特定のアミノ酸に対する、３’末端のＣＡジヌクレオチドを欠損したｔＲＮＡ（ｔＲＮＡ−ＣＡ）と、前記非天然アミノ酸−ｐｄＣｐＡ又はヒドロキシ酸化合物−ｐｄＣｐＡとを連結する工程、
を含む方法や、非天然アミノ酸及びヒドロキシ酸化合物をｔＲＮＡに連結できる改変アミノアシル化酵素（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６（２００５）２２７−２３８）等の酵素を用いる方法によっても得られうる。
作業の容易性および経済性の観点から、「タンパク質翻訳系」として、生細胞を使用する場合は、酵素を用いる方法を使用して、非天然アミノ酸又はヒドロキシ酸化合物とアミノ酸Ｘに対するｔＲＮＡとの複合体を形成させることが好ましい。

前記工程１）における非天然アミノ酸とｐｄＣｐＡとの結合に際して、非天然アミノ酸のアミノ基に、ｔ−ブトキシカルボニル基、光脱保護能のあるＮＶＯＣ基等を導入して保護し、さらに、得られた産物をシアノメチルエステル化すればよい。なお、得られた産物は、各種クロマトグラフィーにより適宜精製されうる。また、前記工程１）におけるヒドロキシ酸化合物とｐｄＣｐＡとの結合に際して、ヒドロキシ酸の水酸基にジメトキシトリチル基等を導入して保護し、さらに、得られた産物をシアノメチルエステル化すればよい。なお、得られた産物は、各種クロマトグラフィーにより適宜精製されうる。

前記ｐｄＣｐＡは、ホスホロアミダイト法等により得られうる。得られたｐｄＣｐＡは、各種クロマトグラフィーにより適宜精製されうる。

前記工程１）において、非天然アミノ酸又はヒドロキシ酸化合物とｐｄＣｐＡとの結合後、得られた産物について、脱保護をすればよい。なお、得られた非天然アミノ酸又はヒドロキシ酸−ｐｄＣｐＡは、各種クロマトグラフィーにより適宜精製されうる。

前記特定のアミノ酸に対するｔＲＮＡ−ＣＡは、例えば、イン・ビトロ系において転写反応を行ったのちゲル精製することにより、作製されうる。

工程２）において、前記非天然アミノ酸−ｐｄＣｐＡ又はヒドロキシ酸化合物−ｐｄＣｐＡと、前記特定のアミノ酸に対するｔＲＮＡ−ＣＡとは、例えば、リガーゼを用いることにより連結させることができる。

前記「タンパク質翻訳反応条件」としては、用いられるタンパク質翻訳系の種類により異なるが、例えば、大腸菌のタンパク質翻訳系の場合、３７℃で６０分、４２℃で３０分等の条件が挙げられる。

本発明の製造方法は、より具体的には、例えば、（Ａ）タンパク質翻訳系において、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンからなる群より選択されたアミノ酸Ｘに対するｔＲＮＡと、該選択されたアミノ酸Ｘとの結合を阻害する条件下に、該アミノ酸Ｘ以外のアミノ酸Ｙに対するｔＲＮＡと該アミノ酸Ｙとを結合させる工程、並びに
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）で得られた産物と、鋳型となるｍＲＮＡとを用い、非天然アミノ酸又はヒドロキシ酸化合物とアミノ酸Ｘに対するｔＲＮＡとの複合体の存在下、タンパク質翻訳反応条件下に翻訳を行なわせる工程、
を含むプロセスにより行なわれうる。

本発明の製造方法によれば、種々の材料化学、特に、非天然型アミノ酸の化学的性質を利用したナノテクノロジーなどの基礎研究分野への応用、生体の生命機能を発現させる様々な生体分子、例えば、タンパク質の化学的機能に着目した人工タンパク分子デバイス等の創製等が期待される。

本発明は、他の側面では、１）前記アミノ酸Ｘに特異的なアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素に対する阻害物質と、
２）非天然アミノ酸及び／又はヒドロキシ酸化合物と、
３）タンパク質翻訳系と、
を含有した、本発明の非天然アミノ酸及び／又はヒドロキシ酸含有化合物の製造方法に用いるためのキットに関する。

本発明のキットにおける阻害物質と、非天然アミノ酸及び／又はヒドロキシ酸化合物とタンパク質翻訳系とは、前記と同様である。

本発明のキットは、前記阻害物質と非天然アミノ酸、ヒドロキシ酸化合物とタンパク質翻訳系とを含有することに１つの大きな特徴がある。したがって、本発明のキットによれば、本発明の製造方法を簡便に行なうことができる。また、本発明のキットによれば、アミノ酸配列へ非天然アミノ酸及び／又はヒドロキシ酸化合物を導入することができ、多数のコドンへ非天然アミノ酸及び／又はヒドロキシ酸化合物を割り当てることができ、天然アミノ酸と非天然アミノ酸及び／又はヒドロキシ酸化合物との任意の組合せによる所望のポリペプチドを得ることができる。

本発明のキットは、前記２）の非天然アミノ酸に代えて、非天然アミノ酸−ｔＲＮＡ及び／又はヒドロキシ酸化合物−ｔＲＮＡを含有してもよい。また、本発明のキットは、適宜、タンパク質翻訳系に必要な各種試薬を含有してもよい。

以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

調製例１
（１）Ｎ−Ｂｏｃ−Ｌ−ナフチルアラニン シアノメチルエステルの調製
Ｎ−Ｂｏｃ−Ｌ−ナフチルアラニン〔１．０ｍｍｏｌ、ワタナベケミカル（Ｗａｔａｎａｂｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）社製〕３００ｍｇを、トリエチルアミン（２当量）とクロロアセトニトリル（３当量）との混合物に溶解させ、得られた溶液を、室温で１２時間撹拌した。その後、得られた産物に、酢酸エチル１００ｍＬを添加し、ついで、１Ｍ 重硫酸ナトリウム水溶液を添加して、抽出を行なった。得られた有機層を、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、重硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧乾燥させ、それにより、収率８６％で黄色の粉末 ３０４ｍｇを得た。

得られた黄色の粉末の化合物を、商品名：Ｖａｒｉａｎ Ｍｅｒｃｕｒｙ ４００（４００ＭＨｚ）スペクトロメーターに供し、^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを得た。結合定数（Ｊ値）をＨｚで示す。ケミカルシフトを、内部標準として残存クロロホルム（ｄ＝７．２４）を用いて、テトラメチルシランからの低磁場のｐｐｍで示す。また、得られた黄色の粉末の化合物を、商品名：ＪＭＳ ＤＸ−３００スペクトロメーター（ＪＥＯＬ社製）に供し、ＦＡＢマススペクトルを得た。

得られた^１Ｈ ＮＭＲスペクトルのケミカルシフトは、^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３、３００Ｈｚ）ｄ＝７．８２（ｍ，３Ｈ），７．６２（ｓ，１Ｈ），７．４８（ｍ，２Ｈ），７．２９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．５），４．９４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８），４．７４（ｍ，３Ｈ），３．２８（ｍ，２Ｈ），１．４０（ｓ，９Ｈ）である。また、ＦＡＢマススペクトルにより、分子量３５４と算出された。

（２）Ｌ−ナフチルアラニルｐｄＣｐＡの調製
化学リン酸化試薬（商品名：Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ〔グレンリサーチ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）社製〕）、デオキシシトシンホスホロアミダイト〔グレンリサーチ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）社製〕）、及びＣＰＧ固定化アデノシン（商品名：Ｂｚ−Ａ−ＣＰＧ〔グレンリサーチ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）社製〕）を用いて、商品名：ＡＢＩ３９２ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー〔パーキン−エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）社製〕で、ジヌクレオチドｐｄＣｐＡを合成した。合成したｐｄＣｐＡについて、アンモニア水（６ｍＬ）中、５５℃で脱保護を行ない、その後、溶媒をスピードバック・凍結乾燥により除去した。ついで、得られた産物を、１Ｍ テトラブチルアンモニウム溶液 １ｍＬに再溶解した。得られた溶液を、商品名：Ｗａｋｏｓｉｌ ５Ｃ１８カラムでの逆相ＨＰＬＣに供し、０〜５０容積％ アセトニトリル−水のリニアグラジェントにより精製し、ｐｄＣｐＡのテトラ−ｎ−ブチルアンモニウム塩を得た。

得られたｐｄＣｐＡのテトラ−ｎ−ブチルアンモニウム塩を、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させた。得られたｐｄＣｐＡ テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム塩のＤＭＦ溶液（２０μＬ、０．５μｍｏｌ）に、前記（１）で得られたＮ−Ｂｏｃ−Ｌ−ナフチルアラニン シアノメチルエステル １０μｍｏｌを添加し、得られた溶液を室温で３時間インキュベーションすることにより、ｐｄＣｐＡのアミノアシル化を行なった。

ついで、得られた産物を、商品名：Ｗａｋｏｓｉｌ ５Ｃ１８カラムでの逆相ＨＰＬＣに供し、５〜７５容積％ アセトニトリルの０．１Ｍ トリエチルアミン酢酸（ＴＥＡＡ）緩衝液（ｐＨ７．０）のリニアグラジェントにより精製し、Ｎ−Ｂｏｃ−Ｌ−ナフチルアラニルｐｄＣｐＡを得た。得られた産物を、凍結乾燥させ、氷中、トリフルオロ酢酸 １００μＬに再溶解させた。

得られた溶液を、氷上で１０分間放置し、Ｎ_２ガスを吹き付けることによりトリフルオロ酢酸を除去した。残渣を、１ｍＬのジエチルエーテルで洗浄し、残った沈殿を、遠心分離（１５，０００×ｇ、４℃で３０分間）で回収した。前記ジエチルエーテルによる洗浄と遠心分離とのサイクルを２回繰り返した。得られた産物について、α−シアノ−４−オキシ桂皮酸をマトリックスとして用いて、商品名：Ｖｏｙａｇｅｒ Ｅｌｉｔｅ装置〔アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）社製〕で、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルを測定した結果、分子量８３２．０８であり、Ｌ−ナフチルアラニルｐｄＣｐＡが得られたことが示された。得られたＬ−ナフチルアラニルｐｄＣｐＡを、ジメチルスルホキシドに溶解させ、３ｍＭ Ｌ−ナフチルアラニルｐｄＣｐＡのＤＭＳＯ溶液を得た。

（３）酵母ｔＲＮＡ^Ｐｈｅ _ＧＡＡ−ＣＡのＲｕｎ−ｏｆｆ転写
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ〔ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社製〕を用いて、酵母ｔＲＮＡ^Ｐｈｅ _ＣＵＡ−ＣＡをコードするプラスミド（大阪大学の遠藤博士より供与）に部位特異的に変異導入し、それにより、Ｔ７プロモーターの制御下に酵母ｔＲＮＡ^Ｐｈｅ _ＧＡＡ−ＣＡをコードするプラスミドを調製した。

得られたプラスミド ３０μｇを、１×反応緩衝液〔ニューイングランドバイオラボ社製〕１１０μＬに溶解させた。得られた溶液に、２０ユニットのＦｏｋＩ〔ニューイングランドバイオラボ社製〕を添加し、得られた溶液を、３７℃で６時間インキュベーションし、ついで、６５℃で２０分間インキュベーションした。得られた溶液は、精製せずに、転写反応に用いた。

ＦｏｋＩ−直鎖状化プラスミド溶液 ５５μＬと各２μｍｏｌのＮＴＰ（ＭＢＩ社製）と５μｍｏｌのＧＭＰ〔シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製〕と８０ＵのＲＮａｓｅインヒビター〔東洋紡績株式会社製〕と１Ｕの無機ピロホスファターゼ〔カルビオケム−ノバビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）社製〕と２２００ＵのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ〔東洋紡績株式会社製〕と１０μＬの１０×反応緩衝液〔組成：４００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２００ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０ｍＭ ＤＴＴ〕とを含む反応溶液 ５００μＬを、３７℃、８時間インキュベーションし、転写反応を行なった。

キアジェン（ＱＩＡＧＥＮ）社製ＤＮＡ／ＲＮＡキットを用いて、転写された酵母ｔＲＮＡ^Ｐｈｅ _ＧＡＡ−ＣＡを精製した。

（４）ミスアシレーションされた全長ｔＲＮＡの調製
前記（３）で得られたｔＲＮＡ^Ｐｈｅ _ＧＡＡ−ＣＡ １０μｇと、前記（２）で得られたＬ−ナフチルアラニルｐｄＣｐＡのＤＭＳＯ溶液（Ｌ−ナフチルアラニルｐｄＣｐＡ １２ｐｍｏｌ）と、５０ＵのＴ４ ＲＮＡリガーゼ〔タカラバイオ株式会社製〕とを含む反応溶液〔組成：５５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−Ｎａ（ｐＨ７．５）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、３．３ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰ〕２０μＬを、４℃で２時間インキュベーションし、ｔＲＮＡ^Ｐｈｅ _ＧＡＡ−ＣＡとＬ−ナフチルアラニルｐｄＣｐＡとをライゲーションさせた。得られた産物を、０．４５Ｍ 酢酸カリウム水溶液（ｐＨ５．０）４０μＬで希釈した。

得られた溶液に、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５／２４／１）６０μＬを添加して、ｔＲＮＡ^Ｐｈｅ _ＧＡＡ−ＣＡとＬ−ナフチルアラニルｐｄＣｐＡとから生成した産物（Ｎａｐ−ｔＲＮＡ）を含む水層を得た。得られた水層に、クロロホルム６０μＬを添加して、Ｎａｐ−ｔＲＮＡを含む水層を得た。前記水層に、１００（ｖ／ｖ）％ エタノール３５０μＬを添加し、ついで、１５０００×ｇの遠心分離により、Ｎａｐ−ｔＲＮＡ沈殿を回収した。回収したＮａｐ−ｔＲＮＡ沈殿を、冷７０％（ｖ／ｖ）エタノール（１２０μＬ）で１回洗浄し、真空下に乾燥させ、１ｍＭ 酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．０）４μＬに再懸濁させた。

調製例２〜５
調製例１と同様にして、Ｎａｐ−ｔＲＮＡ^Ｐｈｅ _ＧＡＵ、Ｎａｐ−ｔＲＮＡ^Ｐｈｅ _ＣＡＣ、Ｂｐｈ−ｔＲＮＡ^Ｐｈｅ _ＧＡＵ、及びＩｄｏ−ｔＲＮＡ^Ｐｈｅ _ＣＡＣを得た。

実施例１ Ｐｈｅ−ＳＡによるＤＨＦＲ発現の抑制作用の確認
（１）ＤＨＦＲ発現鋳型の構築
全６個のＰｈｅコドン（３個のＵＵＵコドン及び３つのＵＵＣコドン）を含み、Ｎ−末端にＴ７−タグを有するＥ．ｃｏｌｉジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ［６］）のｍＲＮＡ鋳型を、以下のように調製した。

Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨＦＲ遺伝子（６つのＰｈｅを有する；以下、「ｐＤＨＦＲ［６］」という）を含むプラスミド〔Ｐｏｓｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの清水博士より供与〕と、商品名：ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ〔ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社製〕とを用いて、前記ＤＨＦＲ［６］をコードする核酸の塩基配列における６つのＰｈｅコドンの全てを他のコドンに置換し、Ｐｈｅコドンを全く含まないｐＤＨＦＲ［０］鋳型を得た。なお、前記ＤＨＦＲ［６］をコードする核酸において、３１位のＵＵＵをＧＵＵに、１０３位のＵＵＣをＣＵＣに、１２５位のＵＵＵをＵＡＣに、１３７位のＵＵＣをＵＡＣに、１４０位のＵＵＣをＵＡＣに、１５３位のＵＵＵをＵＡＵに置換した。

また、１つのＰｈｅコドンを含むＤＨＦＲ［１］鋳型を、前記と同様の方法で、ｐＤＨＦＲ［０］の１３７位のＵＵＣコドンを元のＵＵＣに戻すことにより調製した。

得られた鋳型 ２０ｎｇを用い、Ｔ７タグとＳＤ配列とを有するフォワードプライマー（４ｐｍｏｌ）［配列番号：１；５’−（ＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＡＴＧＧＣＴＡＧＣＡＴＧＡＣＴＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣＡＡＡＴＧ ＧＧＴＡＴＣＡＧＴＣＴＧＡＴＴＧＣＧ）−３’〔オペロン（Ｏｐｅｒｏｎ）社製〕］と、リバースプライマー（４ｐｍｏｌ）［配列番号：２；５’−（ＴＡＴＴＣＡＴＴＡＣＣＧＣＣＧ ＣＴＣＣＡＧＡＡＴＣＴＣＡＴＡＧＣＡＡＴＡＧＣＴ）−３’〔オペロン（Ｏｐｅｒｏｎ）社製〕］と、１．２５ＵのＰｆｕ Ｕｌｔｒａ ＨＦ ＤＮＡポリメラーゼ〔ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社製〕と、各４ｎｍｏｌのｄＮＴＰ〔東洋紡績株式会社製〕と１０×Ｐｆｕ Ｕｌｔｒａ ＨＦ反応緩衝液 ２μＬとを含む反応混合物 ２０μＬ中で、１ｓｔ ＰＣＲを行なった。その後、得られたＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動に供し、精製し、精製１ｓｔ ＰＣＲ産物を得た。

精製１ｓｔ ＰＣＲ産物 ０．１ｐｍｏｌを鋳型として用い、Ｔ７プロモーターを有するユニバーサルプライマー（４ｐｍｏｌ）［配列番号：３；５’−ｄ（ＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＴＴＴＣＣＣＴＣＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡ）−３’〔オペロン（Ｏｐｅｒｏｎ）社製〕］とリバースプライマー ４ｐｍｏｌと、１．２５ＵのＰｆｕ Ｕｌｔｒａ ＨＦ ＤＮＡポリメラーゼと、各４ｎｍｏｌのｄＮＴＰと、１０×Ｐｆｕ Ｕｌｔｒａ ＨＦ反応緩衝液 ２μＬとを含む反応混合物 ２０μＬ中で、２ｎｄ ＰＣＲを行なった。得られた二本鎖鋳型ＤＮＡは、Ｔ７プロモーターと、ＳＤ配列と開始コドン（ＡＴＧ）と、Ｎ末端におけるＴ７タグ配列と、終止コドン（ＴＡＡ）とを有するＤＮＡであった。

得られたＤＮＡを鋳型とし、商品名：Ｔ７ ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔキット〔アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）〕を用いたＴ７ ｒｕｎ−ｏｆｆ転写により、ＤＨＦＲ［ｘ］ｍＲＮＡ（ｘ＝６、１又は０）を得、商品名：ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｌｅａｎ Ｕｐキット〔キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）社製〕で精製した。

（２）ＤＨＦＲの翻訳及びウエスタンブロット解析
５μＭ ５’−Ｏ−［Ｎ−（フェニルアラニル）スルファモイル］アデノシン〔Ｐｈｅ−ＳＡ（ＲＮＡ−ＴＥＣ製）〕の存在下又は非存在下に、再構成Ｅ．ｃｏｌｉ翻訳溶液〔Ｃｌａｓｓｉｃ Ｉ（ポストゲノムインスティチュート（Ｐｏｓｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）製〕８μＬを、３７℃又は５０℃で０、３０又は６０分インキュベーションした。

その後、得られた産物に、ｍＲＮＡ鋳型 １．８μｇとＮａｐ−ｔＲＮＡ ５μｇとを添加又はｍＲＮＡ鋳型 １．８μｇのみを添加して全１１．５μＬとし、得られた混合物を３７℃で６０分間インキュベーションして、翻訳を行ない、Ｔ７タグタンパク質を得た。

得られた産物を、試料ローディング緩衝液〔１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、４（ｗ／ｖ）％ ＳＤＳ、２０（ｗ／ｖ）％ グリセロール、０．００２（ｗ／ｖ）％ ブロモフェノールブルー、１０（ｖ／ｖ）％ ２−メルカプトエタノール〕２５μＬと水 １３．５μＬと混合した。得られた試料を、９５℃で５分間インキュベーションした。ついで、得られた溶液 ５μＬを、商品名：Ｍｉｎｉ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＳＰＲ３００ ｓｙｓｔｅｍ〔バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社製〕を用いた１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。その後、泳動後のゲル上のタンパク質を、商品名：Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ ＳＤ ｓｙｓｔｅｍ〔バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社製〕を用いて、ＰＶＤＦ膜〔商品名：Ｈｙｂｏｎｄ^ＴＭ−Ｐ、アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社製〕に転写させた。

その後、前記ＰＶＤＦ膜上のＴ７タグタンパク質を、抗Ｔ７−ＨＲＰコンジュゲート〔ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社製〕と商品名：ＥＣＬ Ｐｌｕｓ^ＴＭ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ〔アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社製〕とにより可視化させた。その結果を、図１に示す。

また、ＤＨＦＲ［０］及びＤＨＦＲ［１］の収率について、別の同じ条件下で得られたＤＨＦＲ［６］の収率を参照して、連続希釈された（１０％、２０％、４０％、６０％、８０％、１００％）ＤＨＦＲ［６］溶液のセットを用いたキャリブレーション後、少なくとも３回の実験のパーセント平均値±ＳＤ（標準偏差）として示した。

その結果、図１のレーン１１に示されるように、ＤＨＦＲ［０］が、Ｐｈｅ−ＳＡによりほとんど影響を受けず、効率よく合成されるのに対し、レーン８に示されるように、Ｐｈｅ−ＳＡの存在下で、ＤＨＦＲ［６］は、１０％以下に、強く抑制されることがわかる。

また、図１に示されるように、翻訳開始前に、Ｐｈｅ−ＳＡの存在下に、３７℃で３０分又は６０分プレインキュベーションする処理により、ＤＨＦＲ［０］の収量は、レーン６及び７それぞれに対して、レーン１２及び１３それぞれにおいて、９０％以上であり、顕著に減少することなく、実質的に、ＤＨＦＲ［６］（レーン９及び１０）の収量を抑制することがわかる。

実施例２ Ｐｈｅ−ｔＲＮＡ複合体の形成が阻害される条件下におけるＮａｐ−ｔＲＮＡを用いたタンパク質の翻訳
５μＭ Ｐｈｅ−ＳＡ（ＲＮＡ−ＴＥＣ製）の存在下又は非存在下に、再構成Ｅ．ｃｏｌｉ翻訳溶液〔Ｃｌａｓｓｉｃ Ｉ（ポストゲノムインスティチュート（Ｐｏｓｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）製〕８μＬを、３７℃又は５０℃で０、３０又は６０分インキュベーションした。

その後、１３７位における１つのＰｈｅコドン（ＵＵＵ）を有するＤＨＦＲ［１］ｍＲＮＡ鋳型 １．８μｇとＮａｐ−ｔＲＮＡ^Ｐｈｅ _ＧＡＡ ５μｇとの添加又はｍＲＮＡ鋳型 １．８μｇのみの添加をして全１１．５μＬとし、得られた混合物を３７℃で６０分間インキュベーションして、翻訳を行ない、Ｔ７タグタンパク質を得た。

得られた産物を、試料ローディング緩衝液〔１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、４（ｗ／ｖ）％ ＳＤＳ、２０（ｗ／ｖ）％ グリセロール、０．００２（ｗ／ｖ）％ ブロモフェノールブルー、１０（ｖ／ｖ）％ ２−メルカプトエタノール〕２５μＬと水 １３．５μＬと混合した。得られた試料を、９５℃で５分間インキュベーションした。ついで、得られた溶液 ５μＬを、商品名：Ｍｉｎｉ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＳＰＲ３００ ｓｙｓｔｅｍ〔バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社製〕を用いた１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。その後、泳動後のゲル上のタンパク質を、商品名：Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ ＳＤ ｓｙｓｔｅｍ〔バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社製〕を用いて、ＰＶＤＦ膜〔商品名：Ｈｙｂｏｎｄ^ＴＭ−Ｐ、アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社製〕に転写させた。

その後、前記ＰＶＤＦ膜上のＴ７タグタンパク質を、抗Ｔ７−ＨＲＰコンジュゲート〔ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社製〕と商品名：ＥＣＬ Ｐｌｕｓ^ＴＭ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ〔アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社製〕とにより可視化させた。その結果を図２に示す。

その結果、図２に示されるように、Ｐｈｅ−ＳＡ存在下にプレインキュベーションされた反応混合物中、Ｎａｐ−ｔＲＮＡ^Ｐｈｅ _ＧＡＡの存在下、翻訳を行なった場合、全長ＤＨＦＲ［１］は、レーン２の通常の条件の場合に比べ、１００％以上の収率で回収されることがわかる。

実施例３ Ｎａｐを１つ含有する化合物の製造１
（１）オリゴペプチド発現鋳型の構築
１つのＰｈｅ（９位のＵＵＣコドン）と他の１２アミノ酸とを有する２４マーのオリゴペプチドＨ_２Ｎ−ｆＭＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳＤＹＫＤＤＤＤＫ−ＣＯ_２Ｈ〔配列番号：４；ｍ／ｚ＝２９０２．２６）に対するｍＲＮＡを以下のように作製した。

ＳＤ配列を有するフォワードプライマー〔配列番号：５；５’−ＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＡＴＧＡＡＡＧＡＡＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣ−３’〕４ｐｍｏｌと、リバースプライマー〔配列番号：６；５’−（ＴＡＴＴＣＡＴＴＡＣＴＴＧＴＣＡＴＣＧＴＣＡＴＣＣＴ）−３’〕４ｐｍｏｌと、合成ＤＮＡ鋳型 ０．１ｐｍｏｌと、商品名：Ｐｆｕ Ｕｌｔｒａ ＨＦ ＤＮＡポリメラーゼ〔ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社製〕１．２５Ｕと、各４ｎｍｏｌのｄＮＴＰ〔東洋紡績株式会社製〕と１０×Ｐｆｕ Ｕｌｔｒａ ＨＦ反応緩衝液 ２μＬとを含む反応混合物 ２０μＬ中で１ｓｔ ＰＣＲを行なった。ＰＣＲ条件は、９５℃３分、（９５℃１分と５１℃１分、７２℃１分）を３０サイクル、７２℃１０分であった。なお、前記合成ＤＮＡ鋳型として、５’−ＡＴＧＡＡＡＧＡＡＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＴＡＡＡＴＴＣＧＡＡＣＧＣＣＡＧＣＡＣＡＴＧＧＡＣＡＧＣＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＧＴＡＡ−３’（配列番号：７）〔オペロン（Ｏｐｅｒｏｎ）社製〕を用いた。前記配列番号：７中、ＦＬＡＧ−タグ〔ＡｓｐＴｙｒＬｙｓＡｓｐＡｓｐＡｓｐＡｓｐＬｙｓ（配列番号：８）〕をコードする塩基配列は、塩基番号：４８〜７２であり、Ｐｈｅコドン（ＴＴＣ）は、塩基番号：２５〜２７である。

１ｓｔＰＣＲ後、得られた産物を、アガロースゲル電気泳動で精製した。

得られた１ｓｔ ＰＣＲ産物 ０．１ｐｍｏｌと、Ｔ７プロモーターを有するユニバーサルプライマー〔配列番号：３；５’−ｄ（ＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＴＴＴＣＣＣＴＣＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡ）−３’〕４ｐｍｏｌと、リバースプライマー ４ｐｍｏｌと、商品名：Ｐｆｕ Ｕｌｔｒａ ＨＦ ＤＮＡポリメラーゼ １．２５Ｕと、各４ｎｍｏｌのｄＮＴＰと、１０×Ｐｆｕ Ｕｌｔｒａ ＨＦ反応緩衝液 ２μＬとを含む反応混合物 ２０μＬ中で２ｎｄ ＰＣＲを行なった。ＰＣＲ条件は、９５℃３分のインキュベーションの後、９５℃１分と４７℃１分と７２℃１分とを１サイクルとする３０サイクル、７２℃１０分のインキュベーションであった。

得られた二本鎖鋳型ＤＮＡは、Ｔ７プロモーターと、ＳＤ配列と開始コドン（ＡＴＧ）と１つのＰｈｅコドン（ＴＴＣ）とＦＬＡＧタグとを有する。商品名：Ｔ７ ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔキット〔アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）社製〕を用い、前記二本鎖鋳型ＤＮＡのＴ７ ｒｕｎ−ｏｆｆ転写を行ない、オリゴペプチド発現鋳型ｍＲＮＡを得た。得られたオリゴペプチド発現鋳型ｍＲＮＡを、商品名：ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｌｅａｎ Ｕｐ Ｋｉｔ〔キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）社製〕で精製した。

（２）オリゴペプチドの翻訳、精製及び質量分析
再構成Ｅ．ｃｏｌｉ翻訳溶液〔４０μＬ、Ｃｌａｓｓｉｃ Ｉ、ポストゲノムインスティチュート（Ｐｏｓｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）製〕を、５μＭ Ｐｈｅ−ＳＡ〔ＲＮＡ−ＴＥＣ製〕存在又は非存在下に、３７℃又は５０℃で０又は３０分プレインキュベーションした。

プレインキュベーション後の溶液に、ｍＲＮＡ鋳型 １０μｇを添加すること又はＮａｐ−ｔＲＮＡ ２０μｇと共にｍＲＮＡ鋳型 １０μｇを添加することにより、全反応液量５５．５μＬとし、３７℃で６０分間インキュベーションして翻訳を行なった。

得られた産物に、Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ^ＴＭ Ｍ２アフィニティーゲル〔シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製〕２０μＬと、溶解緩衝液〔組成：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ^ＴＭ−２０〕３５０μＬとを添加した。得られた混合物を、４℃で５時間、穏やかに反転させた。得られた産物を、商品名：ＭｉｃｒｏＳｐｉｎカラム〔アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社製〕に供し、１０００×ｇ、５秒間の遠心分離でろ過した。ろ過後に得られた前記Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ^ＴＭ Ｍ２アフィニティーゲルのアガロースビーズを、予め冷却したＴＢＳ緩衝液〔組成：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ〕３００μＬので５回洗浄した。洗浄後のアガロースビーズを、抽出緩衝液〔組成：０．１Ｍ グリシン−ＨＣｌ（ｐＨ３．５）〕１７０μＬに再懸濁させた。得られた懸濁物を、室温で５分間、穏やかに振盪させながらインキュベーションし、１０００×ｇ、５秒間の遠心分離でろ過した。

得られたろ液に、１．５Ｍ ＮａＣｌを含む０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）１７μＬを添加した。得られた溶液を、商品名：Ｍｉｎｉ Ｄｉａｌｙｓｉｓ ｋｉｔ １ｋＤａカットオフ、アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社製で大量の蒸留水に対して１２時間透析し、精製オリゴペプチド溶液を得た。得られた精製オリゴペプチド溶液 １μＬを、０．３％ トリフルオロ酢酸を含む水とアセトニトリルとの１：１混合液に溶解させた１０ｍｇ／ｍＬ α−シアノ−４−オキシ桂皮酸溶液 ４μＬに添加した。

得られた混合物（２μＬ）を、ＭＡＬＤＩプレートにスポットし、空気乾燥させ、解析した。なお、ＮａｐがＰｈｅの代わりに取り込まれた場合、得られたペプチドのマスは、ｍ／ｚ＝２９５２．２８であり、（Ｎａｐ−Ｐｈｅ）のマスシフト＝＋５０．０６Ｄａである。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトルの結果を図３に示す。

その結果、図３の（ａ）に示されるように、通常の翻訳条件で得られたペプチド産物は、Ｓタグアッセイにより測定して、翻訳混合物 ５０μＬから精製ペプチド ２６０±３０ｎｇであり、２９０１．７６ｍ／ｚにシグナルを示したにすぎない。また、図３の（ｂ）に示されるように、Ｎａｐ−ｔＲＮＡ^Ｐｈｅ _ＧＡＡを添加することにより、２９５１．４４ｍ／ｚにおいて非常に弱い別のシグナルの出現をもたらした。これに対して、図３の（ｃ）に示されるように、フェニルアラニンの触媒再アシル化が、Ｐｈｅ−ＳＡの添加により阻害された場合、Ｎａｐ含有ハイブリッドペプチドに対応する別のより高い２９５１．５９のシグナルが、容易に検出できるようになった。また、図３の（ｄ）に示されるように、Ｐｈｅ−ＳＡ存在下、３７℃で３０分間インキュベーションすることにより、２９５１．５８ｍ／ｚ付近のシグナルとして示される主要産物としてＮａｐ含有ハイブリッドペプチドが得られることがわかる。さらに、図３の（ｅ）に示されるように、Ｐｈｅ−ＳＡ存在下、５０℃で３０分間のインキュベーションにより、２９５１．６２ｍ／ｚ付近のシグナルとして示される主要産物としてＮａｐ含有ハイブリッドペプチドが得られることがわかる。

実施例４ Ｎａｐを１つ含有する化合物の製造２
（１）オリゴペプチド発現鋳型の構築
１つのＩｌｅ（９位のＡＵＣコドン）と他の１２アミノ酸とを有する２４マーのオリゴペプチドＨ_２Ｎ−ｆＭＫＥＴＡＡＡＫＩＥＲＱＨＭＤＳＤＹＫＤＤＤＤＫ−ＣＯ_２Ｈ〔配列番号：９；ｍ／ｚ＝２８６８．２７）に対するｍＲＮＡを実施例３と同様にして作製した。

（２）オリゴペプチドの翻訳、精製及び質量分析
実施例３と同様の手法によりＰｈｅコドンの代わりに、ＩｌｅコドンをＮａｐ導入対象コドンとし、同様の条件におけるＮａｐ含有ハイブリッドペプチドの形成を調べた。その結果を図４に示す。

図４に示されるように、５μＭ Ｉｌｅ−ＳＡ存在下、５０℃で３０分間のインキュベーションにより、２９５１．５１ｍ／ｚ付近のシグナルとして示される主要産物として、効率よくＮａｐ含有ハイブリッドペプチドが得られることがわかる。

実施例５ Ｎａｐを１つ含有する化合物の製造３
（１）オリゴペプチド発現鋳型の構築
１つのＶａｌ（１１位のＧＵＧコドン）と他の１２アミノ酸とを有する２４マーのオリゴペプチドＨ_２Ｎ−ｆＭＫＥＴＡＡＡＫＦＥＶＱＨＭＤＳＤＹＫＤＤＤＤＫ−ＣＯ_２Ｈ〔配列番号：１０；ｍ／ｚ＝２８５６．０３）に対するｍＲＮＡを実施例３と同様にして作製した。

（２）オリゴペプチドの翻訳、精製及び質量分析
Ｖａｌ−ＳＡ濃度を１０μＭとし、Ｐｈｅコドンの代わりに、ＶａｌコドンをＮａｐ導入対象コドンとし、プレインキュベーションを５０℃、３０分で行った以外は実施例３と同様の手法及び条件でＮａｐ含有ハイブリッドペプチドの形成を調べた。その結果を図５に示す。

図５に示されるように、１０μＭ Ｖａｌ−ＳＡ存在下、５０℃で３０分間のインキュベーションにより、２９５３．７４ｍ／ｚ付近のシグナルとして示される主要産物として、効率よくＮａｐ含有ハイブリッドペプチドが得られることがわかる。

実施例６ Ｂｐｈを１つ含有する化合物の製造
（１）オリゴペプチド発現鋳型の構築
実施例４と同様にして、同様のｍＲＮＡを作製した。

（２）オリゴペプチドの翻訳、精製及び質量分析
非天然アミノ酸としてＢｐｈ（Ｂｐｈ−ｔＲＮＡ_ＧＡＵ ２０μｇ）を用い、ＩｌｅコドンをＢｐｈ導入対象コドンとし、プレインキュベーションを５０℃、３０分で行った以外は実施例３と同様の手法及び条件でＢｐｈ含有ハイブリッドペプチドの形成を調べた。その結果を図６に示す。

図６に示されるように、５μＭ Ｉｌｅ−ＳＡ存在下、５０℃で３０分間のインキュベーションにより、２９７８．７２ｍ／ｚ付近のシグナルとして示される主要産物として、効率よくＢｐｈ含有ハイブリッドペプチドが得られることがわかる。

実施例７ Ｉｄｏを１つ含有する化合物の製造
（１）オリゴペプチド発現鋳型の構築
実施例５と同様にして、同様のｍＲＮＡを作製した。

（２）オリゴペプチドの翻訳、精製及び質量分析
非天然アミノ酸としてＩｄｏ（Ｉｄｏ−ｔＲＮＡ_ＣＡＣ ２０μｇ）を用い、ＶａｌコドンをＩｄｏ導入対象コドンとし、実施例５と同様の手法及び条件でＩｄｏ含有ハイブリッドペプチドの形成を調べた。その結果を図７に示す。

図７に示されるように、１０μＭ Ｖａｌ−ＳＡ存在下、５０℃で３０分間のインキュベーションにより、３０２９．５４ｍ／ｚ付近のシグナルとして示される主要産物として、効率よくＩｄｏ含有ハイブリッドペプチドが得られることがわかる。

以上の結果より、任意のアミノ酸コドンを、任意の非天然アミノ酸導入対象コドンとして用いることができることがわかる。

実施例８ ＰｈｅＯＨを１つ含有する化合物の製造
前記実施例３におけるＮａｐに代えて、ＰｈｅＯＨ（ヒドロキシフェニルアラニン）を用い、実施例３と同様に、ＰｈｅＯＨ含有ハイブリッドペプチドを形成させた。ついで、得られた産物を希釈アンモニア水で加水分解し、生じた産物を調べた。結果を図８に示す。

その結果、図８に示されるように、Ｐｈｅ−ＳＡ存在下におけるプレインキュベーション後にヒドロキシフェニルアラニン付加ｔＲＮＡを添加したサンプルでは、エステル加水分解により全長ポリペプチドのバンドが時間経過とともに消失していることが確認されたため、ＰｈｅＯＨがペプチド鎖に導入されていることがわかった。

実施例９ Ｎａｐを２つ含有する化合物の製造
（１）オリゴペプチド発現鋳型の構築
２つのＰｈｅ（９位と１０位のＵＵＣコドン）と他の１２アミノ酸とを有する２５マーのオリゴペプチドＨ_２Ｎ−ｆＭＫＥＴＡＡＡＫＦＦＥＲＱＨＭＤＳＤＹＫＤＤＤＤＫ−ＣＯ_２Ｈ〔配列番号：１１；ｍ／ｚ＝３０４９．３２）に対するｍＲＮＡを実施例３と同様にして作製した。

（２）オリゴペプチドの翻訳、精製及び質量分析
非天然アミノ酸としてＮａｐ（Ｎａｐ−ｔＲＮＡ_ＧＡＡ ２０μｇ）を用い、プレインキュベーションを５０℃、３０分で行った以外は実施例３と同様の手法及び条件でＮａｐ含有ハイブリッドペプチドの形成を調べた。その結果を図９に示す。

図９に示されるように、５μＭ Ｐｈｅ−ＳＡ存在下、５０℃で３０分間のインキュベーションにより、３１４９．８５ｍ／ｚ付近のシグナルとして示される主要産物として、効率よくＮａｐ含有ハイブリッドペプチドが得られることがわかる。

実施例１０ Ｂｐｈを２つ含有する化合物の製造
（１）オリゴペプチド発現鋳型の構築
２つのＩｌｅ（９位と１０位のＡＵＣコドン）と他の１２アミノ酸とを有する２５マーのオリゴペプチドＨ_２Ｎ−ｆＭＫＥＴＡＡＡＫＩＩＥＲＱＨＭＤＳＤＹＫＤＤＤＤＫ−ＣＯ_２Ｈ〔配列番号：１２；ｍ／ｚ＝２９８１．３５）に対するｍＲＮＡを実施例３と同様にして作製した。

（２）オリゴペプチドの翻訳、精製及び質量分析
非天然アミノ酸としてＢｐｈ（Ｂｐｈ−ｔＲＮＡ_ＧＡＵ ２０μｇ）を用い、ＩｌｅコドンをＢｐｈ導入対象コドンとし、プレインキュベーションを５０℃、３０分で行った以外は実施例３と同様の手法及び条件でＢｐｈ含有ハイブリッドペプチドの形成を調べた。その結果を図１０に示す。

図１０に示されるように、５μＭ Ｉｌｅ−ＳＡ存在下、５０℃で３０分間のインキュベーションにより、３２０１．９４ｍ／ｚ付近のシグナルとして示される主要産物として、効率よくＢｐｈ含有ハイブリッドペプチドが得られることがわかる。

以上の結果より、複数のアミノ酸コドンに、非天然アミノ酸を導入することができることがわかる。

実施例１１ ＮａｐとＢｐｈとを含有する化合物の製造
（１）オリゴペプチド発現鋳型の構築
それぞれ１つのＰｈｅ（９位のＵＵＣコドン）とＩｌｅ（１０位のＡＵＣコドン）と他の１２アミノ酸とを有する２５マーのオリゴペプチドＨ_２Ｎ−ｆＭＫＥＴＡＡＡＫＦＩＥＲＱＨＭＤＳＤＹＫＤＤＤＤＫ−ＣＯ_２Ｈ〔配列番号：１３；ｍ／ｚ＝３０１５．３４）に対するｍＲＮＡを実施例３と同様にして作製した。

（２）オリゴペプチドの翻訳、精製及び質量分析
非天然アミノ酸としてＮａｐ（Ｎａｐ−ｔＲＮＡ_ＧＡＡ ２０μｇ）及びＢｐｈ（Ｂｐｈ−ｔＲＮＡ_ＧＡＵ ２０μｇ）を用い、ＰｈｅコドンをＮａｐ導入対象コドン、ＩｌｅコドンをＢｐｈ導入対象コドンとし、プレインキュベーションを５０℃、３０分で行った以外は実施例３と同様の手法及び条件でＮａｐ及びＢｐｈ含有ハイブリッドペプチドの形成を調べた。その結果を図１１に示す。

図１１に示されるように、５μＭ Ｐｈｅ−ＳＡ及び５μＭ Ｉｌｅ−ＳＡ存在下、５０℃で３０分間のインキュベーションにより、３１７５．９７ｍ／ｚ付近のシグナルとして示される主要産物として、効率よくＮａｐ及びＢｐｈ含有ハイブリッドペプチドが得られることがわかる。

以上の結果より、複数種のアミノ酸コドンに、それぞれ異なる非天然アミノ酸を導入することができることがわかる。

略語一覧
Ｎａｐ：ナフチルアラニン
Ｂｐｈ：ビフェニルアラニン
Ｉｄｏ：ヨードフェニルアラニン
ＳＡ：５’−Ｏ−［Ｎ−（アミノアシル）スルファモイル］アデノシン
ｐｄＣｐＡ：５’−ホスフェートー２’−デオキシシチジリルー（３’−５’）アデノシン

本発明により、単離されたｍＲＮＡ又はクローン化されたＤＮＡから得られたｍＲＮＡを用いて、簡便に、非天然アミノ酸及び／又はヒドロキシ酸含有化合物を製造することができる。

配列番号：１は、プライマーの配列である。

配列番号：２は、プライマーの配列である。

配列番号：３は、プライマーの配列である。

配列番号：４は、オリゴペプチドの配列である。

配列番号：５は、プライマーの配列である。

配列番号：６は、プライマーの配列である。

配列番号：７は、プライマーの配列である。

配列番号：８は、プライマーの配列である。

配列番号：９は、オリゴペプチドの配列である。

配列番号：１０は、オリゴペプチドの配列である。

配列番号：１１は、オリゴペプチドの配列である。

配列番号：１２は、オリゴペプチドの配列である。

配列番号：１３は、オリゴペプチドの配列である。

Claims (7)

1. タンパク質翻訳系において、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンからなる群より選択されたアミノ酸Ｘと該アミノ酸Ｘに対するｔＲＮＡとの結合を阻害する条件下で、非天然アミノ酸又はヒドロキシ酸化合物と前記アミノ酸Ｘに対するｔＲＮＡとの複合体を形成し、タンパク質翻訳反応条件下に翻訳を行なわせることを特徴とする非天然アミノ酸及び／又はヒドロキシ酸含有化合物の製造方法。
2. アミノ酸Ｘに特異的なアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素に対する阻害物質により、アミノ酸Ｘに対するｔＲＮＡと、アミノ酸Ｘとの結合を阻害する、請求項１記載の製造方法。
3. 該阻害物質が、５’−Ｏ−［Ｎ−（アミノアシル）スルファモイル］アデノシン誘導体化合物である、請求項２記載の製造方法。
4. （Ａ）タンパク質翻訳系において、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンからなる群より選択されたアミノ酸Ｘに対するｔＲＮＡと該アミノ酸Ｘとの結合を阻害する条件下に、さらに該アミノ酸Ｘ以外のアミノ酸Ｙに対するｔＲＮＡと該アミノ酸Ｙとを結合させる工程、並びに
   （Ｂ）前記ステップ（Ａ）で得られた産物と、鋳型となるｍＲＮＡとを用い、非天然アミノ酸又はヒドロキシ酸化合物とアミノ酸Ｘに対するｔＲＮＡとの複合体の存在下、タンパク質翻訳反応条件下に翻訳を行なわせる工程、
   を含む、請求項１〜３いずれか１項に記載の製造方法。
5. １）アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンからなる群より選択されたアミノ酸Ｘに特異的なアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素に対する阻害物質と、
   ２）非天然アミノ酸及び／又はヒドロキシ酸化合物と、
   ３）タンパク質翻訳系と、
   を含有してなる、請求項１〜４いずれか１項に記載の非天然アミノ酸及び／又はヒドロキシ酸含有化合物の製造方法に用いるためのキット。
6. 阻害物質が、５’−Ｏ−［Ｎ−（アミノアシル）スルファモイル］アデノシン誘導体化合物である、請求項５記載のキット。
7. 非天然アミノ酸及び／又はヒドロキシ酸化合物に代えて、非天然アミノ酸−ｔＲＮＡ及び／又はヒドロキシ酸化合物−ｔＲＮＡを含有してなる、請求項５又は６記載のキット。

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