JPWO2006085689A1 - テロメライシン併用抗癌剤 - Google Patents
テロメライシン併用抗癌剤 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2006085689A1 JPWO2006085689A1 JP2007502685A JP2007502685A JPWO2006085689A1 JP WO2006085689 A1 JPWO2006085689 A1 JP WO2006085689A1 JP 2007502685 A JP2007502685 A JP 2007502685A JP 2007502685 A JP2007502685 A JP 2007502685A JP WO2006085689 A1 JPWO2006085689 A1 JP WO2006085689A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cancer
- substance
- gene
- cells
- pharmaceutical composition
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 0 CC1CCC(*)CC1 Chemical compound CC1CCC(*)CC1 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
- A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
- A61K31/475—Quinolines; Isoquinolines having an indole ring, e.g. yohimbine, reserpine, strychnine, vinblastine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
- A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
- A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
- A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
- A61K31/4745—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. phenantrolines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
- A61K35/761—Adenovirus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- A61K38/1758—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals p53
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Virology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Marine Sciences & Fisheries (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本発明は、抗癌活性がさらに増強された医薬組成物の提供に関する。具体的には、ヒトテロメラーゼのプロモーター、E1A遺伝子、IRES配列及びE1B遺伝子をこの順に含むポリヌクレオチドを含む組換えウイルスと、抗腫瘍作用を有する物質とを含む腫瘍の併用療法のための医薬組成物である。
Description
本発明は、ヒトテロメラーゼのプロモーター、E1A遺伝子、IRES配列及びE1B遺伝子をこの順に含むポリヌクレオチドを含む組換えウイルスと、抗腫瘍作用を有する物質とを含む腫瘍の併用療法のための医薬組成物に関する。
腫瘍細胞で選択的に増殖する組換えウイルスは、腫瘍細胞の中でウイルス増殖が生じ細胞死を誘導するため、それのみでも抗腫瘍効果を有する。しかし、抗腫瘍効果を有する物質と併用することで、癌細胞の増殖を抑制し、癌細胞内でのウイルス増殖の時間的余裕を確保することができる。また、癌細胞内において増殖したウイルスが、抗癌剤により破壊されることで、ウイルス放出を促進され、周辺癌細胞への急速なウイルス拡散と顕著な抗腫瘍効果が期待できる。さらに、ウイルスによる細胞死と従来の抗癌剤による細胞死の作用機構は異なるため、併用した際にもそれぞれの抗腫瘍効果が阻害される可能性は低いと推測される。実際に、腫瘍細胞で選択的に増殖するヘルペスウイルスは、抗癌剤や放射線療法などの従来の抗癌治療との併用で、前臨床的および臨床的に抗腫瘍効果の増強が認められたと報告されている。(Post DE,Fulci G,Chiocca EA,Van Meir EG.Replicative oncolytic herpes simplex viruses in combination cancer therapies.Curr Gene Ther.2004 Mar;4(1):41−51及びBennett JJ,Adusumilli P,Petrowsky H,Burt BM,Roberts G,Delman KA,Zager JS,Chou TC,Fong Y.Up−regulation of GADD34 mediates the synergistic anticancer activity of mitomycin C and a gamma134.5 deleted oncolytic herpes virus(G207).FASEB J.2004 Jun;18(9):1001−3.)
本発明は、抗癌活性がさらに増強された医薬組成物を提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。そして、ヒトテロメラーゼのプロモーター、E1A遺伝子、IRES配列及びE1B遺伝子をこの順に含むポリヌクレオチドを含む組換えウイルスと従来の抗腫瘍作用を有する物質と併用すると、抗腫瘍活性が高まることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
(1)ヒトテロメラーゼのプロモーター、E1A遺伝子、IRES配列及びE1B遺伝子をこの順に含むポリヌクレオチドを含む組換えウイルスと、抗腫瘍作用を有する物質とを含む、腫瘍の併用療法のための医薬組成物。
上記の医薬組成物のうち、ヒトテロメラーゼとしては、例えばhTERTがあげられる。また、ウイルスとしてはアデノウイルスを例示できる。抗腫瘍作用を有する物質としては、微小管阻害活性を有する物質、トポイソメラーゼI阻害活性を有する物質のほか、ヒストンデアセチラーゼ阻害活性を有する物質やINGN−201を有する物質があげられる。さらに、微小管阻害活性を有する物質としてはドセタキセル若しくはビノレルビン又はそれらの塩を例示でき、トポイソメラーゼI阻害活性を有する物質としてはイリノテカン又はその塩を例示でき、ヒストンデアセチラーゼ阻害活性を有する物質としてはFR901228を例示できる。なお、腫瘍は、特に限定されず、例えば肺癌、大腸癌、胃癌、乳癌、食道癌、頭頸部癌、肝臓癌、膵臓癌、胆嚢・胆管癌、前立腺癌、膀胱癌、子宮頸癌、甲状腺癌、卵巣癌、白血病、リンパ腫、肉腫、及び間葉系腫瘍などがあげられる。
(2)ヒトテロメラーゼのプロモーター、E1A遺伝子、IRES配列及びE1B遺伝子をこの順に含むポリヌクレオチドを含む組換えウイルスと、抗腫瘍作用を有する物質とを併用することを特徴とする、腫瘍細胞の増殖を抑制する方法。
(3)ヒトテロメラーゼのプロモーター、E1A遺伝子、IRES配列及びE1B遺伝子をこの順に含むポリヌクレオチドを含む組換えウイルスと、抗腫瘍作用を有する物質とを併用することを特徴とする、腫瘍の治療方法。
上記(2)及び(3)において、ヒトテロメラーゼとしては、例えばhTERTがあげられる。また、ウイルスとしてはアデノウイルスを例示できる。抗腫瘍作用を有する物質としては、微小管阻害活性を有する物質、トポイソメラーゼI阻害活性を有する物質のほか、ヒストンデアセチラーゼ阻害活性を有する物質やINGN−201を有する物質があげられる。さらに、微小管阻害活性を有する物質としてはドセタキセル若しくはビノレルビン又はそれらの塩を例示でき、トポイソメラーゼI阻害活性を有する物質としてはイリノテカン又はその塩を例示でき、ヒストンデアセチラーゼ阻害活性を有する物質としてはFR901228を例示できる。なお、腫瘍は、特に限定されず、例えば肺癌、大腸癌、胃癌、乳癌、食道癌、頭頸部癌、肝臓癌、膵臓癌、胆嚢・胆管癌、前立腺癌、膀胱癌、子宮頸癌、甲状腺癌、卵巣癌、白血病、リンパ腫、肉腫、及び間葉系腫瘍などがあげられる。
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。そして、ヒトテロメラーゼのプロモーター、E1A遺伝子、IRES配列及びE1B遺伝子をこの順に含むポリヌクレオチドを含む組換えウイルスと従来の抗腫瘍作用を有する物質と併用すると、抗腫瘍活性が高まることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
(1)ヒトテロメラーゼのプロモーター、E1A遺伝子、IRES配列及びE1B遺伝子をこの順に含むポリヌクレオチドを含む組換えウイルスと、抗腫瘍作用を有する物質とを含む、腫瘍の併用療法のための医薬組成物。
上記の医薬組成物のうち、ヒトテロメラーゼとしては、例えばhTERTがあげられる。また、ウイルスとしてはアデノウイルスを例示できる。抗腫瘍作用を有する物質としては、微小管阻害活性を有する物質、トポイソメラーゼI阻害活性を有する物質のほか、ヒストンデアセチラーゼ阻害活性を有する物質やINGN−201を有する物質があげられる。さらに、微小管阻害活性を有する物質としてはドセタキセル若しくはビノレルビン又はそれらの塩を例示でき、トポイソメラーゼI阻害活性を有する物質としてはイリノテカン又はその塩を例示でき、ヒストンデアセチラーゼ阻害活性を有する物質としてはFR901228を例示できる。なお、腫瘍は、特に限定されず、例えば肺癌、大腸癌、胃癌、乳癌、食道癌、頭頸部癌、肝臓癌、膵臓癌、胆嚢・胆管癌、前立腺癌、膀胱癌、子宮頸癌、甲状腺癌、卵巣癌、白血病、リンパ腫、肉腫、及び間葉系腫瘍などがあげられる。
(2)ヒトテロメラーゼのプロモーター、E1A遺伝子、IRES配列及びE1B遺伝子をこの順に含むポリヌクレオチドを含む組換えウイルスと、抗腫瘍作用を有する物質とを併用することを特徴とする、腫瘍細胞の増殖を抑制する方法。
(3)ヒトテロメラーゼのプロモーター、E1A遺伝子、IRES配列及びE1B遺伝子をこの順に含むポリヌクレオチドを含む組換えウイルスと、抗腫瘍作用を有する物質とを併用することを特徴とする、腫瘍の治療方法。
上記(2)及び(3)において、ヒトテロメラーゼとしては、例えばhTERTがあげられる。また、ウイルスとしてはアデノウイルスを例示できる。抗腫瘍作用を有する物質としては、微小管阻害活性を有する物質、トポイソメラーゼI阻害活性を有する物質のほか、ヒストンデアセチラーゼ阻害活性を有する物質やINGN−201を有する物質があげられる。さらに、微小管阻害活性を有する物質としてはドセタキセル若しくはビノレルビン又はそれらの塩を例示でき、トポイソメラーゼI阻害活性を有する物質としてはイリノテカン又はその塩を例示でき、ヒストンデアセチラーゼ阻害活性を有する物質としてはFR901228を例示できる。なお、腫瘍は、特に限定されず、例えば肺癌、大腸癌、胃癌、乳癌、食道癌、頭頸部癌、肝臓癌、膵臓癌、胆嚢・胆管癌、前立腺癌、膀胱癌、子宮頸癌、甲状腺癌、卵巣癌、白血病、リンパ腫、肉腫、及び間葉系腫瘍などがあげられる。
図1は、本発明の組換えアデノウイルス(テロメライシン)の模式図を示す。
図2は、FR901228を示す。
図3は、CAR発現がアデノウイルス感染に及ぼす影響を示す図である。
図4は、テロメライシンと微小管阻害薬との併用効果を、XTTアンセイを用いて解析したグラフを示す。
図5は、テロメライシンと、微小管阻害剤ビノレルビン及びトポイソメラーゼI阻害剤SN−38(CPT−11代謝産物)を用いてXTTアッセイを行ったグラフを示す。
図6は、抗癌剤が組換えウイルスの増殖に及ぼす影響を解析したグラフを示す。
図7は、テロメライシン及び微小管阻害薬が腫瘍細胞の細胞周期に及ぼす影響を示すグラフである。
図8は、テロメライシン及び微小管阻害剤のH1299ヒト肺癌腫瘍におけるインビボ抗腫瘍効果を示す。
図9は、テロメライシン腫瘍内投与後の腫瘍組織及び肝臓における組織学的変化(HE染色)を示す写真である。
図10は、HDAC阻害剤FR901228によるアデノウイルス受容体CARの発現を示すグラフである。
図11は、HDAC阻害剤FR901228によるアデノウイルス感染効率を示す写真である。
図12は、HDAC阻害剤FR901228によるOBP−401感染効率の増強を示すグラフである。
図13は、HDAC阻害剤FR901228によるテロメライシン抗腫瘍効果の増強を示すグラフである。
図14は、Advexinの抗腫瘍効果を測定したグラフである。
図15は、テロメライシン−Advexin同時投与による抗腫瘍効果を測定したグラフである。
図16は、テロメライシン−Advexin時間差投与による抗腫瘍効果を測定したグラフである。
図17は、テロメライシン−Advexin時間差投与による抗腫瘍効果を測定したグラフである。
図18は、テロメライシン−Advexin時間差投与による抗腫瘍効果を測定したグラフである。
図2は、FR901228を示す。
図3は、CAR発現がアデノウイルス感染に及ぼす影響を示す図である。
図4は、テロメライシンと微小管阻害薬との併用効果を、XTTアンセイを用いて解析したグラフを示す。
図5は、テロメライシンと、微小管阻害剤ビノレルビン及びトポイソメラーゼI阻害剤SN−38(CPT−11代謝産物)を用いてXTTアッセイを行ったグラフを示す。
図6は、抗癌剤が組換えウイルスの増殖に及ぼす影響を解析したグラフを示す。
図7は、テロメライシン及び微小管阻害薬が腫瘍細胞の細胞周期に及ぼす影響を示すグラフである。
図8は、テロメライシン及び微小管阻害剤のH1299ヒト肺癌腫瘍におけるインビボ抗腫瘍効果を示す。
図9は、テロメライシン腫瘍内投与後の腫瘍組織及び肝臓における組織学的変化(HE染色)を示す写真である。
図10は、HDAC阻害剤FR901228によるアデノウイルス受容体CARの発現を示すグラフである。
図11は、HDAC阻害剤FR901228によるアデノウイルス感染効率を示す写真である。
図12は、HDAC阻害剤FR901228によるOBP−401感染効率の増強を示すグラフである。
図13は、HDAC阻害剤FR901228によるテロメライシン抗腫瘍効果の増強を示すグラフである。
図14は、Advexinの抗腫瘍効果を測定したグラフである。
図15は、テロメライシン−Advexin同時投与による抗腫瘍効果を測定したグラフである。
図16は、テロメライシン−Advexin時間差投与による抗腫瘍効果を測定したグラフである。
図17は、テロメライシン−Advexin時間差投与による抗腫瘍効果を測定したグラフである。
図18は、テロメライシン−Advexin時間差投与による抗腫瘍効果を測定したグラフである。
本発明は、ヒトテロメラーゼのプロモーター、E1A遺伝子、IRES配列及びE1B遺伝子をこの順に含むポリヌクレオチドを含む組換えウイルスと、抗腫瘍作用を有する物質とを含む腫瘍の併用療法のための医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は、上記の組換えウイルスと抗腫瘍作用物質を単独で腫瘍細胞に投与した場合に得られる抗腫瘍効果よりも優れた効果が得られるだけでなく、これらの物質を単独で用いた場合には抗腫瘍作用を奏さない腫瘍細胞にも抗腫瘍効果を発揮する。以下、本発明を詳細に説明する、
1.本発明の組換えウイルス
本発明の組換えウイルスは、ヒトテロメラーゼのプロモーター、E1A遺伝子、IRES配列及びE1B遺伝子をこの順に含むポリヌクレオチドがゲノムに組み込まれたウイルスをいう。用いられるウイルスは特に限定されないが、安全性等の点からアデノウイルスが好ましい。また、アデノウイルスの中でも、使用の簡便さ等の点からタイプ5のアデノウイルスが特に好ましい。
本発明に使用される組換えウイルスは、ヒトテロメラーゼのプロモーターにより、E1A遺伝子、IRES配列及びE1B遺伝子が駆動される。腫瘍細胞では正常細胞と比較してテロメラーゼの発現が極めて高いため、テロメラーゼが含まれる腫瘍細胞においてはテロメラーゼプロモーターが発現し、これにより本発明に含まれる組換えウイルスが増殖する。このように、本発明の医薬組成物に含まれる組換えウイルスは、正常細胞では増殖せず、腫瘍細胞でしか増殖しないので、癌細胞特異的およびテロメラーゼ特異的に増殖・複製されることになる。その結果、腫瘍細胞内では、ウイルス増殖による細胞障害が起こり、これにより、本発明に使用される組換えウイルスは腫瘍細胞を特異的に死滅させることができる。
「テロメラーゼのプロモーター」は、テロメラーゼの転写開始部位を決定し、その頻度を直接的に調節する。テロメラーゼとは、真核生物染色体の複製時の短縮に拮抗して、テロメア長を維持する酵素である。このようなテロメラーゼのプロモーターの種類は、目的とする遺伝子の発現に用いるウイルスに対応しうる、適切なプロモーターであればいかなるものでもよく、特に限定されるものではないが、例えば、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)のプロモーターが好ましい。hTERTは、その5’末端の上流1.4kbpの領域で、多くの転写因子結合配列が確認されており、その領域がhTERTプロモーターと考えられるが、中でも、翻訳開始部位の上流181bpの配列が下流の遺伝子発現に重要なコア領域である。本発明において、このコア領域を含むものであれば、限定されずに使用することができるが、このコア領域を完全に含む上流378bp程度の配列をhTERTプロモーターとして使用するのが好ましい。この378bp程度の配列は、181bpのコア領域単独の場合と比べて、その遺伝子発現効率が同等であることが確認されている。455bpの長さのhTERTプロモーターの塩基配列を配列番号1に示す。
hTERTプロモーターは、配列番号1に示される塩基配列のほか、配列番号1からなるDNAに対し相補的な塩基配列よりなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつhTERTプロモーターとしての活性を有するヌクレオチドの塩基配列も含まれる。このようなヌクレオチドは、配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、又はその断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、cDNAライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることができる。cDNAライブラリーの作製方法については、「Molecular Cloning,A Laboratory Manual 2nd ed.」(Cold Spring Harbor Press(1989))を参照することができる。また、市販のcDNAライブラリー及びゲノムライブラリーを用いてもよい。上記ハイブリダイゼーションにおいてストリンジェントな条件としては、たとえば、1×SSC〜2×SSC、0.1%〜0.5%SDS及び42℃〜68℃の条件が挙げられ、より詳細には、60〜68℃で30分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、2×SSC、0.1%SDS中、室温で5〜15分の洗浄を4〜6回行う条件が挙げられる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Molecular Cloning,A Laboratory Manual 2nd ed.」(Cold Spring Harbor Press(1989);特にSection9.47−9.58)等を参照することができる。また、配列番号1と50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、98%以上又は99%以上の相同性を有し、かつhTERTプロモーターとしての活性を有するヌクレオチドの塩基配列も用いることができる。
本発明において、E1A遺伝子、IRES配列及びE1B遺伝子をこの順に含むこととしたのは、IRES配列をE1A遺伝子とE1B遺伝子との間に挿入したものを使用すると、ウイルスが宿主細胞に感染した際に、増殖能が高くなるためである。なお、E1A遺伝子とE1B遺伝子は、E1遺伝子に含まれる遺伝子であるが、このE1遺伝子とは、ウイルスの有するDNA複製に関する初期遺伝子(early:E)と後期遺伝子(late:L)のうちの初期遺伝子の一つをいい、ウイルスゲノムの転写の制御に係わるタンパク質をコードしている。E1A遺伝子によりコードされるE1Aタンパク質は、感染可能なウイルス産生に必要な遺伝子群(E1B、E2、E4等)の転写を活性化する。E1B遺伝子でコードされるE1Bタンパク質は、後期遺伝子(L遺伝子)のmRNAが、感染した宿主細胞の細胞質へ蓄積するのを助け、宿主細胞のタンパク質合成を阻害することで、ウイルスの複製を促進する。E1A遺伝子、E1B遺伝子の塩基配列を、それぞれ配列番号2及び配列番号3に示す。
E1A及びE1Bは、それぞれ配列番号2及び配列番号3に示される塩基配列のほか、配列番号2及び配列番号3からなるDNAに対し相補的な塩基配列よりなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ各々E1A及びE1Bとしての活性を有するタンパク質をコードする塩基配列も含まれる。このような塩基配列は、それぞれ配列番号2及び配列番号3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、又はその断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、cDNAライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることができる。cDNAライブラリーの作製方法については、「Molecular Cloning,A Laboratory Manual 2nd ed.」(Cold Spring Harbor Press(1989))を参照することができる。また、市販のcDNAライブラリー及びゲノムライブラリーを用いてもよい。上記ハイブリダイゼーションにおいてストリンジェントな条件としては、たとえば、1×SSC〜2×SSC、0.1%〜0.5%SDS及び42℃〜68℃の条件が挙げられ、より詳細には、60〜68℃で30分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、2×SSC、0.1%SDS中、室温で5〜15分の洗浄を4〜6回行う条件が挙げられる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Molecular Cloning,A Laboratory Manual 2nd ed.」(Cold Spring Harbor Press(1989);特にSection9.47−9.58)等を参照することができる。また、配列番号2又は3と50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、98%以上又は99%以上の相同性を有し、かつE1A及びE1Bとしての活性を有するヌクレオチドの塩基配列も用いることができる。
IRES(Internal Ribosome Entry Site)とは、ピコルナウイルス科に特異的なタンパク質合成開始シグナルであり、18SリボソームRNAの3’末端と相補的な配列があるためリボソーム結合部位としての役割を果たすと考えられている。ピコルナウイルス科のウイルス由来mRNAはこの配列を介して翻訳されることが知られている。IRES配列からの翻訳効率は高く、mRNAの途中からでもキャップ構造非依存的にタンパク質合成が行われる。したがって、本ウイルスでは、ヒトテロメラーゼのプロモーターによりE1A遺伝子とIRES配列の下流にあるE1B遺伝子の両方が独立に翻訳される。IRESを使用すると、テロメラーゼのプロモーターの発現制御がE1A遺伝子、E1B遺伝子に独立して及ぶために、E1A遺伝子あるいはE1B遺伝子のいずれか一方をテロメラーゼのプロモーターで制御する場合に比べて、ウイルスの増殖をより厳格にテロメラーゼ活性を有する細胞に限定することができる。IRES配列を配列番号4に示す。
また、IRESは、配列番号4に示される塩基配列のほか、配列番号4からなるDNAに対し相補的な塩基配列よりなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつIRESとしての活性を有するタンパク質をコードする塩基配列も含まれる。このような塩基配列は、配列番号4で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、又はその断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、cDNAライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることができる。cDNAライブラリーの作製方法については、「Molecular Cloning,A Laboratory Manual 2nd ed.」(Cold Spring Harbor Press(1989))を参照することができる。また、市販のcDNAライブラリー及びゲノムライブラリーを用いてもよい。上記ハイブリダイゼーションにおいてストリンジェントな条件としては、たとえば、1×SSC〜2×SSC、0.1%〜0.5%SDS及び42℃〜68℃の条件が挙げられ、より詳細には、60〜68℃で30分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、2×SSC、0.1%SDS中、室温で5〜15分の洗浄を4〜6回行う条件が挙げられる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Molecular Cloning,A Laboratory Manual 2nd ed.」(Cold Spring Harbor Press(1989);特にSection9.47−9.58)等を参照することができる。また、配列番号4と50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、98%以上又は99%以上の相同性を有し、かつIRESとしての活性を有するヌクレオチドの塩基配列も用いることができる。
また、本発明において、ヒトテロメラーゼのプロモーターは、E1遺伝子の上流に位置する。テロメラーゼ活性を有する細胞内で増殖を促進することができるからである。
本発明の組換えウイルスに含まれる遺伝子は、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、遺伝子工学的手法として一般的に用いられているDNA合成装置を用いた核酸合成法を使用することができる。また、鋳型となる遺伝子配列を単離又は合成した後に、それぞれの遺伝子に特異的なプライマーを設計し、PCR装置を用いてその遺伝子配列を増幅するPCR法(Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons(1987)Section 6.1−6.4)又はクローニングベクターを用いた遺伝子増幅法を用いることができる。上記方法は、Moleculer cloning 2nd Edt.Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)等に従い、当業者ならば容易に行うことができる。得られたPCR産物の精製には公知の方法を用いることができる。たとえば、エチジウムブロマイドを用いる方法、SYBR GreenI(Molecular probes社)を用いる方法、GENECLEAN(フナコシ)、QIAGEN(QIAGEN社)等によるアガロースゲルを用いる方法、DEAE−セルロース濾紙を用いる方法、フリーズ&スクイーズ法、透析チューブを用いる方法等がある。アガロースゲルを用いる場合には、アガロースゲル電気泳動し、DNA断片をアガロースゲルより切り出して精製する。必要に応じて、慣用の配列決定法により期待された遺伝子が得られていることを確認することができる。例えば、ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法(Sanger et al.(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:5463)等により行うことができる。また、適当なDNAシークエンサー(例えば、ABI PRISM(アプライドバイオシステムズ社))を利用して配列を解析することも可能である。
その後、上記のようにして得られた各々の遺伝子を所定の順序となるように連結させる。まず、上記各々の遺伝子を公知の制限酵素等で切断し、切断した当該遺伝子のDNA断片を公知のベクターに公知の方法に従って挿入し、連結する。公知のベクターとしては、脳心筋炎ウイルス(ECMV)のIRES(mRNA内部のリボソーム結合サイト)が含まれていて、1種類のmRNAから2箇所のオープンリーディングフレーム(ORF)を翻訳することが可能なpIRESベクターのほか、大腸菌由来のプラスミド(pCR4、pCR2、pCR2.1、pBR322、pBR325、pUC12、pUC13など)、枯草菌由来のプラスミド(pUB110、pTP5、pC194など)、酵母由来プラスミド(pSH19、pSH15など)、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、pA1−11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neoなどが用いられるが、本発明の場合は、pIRESベクターを用いると、マルチクローニングサイトに、順次必要な遺伝子を挿入することにより、「ヒトテロメラーゼのプロモーター、E1A遺伝子、IRES配列及びE1B遺伝子」をこの順に含む組み換え遺伝子を作製することができるため、好ましい。DNAの連結には、DNAリガーゼを用いることができる。上記組換え遺伝子のウイルスへの組み込みは、例えばエレクトロポレーション法、リポソーム法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等を用いることができる。
本発明において、ヒトテロメラーゼとしてhTERTを用いる場合について以下に具体的に説明する。
293細胞等のE1遺伝子を発現している細胞からE1A−S、E1A−AS、E1B−S、E1B−AS等のプライマーを用いて、RT−PCR及び/又はDNA−PCRを行うことによりE1A遺伝子及びE1B遺伝子を増幅し、必要に応じてTAクローニング等の公知の方法を用いて配列を確認した後、公知の制限酵素でE1A及びE1BのDNA断片を切り出すことができる。
次に、本発明に使用されるhTERT−E1A−IRES−E1Bからなる遺伝子は、公知のベクター(例えばpIRES等)に『E1A−IRES−E1B』の順になるように各遺伝子を、マルチクローニングサイト等を利用して挿入することにより作製することができる。次いで、MluI、BglIII等の制限酵素で切り出したhTERTプロモーター配列を、E1Aの上流に挿入することができる。
なお、必要に応じて、pShuttleなどの公知ベクターに含まれるサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターをMfeI、NheI等の適当な制限酵素により取り除き、その部位にphTERT−E1A−IRES−E1Bから制限酵素NheIおよびNotIで切り出した配列を挿入することができる。このように、本発明に使用されるhTERT−E1A−IRES−E1Bからなるカセット(図1)を組込んだアデノウイルスを、特に「テロメライシン」又は「Telomelysin」という。hTERTプロモーターの制御下にアデノウイルスの増殖に必要なE1遺伝子を発現させることによって、ウイルスを癌細胞特異的に増殖させることができる。
組換えウイルスを細胞に感染させるには、例えば、以下の方法で感染させることができる。まず、ヒト大腸癌細胞SW620、ヒト肺癌細胞A549、H1299等の細胞を適当な培養液が入った培養プレートに播き、炭酸ガス存在下で、37℃で培養する。培養液は、動物細胞培養に一般的に使用されるDMEM、MEM、RPMI−1640などが採用され、必要応じて血清、抗生物質、ビタミン等を添加することができる。培養した細胞に一定量の本ウイルス、例えば、0.1〜10MOI、好ましくは、0.1〜1MOI(multiplicity of infection)を接種することにより感染させる。MOIとは、一定量の培養細胞に一定量のウイルス粒子を感染させる場合のウイルス量(感染単位)と細胞数の比をいい、ウイルスを細胞に感染させる際の指標として用いられる。
なお、ウイルス増殖を確認するには、ウイルス感染細胞を回収し、DNAを抽出し、本ウイルスが有する適当な遺伝子を標的とするプライマーを用いてリアルタイムPCRを行うことで定量的に解析することができる。
2.抗腫瘍作用を有する物質
本発明の抗腫瘍作用を有する物質とは、生体の調節機構が乱れて細胞分裂を繰り返し、細胞が過剰増殖した結果、腫瘍塊となるような腫瘍細胞(癌細胞)の発育や増殖を抑制する作用を有する物質をいい、癌細胞の核酸合成を抑制し、あるいは、代謝を阻害することにより増殖を阻止するような物質も含まれる。具体的には、癌細胞の核酸タンパク質にアルキル基を導入して細胞障害を起こさせるようなアルキル化活性を有する物質、代謝過程で酵素に拮抗して、細胞合成を阻害する代謝拮抗活性を有する物質、抗癌作用を有する抗生物質、微小管に作用して抗腫瘍効果を示す微小管阻害活性を有する物質、トポイソメラーゼを阻害するトポイソメラーゼ阻害活性を有する物質などがある。トポイソメラーゼとは、DNAに一時的に切れ目を入れてDNA鎖のリンキング数を変える反応を触媒する酵素である。各物質について以下に具体的に示す。
アルキル化活性を有する物質:カルボコン、ブスルファン(マスタード薬)、ニムスチン(ニトロソウレア類)など
代謝拮抗活性を有する物質:メトトレキサート(葉酸系)、メルカプトプリン、(プリン系)、シタラビン(ピリミジン系)、フルオロウラシル、テガフール、カルモフールなど
抗生物質:アクチノマイシンD、ブレオマイシン、アドリアマイシン、マイトマイシンCなど
微小管阻害活性を有する物質:ドセタキセル、パクリタキセル(タキサン)、ビノレルビン、ビンクリスチン、ビンブラスチン(アルカロイド系)など
トポイソメラーゼ阻害活性を有する物質:イリノテカン(トポイソメラーゼI阻害薬)、ポドフィロトキシン誘導体(トポイソメラーゼII阻害薬)
本発明においては、上記抗腫瘍作用を有する物質の塩を用いることもできる。本発明に適する「塩」としては、特に限定されないが、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、ピロ硫酸、メタリン酸、ヨウ化水素酸等の各種無機酸付加塩;酢酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、グリコール酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、シュウ酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、p−トルエンスルホン酸塩、アスコルビン酸塩、安息香酸等の各種有機酸付加塩;アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、等の各種アミノ酸との塩を挙げることができる。また、上記物質がフェノール性水酸基又はカルボキシル基を有する場合には、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩として用いることもできる。
また、本発明においては、上記物質の水和物又は非水和物などを用いることができる。非水和物としては、アルコール(例えば、メタノール、エタノール、n−プロパノール)、ジメチルホルムアミドなどを使用することができる。
上記物質は、公知の化学合成により、あるいは市販品としても得ることができる。
特に、上記した抗癌剤のうち、本発明における抗癌剤としては、微小管阻害活性を有する物質であるドセタキセル及びビノレルビン並びにトポイソメラーゼ阻害活性を有する物質であるイリノテカンが好ましいがこれらに限定されない。
ドセタキセルとは、上記微小管阻害薬のうちのタキサン系に分類され、主に乳がん、非小細胞肺癌の治療に適用される。ドセタキセルは、セイヨウイチイ針葉抽出物から半合成品として得られ、チューブリンとの重合を促進して、微小管形成と共に、微小管の脱重合を抑制するほか、細胞の有糸分裂を停止させる機能を有する。
ビノレルビンとは、上記微小管阻害薬のうちの植物(ビンカ)アルカロイド系に分類され、非小細胞肺がんの治療に適用されるほか、注射薬として乳がんに対する治験が行われている。ビノレルビンは、神経毒性が低く、チューブリンに選択的に作用してその重合を阻害するほか、細胞分裂を妨げることで細胞を死滅させる機能を有する。
イリノテカンとは、上記トポイソメラーゼI阻害活性を有する物質として分類され、大腸ガン、いくつかの悪性リンパ腫並びに小細胞肺癌、非小細胞肺癌、子宮頸癌、卵巣癌、胃癌(手術不能又は再発)、結腸・直腸癌(手術不能又は再発)、乳癌(手術不能又は再発)、有棘細胞癌、及び悪性リンパ腫(非ホジキンリンパ腫)といった癌の治療に適用される。イリノテカンは、中国原産植物である喜樹から抽出されたビンカアルカロイドであるカンプトテシンであり、細胞分裂に必要な要素の発達を妨げることによりガン細胞の成長を阻害する機能を有する。
また、上記の分類には含まれていないが、ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害活性を有する物質も本発明の医薬組成物に含まれる物質として有効である。HDAC阻害活性を有する物質とは、ヒストン脱アセチル化を阻害するように作用する物質である。HDAC阻害活性を有する物質は、アデノウイルス受容体(CAR)の発現を増強することで、ある種のがん細胞においてテロメライシンと相乗的に抗腫瘍効果を発揮する。
HDACとは、ヒストンのアセチル化を調節する酵素の一種でヒストンのアセチル化を阻害するように作用する酵素である。ヒストンは、ヌクレオソームのコアを形成するタンパク質であり、ヒストンの脱アセチル化を触媒することにより、クロマチンの構造変化を促し、遺伝子発現を抑制する機能を有する。このHDACの作用を阻害し、正常細胞及び腫瘍細胞においてヒストンがアセチル化されるように作用する物質が同定され、現在、米国NCI(米国国立癌研究所)を中心にHDAC阻害剤として臨床試験が進行中である。HDAC阻害活性を有する物質は、細胞腫の分化、もしくは細胞自体の分化を誘導する物質であるため、強力な化学療法をしなくても、癌化した細胞を正常細胞に戻すことができる。
HDAC阻害活性を有する物質の一例として、FR901228(FK228)という物質を挙げることができる(図2)。FR901228は、米国国立癌研究所でNSC番号630176として登録されており、Mapouria mandrarensis由来のシクロペプチドで、分子式C24H36N4O6S2の図2に示すような化学式で表される。FR901228は、造血性細胞において、コクサッキーウイルス・アデノウイルス受容体(CAR)レベルやavインテグリンレベル及びH3ヒストンのアセチル化を促進し、FR901228処理した造血性細胞ではアデノウイルスが感染しやすくなるといわれている(Blood,15 March 2002,vol.99,No.6,pp.2248−2251)。
アデノウイルスは受容体CARを介して細胞に感染・進入するが、CARが陰性である癌細胞ではウイルス感染効率が低下している。そこで、癌細胞においてもCARの発現が増強されれば、アデノウイルスは癌細胞に進入しやすくなる(図3)。FR901228は、癌細胞においてもCARの発現を増強させることができるため、FR901228と本発明の組換えアデノウイルスを併用して用いた場合、FR901228は本来の抗腫瘍作用に加え、併用される組換えアデノウイルスの腫瘍細胞への感染効率を向上させる作用をも有し、好ましい。
ここで、FR901228が腫瘍細胞中のCARの発現を増強しているか否かは、フローサイトメトリーを用いた以下の実験により確認することができる、すなわち、各種腫瘍細胞を適当な条件で培養した後、FR90122を適当量添加して処理した後に、フローサイトメトリーにてCAR発現を解析する。
さらに、遺伝子治療に用いられる物質も本発明の医薬組成物に含まれる物質として有効である。遺伝子治療とは、癌抑制治療、免疫増強活性や血管新生阻害作用を有するタンパク質を体内で一過性に、あるいは持続的に発現させて腫瘍を治療する方法である。このような遺伝子治療に用いられる物質として、具体的には、INGN−201(Advexin;Introgen Therapeutics社)が挙げられるが、これらに限定されない。INGN−201は、腫瘍抑制遺伝子であるp53遺伝子をアデノウイルスに組み込んだ遺伝子治療薬であり、p53タンパク質を発現する複製不能のアデノウイルスである。ある種の腫瘍細胞においてテロメライシンと相乗的に抗腫瘍効果を発揮する。
INGN−201はテロメライシンと異なり、癌細胞にアポトーシス細胞死を誘導することで抗腫瘍効果を発揮する。INGN−201とテロメライシンが同時に癌細胞に感染すると、テロメライシンによって産生されるE1タンパク質を利用することにより、複製不能なINGN−201も増殖することが可能となる。このINGN−201によりp53タンパク質が大量に産生されてアポトーシスが誘導されると共に、テロメライシンによる細胞死も加わるため、非常に強い殺細胞効果が期待される。
本発明の医薬組成物が作用する腫瘍(癌)細胞の種類は、限定されるものではなく、あらゆる種類の腫瘍細胞を用いることができる。例えば、頭頸部、胃、大腸、肺、肝、前立腺、膵、食道、膀胱、胆嚢・胆管、乳房、子宮、甲状腺、卵巣等における固形癌、あるいは白血病、リンパ腫、肉腫、間葉系腫瘍等に有効である。ヒトの組織由来の腫瘍細胞のほとんどはテロメラーゼ活性の上昇を示しており、本発明の医薬組成物はそのようなテロメラーゼ活性により増殖が活発になった腫瘍細胞に全般的に作用しうる。特に、本発明で用いられる、抗腫瘍作用を有する物質(抗癌剤)が作用する大腸、肺、胃、食道、肝臓、前立腺、頭頸部、乳房等に効果がある。
上記のように、腫瘍細胞では正常細胞と比較してテロメラーゼの発現が極めて高いため、本発明の医薬組成物に含まれる組換えウイルスは、正常細胞では増殖せず、腫瘍細胞のみで増殖するため、結果として腫瘍細胞を特異的に死滅させることができる。
3.医薬組成物
本発明の医薬組成物は、ヒトテロメラーゼのプロモーター、E1A遺伝子、IRES配列及びE1B遺伝子をこの順に含むポリヌクレオチドを含む組換えウイルスと、抗腫瘍作用を有する物質とを併用することを特徴とする。
これは、テロメライシン組換えウイルスが腫瘍細胞に及ぼす細胞死の作用機序が、従来の抗がん剤によるアポトーシスの作用機序とは異なること、さらに、テロメライシン組換えウイルスは、抗腫瘍作用を有する物質で腫瘍細胞が処理された場合でも、何らその影響を受けずに、その細胞内での増殖複製を行うことができるといった、テロメライシンの性質により達成されたものである。
本発明の医薬組成物は、そのまま患部に適用することもできるし、あらゆる公知の方法、例えば、静脈、筋肉、腹腔内又は皮下等の注射、あるいは鼻腔、口腔又は肺からの吸入、経口投与、カテーテルなどを用いた血管内投与等により生体(対象となる細胞や臓器)に導入することもできる。さらに、本発明の医薬組成物に含まれる組換えウイルスと、抗腫瘍作用を有する物質とは、同時に投与することもできるし、一方を投与後、一定時間経過後に他方を投与する方法により生体に導入することもできる。
また、例えば凍結などの方法により扱いやすくした後、そのまま用いてもよく、あるいは賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤等公知の薬学的に許容される担体、公知の添加剤(緩衝剤、等張化剤、キレート剤、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等が含まれる。)などと混合することができる。本発明の医薬組成物に含まれる組換えウイルスと、抗腫瘍作用を有する物質とを別個独立に投与する場合は、各々に上記物質を混合することもできる。
本発明の医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、シロップ剤等の経口投与剤、注射剤、外用剤、坐剤、点眼剤等の非経口投与剤などの形態に応じて、経口投与又は非経口投与することができる。好ましくは、筋肉、腹腔等への局部注射、静脈への注射等が例示される。
投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象、患者の年齢、体重、性別、症状その他の条件により適宜選択されるが、本発明に含まれるウイルスの一日投与量としては、106〜1011PFU(plaque forming units)程度、好ましくは109〜1011PFU程度とするのがよく、1日1回投与することもでき、数回に分けて投与することもできる。また、本発明のウイルスを使用する際には、公知の免疫抑制剤等を用いることにより、生体の免疫を抑制し、該ウイルスが感染し易くすることもできる。更に、本発明のウイルスは、公知の抗癌剤及び放射線からなる群から選ばれる少なくとも1種の抗癌剤を併用することもできる。
本発明の医薬組成物は、以下の理由で副作用が生じる可能性は極めて低いと考えられ、非常に安全な製剤であるということができる。
(1)正常の体細胞ではテロメラーゼ活性がほとんどなく、また、造血細胞等の浮遊細胞では本発明のウイルスは感染しにくい。
(2)本発明のウイルスは増殖能を有するので、通常の遺伝子治療で用いられている非増殖性ウイルスよりも低い濃度で使用することができる。
(3)本発明のウイルスが過剰に投与された場合であっても、生体内の通常の免疫作用によって抗ウイルス作用が働く。
本発明に含まれる抗腫瘍作用を有する物質の投与量も、有効成分の種類、投与経路、投与対象、患者の年齢、体重、性別、症状その他の条件により適宜選択される。例えば、ドセタキセルの場合は、通常、成人に1日1回、60mg/m2(体表面積)を1時間以上かけて3〜4週間間隔で点滴静注する。なお、症状により適宜増減することが可能である。ただし、1回最高用量は70mg/m2とする。
ビノレルビンの場合は、例えば、1回2.0〜2.5mg/m2を1週間間隔で静脈内に緩徐に静注することができる。
イリノテカンの場合は、例えば、塩酸イリノテカンとして、通常、成人に1日1回、150mg/m2を2週間間隔で3〜4回点滴静注し、少なくとも3週間休薬する。これを1クールとして、投与を繰り返す。
FR901228の場合は、欧米にて臨床試験が進行中であり、未だ至適容量や至適投与経路が確立されていない。
INGN−201の場合は、まだ臨床試験が進行中であり、至適容量は確立されていないが、本邦での臨床試験では1011PFU(plaque forming units)まで、また米国の臨床試験でも3x1012VP(virus particles)までの投与で重篤な副作用はみられていない。投与経路としては腫瘍内投与が好ましいがこれに限定されない。
本発明の医薬組成物の抗腫瘍作用は以下のように試験を行い検討することができる。
(1)組換えウイルスと抗腫瘍作用を有する物質の併用効果の検討
本発明の医薬組成物に含まれる組換えウイルスと抗腫瘍作用を有する物質を併用すると、これらを単独で使用した場合には効果がみられない腫瘍に対して抗腫瘍作用を発揮する。従って、本発明の医薬組成物を用いることでより多様な腫瘍に対する治療等が可能となる。
また、腫瘍の種類によっては、抗腫瘍作用を有する物質を低濃度で投与すると本発明の医薬祖生物の抗腫瘍効果が発揮されるが、抗腫瘍作用を有する物質を高濃度で投与すると本発明の医薬祖生物の抗腫瘍効果が発揮されない場合がある。抗腫瘍作用を有する物質の服用は、副作用を伴うことが多いため、当該投与量を少なくするのは、患者のQOLの向上という側面からも好ましい。
本発明の医薬組成物が癌細胞に対して、どの程度の抗腫瘍効果が認められるか解析するには、例えば、XTTアッセイを行いることができる。
XTT(2,3−bis[2−Methoxy−4−nitro−5−sulfophenyl]−2H−tetrazolium−5−carboxyanilide inner salt)アッセイは、生細胞中のミトコンドリアの脱水素酵素により生存細胞の活性を測定することを基本原理としており、インビトロにおける細胞毒性をモニターするのに適した方法である。以下にXTTアッセイについて具体的に説明する。
XTT溶液は、フェノールレッドを含まない場合又は平衡塩溶液に溶解させた場合は黄色を示す。このXTT溶液が生存細胞と接触すると、生存細胞のミトコンドリアの脱水素酵素がXTTのテトラゾリウム環を切断し、水溶液に可溶の橙色のフォルマザン結晶が生成する。なお、実際はXTTの生物学的還元が不十分であるため、還元促進剤としてフェナジンメトサルフェート(PMS)等の電子共役物質が反応液に添加されることが多い。そして、細胞数の増減によって、生成するフォルマザン量が変化することを利用し、得られた橙色の溶液を比色法により測定することによって、所望の物質の細胞毒性を測定することができる。本発明の医薬組成物の解析にあたっては、本発明の組換えウイルスをインビトロで培養中の種々の癌細胞に適当な濃度(MOI:multiplicity of infection)で感染させる。上記細胞を適当な条件で培養後、種々の濃度の抗腫瘍作用を有する物質を上記ウイルス感染細胞培養液に投与する。ウイルス感染後、適当な期間培養した後に、上記XTTアッセイを行い、抗腫瘍効果を解析することができる。
(2)抗腫瘍作用を有する物質が組換えウイルスの増殖に及ぼす影響
本発明の医薬組成物に含まれる組換えウイルスと抗腫瘍作用を有する物質を併用しても、抗腫瘍作用を有する物質の存在によって組換えウイルスの増殖複製は何ら影響を受けない。従って、本発明の医薬組成物に含まれる前記ウイルスは、併用されても、単独で使用されるときに発揮される抗腫瘍効果が阻害されることはない。
本発明の医薬組成物において併用される抗腫瘍作用を有する物質が組換えウイルスの標的細胞内における増殖にどのような影響を及ぼすのかについては、例えば、定量的リアルタイムPCRを用いて以下のように測定することができる。すなわち、抗腫瘍作用を有する物質を併用して組換えウイルスを適当な期間培養した後、ウイルス感染細胞を回収してDNAを抽出し、本ウイルスが有する適当な遺伝子を標的とするプライマーを用いてリアルタイムPCRを行うことで、本ウイルスが有する適当な遺伝子を定量的に解析することができる。このとき、例えば、本発明の組換えウイルスに蛍光物質をコードする遺伝子などを組み込んでおくと、本ウイルスの増殖がみられる細胞は、励起光をあてることにより所定の蛍光(例えばGFPの場合は緑色蛍光)を発するため、細胞内におけるウイルス増殖を可視化することができる。例えば、ウイルス感染細胞を蛍光顕微鏡下に観察すると、細胞でGFP蛍光発現が見られる。また、CCDカメラを用いて、経時的にGFP蛍光発現を観察することで、ウイルス感染細胞を経時的に観察することもでき、そのような組換えウイルスを生体内に投与すれば、生体内において細胞をリアルタイムで標識および検出することもできる。
(3)抗腫瘍作用を有する物質及び組換えウイルスが腫瘍細胞の細胞周期に及ぼす影響
本発明の医薬組成物において併用される抗腫瘍作用を有する物質と組換えウイルスが腫瘍細胞に及ぼす抗腫瘍効果は、各々独立しており、互いに影響を及ぼしあうようなものではない。組換えウイルスが腫瘍細胞に及ぼす抗腫瘍効果は、抗腫瘍作用を有する物質の抗腫瘍効果とは全く異なる作用機序によるものである。従って、組換えウイルスが存在しても、例えば、抗腫瘍作用を有する物質が腫瘍細胞の細胞周期を阻害し、アポトーシスを誘導する機能が失われることはない。
本発明の医薬組成物において併用される抗腫瘍作用を有する物質と組換えウイルスが標的とする細胞周期にどのような影響を及ばすのかについては、例えば、フローサイトメトリー(Flow cytometry)を用いて、核を染色するPI(propidium iodide)により細胞周期(cell cycle)を解析することができる。
フローサイトメトリーとは、細胞浮遊液を高速で流動させて、個々の粒子から発する蛍光を測定することにより、細胞集団中の個々の細胞の大きさ、DNA含量等を測定する方法をいう。フローサイトメトリーは、細胞1個1個の相対的大きさや形状、内部構造の違いを解析できるばかりではなく、さらに蛍光標識を行うことにより蛍光強度や蛍光の種類を測定し、細胞の同定や細胞群を構成する種々の細胞の存在比を短時間で解析することができる。
細胞膜は、細胞死により、その状態を保てなくなるため、上記PI等で容易に核が染色される。従って、このPIによる核染色の結果から、DNA量と細胞周期を判定することができる。なお、腫瘍細胞では、細胞周期におけるS期及びG2/M期の割合が高いと悪性度が高いとされる。従って、G2/M期の割合が抑制されるような結果が得られれば、抗腫瘍効果が認められるといえる。
(4)抗腫瘍作用を有する物質及び組換えウイルス併用時におけるインビボ抗腫瘍効果
本発明の医薬組成物である抗腫瘍作用を有する物質及び組換えウイルスを併用した場合には、組換えウイルスを単独投与した場合や、抗腫瘍作用を有する物質を単独投与した場合に比較して極めて高い抗腫瘍効果を得ることができる。
抗腫瘍効果は、例えば、以下のように腫瘍径を計測することによって解析することができる。
第5週齢ヌードマウス背部皮下に適当な腫瘍細胞、例えばH1299を接種し、腫瘍が5〜10mm大になった時点で、適当な間隔をおいて、テロメライシンを適当量腫瘍内に投与し、ドセタキセルを腹腔内に適当量投与する。このとき、対照として、PBSを腫瘍内投与、腹腔内投与するとよい。投与後、適当な期間をおいて腫瘍径を計測し、コントロールと比べて腫瘍の大きさに有意差が見られるかを解析する。
また、本発明の医薬組成物は、抗腫瘍作用を有する物質が、組換えウイルスの感染効率を増強させる作用を有する場合もありうる。そのような作用があることを確認するには、例えば、腫瘍細胞の培養液に抗腫瘍作用を有する物質を添加した後に、組換えウイルスを接種し、そのウイルスが腫瘍細胞にどの程度感染したかを測定することにより、腫瘍細胞の培養液に抗腫瘍作用を有する物質を添加していない培養液に接種したウイルスの感染状態と比較することにより確認することができる。
そのウイルスが腫瘍細胞にどの程度感染したかを確認するには、例えば、本発明の非増殖型組換えウイルスのベクターに、LacZ遺伝子を組み込んだ非増殖型LacZ遺伝子発現アデノウイルスを用いることができる。この方法を用いると、この非増殖型LacZ遺伝子発現アデノウイルスが細胞に感染し、増殖するとLacZ遺伝子が発現して青色に発色するので、ウイルス感染が確認しやすいからである。別の方法としては、本発明の組換えウイルスゲノム中の適当部位に、標識タンパク質、例えば、GFPをコードする遺伝子を組み込んだ組換えウイルスを用いることもできる。このような組換えウイルスを用いると、ウイルスの増殖は、GFPを定量することにより確認できるため好ましい。
本発明の抗腫瘍作用を有する物質と組換えウイルスの併用効果を確認するためには、例えば、アイソボログラム(Isobologram)を用いた試験によって確認することもできる。
アイソボログラムとは、2つの物質の相乗効果の有無を解析するためシステムである。具体的には、ある薬剤とある薬剤の相乗効果の有無を、MTTアッセイもしくはチミジンの取り込みをもとに腫瘍細胞の増殖の進行の有無を調べるものである。MTTアッセイとは、医薬組成物の感受性テストであり、具体的には、腫瘍細胞を各種抗癌剤とともに適当な期間混合培養し、培養終了時の生残腫瘍細胞の活性をミトコンドリアのSuccinic dehydrogenase(SD)活性を判定することにより抗癌剤に対する感受性を判定することによって行う。すなわち腫瘍細胞とSDの基質であるテトラゾリウム塩(MTT)とを反応させ、析出するフォルマザン結晶をDMSOで溶解し、紫色の発色をマイクロプレートリーダーにより吸光度を測定する(MTT判定)。このようにして生細胞活性を測定することで、薬剤の効果を比色により判定することが可能となるのである。例えば、本発明の抗腫瘍作用を有する物質と組換えウイルスを適当な腫瘍細胞、例えば、ヒト肺癌細胞H1299に投与して培養した後、上記方法を用いて、MTTアッセイをすることにより、H1299に対する抗腫瘍活性を測定することができる。
(5)本発明の医薬組成物の腫瘍内投与後の腫瘍組織及び肝臓の組織学的変化(HE染色)
本発明の医薬組成物は、服用しても肝臓に影響を与えることがなく、安全性が高い優れた医薬組成物である。医薬組成物が体内に投与された場合に、肝臓、消化管粘膜、腎臓等で分解・解毒される(代謝)。このとき、最大の代謝器官が肝臓である。本発明の医薬組成物を生体内に投与した場合、標的とする腫瘍組織に抗腫瘍効果を及ぼしても、上記したような代謝器官である肝臓には何ら影響を及ぼさない。従って、本発明の医薬組成物は、安全性が高い優れた医薬組成物といえる。
このような医薬組成物の安全性評価は、例えば、本発明における医薬組成物を腫瘍内に投与した場合に、腫瘍組織及び肝臓組織がどのように変化するかを解析すればよい。例えば、ヘマトキシリン・エオジン(HE)染色等の組織学的染色方法を用いて確認することができる。
HE染色は基本的な組織染色方法で、組織内の電荷の違いにより染まる色素が異なることを利用したものである。例えば、核は青紫色に染まり、その他の細胞質、線維、赤血球などは、それぞれの性質に応じ濃淡各種の赤色に染まる。
具体的には、本発明の医薬組成物を投与した腫瘍組織等の組織切片を脱パラフィン処理後、ヘマトキシリン液で処理した後、エオジン液で処理することによって腫瘍組織等の組織学的変化を確認することができる。例えば、腫瘍細胞に抗腫瘍効果が見られた場合は、腫瘍細胞が硝子化変性起こす。
4.本発明の医薬組成物を用いた腫瘍細胞の増殖を抑制する方法
本発明は、上記テロメライシン組換えウイルスと、抗腫瘍作用を有する物質とを組み合わせて用いることを特徴とする、腫瘍細胞の増殖を抑制する方法である。
腫瘍細胞の増殖を抑制するには、例えば、テロメライシンを投与した後に微小管阻害薬を投与すればよい。培養細胞を用いた実験から、この方法により顕著な併用効果が認められることが明らかである。又は、テロメライシンを腫瘍内に投与し、同時に微小管阻害薬を全身投与してもよい。動物実験では、上記のような同時投与により明らかな併用効果が認められている。一方、HDAC阻害剤の場合は、テロメライシンより先にHDAC阻害剤を用いてもよく、このような方法により、いっそう強い相乗効果が得られる。なお、INGN−201とテロメライシンを併用する場合は、腫瘍細胞の種類によっては、テロメライシン投与24時間後に、INGN−201を投与するといった投与方法が効果的な場合と、同時投与でも同様の効果が得られる場合がある。例えば、肺癌では、テロメライシンを先行投与した方が効果的である一方で、大腸癌では同時投与でも同様の効果が得られる。なお、INGN−201とテロメライシンの併用投与はこれらの細胞に限定されない。
以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
1.本発明の組換えウイルス
本発明の組換えウイルスは、ヒトテロメラーゼのプロモーター、E1A遺伝子、IRES配列及びE1B遺伝子をこの順に含むポリヌクレオチドがゲノムに組み込まれたウイルスをいう。用いられるウイルスは特に限定されないが、安全性等の点からアデノウイルスが好ましい。また、アデノウイルスの中でも、使用の簡便さ等の点からタイプ5のアデノウイルスが特に好ましい。
本発明に使用される組換えウイルスは、ヒトテロメラーゼのプロモーターにより、E1A遺伝子、IRES配列及びE1B遺伝子が駆動される。腫瘍細胞では正常細胞と比較してテロメラーゼの発現が極めて高いため、テロメラーゼが含まれる腫瘍細胞においてはテロメラーゼプロモーターが発現し、これにより本発明に含まれる組換えウイルスが増殖する。このように、本発明の医薬組成物に含まれる組換えウイルスは、正常細胞では増殖せず、腫瘍細胞でしか増殖しないので、癌細胞特異的およびテロメラーゼ特異的に増殖・複製されることになる。その結果、腫瘍細胞内では、ウイルス増殖による細胞障害が起こり、これにより、本発明に使用される組換えウイルスは腫瘍細胞を特異的に死滅させることができる。
「テロメラーゼのプロモーター」は、テロメラーゼの転写開始部位を決定し、その頻度を直接的に調節する。テロメラーゼとは、真核生物染色体の複製時の短縮に拮抗して、テロメア長を維持する酵素である。このようなテロメラーゼのプロモーターの種類は、目的とする遺伝子の発現に用いるウイルスに対応しうる、適切なプロモーターであればいかなるものでもよく、特に限定されるものではないが、例えば、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)のプロモーターが好ましい。hTERTは、その5’末端の上流1.4kbpの領域で、多くの転写因子結合配列が確認されており、その領域がhTERTプロモーターと考えられるが、中でも、翻訳開始部位の上流181bpの配列が下流の遺伝子発現に重要なコア領域である。本発明において、このコア領域を含むものであれば、限定されずに使用することができるが、このコア領域を完全に含む上流378bp程度の配列をhTERTプロモーターとして使用するのが好ましい。この378bp程度の配列は、181bpのコア領域単独の場合と比べて、その遺伝子発現効率が同等であることが確認されている。455bpの長さのhTERTプロモーターの塩基配列を配列番号1に示す。
hTERTプロモーターは、配列番号1に示される塩基配列のほか、配列番号1からなるDNAに対し相補的な塩基配列よりなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつhTERTプロモーターとしての活性を有するヌクレオチドの塩基配列も含まれる。このようなヌクレオチドは、配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、又はその断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、cDNAライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることができる。cDNAライブラリーの作製方法については、「Molecular Cloning,A Laboratory Manual 2nd ed.」(Cold Spring Harbor Press(1989))を参照することができる。また、市販のcDNAライブラリー及びゲノムライブラリーを用いてもよい。上記ハイブリダイゼーションにおいてストリンジェントな条件としては、たとえば、1×SSC〜2×SSC、0.1%〜0.5%SDS及び42℃〜68℃の条件が挙げられ、より詳細には、60〜68℃で30分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、2×SSC、0.1%SDS中、室温で5〜15分の洗浄を4〜6回行う条件が挙げられる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Molecular Cloning,A Laboratory Manual 2nd ed.」(Cold Spring Harbor Press(1989);特にSection9.47−9.58)等を参照することができる。また、配列番号1と50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、98%以上又は99%以上の相同性を有し、かつhTERTプロモーターとしての活性を有するヌクレオチドの塩基配列も用いることができる。
本発明において、E1A遺伝子、IRES配列及びE1B遺伝子をこの順に含むこととしたのは、IRES配列をE1A遺伝子とE1B遺伝子との間に挿入したものを使用すると、ウイルスが宿主細胞に感染した際に、増殖能が高くなるためである。なお、E1A遺伝子とE1B遺伝子は、E1遺伝子に含まれる遺伝子であるが、このE1遺伝子とは、ウイルスの有するDNA複製に関する初期遺伝子(early:E)と後期遺伝子(late:L)のうちの初期遺伝子の一つをいい、ウイルスゲノムの転写の制御に係わるタンパク質をコードしている。E1A遺伝子によりコードされるE1Aタンパク質は、感染可能なウイルス産生に必要な遺伝子群(E1B、E2、E4等)の転写を活性化する。E1B遺伝子でコードされるE1Bタンパク質は、後期遺伝子(L遺伝子)のmRNAが、感染した宿主細胞の細胞質へ蓄積するのを助け、宿主細胞のタンパク質合成を阻害することで、ウイルスの複製を促進する。E1A遺伝子、E1B遺伝子の塩基配列を、それぞれ配列番号2及び配列番号3に示す。
E1A及びE1Bは、それぞれ配列番号2及び配列番号3に示される塩基配列のほか、配列番号2及び配列番号3からなるDNAに対し相補的な塩基配列よりなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ各々E1A及びE1Bとしての活性を有するタンパク質をコードする塩基配列も含まれる。このような塩基配列は、それぞれ配列番号2及び配列番号3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、又はその断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、cDNAライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることができる。cDNAライブラリーの作製方法については、「Molecular Cloning,A Laboratory Manual 2nd ed.」(Cold Spring Harbor Press(1989))を参照することができる。また、市販のcDNAライブラリー及びゲノムライブラリーを用いてもよい。上記ハイブリダイゼーションにおいてストリンジェントな条件としては、たとえば、1×SSC〜2×SSC、0.1%〜0.5%SDS及び42℃〜68℃の条件が挙げられ、より詳細には、60〜68℃で30分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、2×SSC、0.1%SDS中、室温で5〜15分の洗浄を4〜6回行う条件が挙げられる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Molecular Cloning,A Laboratory Manual 2nd ed.」(Cold Spring Harbor Press(1989);特にSection9.47−9.58)等を参照することができる。また、配列番号2又は3と50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、98%以上又は99%以上の相同性を有し、かつE1A及びE1Bとしての活性を有するヌクレオチドの塩基配列も用いることができる。
IRES(Internal Ribosome Entry Site)とは、ピコルナウイルス科に特異的なタンパク質合成開始シグナルであり、18SリボソームRNAの3’末端と相補的な配列があるためリボソーム結合部位としての役割を果たすと考えられている。ピコルナウイルス科のウイルス由来mRNAはこの配列を介して翻訳されることが知られている。IRES配列からの翻訳効率は高く、mRNAの途中からでもキャップ構造非依存的にタンパク質合成が行われる。したがって、本ウイルスでは、ヒトテロメラーゼのプロモーターによりE1A遺伝子とIRES配列の下流にあるE1B遺伝子の両方が独立に翻訳される。IRESを使用すると、テロメラーゼのプロモーターの発現制御がE1A遺伝子、E1B遺伝子に独立して及ぶために、E1A遺伝子あるいはE1B遺伝子のいずれか一方をテロメラーゼのプロモーターで制御する場合に比べて、ウイルスの増殖をより厳格にテロメラーゼ活性を有する細胞に限定することができる。IRES配列を配列番号4に示す。
また、IRESは、配列番号4に示される塩基配列のほか、配列番号4からなるDNAに対し相補的な塩基配列よりなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつIRESとしての活性を有するタンパク質をコードする塩基配列も含まれる。このような塩基配列は、配列番号4で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、又はその断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、cDNAライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることができる。cDNAライブラリーの作製方法については、「Molecular Cloning,A Laboratory Manual 2nd ed.」(Cold Spring Harbor Press(1989))を参照することができる。また、市販のcDNAライブラリー及びゲノムライブラリーを用いてもよい。上記ハイブリダイゼーションにおいてストリンジェントな条件としては、たとえば、1×SSC〜2×SSC、0.1%〜0.5%SDS及び42℃〜68℃の条件が挙げられ、より詳細には、60〜68℃で30分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、2×SSC、0.1%SDS中、室温で5〜15分の洗浄を4〜6回行う条件が挙げられる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Molecular Cloning,A Laboratory Manual 2nd ed.」(Cold Spring Harbor Press(1989);特にSection9.47−9.58)等を参照することができる。また、配列番号4と50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、98%以上又は99%以上の相同性を有し、かつIRESとしての活性を有するヌクレオチドの塩基配列も用いることができる。
また、本発明において、ヒトテロメラーゼのプロモーターは、E1遺伝子の上流に位置する。テロメラーゼ活性を有する細胞内で増殖を促進することができるからである。
本発明の組換えウイルスに含まれる遺伝子は、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、遺伝子工学的手法として一般的に用いられているDNA合成装置を用いた核酸合成法を使用することができる。また、鋳型となる遺伝子配列を単離又は合成した後に、それぞれの遺伝子に特異的なプライマーを設計し、PCR装置を用いてその遺伝子配列を増幅するPCR法(Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons(1987)Section 6.1−6.4)又はクローニングベクターを用いた遺伝子増幅法を用いることができる。上記方法は、Moleculer cloning 2nd Edt.Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)等に従い、当業者ならば容易に行うことができる。得られたPCR産物の精製には公知の方法を用いることができる。たとえば、エチジウムブロマイドを用いる方法、SYBR GreenI(Molecular probes社)を用いる方法、GENECLEAN(フナコシ)、QIAGEN(QIAGEN社)等によるアガロースゲルを用いる方法、DEAE−セルロース濾紙を用いる方法、フリーズ&スクイーズ法、透析チューブを用いる方法等がある。アガロースゲルを用いる場合には、アガロースゲル電気泳動し、DNA断片をアガロースゲルより切り出して精製する。必要に応じて、慣用の配列決定法により期待された遺伝子が得られていることを確認することができる。例えば、ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法(Sanger et al.(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:5463)等により行うことができる。また、適当なDNAシークエンサー(例えば、ABI PRISM(アプライドバイオシステムズ社))を利用して配列を解析することも可能である。
その後、上記のようにして得られた各々の遺伝子を所定の順序となるように連結させる。まず、上記各々の遺伝子を公知の制限酵素等で切断し、切断した当該遺伝子のDNA断片を公知のベクターに公知の方法に従って挿入し、連結する。公知のベクターとしては、脳心筋炎ウイルス(ECMV)のIRES(mRNA内部のリボソーム結合サイト)が含まれていて、1種類のmRNAから2箇所のオープンリーディングフレーム(ORF)を翻訳することが可能なpIRESベクターのほか、大腸菌由来のプラスミド(pCR4、pCR2、pCR2.1、pBR322、pBR325、pUC12、pUC13など)、枯草菌由来のプラスミド(pUB110、pTP5、pC194など)、酵母由来プラスミド(pSH19、pSH15など)、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、pA1−11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neoなどが用いられるが、本発明の場合は、pIRESベクターを用いると、マルチクローニングサイトに、順次必要な遺伝子を挿入することにより、「ヒトテロメラーゼのプロモーター、E1A遺伝子、IRES配列及びE1B遺伝子」をこの順に含む組み換え遺伝子を作製することができるため、好ましい。DNAの連結には、DNAリガーゼを用いることができる。上記組換え遺伝子のウイルスへの組み込みは、例えばエレクトロポレーション法、リポソーム法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等を用いることができる。
本発明において、ヒトテロメラーゼとしてhTERTを用いる場合について以下に具体的に説明する。
293細胞等のE1遺伝子を発現している細胞からE1A−S、E1A−AS、E1B−S、E1B−AS等のプライマーを用いて、RT−PCR及び/又はDNA−PCRを行うことによりE1A遺伝子及びE1B遺伝子を増幅し、必要に応じてTAクローニング等の公知の方法を用いて配列を確認した後、公知の制限酵素でE1A及びE1BのDNA断片を切り出すことができる。
次に、本発明に使用されるhTERT−E1A−IRES−E1Bからなる遺伝子は、公知のベクター(例えばpIRES等)に『E1A−IRES−E1B』の順になるように各遺伝子を、マルチクローニングサイト等を利用して挿入することにより作製することができる。次いで、MluI、BglIII等の制限酵素で切り出したhTERTプロモーター配列を、E1Aの上流に挿入することができる。
なお、必要に応じて、pShuttleなどの公知ベクターに含まれるサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターをMfeI、NheI等の適当な制限酵素により取り除き、その部位にphTERT−E1A−IRES−E1Bから制限酵素NheIおよびNotIで切り出した配列を挿入することができる。このように、本発明に使用されるhTERT−E1A−IRES−E1Bからなるカセット(図1)を組込んだアデノウイルスを、特に「テロメライシン」又は「Telomelysin」という。hTERTプロモーターの制御下にアデノウイルスの増殖に必要なE1遺伝子を発現させることによって、ウイルスを癌細胞特異的に増殖させることができる。
組換えウイルスを細胞に感染させるには、例えば、以下の方法で感染させることができる。まず、ヒト大腸癌細胞SW620、ヒト肺癌細胞A549、H1299等の細胞を適当な培養液が入った培養プレートに播き、炭酸ガス存在下で、37℃で培養する。培養液は、動物細胞培養に一般的に使用されるDMEM、MEM、RPMI−1640などが採用され、必要応じて血清、抗生物質、ビタミン等を添加することができる。培養した細胞に一定量の本ウイルス、例えば、0.1〜10MOI、好ましくは、0.1〜1MOI(multiplicity of infection)を接種することにより感染させる。MOIとは、一定量の培養細胞に一定量のウイルス粒子を感染させる場合のウイルス量(感染単位)と細胞数の比をいい、ウイルスを細胞に感染させる際の指標として用いられる。
なお、ウイルス増殖を確認するには、ウイルス感染細胞を回収し、DNAを抽出し、本ウイルスが有する適当な遺伝子を標的とするプライマーを用いてリアルタイムPCRを行うことで定量的に解析することができる。
2.抗腫瘍作用を有する物質
本発明の抗腫瘍作用を有する物質とは、生体の調節機構が乱れて細胞分裂を繰り返し、細胞が過剰増殖した結果、腫瘍塊となるような腫瘍細胞(癌細胞)の発育や増殖を抑制する作用を有する物質をいい、癌細胞の核酸合成を抑制し、あるいは、代謝を阻害することにより増殖を阻止するような物質も含まれる。具体的には、癌細胞の核酸タンパク質にアルキル基を導入して細胞障害を起こさせるようなアルキル化活性を有する物質、代謝過程で酵素に拮抗して、細胞合成を阻害する代謝拮抗活性を有する物質、抗癌作用を有する抗生物質、微小管に作用して抗腫瘍効果を示す微小管阻害活性を有する物質、トポイソメラーゼを阻害するトポイソメラーゼ阻害活性を有する物質などがある。トポイソメラーゼとは、DNAに一時的に切れ目を入れてDNA鎖のリンキング数を変える反応を触媒する酵素である。各物質について以下に具体的に示す。
アルキル化活性を有する物質:カルボコン、ブスルファン(マスタード薬)、ニムスチン(ニトロソウレア類)など
代謝拮抗活性を有する物質:メトトレキサート(葉酸系)、メルカプトプリン、(プリン系)、シタラビン(ピリミジン系)、フルオロウラシル、テガフール、カルモフールなど
抗生物質:アクチノマイシンD、ブレオマイシン、アドリアマイシン、マイトマイシンCなど
微小管阻害活性を有する物質:ドセタキセル、パクリタキセル(タキサン)、ビノレルビン、ビンクリスチン、ビンブラスチン(アルカロイド系)など
トポイソメラーゼ阻害活性を有する物質:イリノテカン(トポイソメラーゼI阻害薬)、ポドフィロトキシン誘導体(トポイソメラーゼII阻害薬)
本発明においては、上記抗腫瘍作用を有する物質の塩を用いることもできる。本発明に適する「塩」としては、特に限定されないが、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、ピロ硫酸、メタリン酸、ヨウ化水素酸等の各種無機酸付加塩;酢酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、グリコール酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、シュウ酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、p−トルエンスルホン酸塩、アスコルビン酸塩、安息香酸等の各種有機酸付加塩;アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、等の各種アミノ酸との塩を挙げることができる。また、上記物質がフェノール性水酸基又はカルボキシル基を有する場合には、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩として用いることもできる。
また、本発明においては、上記物質の水和物又は非水和物などを用いることができる。非水和物としては、アルコール(例えば、メタノール、エタノール、n−プロパノール)、ジメチルホルムアミドなどを使用することができる。
上記物質は、公知の化学合成により、あるいは市販品としても得ることができる。
特に、上記した抗癌剤のうち、本発明における抗癌剤としては、微小管阻害活性を有する物質であるドセタキセル及びビノレルビン並びにトポイソメラーゼ阻害活性を有する物質であるイリノテカンが好ましいがこれらに限定されない。
ドセタキセルとは、上記微小管阻害薬のうちのタキサン系に分類され、主に乳がん、非小細胞肺癌の治療に適用される。ドセタキセルは、セイヨウイチイ針葉抽出物から半合成品として得られ、チューブリンとの重合を促進して、微小管形成と共に、微小管の脱重合を抑制するほか、細胞の有糸分裂を停止させる機能を有する。
ビノレルビンとは、上記微小管阻害薬のうちの植物(ビンカ)アルカロイド系に分類され、非小細胞肺がんの治療に適用されるほか、注射薬として乳がんに対する治験が行われている。ビノレルビンは、神経毒性が低く、チューブリンに選択的に作用してその重合を阻害するほか、細胞分裂を妨げることで細胞を死滅させる機能を有する。
イリノテカンとは、上記トポイソメラーゼI阻害活性を有する物質として分類され、大腸ガン、いくつかの悪性リンパ腫並びに小細胞肺癌、非小細胞肺癌、子宮頸癌、卵巣癌、胃癌(手術不能又は再発)、結腸・直腸癌(手術不能又は再発)、乳癌(手術不能又は再発)、有棘細胞癌、及び悪性リンパ腫(非ホジキンリンパ腫)といった癌の治療に適用される。イリノテカンは、中国原産植物である喜樹から抽出されたビンカアルカロイドであるカンプトテシンであり、細胞分裂に必要な要素の発達を妨げることによりガン細胞の成長を阻害する機能を有する。
また、上記の分類には含まれていないが、ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害活性を有する物質も本発明の医薬組成物に含まれる物質として有効である。HDAC阻害活性を有する物質とは、ヒストン脱アセチル化を阻害するように作用する物質である。HDAC阻害活性を有する物質は、アデノウイルス受容体(CAR)の発現を増強することで、ある種のがん細胞においてテロメライシンと相乗的に抗腫瘍効果を発揮する。
HDACとは、ヒストンのアセチル化を調節する酵素の一種でヒストンのアセチル化を阻害するように作用する酵素である。ヒストンは、ヌクレオソームのコアを形成するタンパク質であり、ヒストンの脱アセチル化を触媒することにより、クロマチンの構造変化を促し、遺伝子発現を抑制する機能を有する。このHDACの作用を阻害し、正常細胞及び腫瘍細胞においてヒストンがアセチル化されるように作用する物質が同定され、現在、米国NCI(米国国立癌研究所)を中心にHDAC阻害剤として臨床試験が進行中である。HDAC阻害活性を有する物質は、細胞腫の分化、もしくは細胞自体の分化を誘導する物質であるため、強力な化学療法をしなくても、癌化した細胞を正常細胞に戻すことができる。
HDAC阻害活性を有する物質の一例として、FR901228(FK228)という物質を挙げることができる(図2)。FR901228は、米国国立癌研究所でNSC番号630176として登録されており、Mapouria mandrarensis由来のシクロペプチドで、分子式C24H36N4O6S2の図2に示すような化学式で表される。FR901228は、造血性細胞において、コクサッキーウイルス・アデノウイルス受容体(CAR)レベルやavインテグリンレベル及びH3ヒストンのアセチル化を促進し、FR901228処理した造血性細胞ではアデノウイルスが感染しやすくなるといわれている(Blood,15 March 2002,vol.99,No.6,pp.2248−2251)。
アデノウイルスは受容体CARを介して細胞に感染・進入するが、CARが陰性である癌細胞ではウイルス感染効率が低下している。そこで、癌細胞においてもCARの発現が増強されれば、アデノウイルスは癌細胞に進入しやすくなる(図3)。FR901228は、癌細胞においてもCARの発現を増強させることができるため、FR901228と本発明の組換えアデノウイルスを併用して用いた場合、FR901228は本来の抗腫瘍作用に加え、併用される組換えアデノウイルスの腫瘍細胞への感染効率を向上させる作用をも有し、好ましい。
ここで、FR901228が腫瘍細胞中のCARの発現を増強しているか否かは、フローサイトメトリーを用いた以下の実験により確認することができる、すなわち、各種腫瘍細胞を適当な条件で培養した後、FR90122を適当量添加して処理した後に、フローサイトメトリーにてCAR発現を解析する。
さらに、遺伝子治療に用いられる物質も本発明の医薬組成物に含まれる物質として有効である。遺伝子治療とは、癌抑制治療、免疫増強活性や血管新生阻害作用を有するタンパク質を体内で一過性に、あるいは持続的に発現させて腫瘍を治療する方法である。このような遺伝子治療に用いられる物質として、具体的には、INGN−201(Advexin;Introgen Therapeutics社)が挙げられるが、これらに限定されない。INGN−201は、腫瘍抑制遺伝子であるp53遺伝子をアデノウイルスに組み込んだ遺伝子治療薬であり、p53タンパク質を発現する複製不能のアデノウイルスである。ある種の腫瘍細胞においてテロメライシンと相乗的に抗腫瘍効果を発揮する。
INGN−201はテロメライシンと異なり、癌細胞にアポトーシス細胞死を誘導することで抗腫瘍効果を発揮する。INGN−201とテロメライシンが同時に癌細胞に感染すると、テロメライシンによって産生されるE1タンパク質を利用することにより、複製不能なINGN−201も増殖することが可能となる。このINGN−201によりp53タンパク質が大量に産生されてアポトーシスが誘導されると共に、テロメライシンによる細胞死も加わるため、非常に強い殺細胞効果が期待される。
本発明の医薬組成物が作用する腫瘍(癌)細胞の種類は、限定されるものではなく、あらゆる種類の腫瘍細胞を用いることができる。例えば、頭頸部、胃、大腸、肺、肝、前立腺、膵、食道、膀胱、胆嚢・胆管、乳房、子宮、甲状腺、卵巣等における固形癌、あるいは白血病、リンパ腫、肉腫、間葉系腫瘍等に有効である。ヒトの組織由来の腫瘍細胞のほとんどはテロメラーゼ活性の上昇を示しており、本発明の医薬組成物はそのようなテロメラーゼ活性により増殖が活発になった腫瘍細胞に全般的に作用しうる。特に、本発明で用いられる、抗腫瘍作用を有する物質(抗癌剤)が作用する大腸、肺、胃、食道、肝臓、前立腺、頭頸部、乳房等に効果がある。
上記のように、腫瘍細胞では正常細胞と比較してテロメラーゼの発現が極めて高いため、本発明の医薬組成物に含まれる組換えウイルスは、正常細胞では増殖せず、腫瘍細胞のみで増殖するため、結果として腫瘍細胞を特異的に死滅させることができる。
3.医薬組成物
本発明の医薬組成物は、ヒトテロメラーゼのプロモーター、E1A遺伝子、IRES配列及びE1B遺伝子をこの順に含むポリヌクレオチドを含む組換えウイルスと、抗腫瘍作用を有する物質とを併用することを特徴とする。
これは、テロメライシン組換えウイルスが腫瘍細胞に及ぼす細胞死の作用機序が、従来の抗がん剤によるアポトーシスの作用機序とは異なること、さらに、テロメライシン組換えウイルスは、抗腫瘍作用を有する物質で腫瘍細胞が処理された場合でも、何らその影響を受けずに、その細胞内での増殖複製を行うことができるといった、テロメライシンの性質により達成されたものである。
本発明の医薬組成物は、そのまま患部に適用することもできるし、あらゆる公知の方法、例えば、静脈、筋肉、腹腔内又は皮下等の注射、あるいは鼻腔、口腔又は肺からの吸入、経口投与、カテーテルなどを用いた血管内投与等により生体(対象となる細胞や臓器)に導入することもできる。さらに、本発明の医薬組成物に含まれる組換えウイルスと、抗腫瘍作用を有する物質とは、同時に投与することもできるし、一方を投与後、一定時間経過後に他方を投与する方法により生体に導入することもできる。
また、例えば凍結などの方法により扱いやすくした後、そのまま用いてもよく、あるいは賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤等公知の薬学的に許容される担体、公知の添加剤(緩衝剤、等張化剤、キレート剤、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等が含まれる。)などと混合することができる。本発明の医薬組成物に含まれる組換えウイルスと、抗腫瘍作用を有する物質とを別個独立に投与する場合は、各々に上記物質を混合することもできる。
本発明の医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、シロップ剤等の経口投与剤、注射剤、外用剤、坐剤、点眼剤等の非経口投与剤などの形態に応じて、経口投与又は非経口投与することができる。好ましくは、筋肉、腹腔等への局部注射、静脈への注射等が例示される。
投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象、患者の年齢、体重、性別、症状その他の条件により適宜選択されるが、本発明に含まれるウイルスの一日投与量としては、106〜1011PFU(plaque forming units)程度、好ましくは109〜1011PFU程度とするのがよく、1日1回投与することもでき、数回に分けて投与することもできる。また、本発明のウイルスを使用する際には、公知の免疫抑制剤等を用いることにより、生体の免疫を抑制し、該ウイルスが感染し易くすることもできる。更に、本発明のウイルスは、公知の抗癌剤及び放射線からなる群から選ばれる少なくとも1種の抗癌剤を併用することもできる。
本発明の医薬組成物は、以下の理由で副作用が生じる可能性は極めて低いと考えられ、非常に安全な製剤であるということができる。
(1)正常の体細胞ではテロメラーゼ活性がほとんどなく、また、造血細胞等の浮遊細胞では本発明のウイルスは感染しにくい。
(2)本発明のウイルスは増殖能を有するので、通常の遺伝子治療で用いられている非増殖性ウイルスよりも低い濃度で使用することができる。
(3)本発明のウイルスが過剰に投与された場合であっても、生体内の通常の免疫作用によって抗ウイルス作用が働く。
本発明に含まれる抗腫瘍作用を有する物質の投与量も、有効成分の種類、投与経路、投与対象、患者の年齢、体重、性別、症状その他の条件により適宜選択される。例えば、ドセタキセルの場合は、通常、成人に1日1回、60mg/m2(体表面積)を1時間以上かけて3〜4週間間隔で点滴静注する。なお、症状により適宜増減することが可能である。ただし、1回最高用量は70mg/m2とする。
ビノレルビンの場合は、例えば、1回2.0〜2.5mg/m2を1週間間隔で静脈内に緩徐に静注することができる。
イリノテカンの場合は、例えば、塩酸イリノテカンとして、通常、成人に1日1回、150mg/m2を2週間間隔で3〜4回点滴静注し、少なくとも3週間休薬する。これを1クールとして、投与を繰り返す。
FR901228の場合は、欧米にて臨床試験が進行中であり、未だ至適容量や至適投与経路が確立されていない。
INGN−201の場合は、まだ臨床試験が進行中であり、至適容量は確立されていないが、本邦での臨床試験では1011PFU(plaque forming units)まで、また米国の臨床試験でも3x1012VP(virus particles)までの投与で重篤な副作用はみられていない。投与経路としては腫瘍内投与が好ましいがこれに限定されない。
本発明の医薬組成物の抗腫瘍作用は以下のように試験を行い検討することができる。
(1)組換えウイルスと抗腫瘍作用を有する物質の併用効果の検討
本発明の医薬組成物に含まれる組換えウイルスと抗腫瘍作用を有する物質を併用すると、これらを単独で使用した場合には効果がみられない腫瘍に対して抗腫瘍作用を発揮する。従って、本発明の医薬組成物を用いることでより多様な腫瘍に対する治療等が可能となる。
また、腫瘍の種類によっては、抗腫瘍作用を有する物質を低濃度で投与すると本発明の医薬祖生物の抗腫瘍効果が発揮されるが、抗腫瘍作用を有する物質を高濃度で投与すると本発明の医薬祖生物の抗腫瘍効果が発揮されない場合がある。抗腫瘍作用を有する物質の服用は、副作用を伴うことが多いため、当該投与量を少なくするのは、患者のQOLの向上という側面からも好ましい。
本発明の医薬組成物が癌細胞に対して、どの程度の抗腫瘍効果が認められるか解析するには、例えば、XTTアッセイを行いることができる。
XTT(2,3−bis[2−Methoxy−4−nitro−5−sulfophenyl]−2H−tetrazolium−5−carboxyanilide inner salt)アッセイは、生細胞中のミトコンドリアの脱水素酵素により生存細胞の活性を測定することを基本原理としており、インビトロにおける細胞毒性をモニターするのに適した方法である。以下にXTTアッセイについて具体的に説明する。
XTT溶液は、フェノールレッドを含まない場合又は平衡塩溶液に溶解させた場合は黄色を示す。このXTT溶液が生存細胞と接触すると、生存細胞のミトコンドリアの脱水素酵素がXTTのテトラゾリウム環を切断し、水溶液に可溶の橙色のフォルマザン結晶が生成する。なお、実際はXTTの生物学的還元が不十分であるため、還元促進剤としてフェナジンメトサルフェート(PMS)等の電子共役物質が反応液に添加されることが多い。そして、細胞数の増減によって、生成するフォルマザン量が変化することを利用し、得られた橙色の溶液を比色法により測定することによって、所望の物質の細胞毒性を測定することができる。本発明の医薬組成物の解析にあたっては、本発明の組換えウイルスをインビトロで培養中の種々の癌細胞に適当な濃度(MOI:multiplicity of infection)で感染させる。上記細胞を適当な条件で培養後、種々の濃度の抗腫瘍作用を有する物質を上記ウイルス感染細胞培養液に投与する。ウイルス感染後、適当な期間培養した後に、上記XTTアッセイを行い、抗腫瘍効果を解析することができる。
(2)抗腫瘍作用を有する物質が組換えウイルスの増殖に及ぼす影響
本発明の医薬組成物に含まれる組換えウイルスと抗腫瘍作用を有する物質を併用しても、抗腫瘍作用を有する物質の存在によって組換えウイルスの増殖複製は何ら影響を受けない。従って、本発明の医薬組成物に含まれる前記ウイルスは、併用されても、単独で使用されるときに発揮される抗腫瘍効果が阻害されることはない。
本発明の医薬組成物において併用される抗腫瘍作用を有する物質が組換えウイルスの標的細胞内における増殖にどのような影響を及ぼすのかについては、例えば、定量的リアルタイムPCRを用いて以下のように測定することができる。すなわち、抗腫瘍作用を有する物質を併用して組換えウイルスを適当な期間培養した後、ウイルス感染細胞を回収してDNAを抽出し、本ウイルスが有する適当な遺伝子を標的とするプライマーを用いてリアルタイムPCRを行うことで、本ウイルスが有する適当な遺伝子を定量的に解析することができる。このとき、例えば、本発明の組換えウイルスに蛍光物質をコードする遺伝子などを組み込んでおくと、本ウイルスの増殖がみられる細胞は、励起光をあてることにより所定の蛍光(例えばGFPの場合は緑色蛍光)を発するため、細胞内におけるウイルス増殖を可視化することができる。例えば、ウイルス感染細胞を蛍光顕微鏡下に観察すると、細胞でGFP蛍光発現が見られる。また、CCDカメラを用いて、経時的にGFP蛍光発現を観察することで、ウイルス感染細胞を経時的に観察することもでき、そのような組換えウイルスを生体内に投与すれば、生体内において細胞をリアルタイムで標識および検出することもできる。
(3)抗腫瘍作用を有する物質及び組換えウイルスが腫瘍細胞の細胞周期に及ぼす影響
本発明の医薬組成物において併用される抗腫瘍作用を有する物質と組換えウイルスが腫瘍細胞に及ぼす抗腫瘍効果は、各々独立しており、互いに影響を及ぼしあうようなものではない。組換えウイルスが腫瘍細胞に及ぼす抗腫瘍効果は、抗腫瘍作用を有する物質の抗腫瘍効果とは全く異なる作用機序によるものである。従って、組換えウイルスが存在しても、例えば、抗腫瘍作用を有する物質が腫瘍細胞の細胞周期を阻害し、アポトーシスを誘導する機能が失われることはない。
本発明の医薬組成物において併用される抗腫瘍作用を有する物質と組換えウイルスが標的とする細胞周期にどのような影響を及ばすのかについては、例えば、フローサイトメトリー(Flow cytometry)を用いて、核を染色するPI(propidium iodide)により細胞周期(cell cycle)を解析することができる。
フローサイトメトリーとは、細胞浮遊液を高速で流動させて、個々の粒子から発する蛍光を測定することにより、細胞集団中の個々の細胞の大きさ、DNA含量等を測定する方法をいう。フローサイトメトリーは、細胞1個1個の相対的大きさや形状、内部構造の違いを解析できるばかりではなく、さらに蛍光標識を行うことにより蛍光強度や蛍光の種類を測定し、細胞の同定や細胞群を構成する種々の細胞の存在比を短時間で解析することができる。
細胞膜は、細胞死により、その状態を保てなくなるため、上記PI等で容易に核が染色される。従って、このPIによる核染色の結果から、DNA量と細胞周期を判定することができる。なお、腫瘍細胞では、細胞周期におけるS期及びG2/M期の割合が高いと悪性度が高いとされる。従って、G2/M期の割合が抑制されるような結果が得られれば、抗腫瘍効果が認められるといえる。
(4)抗腫瘍作用を有する物質及び組換えウイルス併用時におけるインビボ抗腫瘍効果
本発明の医薬組成物である抗腫瘍作用を有する物質及び組換えウイルスを併用した場合には、組換えウイルスを単独投与した場合や、抗腫瘍作用を有する物質を単独投与した場合に比較して極めて高い抗腫瘍効果を得ることができる。
抗腫瘍効果は、例えば、以下のように腫瘍径を計測することによって解析することができる。
第5週齢ヌードマウス背部皮下に適当な腫瘍細胞、例えばH1299を接種し、腫瘍が5〜10mm大になった時点で、適当な間隔をおいて、テロメライシンを適当量腫瘍内に投与し、ドセタキセルを腹腔内に適当量投与する。このとき、対照として、PBSを腫瘍内投与、腹腔内投与するとよい。投与後、適当な期間をおいて腫瘍径を計測し、コントロールと比べて腫瘍の大きさに有意差が見られるかを解析する。
また、本発明の医薬組成物は、抗腫瘍作用を有する物質が、組換えウイルスの感染効率を増強させる作用を有する場合もありうる。そのような作用があることを確認するには、例えば、腫瘍細胞の培養液に抗腫瘍作用を有する物質を添加した後に、組換えウイルスを接種し、そのウイルスが腫瘍細胞にどの程度感染したかを測定することにより、腫瘍細胞の培養液に抗腫瘍作用を有する物質を添加していない培養液に接種したウイルスの感染状態と比較することにより確認することができる。
そのウイルスが腫瘍細胞にどの程度感染したかを確認するには、例えば、本発明の非増殖型組換えウイルスのベクターに、LacZ遺伝子を組み込んだ非増殖型LacZ遺伝子発現アデノウイルスを用いることができる。この方法を用いると、この非増殖型LacZ遺伝子発現アデノウイルスが細胞に感染し、増殖するとLacZ遺伝子が発現して青色に発色するので、ウイルス感染が確認しやすいからである。別の方法としては、本発明の組換えウイルスゲノム中の適当部位に、標識タンパク質、例えば、GFPをコードする遺伝子を組み込んだ組換えウイルスを用いることもできる。このような組換えウイルスを用いると、ウイルスの増殖は、GFPを定量することにより確認できるため好ましい。
本発明の抗腫瘍作用を有する物質と組換えウイルスの併用効果を確認するためには、例えば、アイソボログラム(Isobologram)を用いた試験によって確認することもできる。
アイソボログラムとは、2つの物質の相乗効果の有無を解析するためシステムである。具体的には、ある薬剤とある薬剤の相乗効果の有無を、MTTアッセイもしくはチミジンの取り込みをもとに腫瘍細胞の増殖の進行の有無を調べるものである。MTTアッセイとは、医薬組成物の感受性テストであり、具体的には、腫瘍細胞を各種抗癌剤とともに適当な期間混合培養し、培養終了時の生残腫瘍細胞の活性をミトコンドリアのSuccinic dehydrogenase(SD)活性を判定することにより抗癌剤に対する感受性を判定することによって行う。すなわち腫瘍細胞とSDの基質であるテトラゾリウム塩(MTT)とを反応させ、析出するフォルマザン結晶をDMSOで溶解し、紫色の発色をマイクロプレートリーダーにより吸光度を測定する(MTT判定)。このようにして生細胞活性を測定することで、薬剤の効果を比色により判定することが可能となるのである。例えば、本発明の抗腫瘍作用を有する物質と組換えウイルスを適当な腫瘍細胞、例えば、ヒト肺癌細胞H1299に投与して培養した後、上記方法を用いて、MTTアッセイをすることにより、H1299に対する抗腫瘍活性を測定することができる。
(5)本発明の医薬組成物の腫瘍内投与後の腫瘍組織及び肝臓の組織学的変化(HE染色)
本発明の医薬組成物は、服用しても肝臓に影響を与えることがなく、安全性が高い優れた医薬組成物である。医薬組成物が体内に投与された場合に、肝臓、消化管粘膜、腎臓等で分解・解毒される(代謝)。このとき、最大の代謝器官が肝臓である。本発明の医薬組成物を生体内に投与した場合、標的とする腫瘍組織に抗腫瘍効果を及ぼしても、上記したような代謝器官である肝臓には何ら影響を及ぼさない。従って、本発明の医薬組成物は、安全性が高い優れた医薬組成物といえる。
このような医薬組成物の安全性評価は、例えば、本発明における医薬組成物を腫瘍内に投与した場合に、腫瘍組織及び肝臓組織がどのように変化するかを解析すればよい。例えば、ヘマトキシリン・エオジン(HE)染色等の組織学的染色方法を用いて確認することができる。
HE染色は基本的な組織染色方法で、組織内の電荷の違いにより染まる色素が異なることを利用したものである。例えば、核は青紫色に染まり、その他の細胞質、線維、赤血球などは、それぞれの性質に応じ濃淡各種の赤色に染まる。
具体的には、本発明の医薬組成物を投与した腫瘍組織等の組織切片を脱パラフィン処理後、ヘマトキシリン液で処理した後、エオジン液で処理することによって腫瘍組織等の組織学的変化を確認することができる。例えば、腫瘍細胞に抗腫瘍効果が見られた場合は、腫瘍細胞が硝子化変性起こす。
4.本発明の医薬組成物を用いた腫瘍細胞の増殖を抑制する方法
本発明は、上記テロメライシン組換えウイルスと、抗腫瘍作用を有する物質とを組み合わせて用いることを特徴とする、腫瘍細胞の増殖を抑制する方法である。
腫瘍細胞の増殖を抑制するには、例えば、テロメライシンを投与した後に微小管阻害薬を投与すればよい。培養細胞を用いた実験から、この方法により顕著な併用効果が認められることが明らかである。又は、テロメライシンを腫瘍内に投与し、同時に微小管阻害薬を全身投与してもよい。動物実験では、上記のような同時投与により明らかな併用効果が認められている。一方、HDAC阻害剤の場合は、テロメライシンより先にHDAC阻害剤を用いてもよく、このような方法により、いっそう強い相乗効果が得られる。なお、INGN−201とテロメライシンを併用する場合は、腫瘍細胞の種類によっては、テロメライシン投与24時間後に、INGN−201を投与するといった投与方法が効果的な場合と、同時投与でも同様の効果が得られる場合がある。例えば、肺癌では、テロメライシンを先行投与した方が効果的である一方で、大腸癌では同時投与でも同様の効果が得られる。なお、INGN−201とテロメライシンの併用投与はこれらの細胞に限定されない。
以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
<組換えアデノウイルス(テロメライシン)の作製>
ヒト胎児腎臓細胞293細胞から抽出したRNAと、以下の特異的なプライマー(E1A−S:配列番号5、E1A−AS:配列番号6)を用いて以下の条件でRT−PCRを行い、897bpのE1A遺伝子を増幅した。
E1A−S:5’−ACA CCG GGA CTG AAA ATG AG−3’(配列番号5)
E1A−AS:5’−CAC AGG TTT ACA CCT TAT GGC−3’(配列番号6)
PCR液組成: 1×PCRバッファー
0.2mM 各 dNTP
5mM MgCl2
2.5U AmpliTaq Gold
0.2M 各プライマー
反応条件: 95℃ 10分
(95℃ 1分、56℃ 1分、72℃ 1.5分)×32サイクル
72℃ 7分
4℃ 5分
同様に、293細胞から抽出したDNAより以下のプライマー(E1B−S:配列番号7、E1B−AS:配列番号8)を用いてDNA−PCRを行い、1822bpのE1B遺伝子を増幅した。PCR液組成、反応条件(サイクル、温度)はE1A遺伝子の場合と同様に行った。
E1B−S:5’−CTG ACC TCA TGG AGG CTT GG−3’(配列番号7)
E1B−AS:5’−GCC CAC ACA TTT CAG TAC CTC−3’(配列番号8)
それぞれのPCR産物のTA Cloning(TA Cloning Kit Dual Promoter;Invitrogen)を行い、シークエンスを確認した後、制限酵素EcoRIにより、各々911bp(E1A)、1836bp(E1B)のDNA断片を切り出した。
pIRESベクター(CLONTECH)のMluI切断部位にE1Aを、SalI部位にE1Bをそれぞれ順方向に挿入した(E1A−IRES−E1B)。
制限酵素MluIおよびBglIIで切り出した455bpのhTERTプロモーター配列を、E1A−IRES−E1BのE1A上流にあるXhoI部位に順方向に挿入した(phTERT−E1A−IRES−E1B)。
pShuttleベクターに含まれるサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターを制限酵素MfeIおよびNheI処理により取り除き、その部位にphTERT−E1A−IRES−E1Bより制限酵素NheIおよびNotIで切り出した3828bpの配列を挿入した(pSh−hAIB)。
pSh−hAIBより制限酵素I−CeuIおよびPl−SceIにより4381bpの配列を切り出し、Adeno−X Expression System(CLONTECH)のAdeno−X Viral DNAに挿入した(AdenoX−hAIB)。AdenoX−hAIBを制限酵素PacI処理で線状化した後、293細胞にトランスフェクションし、感染性のある組換えアデノウイルスを作製した(テロメライシン;Telomelysin)。テロメライシンに組み込まれた複製カセットの模式図を図1に示す。
ヒト胎児腎臓細胞293細胞から抽出したRNAと、以下の特異的なプライマー(E1A−S:配列番号5、E1A−AS:配列番号6)を用いて以下の条件でRT−PCRを行い、897bpのE1A遺伝子を増幅した。
E1A−S:5’−ACA CCG GGA CTG AAA ATG AG−3’(配列番号5)
E1A−AS:5’−CAC AGG TTT ACA CCT TAT GGC−3’(配列番号6)
PCR液組成: 1×PCRバッファー
0.2mM 各 dNTP
5mM MgCl2
2.5U AmpliTaq Gold
0.2M 各プライマー
反応条件: 95℃ 10分
(95℃ 1分、56℃ 1分、72℃ 1.5分)×32サイクル
72℃ 7分
4℃ 5分
同様に、293細胞から抽出したDNAより以下のプライマー(E1B−S:配列番号7、E1B−AS:配列番号8)を用いてDNA−PCRを行い、1822bpのE1B遺伝子を増幅した。PCR液組成、反応条件(サイクル、温度)はE1A遺伝子の場合と同様に行った。
E1B−S:5’−CTG ACC TCA TGG AGG CTT GG−3’(配列番号7)
E1B−AS:5’−GCC CAC ACA TTT CAG TAC CTC−3’(配列番号8)
それぞれのPCR産物のTA Cloning(TA Cloning Kit Dual Promoter;Invitrogen)を行い、シークエンスを確認した後、制限酵素EcoRIにより、各々911bp(E1A)、1836bp(E1B)のDNA断片を切り出した。
pIRESベクター(CLONTECH)のMluI切断部位にE1Aを、SalI部位にE1Bをそれぞれ順方向に挿入した(E1A−IRES−E1B)。
制限酵素MluIおよびBglIIで切り出した455bpのhTERTプロモーター配列を、E1A−IRES−E1BのE1A上流にあるXhoI部位に順方向に挿入した(phTERT−E1A−IRES−E1B)。
pShuttleベクターに含まれるサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターを制限酵素MfeIおよびNheI処理により取り除き、その部位にphTERT−E1A−IRES−E1Bより制限酵素NheIおよびNotIで切り出した3828bpの配列を挿入した(pSh−hAIB)。
pSh−hAIBより制限酵素I−CeuIおよびPl−SceIにより4381bpの配列を切り出し、Adeno−X Expression System(CLONTECH)のAdeno−X Viral DNAに挿入した(AdenoX−hAIB)。AdenoX−hAIBを制限酵素PacI処理で線状化した後、293細胞にトランスフェクションし、感染性のある組換えアデノウイルスを作製した(テロメライシン;Telomelysin)。テロメライシンに組み込まれた複製カセットの模式図を図1に示す。
<テロメライシンと微小管阻害薬との併用効果の検討>
テロメライシンをインビトロで培養中の以下の種々の癌細胞にそれぞれMock、0.1MOI、又は1MOI(MOI:multiplicity of infection)の濃度で感染させた。すなわち、用いた細胞は
ヒト肺癌細胞(H1299、A549、H226Br)、
ヒト大腸癌細胞(SW620、DLD−1)、
ヒト胃癌細胞(MKN28)、
ヒト食道癌細胞(TE8、T.Tn)、
ヒト肝臓癌細胞(HepG2)、
ヒト前立腺癌細胞(LNCaP)である。
具体的には、96ウェルプレートに1x103個の上記細胞を蒔き、24時間後に細胞数をカウントして0.1MOIあるいは1MOIとなるような濃度のウイルスを培養液中に添加した。
翌日、種々の濃度(コントロール、0.1nM、1.0nM、10.0nM、100.0nM)のドセタキセルを上記ウイルス感染細胞培養液に投与した。
感染後5日目にキット(ロシュ・ダイアグノスティックス社)を用いてXTTアッセイを行った。具体的には、ウェルから培養液を除去し、XTT試薬を含む反応液を調整した後に添加培養する。約4時間後にマイクロタイタープレート(ELISA)リーダーで吸光度を測定し、生細胞数を算出、抗腫瘍効果を確認した。
その結果を図4に示す。図4の上段の癌細胞株でテロメライシン0.1MOIと低濃度のドセタキセルとの間に併用効果が認められた。中でも、特にH1299細胞では併用効果が顕著であった。その一方で、HepG2、LNCaPのようにテロメライシンに対する感受性が高い細胞株や、H226Br、T.Tnのようにドセタキセルそのものに感受性がある細胞株では、明らかな併用効果はみられなかった。
<テロメライシンとその他の抗癌剤との併用効果の検討>
併用する抗癌剤として微小管阻害剤ビノレルビン、及びトポイソメラーゼI阻害剤SN−38(CPT−11代謝産物)を用いて、上記と同様の条件でXTTアッセイを行った。その結果、ビノレルビンはドセタキセルとほぼ同様の併用効果を示した。いずれの細胞株もSN−38に感受性があり、SN−38が低濃度の場合に併用効果がみられた(図5)。
<抗癌剤が組換えウイルスの増殖に及ぼす影響>
微小管作用型抗癌剤を併用した場合に、テロメライシンの増殖がどのような影響を受けるかについて、定量的リアルタイムPCRを用いて解析した。
ヒト肺癌細胞H1299及びヒト大腸癌細胞SW620に0.1MOIでテロメライシンを2時間感染させ、さらに2時間後にドセタキセルを投与した。感染後から12、24、36、48、及び60時間後に細胞を回収し、DNA内及び上清中のDNAをそれぞれ抽出した。テロメライシンが有するE1A遺伝子を標的とするプライマーを用いてリアルタイムPCRを行い、ウイルス増殖・複製を定量的に解析した。具体的には、18μlのPCR液に2μlのDNA抽出液を加え、E1Aプライマーを用いて以下の反応条件でPCRを行った。
E1Aプライマー配列:
(正方向)5’−CCTGTGTCTAGAGAATGCAA−3’(配列番号9)
(逆方向)5’−ACAGCTCAAGTCCAAAGGTT−3’(配列番号10)
PCR液組成: 1×LC FastStart DNA Master SYBR Green I
3mM MgCl2
0.5μM 各プライマー
反応条件: 95℃ 10分
(95℃ 10秒、60℃ 15秒、72℃ 8秒)×40サイクル
70℃ 15秒
40℃ 30秒
結果は以下の通りである(図6)。
a)細胞内ではテロメライシンは12−24時間にかけて急速に増殖し、ドセタキセル処理を行っても、同様の増殖効率を示した。
b)上清中に拡散したテロメライシンについても、単独、併用とも同等であった。上清をすべて回収してDNA抽出しているため、細胞死により上清中に放出された全ウイルス量を反映していると考えられる。
以上より、抗癌剤併用はテロメライシンの増殖複製に影響を与えず、ウイルスの抗腫瘍効果を阻害しないと考えられる(図6)。
<テロメライシン及び微小管阻害薬が腫瘍細胞の細胞周期に及ぼす影響>
フローサイトメトリーを用いて、PI(propidium iodide)により細胞周期を解析した。
その結果、治療後12、48時間において、テロメライシンを濃度0.1MOIで単独処理した場合は、細胞周期に変化はみられなかった。
ドセタキセルを単独で投与した場合およびテロメライシン/ドセタキセルを併用投与した場合では、投与後12時間でドセタキセル依存性にG2/M停止がみられるようになり、次第にsub G0/G1が増え、ドセタキセルに依存すると思われるアポトーシス(DNAの断片化)がみられた(図7)。
以上より、テロメライシンによる抗腫瘍効果は、ドセタキセルによるアポトーシスとは異なる分子機構であると思われる。
<テロメライシン及び微小管阻害剤のH1299肺癌腫瘍におけるインビボ抗腫瘍効果>
第5週齢ヌードマウス背部皮下にH1299を接種し、腫瘍が5〜10mm大になった時点で、テロメライシンを腫瘍内に各1×107pfu/50μl/体ずつ、ドセタキセルを腹腔内に12.5mg/kgずつ、1、3、5日後の計3回投与した。対照として、PBSを腫瘍内投与、腹腔内投与した。3日ごとに腫瘍径を計測した。
その結果、テロメライシン単独治療群でもコントロールに比較して有意な増殖抑制がみられたが、併用群では、コントロール群、単独治療群に比べてさらに有意に抗腫瘍効果が認められた(図8)。
<テロメライシン腫瘍内投与後の腫瘍組織及び肝臓における組織学的変化(HE染色)>
第5週齢ヌードマウス背部皮下にH1299を接種し、腫瘍が5〜10mm大になった時点で、テロメライシンを上記細胞腫瘍内に投与した後、最終投与から6日経過後の腫瘍組織および肝臓を以下に従って、組織HE染色した。すなわち、組織切片を作製し、脱パラフィン処理をした後、水洗し、蒸留水を通した。これにヘマトキシリン液を添加し、20分放置した後、軽く水洗した。これを、1%塩酸70%アルコ−ルで分別し、色出しをして、10分間水洗したのち、80%エタノールに通した後、エオジン液に10分間つけた。その後、組織を軽く水洗し、脱水し、透徹して、封入することによってHE染色を行った。
その結果、テロメライシンを単独投与および併用投与した場合では、腫瘍細胞の硝子化変性が広範囲に認められた(図9「Telomelysin」及び「Combination」のパネル)。肝組織ではいずれにおいても毒性は認められなかった(図9)。
テロメライシンをインビトロで培養中の以下の種々の癌細胞にそれぞれMock、0.1MOI、又は1MOI(MOI:multiplicity of infection)の濃度で感染させた。すなわち、用いた細胞は
ヒト肺癌細胞(H1299、A549、H226Br)、
ヒト大腸癌細胞(SW620、DLD−1)、
ヒト胃癌細胞(MKN28)、
ヒト食道癌細胞(TE8、T.Tn)、
ヒト肝臓癌細胞(HepG2)、
ヒト前立腺癌細胞(LNCaP)である。
具体的には、96ウェルプレートに1x103個の上記細胞を蒔き、24時間後に細胞数をカウントして0.1MOIあるいは1MOIとなるような濃度のウイルスを培養液中に添加した。
翌日、種々の濃度(コントロール、0.1nM、1.0nM、10.0nM、100.0nM)のドセタキセルを上記ウイルス感染細胞培養液に投与した。
感染後5日目にキット(ロシュ・ダイアグノスティックス社)を用いてXTTアッセイを行った。具体的には、ウェルから培養液を除去し、XTT試薬を含む反応液を調整した後に添加培養する。約4時間後にマイクロタイタープレート(ELISA)リーダーで吸光度を測定し、生細胞数を算出、抗腫瘍効果を確認した。
その結果を図4に示す。図4の上段の癌細胞株でテロメライシン0.1MOIと低濃度のドセタキセルとの間に併用効果が認められた。中でも、特にH1299細胞では併用効果が顕著であった。その一方で、HepG2、LNCaPのようにテロメライシンに対する感受性が高い細胞株や、H226Br、T.Tnのようにドセタキセルそのものに感受性がある細胞株では、明らかな併用効果はみられなかった。
<テロメライシンとその他の抗癌剤との併用効果の検討>
併用する抗癌剤として微小管阻害剤ビノレルビン、及びトポイソメラーゼI阻害剤SN−38(CPT−11代謝産物)を用いて、上記と同様の条件でXTTアッセイを行った。その結果、ビノレルビンはドセタキセルとほぼ同様の併用効果を示した。いずれの細胞株もSN−38に感受性があり、SN−38が低濃度の場合に併用効果がみられた(図5)。
<抗癌剤が組換えウイルスの増殖に及ぼす影響>
微小管作用型抗癌剤を併用した場合に、テロメライシンの増殖がどのような影響を受けるかについて、定量的リアルタイムPCRを用いて解析した。
ヒト肺癌細胞H1299及びヒト大腸癌細胞SW620に0.1MOIでテロメライシンを2時間感染させ、さらに2時間後にドセタキセルを投与した。感染後から12、24、36、48、及び60時間後に細胞を回収し、DNA内及び上清中のDNAをそれぞれ抽出した。テロメライシンが有するE1A遺伝子を標的とするプライマーを用いてリアルタイムPCRを行い、ウイルス増殖・複製を定量的に解析した。具体的には、18μlのPCR液に2μlのDNA抽出液を加え、E1Aプライマーを用いて以下の反応条件でPCRを行った。
E1Aプライマー配列:
(正方向)5’−CCTGTGTCTAGAGAATGCAA−3’(配列番号9)
(逆方向)5’−ACAGCTCAAGTCCAAAGGTT−3’(配列番号10)
PCR液組成: 1×LC FastStart DNA Master SYBR Green I
3mM MgCl2
0.5μM 各プライマー
反応条件: 95℃ 10分
(95℃ 10秒、60℃ 15秒、72℃ 8秒)×40サイクル
70℃ 15秒
40℃ 30秒
結果は以下の通りである(図6)。
a)細胞内ではテロメライシンは12−24時間にかけて急速に増殖し、ドセタキセル処理を行っても、同様の増殖効率を示した。
b)上清中に拡散したテロメライシンについても、単独、併用とも同等であった。上清をすべて回収してDNA抽出しているため、細胞死により上清中に放出された全ウイルス量を反映していると考えられる。
以上より、抗癌剤併用はテロメライシンの増殖複製に影響を与えず、ウイルスの抗腫瘍効果を阻害しないと考えられる(図6)。
<テロメライシン及び微小管阻害薬が腫瘍細胞の細胞周期に及ぼす影響>
フローサイトメトリーを用いて、PI(propidium iodide)により細胞周期を解析した。
その結果、治療後12、48時間において、テロメライシンを濃度0.1MOIで単独処理した場合は、細胞周期に変化はみられなかった。
ドセタキセルを単独で投与した場合およびテロメライシン/ドセタキセルを併用投与した場合では、投与後12時間でドセタキセル依存性にG2/M停止がみられるようになり、次第にsub G0/G1が増え、ドセタキセルに依存すると思われるアポトーシス(DNAの断片化)がみられた(図7)。
以上より、テロメライシンによる抗腫瘍効果は、ドセタキセルによるアポトーシスとは異なる分子機構であると思われる。
<テロメライシン及び微小管阻害剤のH1299肺癌腫瘍におけるインビボ抗腫瘍効果>
第5週齢ヌードマウス背部皮下にH1299を接種し、腫瘍が5〜10mm大になった時点で、テロメライシンを腫瘍内に各1×107pfu/50μl/体ずつ、ドセタキセルを腹腔内に12.5mg/kgずつ、1、3、5日後の計3回投与した。対照として、PBSを腫瘍内投与、腹腔内投与した。3日ごとに腫瘍径を計測した。
その結果、テロメライシン単独治療群でもコントロールに比較して有意な増殖抑制がみられたが、併用群では、コントロール群、単独治療群に比べてさらに有意に抗腫瘍効果が認められた(図8)。
<テロメライシン腫瘍内投与後の腫瘍組織及び肝臓における組織学的変化(HE染色)>
第5週齢ヌードマウス背部皮下にH1299を接種し、腫瘍が5〜10mm大になった時点で、テロメライシンを上記細胞腫瘍内に投与した後、最終投与から6日経過後の腫瘍組織および肝臓を以下に従って、組織HE染色した。すなわち、組織切片を作製し、脱パラフィン処理をした後、水洗し、蒸留水を通した。これにヘマトキシリン液を添加し、20分放置した後、軽く水洗した。これを、1%塩酸70%アルコ−ルで分別し、色出しをして、10分間水洗したのち、80%エタノールに通した後、エオジン液に10分間つけた。その後、組織を軽く水洗し、脱水し、透徹して、封入することによってHE染色を行った。
その結果、テロメライシンを単独投与および併用投与した場合では、腫瘍細胞の硝子化変性が広範囲に認められた(図9「Telomelysin」及び「Combination」のパネル)。肝組織ではいずれにおいても毒性は認められなかった(図9)。
<HDAC阻害剤FR901228によるアデノウイルス受容体CARの発現増強>
各種ヒト肺癌細胞(A549、H358、H460、H1299)の培養液中にFR901228(藤沢薬品工業)を1ng/mlの濃度で添加して48時間処理した後に、フローサイトメトリーにてCAR発現を解析した。
その結果、A549、H460細胞ではCAR発現が増強していたが、H358、H1299では変化が見られなかった(図10)。
<HDAC阻害剤FR901228によるアデノウイルス感染効率の増強>
次に、A549肺癌細胞と非増殖型LacZ遺伝子発現アデノウイルスを用いて、HDAC阻害剤FR901228がアデノウイルス感染効率を増強するか否かを検討した。A549肺癌細胞の培養液中にFR901228を0.1ng/ml、1ng/mlの濃度で添加して48時間処理した後に、非増殖型LacZ遺伝子発現アデノウイルスを1MOI、10MOIで感染させ、細胞の状態を観察した。
アデノウイルスが細胞に感染し、細胞内で増殖するとLacZ遺伝子が発現して青色に発色することを利用して、FR901228処理によるアデノウイルスの感染効率を確認した。
その結果、FR901228処理により濃度依存性に青色の斑点がみられたことから、LacZ発現が増強していることが示された。従って、アデノウイルスの感染効率が用量依存的に増強することが確認された(図11)。
<HDAC阻害剤FR901228によるテロメライシン感染効率の増強>
次に、A549肺癌細胞と非増殖型LacZ遺伝子発現アデノウイルスを用いて、HDAC阻害剤FR901228が本発明のテロメライシンの感染効率を増強するか否かを検討した。なお、実験に供したテロメライシンは、さらに、本発明の組換えアデノウイルスゲノムのE3領域に、標識タンパク質GFPをコードする遺伝子及び該遺伝子の発現を制御するプロモーターが組み込まれた組換えウイルスOBP−401を用いた。このOBP−401を用いてGFP発現を指標として、FR901228によるウイルス増殖の増強を確認した。
A549肺癌細胞の培養液中にFR901228を0.5ng/ml、1ng/mlの濃度で添加して48時間処理した後に、OBP−401を0.1MOIで感染させた。
このOBP−401の感染後72時間目にGFP発現をフローサイトメトリーにて定量した。その結果、FR901228処理により用量依存性にGFP発現増強がみられ、FR901228がOBP−401の感染・増幅を増強することが確認された(図12)。
<HDAC阻害剤FR901228によるテロメライシン抗腫瘍効果の増強>
FR901228とテロメライシンの併用効果を確認するために、2つの物質の相乗効果の有無を解析するためのアイソボログラムを用いてFR901228とテロメライシンの相乗効果を検討した。
実験には、テロメライシンとして、標識タンパク質GFPをコードする遺伝子及び該遺伝子の発現を制御するプロモーターが組み込まれた組換えウイルスOBP−401と、FR901228を用いた。96ウェルプレートで培養したヒト肺癌細胞A549に、テロメライシンを0.1、0.5、1、2、5、10、100MOIで感染させ、同時にFR901228を0.01、0.5、1、2、5ng/mlの濃度で添加、4日目の生細胞数をMTTアッセイにて測定した。MTTアッセイは、各ウェルの培養液を除去後、PBSで洗浄、0.5mg/mlのMTT(Sigma社)を含む培養液を加えて4時間培養した。0.04N塩酸含有イソプロピルアルコールを加えた後に、マイクロプレートリーダーで吸光度を測定した。図13の右上図はすべての測定値をプロットした図である。縦軸に生細胞率、横軸にそれぞれの濃度をプロットした右下図で、テロメライシンおよびFR901228の容量依存性の抗腫瘍効果が確認できる。それぞれの測定値をSteel及びPeckhamのアイソボログラム法(Steel G.G.,Peckham M.J.Exploitable mechanisms in combined radiotherapy−chemotherapy:the concept of additivity.Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Physiol.,5:85−91,1979)にて解析し、左図を作成した。モード1の青線以下の領域が相乗効果領域であるが、すべての測定値がその領域内にプロットされており、FR901228とテロメライシンはヒト肺癌細胞H1299において相乗的に作用することが明らかとなった(図13)。
各種ヒト肺癌細胞(A549、H358、H460、H1299)の培養液中にFR901228(藤沢薬品工業)を1ng/mlの濃度で添加して48時間処理した後に、フローサイトメトリーにてCAR発現を解析した。
その結果、A549、H460細胞ではCAR発現が増強していたが、H358、H1299では変化が見られなかった(図10)。
<HDAC阻害剤FR901228によるアデノウイルス感染効率の増強>
次に、A549肺癌細胞と非増殖型LacZ遺伝子発現アデノウイルスを用いて、HDAC阻害剤FR901228がアデノウイルス感染効率を増強するか否かを検討した。A549肺癌細胞の培養液中にFR901228を0.1ng/ml、1ng/mlの濃度で添加して48時間処理した後に、非増殖型LacZ遺伝子発現アデノウイルスを1MOI、10MOIで感染させ、細胞の状態を観察した。
アデノウイルスが細胞に感染し、細胞内で増殖するとLacZ遺伝子が発現して青色に発色することを利用して、FR901228処理によるアデノウイルスの感染効率を確認した。
その結果、FR901228処理により濃度依存性に青色の斑点がみられたことから、LacZ発現が増強していることが示された。従って、アデノウイルスの感染効率が用量依存的に増強することが確認された(図11)。
<HDAC阻害剤FR901228によるテロメライシン感染効率の増強>
次に、A549肺癌細胞と非増殖型LacZ遺伝子発現アデノウイルスを用いて、HDAC阻害剤FR901228が本発明のテロメライシンの感染効率を増強するか否かを検討した。なお、実験に供したテロメライシンは、さらに、本発明の組換えアデノウイルスゲノムのE3領域に、標識タンパク質GFPをコードする遺伝子及び該遺伝子の発現を制御するプロモーターが組み込まれた組換えウイルスOBP−401を用いた。このOBP−401を用いてGFP発現を指標として、FR901228によるウイルス増殖の増強を確認した。
A549肺癌細胞の培養液中にFR901228を0.5ng/ml、1ng/mlの濃度で添加して48時間処理した後に、OBP−401を0.1MOIで感染させた。
このOBP−401の感染後72時間目にGFP発現をフローサイトメトリーにて定量した。その結果、FR901228処理により用量依存性にGFP発現増強がみられ、FR901228がOBP−401の感染・増幅を増強することが確認された(図12)。
<HDAC阻害剤FR901228によるテロメライシン抗腫瘍効果の増強>
FR901228とテロメライシンの併用効果を確認するために、2つの物質の相乗効果の有無を解析するためのアイソボログラムを用いてFR901228とテロメライシンの相乗効果を検討した。
実験には、テロメライシンとして、標識タンパク質GFPをコードする遺伝子及び該遺伝子の発現を制御するプロモーターが組み込まれた組換えウイルスOBP−401と、FR901228を用いた。96ウェルプレートで培養したヒト肺癌細胞A549に、テロメライシンを0.1、0.5、1、2、5、10、100MOIで感染させ、同時にFR901228を0.01、0.5、1、2、5ng/mlの濃度で添加、4日目の生細胞数をMTTアッセイにて測定した。MTTアッセイは、各ウェルの培養液を除去後、PBSで洗浄、0.5mg/mlのMTT(Sigma社)を含む培養液を加えて4時間培養した。0.04N塩酸含有イソプロピルアルコールを加えた後に、マイクロプレートリーダーで吸光度を測定した。図13の右上図はすべての測定値をプロットした図である。縦軸に生細胞率、横軸にそれぞれの濃度をプロットした右下図で、テロメライシンおよびFR901228の容量依存性の抗腫瘍効果が確認できる。それぞれの測定値をSteel及びPeckhamのアイソボログラム法(Steel G.G.,Peckham M.J.Exploitable mechanisms in combined radiotherapy−chemotherapy:the concept of additivity.Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Physiol.,5:85−91,1979)にて解析し、左図を作成した。モード1の青線以下の領域が相乗効果領域であるが、すべての測定値がその領域内にプロットされており、FR901228とテロメライシンはヒト肺癌細胞H1299において相乗的に作用することが明らかとなった(図13)。
<遺伝子治療剤INGN−201(Advexin)の抗腫瘍効果の測定>
INGN−201(以下、Advexinともいう、図面も同様)を、インビトロで培養中のH1299細胞、SW620細胞及びTE8細胞にそれぞれMock、10MOI、50MOI、100MOI、500MOI、又は1000MOIの濃度で感染させた。具体的には、96ウェルプレートに1x103個の上記細胞を蒔き、24時間後に細胞数をカウントして上記の濃度のAdvexinを培養液中に添加した。感染後5日目にキット(ロシュ・ダイアグノスティックス社)を用いてXTTアッセイを行った。具体的には、ウェルから培養液を除去し、XTT試薬を含む反応液を調整した後に添加し培養した。約4時間後にマイクロタイタープレート(ELISA)リーダーで吸光度を測定し、生細胞数を算出、抗腫瘍効果を確認した。5日目の生細胞数の比率を、無処置群を1.0として表示した。
その結果を図14に示す。H1299細胞では50MOIで顕著な抗腫瘍効果がみられたものの、SW620細胞では500MOIになってはじめて抗腫瘍効果がみられた。またTE8細胞では、50MOIで軽度増殖抑制が認められたものの、やはり500MOIではじめて明らかな抗腫瘍効果が観察された。したがって、H1299は高感受性株、SW620は低感受性株、TE8は中等度の感受性を有すると考えられる。
<テロメライシン−Advexin同時投与による抗腫瘍効果の測定>
インビトロで培養中のH1299細胞及びSW620細胞に、0MOI、1MOI、5MOI、又は10MOIの濃度のテロメライシン、及び、0MOI、10MOI、50MOI、又は100MOIの濃度のAdvexinをそれぞれ組み合わせて感染させた。具体的には、96ウェルプレートに1x103個の上記細胞を蒔き、24時間後に細胞数をカウントして上記の濃度のテロメライシン及びAdvexinを培養液中に添加した。感染後5日目にキット(ロシュ・ダイアグノスティックス社)を用いてXTTアッセイを行った。具体的には、ウェルから培養液を除去し、XTT試薬を含む反応液を調整した後に添加し培養した。約4時間後にマイクロタイタープレート(ELISA)リーダーで吸光度を測定し、生細胞数を算出し、抗腫瘍効果を確認した。
その結果を図15及び図16に示す。H1299細胞においては、1MOIテロメライシン及び10MOI Advexinを併用することにより、生細胞数が顕著に減少し、顕著な抗腫瘍効果が見られた(図15)。H1299細胞において、Advexinを単独で使用した場合の抗腫瘍効果は、50MOI程度の濃度であった(図14)ことと比較すると、H1299細胞においては、テロメライシンとAdvexinを併用することにより、相乗的な抗腫瘍効果が得られることが示された。また、SW620細胞においては、1MOIテロメライシン及び50MOI Advexinを併用することにより、生細胞数が顕著に減少し、顕著な抗腫瘍効果が見られた(図16)。SW620細胞においてAdvexinを単独で使用した場合の抗腫瘍効果は、500MOI程度の濃度であった(図14)ことと比較すると、SW620細胞においては、テロメライシンとAdvexinを併用することにより、相乗的な抗腫瘍効果が得られることが示された。
<テロメライシン−Advexin時間差投与による抗腫瘍効果の測定>
96ウェルプレートに1x103個のH1299細胞及びSW620細胞を蒔き、インビトロで培養して、24時間後に細胞数をカウントし、(i)テロメライシン及びAdvexinを培養液中に同時投与し、(ii)テロメライシンを投与後24時間後にAdvexinを投与し(テロメライシン先行投与)、(iii)Advexinを投与後24時間後にテロメライシンを投与(Advexin先行投与)して、感染させた。比較にMockをおいた。
具体的に、組み合わせて用いたテロメライシン及びAdvexinの濃度は以下の通りである。
H1299細胞:1MOIテロメライシン及び5MOI又は10MOI Advexin SW620細胞:1MOIテロメライシン及び10MOI、50MOI又は100MOI Advexin
最初の感染後から5日目にキット(ロシュ・ダイアグノスティックス社)を用いてXTTアッセイを行った。具体的には、ウェルから培養液を除去し、XTT試薬を含む反応液を調整した後に添加培養する。約4時間後にマイクロタイタープレート(ELISA)リーダーで吸光度を測定し、生細胞数を算出、抗腫瘍効果を確認した。
その結果を、図17及び18に示す。H1299細胞においては、上記(i)〜(iii)のどの場合も、Mockに比して、顕著な抗腫瘍効果が得られた(図17)が、中でもテロメライシン先行投与の場合が最も抗腫瘍効果が高かった。SW620細胞においては、上記(i)〜(iii)のどの場合も抗腫瘍効果が示されたが、特に、(i)及び(ii)の場合の抗腫瘍効果は顕著であった。
INGN−201(以下、Advexinともいう、図面も同様)を、インビトロで培養中のH1299細胞、SW620細胞及びTE8細胞にそれぞれMock、10MOI、50MOI、100MOI、500MOI、又は1000MOIの濃度で感染させた。具体的には、96ウェルプレートに1x103個の上記細胞を蒔き、24時間後に細胞数をカウントして上記の濃度のAdvexinを培養液中に添加した。感染後5日目にキット(ロシュ・ダイアグノスティックス社)を用いてXTTアッセイを行った。具体的には、ウェルから培養液を除去し、XTT試薬を含む反応液を調整した後に添加し培養した。約4時間後にマイクロタイタープレート(ELISA)リーダーで吸光度を測定し、生細胞数を算出、抗腫瘍効果を確認した。5日目の生細胞数の比率を、無処置群を1.0として表示した。
その結果を図14に示す。H1299細胞では50MOIで顕著な抗腫瘍効果がみられたものの、SW620細胞では500MOIになってはじめて抗腫瘍効果がみられた。またTE8細胞では、50MOIで軽度増殖抑制が認められたものの、やはり500MOIではじめて明らかな抗腫瘍効果が観察された。したがって、H1299は高感受性株、SW620は低感受性株、TE8は中等度の感受性を有すると考えられる。
<テロメライシン−Advexin同時投与による抗腫瘍効果の測定>
インビトロで培養中のH1299細胞及びSW620細胞に、0MOI、1MOI、5MOI、又は10MOIの濃度のテロメライシン、及び、0MOI、10MOI、50MOI、又は100MOIの濃度のAdvexinをそれぞれ組み合わせて感染させた。具体的には、96ウェルプレートに1x103個の上記細胞を蒔き、24時間後に細胞数をカウントして上記の濃度のテロメライシン及びAdvexinを培養液中に添加した。感染後5日目にキット(ロシュ・ダイアグノスティックス社)を用いてXTTアッセイを行った。具体的には、ウェルから培養液を除去し、XTT試薬を含む反応液を調整した後に添加し培養した。約4時間後にマイクロタイタープレート(ELISA)リーダーで吸光度を測定し、生細胞数を算出し、抗腫瘍効果を確認した。
その結果を図15及び図16に示す。H1299細胞においては、1MOIテロメライシン及び10MOI Advexinを併用することにより、生細胞数が顕著に減少し、顕著な抗腫瘍効果が見られた(図15)。H1299細胞において、Advexinを単独で使用した場合の抗腫瘍効果は、50MOI程度の濃度であった(図14)ことと比較すると、H1299細胞においては、テロメライシンとAdvexinを併用することにより、相乗的な抗腫瘍効果が得られることが示された。また、SW620細胞においては、1MOIテロメライシン及び50MOI Advexinを併用することにより、生細胞数が顕著に減少し、顕著な抗腫瘍効果が見られた(図16)。SW620細胞においてAdvexinを単独で使用した場合の抗腫瘍効果は、500MOI程度の濃度であった(図14)ことと比較すると、SW620細胞においては、テロメライシンとAdvexinを併用することにより、相乗的な抗腫瘍効果が得られることが示された。
<テロメライシン−Advexin時間差投与による抗腫瘍効果の測定>
96ウェルプレートに1x103個のH1299細胞及びSW620細胞を蒔き、インビトロで培養して、24時間後に細胞数をカウントし、(i)テロメライシン及びAdvexinを培養液中に同時投与し、(ii)テロメライシンを投与後24時間後にAdvexinを投与し(テロメライシン先行投与)、(iii)Advexinを投与後24時間後にテロメライシンを投与(Advexin先行投与)して、感染させた。比較にMockをおいた。
具体的に、組み合わせて用いたテロメライシン及びAdvexinの濃度は以下の通りである。
H1299細胞:1MOIテロメライシン及び5MOI又は10MOI Advexin SW620細胞:1MOIテロメライシン及び10MOI、50MOI又は100MOI Advexin
最初の感染後から5日目にキット(ロシュ・ダイアグノスティックス社)を用いてXTTアッセイを行った。具体的には、ウェルから培養液を除去し、XTT試薬を含む反応液を調整した後に添加培養する。約4時間後にマイクロタイタープレート(ELISA)リーダーで吸光度を測定し、生細胞数を算出、抗腫瘍効果を確認した。
その結果を、図17及び18に示す。H1299細胞においては、上記(i)〜(iii)のどの場合も、Mockに比して、顕著な抗腫瘍効果が得られた(図17)が、中でもテロメライシン先行投与の場合が最も抗腫瘍効果が高かった。SW620細胞においては、上記(i)〜(iii)のどの場合も抗腫瘍効果が示されたが、特に、(i)及び(ii)の場合の抗腫瘍効果は顕著であった。
本発明により、ヒトテロメラーゼのプロモーター、E1A遺伝子、IRES配列及びE1B遺伝子をこの順に含むポリヌクレオチドを含む組換えウイルスと、抗腫瘍作用を有する物質とを含む腫瘍の併用療法のための医薬組成物が提供される。本発明の医薬組成物によれば、上記の組換えウイルスと抗腫瘍作用物質を各々単独で腫瘍細胞に投与した場合に得られる抗腫瘍効果よりも優れた効果が得られることにより、使用する薬剤の用量を低減することができ、結果として、抗癌剤の服用による副作用を抑制することができる。
さらに、本発明の医薬組成物は、上記の組換えウイルスと抗腫瘍作用物質を各々単独で用いた場合にはそれほど抗腫瘍効果を奏さない腫瘍細胞にも抗腫瘍効果を発揮するため、より多岐にわたる腫瘍に対する抗癌治療が可能となる。
さらに、本発明の医薬組成物は、上記の組換えウイルスと抗腫瘍作用物質を各々単独で用いた場合にはそれほど抗腫瘍効果を奏さない腫瘍細胞にも抗腫瘍効果を発揮するため、より多岐にわたる腫瘍に対する抗癌治療が可能となる。
配列番号5:プライマー
配列番号6:プライマー
配列番号7:プライマー
配列番号8:プライマー
配列番号9:プライマー
配列番号10:プライマー
[配列表]
配列番号6:プライマー
配列番号7:プライマー
配列番号8:プライマー
配列番号9:プライマー
配列番号10:プライマー
[配列表]
Claims (21)
- ヒトテロメラーゼのプロモーター、E1A遺伝子、IRES配列及びE1B遺伝子をこの順に含むポリヌクレオチドを含む組換えウイルスと、抗腫瘍作用を有する物質とを含む、腫瘍の併用療法のための医薬組成物。
- ヒトテロメラーゼがhTERTである、請求項1記載の医薬組成物。
- ウイルスがアデノウイルスである請求項1又は2記載の医薬組成物。
- 抗腫瘍作用を有する物質が微小管阻害活性を有する物質又はトポイソメラーゼI阻害活性を有する物質である、請求項1〜3のいずれか1項記載の医薬組成物。
- 抗腫瘍作用を有する物質がヒストンデアセチラーゼ阻害活性を有する物質である、請求項1〜3のいずれか1項記載の医薬組成物。
- 抗腫瘍作用を有する物質がINGN−201である、請求項1〜3のいずれか1項記載の医薬組成物。
- 微小管阻害活性を有する物質がドセタキセル若しくはビノレルビン又はそれらの塩である、請求項4記載の医薬組成物。
- トポイソメラーゼI阻害活性を有する物質がイリノテカン又はその塩である、請求項4記載の医薬組成物。
- ヒストンデアセチラーゼ阻害活性を有する物質がFR901228である、請求項5記載の医薬組成物。
- 腫瘍が、肺癌、大腸癌、胃癌、乳癌、食道癌、頭頸部癌、肝臓癌、膵臓癌、胆嚢・胆管癌、前立腺癌、膀胱癌、子宮頸癌、甲状腺癌、卵巣癌、白血病、リンパ腫、肉腫、及び間葉系腫瘍からなる群から選択される少なくとも1つである、請求項1〜9のいずれか1項記載の医薬組成物。
- ヒトテロメラーゼのプロモーター、E1A遺伝子、IRES配列及びE1B遺伝子をこの順に含むポリヌクレオチドを含む組換えウイルスと、抗腫瘍作用を有する物質とを併用することを特徴とする、腫瘍細胞の増殖を抑制する方法。
- ヒトテロメラーゼのプロモーター、E1A遺伝子、IRES配列及びE1B遺伝子をこの順に含むポリヌクレオチドを含む組換えウイルスと、抗腫瘍作用を有する物質とを併用することを特徴とする、腫瘍の治療方法。
- ヒトテロメラーゼがhTERTである、請求項11又は12記載の方法。
- ウイルスがアデノウイルスである、請求項11〜13のいずれか1項記載の方法。
- 抗腫瘍作用を有する物質が微小管阻害活性を有する物質又はトポイソメラーゼI阻害活性を有する物質である、請求項11〜14のいずれか1項記載の方法。
- 抗腫瘍作用を有する物質がヒストンデアセチラーゼ阻害活性を有する物質である、請求項11〜15のいずれか1項記載の方法。
- 抗腫瘍作用を有する物質がINGN−201である、請求項11〜16のいずれか1項記載の方法。
- 微小管阻害活性を有する物質が、ドセタキセル若しくはビノレルビン又はそれらの塩である、請求項15記載の方法。
- トポイソメラーゼI阻害活性を有する物質が、イリノテカン又はその塩である、請求項15記載の方法。
- ヒストンデアセチラーゼ阻害活性を有する物質が、FR901228である、請求項16記載の方法。
- 腫瘍が、肺癌、大腸癌、胃癌、乳癌、食道癌、頭頸部癌、肝臓癌、膵臓癌、胆嚢・胆管癌、前立腺癌、膀胱癌、子宮頸癌、甲状腺癌、卵巣癌、白血病、リンパ腫、肉腫、及び間葉系腫瘍からなる群から選択される少なくとも1つである、請求項11〜20いずれか1項記載の方法。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2005034773 | 2005-02-10 | ||
JP2005034773 | 2005-02-10 | ||
JP2005299300 | 2005-10-13 | ||
JP2005299300 | 2005-10-13 | ||
PCT/JP2006/302789 WO2006085689A1 (ja) | 2005-02-10 | 2006-02-10 | テロメライシン併用抗癌剤 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2006085689A1 true JPWO2006085689A1 (ja) | 2008-06-26 |
Family
ID=36793243
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2007502685A Pending JPWO2006085689A1 (ja) | 2005-02-10 | 2006-02-10 | テロメライシン併用抗癌剤 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20100150884A1 (ja) |
EP (1) | EP1859804B1 (ja) |
JP (1) | JPWO2006085689A1 (ja) |
WO (1) | WO2006085689A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2012163538A (ja) * | 2011-02-09 | 2012-08-30 | Olympus Corp | 細胞画像解析システム |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6610839B1 (en) | 1997-08-14 | 2003-08-26 | Geron Corporation | Promoter for telomerase reverse transcriptase |
WO2008065726A1 (fr) * | 2006-11-29 | 2008-06-05 | Oncolys Biopharma Inc. | Agent contenant du télomelysin destiné à rompre la tolérance anti-tumorale |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6911200B2 (en) * | 2000-03-24 | 2005-06-28 | Cell Genesys, Inc. | Methods of treating neoplasia with combination of target-cell specific adenovirus, chemotherapy and radiation |
US7321030B2 (en) * | 2001-09-14 | 2008-01-22 | The New Industry Research Organization | Tumor-specific promotor and use thereof |
JP3867968B2 (ja) * | 2002-07-08 | 2007-01-17 | 関西ティー・エル・オー株式会社 | 腫瘍細胞において選択的に増殖する腫瘍融解ウイルス |
WO2004042025A2 (en) * | 2002-11-01 | 2004-05-21 | Cell Genesys, Inc. | Cell-specific adenovirus vector comprising ebv-specific promoter |
ES2257152B1 (es) * | 2004-05-31 | 2007-07-01 | Laboratorios Almirall S.A. | Combinaciones que comprenden agentes antimuscarinicos y agonistas beta-adrenergicos. |
DE602005018969D1 (de) * | 2004-05-31 | 2010-03-04 | Almirall Sa | Zusammensetzungen mit Antimuskarin-Wirkstoffen und Corticosteroiden |
EP1859793B1 (en) * | 2005-02-28 | 2011-04-20 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Novel combinational use of a sulfonamide compound in the treatment of cancer |
AU2006309551B2 (en) * | 2005-11-07 | 2012-04-19 | Eisai R & D Management Co., Ltd. | Use of combination of anti-angiogenic substance and c-kit kinase inhibitor |
-
2006
- 2006-02-10 JP JP2007502685A patent/JPWO2006085689A1/ja active Pending
- 2006-02-10 US US11/884,221 patent/US20100150884A1/en not_active Abandoned
- 2006-02-10 EP EP06713930.3A patent/EP1859804B1/en active Active
- 2006-02-10 WO PCT/JP2006/302789 patent/WO2006085689A1/ja active Application Filing
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2012163538A (ja) * | 2011-02-09 | 2012-08-30 | Olympus Corp | 細胞画像解析システム |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2006085689A1 (ja) | 2006-08-17 |
US20100150884A1 (en) | 2010-06-17 |
EP1859804B1 (en) | 2016-12-07 |
EP1859804A1 (en) | 2007-11-28 |
EP1859804A4 (en) | 2010-09-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Pavet et al. | Towards novel paradigms for cancer therapy | |
EP1795604B1 (en) | Telomelysin-gfp gene-containing recombinant virus | |
Sobhakumari et al. | NOX4 mediates cytoprotective autophagy induced by the EGFR inhibitor erlotinib in head and neck cancer cells | |
EP2987858B1 (en) | Gene-modified coxsackievirus | |
JP2022533268A (ja) | がんを処置するためのバリアントnrf2の遺伝子ノックアウト | |
EP1553178B1 (en) | Oncolytic virus growing selectively in tumor cells | |
Deng et al. | Oncolytic cancer therapy with a vaccinia virus strain | |
JP2022532939A (ja) | がんを処置するためのnrf2の遺伝子ノックアウト | |
JPWO2006085689A1 (ja) | テロメライシン併用抗癌剤 | |
JP2019504894A (ja) | 肺がんの増殖および転移に対する薬物の調製におけるPDE4阻害剤ZL−n−91の使用 | |
Panda et al. | Halofuginone micelle nanoparticles eradicate Nrf2-activated lung adenocarcinoma without systemic toxicity | |
Lian et al. | RJT-101, a novel camptothecin derivative, is highly effective in the treatment of melanoma through DNA damage by targeting topoisomerase 1 | |
Wang et al. | Anti-tumor synergistic effect of a dual cancer-specific recombinant adenovirus and paclitaxel on breast cancer | |
US11484522B2 (en) | Composite formulation and use thereof for preparing drugs for the treatment of tumours | |
Srivastava et al. | Mode of cell death associated with adenovirus-mediated suicide gene therapy in HNSCC tumor model | |
Wang et al. | Adenovirus-mediated suicide gene therapy under the control of Cox-2 promoter for colorectal cancer | |
CN108503676B (zh) | 用于癌症治疗的果糖类似物及其组合物 | |
JP2007015997A (ja) | テロメライシン含有抗腫瘍剤耐性克服剤 | |
EP2851078B1 (en) | Pharmaceutical composition | |
KR102133205B1 (ko) | PNA-pHLIP 접합체를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 | |
WO2008065726A1 (fr) | Agent contenant du télomelysin destiné à rompre la tolérance anti-tumorale | |
Oreste et al. | Cancer stem cells: The new objective for the eradication of tumours | |
JP2023518019A (ja) | がん幹細胞特異結合ペプチドを含みビタミンb6が結合されたポリオール基盤ポリジキシリトール遺伝子伝達体及びがん幹細胞標的治療技術 | |
Heise et al. | Approaches to the gene therapy of cancer using replication-competent oncolytic adenoviruses | |
CN111973743A (zh) | Rna结合蛋白zcchc4的靶向药物的应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20090209 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110712 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20111220 |