JPWO2006057389A1 - Novel transcription factor phosphorylated by AMP protein kinase and its gene - Google Patents

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Abstract

本発明によれば、糖新生系の抑制に関わる新規転写因子が提供され、さらに糖尿病などの糖新生に関連する疾病の治療および予防のための医薬等が提供される。詳細には、配列表の配列番号：１に記載の塩基配列を含むＤＮＡおよび配列表の配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含む蛋白、ならびにそれらを含有する医薬組成物が提供される。ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the novel transcription factor related to suppression of a gluconeogenesis system is provided, Furthermore, the pharmaceutical etc. for the treatment and prevention of the disease related to gluconeogenesis, such as diabetes, are provided. Specifically, there are provided DNA comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, and a pharmaceutical composition containing them.

Description

本発明は新規転写因子とその遺伝子に関するものである。詳細には、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）遺伝子プロモーター上に結合し、ＡＭＰプロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）によりリン酸化される新規転写因子とその遺伝子、ならびに糖新生に関連した疾病の治療または予防のためのそれらの使用に関する。
The present invention relates to a novel transcription factor and its gene. Specifically, a novel transcription factor and its gene that binds on the phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) gene promoter and is phosphorylated by AMP protein kinase (AMPK), as well as the treatment or prevention of diseases associated with gluconeogenesis For their use for.

糖尿病は主要な成人病の１つであり、特に先進国において罹病率が高く、その治療および予防について、種々検討されているが、未だ決定的な治療および予防法が見出されていないのが現状である。糖尿病患者における糖代謝に関する研究により、糖尿病患者においては血糖値が高いにもかかわらず、肝臓の糖新生が亢進し、さらに血糖値が上昇するという負のループをとることがわかっている。この主な原因は、糖尿病によるインスリン抵抗性のためインスリンによる糖新生系の酵素群の活性抑制がかからないことによるとされている（非特許文献１、２参照）。このように、糖尿病時における糖新生亢進の事実は知られていたが、これを抑制するには、食事療法、運動療法、薬剤投与によってインスリン抵抗性の改善以外に治療法はなかった。   Diabetes mellitus is one of the major adult diseases, especially in developed countries, and various treatments and preventions have been investigated, but no definitive treatment or prevention method has been found yet. Currently. Studies on glucose metabolism in diabetic patients have shown that in diabetic patients, despite the high blood glucose level, hepatic gluconeogenesis is enhanced and the blood glucose level rises. The main cause is said to be that insulin resistance due to diabetes does not suppress the activity of gluconeogenic enzymes by insulin (see Non-Patent Documents 1 and 2). Thus, although the fact of increased gluconeogenesis at the time of diabetes was known, there was no therapeutic method other than improvement of insulin resistance by dietary therapy, exercise therapy, or drug administration to suppress this.

一方、インスリン経路とは別に、ＡＭＰキナーゼ活性上昇に伴い、糖新生系の酵素群の遺伝子発現が抑制されることによる糖新生系の抑制が知られていたが、その標的となる転写因子は全く知られていなかった。かかる転写因子を同定することができれば、糖尿病などの糖新生に関連する疾病の、効率的な治療および予防のために新たなアプローチが確立される。
Saltiel, A.R. Cell, 104, 517-529, 2001 Barthel, A. and Schmoll, D. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 285, E685-E692, 2003 On the other hand, apart from the insulin pathway, gluconeogenesis was suppressed by suppressing the gene expression of gluconeogenic enzymes with the increase in AMP kinase activity. It was not known. If such transcription factors can be identified, a new approach will be established for the efficient treatment and prevention of diseases associated with gluconeogenesis, such as diabetes.
Saltiel, AR Cell, 104, 517-529, 2001 Barthel, A. and Schmoll, D. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 285, E685-E692, 2003

本発明が解決しようとする課題は、糖新生系の抑制に関与する新規転写因子を見出し、そのアミノ酸配列および遺伝子配列を決定すること、ならびに糖尿病などの糖新生に関連する疾病の治療および予防に該新規転写因子利用することである。
The problem to be solved by the present invention is to find a novel transcription factor involved in suppression of the gluconeogenesis system, determine its amino acid sequence and gene sequence, and to treat and prevent diseases related to gluconeogenesis such as diabetes. Utilizing the novel transcription factor.

上記課題に鑑みて、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、糖新生系の鍵遺伝子であるＰＥＰＣＫ遺伝子プロモーター上に結合し、ＡＭＰＫ依存的に該遺伝子の転写を抑制する新規転写因子を見出し、本発明を完成するに至った。   In view of the above problems, as a result of intensive studies, the present inventors have found a novel transcription factor that binds to the PEPCK gene promoter, which is a key gene of the gluconeogenic system, and suppresses transcription of the gene in an AMPK-dependent manner. The present invention has been completed.

すなわち、本発明は、
（１）配列表の配列番号：１に記載のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、
（２）配列表の配列番号：１に記載のヌクレオチド１６８からヌクレオチド１７２７までの配列を含むＤＮＡ；
（３）配列表の配列番号：２に記載のアミノ酸１からアミノ酸５１９までのアミノ酸配列を含む蛋白
（４）（３）に記載の蛋白において１個もしくは複数個のアミノ酸が挿入、欠失もしくは置換されており、かつ以下の特性を有する蛋白をコードするＤＮＡ：
（ａ）ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子プロモーター上に結合する
（ｂ）ＡＭＰキナーゼ依存的に転写を抑制する、
（５）（２）に記載のＤＮＡ分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションし、かつ以下の特性を有する蛋白をコードするＤＮＡ：
（ａ）ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子プロモーター上に結合する
（ｂ）ＡＭＰキナーゼ依存的に転写を抑制する、
（６）（２）に記載のＤＮＡ分子に対して少なくとも９０％以上の同一性を有し、かつ以下の特性を有する蛋白をコードするＤＮＡ：
（ａ）ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子プロモーター上に結合する
（ｂ）ＡＭＰキナーゼ依存的に転写を抑制する、
（７）（４）〜（６）のいずれかに記載のＤＮＡによりコードされる蛋白、
（８）（１）、（２）または（４）〜（６）のいずれかに記載のＤＮＡを含む発現ベクター、
（９）（８）に記載の発現ベクターにより形質転換された形質転換体、
（１０）（９）に記載の形質転換体を（８）に記載の発現ベクターの発現可能な条件下で培養することを特徴とする、組み換え蛋白の製造方法、
（１１）（３）または（７）に記載の蛋白あるいは（１０）に記載の方法により得られた蛋白を含有する、糖新生亢進に関連する疾病を治療または予防するための医薬組成物、
（１２）（１）、（２）または（４）〜（６）のいずれかに記載のＤＮＡあるいは請求項８に記載の発現ベクターを含有する、糖新生亢進に関連する疾病を治療または予防するための医薬組成物、
（１３）疾病が糖尿病である（１１）または（１２）に記載の医薬組成物
を提供するものである。
That is, the present invention
(1) DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing,
(2) DNA comprising the sequence from nucleotide 168 to nucleotide 1727 set forth in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing;
(3) Protein comprising the amino acid sequence from amino acid 1 to amino acid 519 described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing (4) In the protein described in (3), one or more amino acids are inserted, deleted or substituted DNA encoding a protein having the following characteristics:
(A) binds to a phosphoenolpyruvate carboxykinase gene promoter (b) represses transcription in an AMP kinase-dependent manner,
(5) DNA that hybridizes with the DNA molecule according to (2) under stringent conditions and encodes a protein having the following characteristics:
(A) binds to the phosphoenolpyruvate carboxykinase gene promoter (b) represses transcription in an AMP kinase-dependent manner,
(6) DNA encoding a protein having at least 90% identity to the DNA molecule according to (2) and having the following characteristics:
(A) binds to the phosphoenolpyruvate carboxykinase gene promoter (b) represses transcription in an AMP kinase-dependent manner,
(7) a protein encoded by the DNA according to any one of (4) to (6),
(8) An expression vector comprising the DNA according to any one of (1), (2) or (4) to (6),
(9) A transformant transformed with the expression vector according to (8),
(10) A method for producing a recombinant protein, comprising culturing the transformant according to (9) under conditions capable of expressing the expression vector according to (8).
(11) A pharmaceutical composition for treating or preventing a disease associated with increased gluconeogenesis, comprising the protein according to (3) or (7) or the protein obtained by the method according to (10),
(12) Treating or preventing a disease associated with increased gluconeogenesis, comprising the DNA according to any one of (1), (2) or (4) to (6) or the expression vector according to claim 8. A pharmaceutical composition for
(13) The pharmaceutical composition according to (11) or (12), wherein the disease is diabetes.

本発明によれば、糖新生系の抑制に関わる新規転写因子およびその遺伝子が提供され、糖尿病などの糖新生に関連する疾病の新規かつ効率的な治療および予防のための医薬等が提供される。
ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the novel transcription factor and its gene which are concerned with suppression of a gluconeogenesis system are provided, The pharmaceutical for the novel and efficient treatment and prevention of the disease related to gluconeogenesis, such as diabetes, etc. are provided. .

図１は、ＰＥＰＣＫ遺伝子（ヒト由来）プロモーター上流−４５８ｂｐから＋６５ｂｐ、−５９９ｂｐから＋６５ｂｐ、および−７４２ｂｐから＋６５ｂｐの領域の、ＡＩＣＡＲ添加による転写活性の変動を調べた結果を示す図である。パネルａは、ルシフェラーゼ遺伝子および用いた各領域の配置を示すダイヤグラムである。パネルｂは、ＡＩＣＡＲ添加による転写活性の変動を示す棒グラフである。FIG. 1 is a diagram showing the results of examining the variation in transcriptional activity of the PEPCK gene (human-derived) upstream region from −458 bp to +65 bp, −599 bp to +65 bp, and −742 bp to +65 bp due to the addition of AICAR. Panel a is a diagram showing the arrangement of the luciferase gene and each region used. Panel b is a bar graph showing changes in transcriptional activity due to the addition of AICAR. 図２は、本発明の転写因子の結合部位を調べた結果を示す図である。ＰＥＰＣＫ遺伝子（ヒト由来）プロモーター上流−７４２ｂｐから＋６５ｂｐの領域を７個のフラグメントＡ〜Ｇに分けた。その配置を図の上部に示す。図の下部はゲルシフトアッセイの結果である。矢印はＤＮＡ−蛋白複合体を示し、アステリスクは非特異的結合を示す。FIG. 2 is a diagram showing the results of examining the binding site of the transcription factor of the present invention. The region from -742 bp to +65 bp upstream of the PEPCK gene (from human) promoter was divided into 7 fragments A to G. The arrangement is shown in the upper part of the figure. The lower part of the figure is the result of the gel shift assay. Arrows indicate DNA-protein complexes and asterisks indicate non-specific binding. 図３は、本発明の転写因子の塩基配列とその中の特徴的配列（左パネル）ならびに本発明の転写因子中のセリン、スレオニン部位の検索結果（右パネル）を示す。レーン１はＧＢＰ−１−Ｖ５−Ｈｉｓ（ＧＢＰ−１にＶ５−Ｈｉｓエピトープを連結）、レーン２はＧＢＰ−１（ＧＢＰのみ）を試料とした場合である。FIG. 3 shows the nucleotide sequence of the transcription factor of the present invention and the characteristic sequence therein (left panel) and the search results for serine and threonine sites in the transcription factor of the present invention (right panel). Lane 1 is a case where GBP-1-V5-His (V5-His epitope is linked to GBP-1) and Lane 2 is a sample of GBP-1 (GBP only). 図４は、ヒト各臓器における本発明の転写因子の発現パターンをノザン法で調べた結果を示す図である。FIG. 4 shows the results of examining the expression pattern of the transcription factor of the present invention in each human organ by the Northern method. 図５は、本発明の転写因子のＤＮＡ結合性を調べた結果を示す図である。パネルａは競合物質として用いたオリゴヌクレオチドの配列を示す。パネルｂは実際のゲルシフトの結果を示す。FIG. 5 is a diagram showing the results of examining the DNA binding property of the transcription factor of the present invention. Panel a shows the sequence of the oligonucleotide used as a competitor. Panel b shows the actual gel shift results. 図６は、本発明の転写因子のインビトロＡＭＰＫアッセイの結果を示す図である。FIG. 6 is a diagram showing the results of an in vitro AMPK assay of the transcription factor of the present invention. 図７は、本発明の転写因子およびその変異体Ｓ４７０ＡのＰＥＰＣＫ遺伝子抑制作用を示す図である。図中、ＷＴは本発明の転写因子、Ｓ４７０Ａは本発明の転写因子中４７０番目のセリンをアラニンに置換した変異体、ＡＭＰＫ３９２Ｔ１７２Ｄは構成的に活性のあるＡＭＰＫ、ＰＧＣ−１はＰＰＡＲ−γ−Ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ−１である。FIG. 7 is a diagram showing the PEPCK gene inhibitory action of the transcription factor of the present invention and its mutant S470A. In the figure, WT is the transcription factor of the present invention, S470A is a mutant in which the 470th serine in the transcription factor of the present invention is substituted with alanine, AMPK392 T172D is constitutively active AMPK, and PGC-1 is PPAR-γ-. Coactivator-1.

本発明の第１の態様は、配列表の配列番号：１に記載のヌクレオチド配列を含むＤＮＡである。該ＤＮＡは本発明の新規転写因子をコードするｃＤＮＡである。該ＤＮＡは、酵母ワン・ハイブリッド（one-hybrid）法のごとき公知方法を用いてクローニングすることができる。また、その性状解析も一般的な遺伝子工学的および分子生物学的手法を用いて行うことができる。これらの詳細は、本明細書の実施例にて具体的に説明する。   1st aspect of this invention is DNA containing the nucleotide sequence of sequence number 1 of a sequence table. The DNA is a cDNA encoding the novel transcription factor of the present invention. The DNA can be cloned using known methods such as the yeast one-hybrid method. The properties can also be analyzed using general genetic engineering and molecular biological techniques. These details will be specifically described in Examples of the present specification.

本発明の第２の態様は、配列表の配列番号：１に記載のヌクレオチド１６８からヌクレオチド１７２７までの配列を含むＤＮＡである。該配列は、配列番号：２に示すアミノ酸１からアミノ酸５１９までのアミノ酸配列からなる本発明の新規転写因子をコードするオープンリーデイングフレームである。この態様のＤＮＡは、配列番号：１のヌクレオチド１６８からヌクレオチド１７２７までのヌクレオチド配列のほかに、他の塩基配列を含んでいてもよい。例えば、マーカー遺伝子や他のペプチドや蛋白をコードする遺伝子またはその一部などを含んでいてもよい。この態様のＤＮＡの典型例は、配列番号：１のヌクレオチド１６８からヌクレオチド１７２７までの配列からなるものである。   The second aspect of the present invention is DNA comprising the sequence from nucleotide 168 to nucleotide 1727 set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. This sequence is an open reading frame encoding the novel transcription factor of the present invention consisting of the amino acid sequence from amino acid 1 to amino acid 519 shown in SEQ ID NO: 2. The DNA of this embodiment may contain other nucleotide sequences in addition to the nucleotide sequence from nucleotide 168 to nucleotide 1727 of SEQ ID NO: 1. For example, a marker gene, a gene encoding another peptide or protein, or a part thereof may be included. A typical example of the DNA of this embodiment consists of the sequence from nucleotide 168 to nucleotide 1727 of SEQ ID NO: 1.

本発明の第３の態様は、配列表の配列番号：２に記載のアミノ酸配列のアミノ酸１からアミノ酸５１９までを含む蛋白である。該蛋白は、本発明の新規転写因子であり、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）遺伝子プロモーター上に結合し、かつＡＭＰキナーゼ（ＡＭＰＫ）依存的に転写を抑制するという特性を有する。該蛋白は、それをコードするＤＮＡを発現ベクター中に組み込み、適切な条件下で宿主細胞に形質転換して発現させることにより、得ることができる。該蛋白は、配列番号：２に記載されるアミノ酸配列のほかに、他のアミノ酸配列を含んでいてもよく、例えば、マーカーのアミノ酸配列、他のペプチドや蛋白のアミノ酸配列、あるいはそれらの一部などを含んでいてもよい。この態様の蛋白の典型例は、配列番号：２のアミノ酸１からアミノ酸５１９までからなるものである。   A third aspect of the present invention is a protein comprising amino acids 1 to 519 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. The protein is a novel transcription factor of the present invention, and has a property of binding to a phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) gene promoter and suppressing transcription in an AMP kinase (AMPK) -dependent manner. The protein can be obtained by incorporating a DNA encoding it into an expression vector and transforming it into a host cell under appropriate conditions for expression. The protein may contain other amino acid sequences in addition to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, such as amino acid sequences of markers, amino acid sequences of other peptides and proteins, or a part thereof. Etc. may be included. A typical example of the protein of this embodiment is composed of amino acids 1 to 519 of SEQ ID NO: 2.

本発明の第４の態様は、上記転写因子のアミノ酸配列において１個もしくは複数個のアミノ酸が挿入、欠失もしくは置換された蛋白をコードするＤＮＡである。かかるＤＮＡによりコードされる蛋白は、ＰＥＰＣＫ遺伝子プロモーター上に結合し、かつＡＭＰＫ依存的に転写を抑制するという性質を有する。ここに「複数個」とは、アミノ酸残基１個〜約５０個をいい、好ましくはアミノ酸残基１個〜約２５個、より好ましくは１個〜約１５個、最も好ましくは１０個未満をいう。ここで、１個もしくは複数個のアミノ酸の挿入、欠失もしくは置換は、例えば、部位特異的突然変異誘発法（M.J.Zoller et al. Methods in Enzymology, 100, p.468 (1983)）やＰＣＲ法（Molecular Cloning 2nd Ed. Chapter 15, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)）などの公知の手法により遺伝子工学的に容易に行うことができる。   A fourth aspect of the present invention is DNA encoding a protein in which one or more amino acids are inserted, deleted or substituted in the amino acid sequence of the transcription factor. The protein encoded by such DNA has the property of binding to the PEPCK gene promoter and repressing transcription in an AMPK-dependent manner. The term “plurality” as used herein refers to 1 to about 50 amino acid residues, preferably 1 to about 25 amino acid residues, more preferably 1 to about 15, most preferably less than 10. Say. Here, the insertion, deletion or substitution of one or a plurality of amino acids can be performed by, for example, site-directed mutagenesis (MJZoller et al. Methods in Enzymology, 100, p.468 (1983)) or PCR. (Molecular Cloning 2nd Ed. Chapter 15, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)).

本発明の第５の態様は、本発明の第２の態様のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするＤＮＡであって、ＰＥＰＣＫ遺伝子プロモーター上に結合し、ＡＭＰＫ依存的に転写を抑制するという性質を有する蛋白をコードするＤＮＡである。ここにストリンジェントな条件とは、２つのＤＮＡのうち短い方のヌクレオチドの少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、さらに好ましくは少なくとも９８％が塩基対を形成する条件をいう。ストリンジェントな条件の例としては、５ｘＳＳＰＥ、５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、０．２％ ＳＤＳ、５０％ホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液を用い、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションする条件などが挙げられる。   A fifth aspect of the present invention is DNA that hybridizes under stringent conditions with the DNA of the second aspect of the present invention, which binds to the PEPCK gene promoter and suppresses transcription in an AMPK-dependent manner. DNA encoding a protein having properties. Here, stringent conditions are conditions in which at least 90%, preferably at least 95%, more preferably at least 97%, and even more preferably at least 98% of the shorter nucleotide of the two DNAs form base pairs. Say. Examples of stringent conditions include hybridization conditions overnight at 42 ° C. using a hybridization solution containing 5 × SSPE, 5 × Denhardt's, 0.2% SDS, and 50% formamide.

本発明の第６の態様は、本発明の第２の態様のＤＮＡに対して少なくとも９０％以上の同一性を有するＤＮＡであって、ＰＥＰＣＫ遺伝子プロモーター上に結合し、ＡＭＰＫ依存的に転写を抑制するという性質を有する蛋白をコードするＤＮＡである。より好ましくは、該ＤＮＡは、本発明の第２の態様のＤＮＡに対して少なくとも９５％以上の同一性を有するものであり、さらに好ましくは、本発明の第２の態様のＤＮＡに対して少なくとも９７％以上の同一性を有するものであり、最も好ましくは、本発明の第２の態様のＤＮＡに対して少なくとも９８％以上の同一性を有するものである。   A sixth aspect of the present invention is DNA having at least 90% identity to the DNA of the second aspect of the present invention, which binds to the PEPCK gene promoter and suppresses transcription in an AMPK-dependent manner. DNA encoding a protein having the property of More preferably, the DNA has at least 95% identity to the DNA of the second aspect of the present invention, more preferably at least the DNA of the second aspect of the present invention. Those having 97% or more identity, and most preferably those having at least 98% identity to the DNA of the second aspect of the present invention.

本発明の第７の態様は、本発明の第４〜第６の態様のＤＮＡによってコードされる蛋白を提供する。かかる蛋白も、ＰＥＰＣＫ遺伝子プロモーター上に結合し、ＡＭＰＫ依存的に転写を抑制するという性質を有するものである。なお、本明細書において、本発明の第３の態様および第７の態様の蛋白を「本発明の蛋白」、「本発明の転写因子」あるいは「本発明の新規転写因子」と総称することがある。また、本明細書において、本発明の第１の態様、および第４〜第６の態様のＤＮＡを「本発明のＤＮＡ」、「本発明の転写因子をコードするＤＮＡ」あるいは「本発明の新規転写因子をコードするＤＮＡ」と総称することがある。   The seventh aspect of the present invention provides a protein encoded by the DNA of the fourth to sixth aspects of the present invention. Such a protein also binds on the PEPCK gene promoter and has the property of repressing transcription in an AMPK-dependent manner. In the present specification, the proteins of the third and seventh aspects of the present invention are collectively referred to as “the protein of the present invention”, “the transcription factor of the present invention” or “the novel transcription factor of the present invention”. is there. In the present specification, the DNA of the first aspect and the fourth to sixth aspects of the present invention is referred to as “the DNA of the present invention”, “the DNA encoding the transcription factor of the present invention” or “the novel of the present invention. It may be collectively referred to as “DNA encoding a transcription factor”.

また、本発明は、本発明の新規転写因子をコードするＤＮＡに対して相補的なＲＮＡも包含する。   The present invention also includes RNA complementary to DNA encoding the novel transcription factor of the present invention.

本発明の転写因子は、本発明のＤＮＡを発現ベクターに連結し、これを適切な宿主細胞に導入して形質転換し、得られた形質転換体を、該発現ベクターが発現可能な条件下で培養することにより得ることができる。すなわち、クローニングされた本発明の転写因子をコードするＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ３．１（invitrogen）、ｐＧＥＸ−２（Pharmacia）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（＋）（stratagene）などの公知の発現ベクターに連結した後、適当な宿主細胞中に導入し、発現ベクターの発現可能な条件下で培養することにより、本発明の転写因子を得ることができる。所望により、得られた本発明の転写因子を精製してもよい。遺伝子発現の確認を容易化するために、薬物耐性マーカーやＧＳＴタグまたは緑色蛍光蛋白などのタグあるいはルシフェラーゼレポーターを用いてもよい。これらのマーカー、タグあるいはレポーターの遺伝子を組み込んだベクターも種々のものが市販されている。宿主細胞としては、原核生物細胞、真核生物細胞のいずれでもよく、例えば、大腸菌などの細菌株や動物細胞株（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞など）は使用例も多く、入手も容易であり、本発明の転写因子の製造にも容易に利用できる。発現ベクターでの宿主細胞の形質転換も公知の手法が利用できる。例えば、細菌細胞の形質転換には、カルシウム法やエレクトロポレーションなどの手法を用いることができる。また、動物細胞の形質転換にはリポフェクチン法なども使用できる。得られた形質転換体の培養も公知の方法に従って行うことができる。   The transcription factor of the present invention comprises the DNA of the present invention linked to an expression vector, introduced into an appropriate host cell for transformation, and the resulting transformant is subjected to conditions under which the expression vector can be expressed. It can be obtained by culturing. That is, after ligating the cloned DNA encoding the transcription factor of the present invention to a known expression vector such as pcDNA3.1 (invitrogen), pGEX-2 (Pharmacia), pBluescript (+) (stratagene), etc. The transcription factor of the present invention can be obtained by introducing it into a host cell and culturing it under conditions where the expression vector can be expressed. If desired, the obtained transcription factor of the present invention may be purified. In order to facilitate confirmation of gene expression, a drug resistance marker, a tag such as GST tag or green fluorescent protein, or a luciferase reporter may be used. Various vectors incorporating these marker, tag or reporter genes are commercially available. The host cell may be either a prokaryotic cell or a eukaryotic cell. For example, bacterial strains such as E. coli and animal cell strains (for example, COS cells, CHO cells, etc.) have many examples of use and are easily available. It can be easily used for the production of the transcription factor of the present invention. Known techniques can also be used to transform host cells with expression vectors. For example, techniques such as calcium method and electroporation can be used for transformation of bacterial cells. Moreover, the lipofectin method etc. can also be used for transformation of an animal cell. The obtained transformant can also be cultured according to a known method.

培養上清中に産生された本発明の転写因子は、公知の精製方法、例えばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーなどの種々のクロマトグラフィー法、限外濾過、クロマトフォーカシングなどを用いて精製あるいは単離することができる。得られた本発明の転写因子のアッセイは、後で実施例にて説明するように、特定のＤＮＡフラグメントへの結合能やインビトロＡＭＰＫアッセイなどにより行うことができる。   The transcription factor of the present invention produced in the culture supernatant is obtained by using a known purification method, for example, various chromatographic methods such as gel filtration, ion exchange chromatography or affinity chromatography, ultrafiltration, chromatofocusing and the like. It can be purified or isolated. The obtained transcription factor assay of the present invention can be performed by the ability to bind to a specific DNA fragment, an in vitro AMPK assay, or the like, as described later in the Examples.

本発明の転写因子はＰＥＰＣＫ遺伝子プロモーター上に結合し、ＰＥＰＣＫ遺伝子の発現を抑制するものである。ＰＥＰＣＫは糖新生系の鍵酵素で、オキサロ酢酸からホスホエノールピルビン酸への変換を触媒する。したがって、本発明の転写因子によってこの酵素の発現を抑制することにより、糖新生の亢進を抑制することができる。糖新生の亢進に関連した疾病としては、典型的には糖尿病が挙げられるが、糖尿病に起因する疾病もこれに包含される。   The transcription factor of the present invention binds on the PEPCK gene promoter and suppresses the expression of the PEPCK gene. PEPCK is a key gluconeogenic enzyme that catalyzes the conversion of oxaloacetate to phosphoenolpyruvate. Therefore, by suppressing the expression of this enzyme by the transcription factor of the present invention, it is possible to suppress the promotion of gluconeogenesis. The disease associated with enhanced gluconeogenesis typically includes diabetes, but also includes diseases caused by diabetes.

したがって、本発明は、本発明の転写因子を有効成分として含有する、糖新生の亢進に関連した疾病を治療または予防するための医薬組成物を提供する。また、本発明は、本発明の転写因子を投与することを特徴とする、糖新生の亢進に関連した疾病、例えば糖尿病を治療または予防するための方法も提供する。上記の本発明の転写因子を有効成分として含有する医薬組成物は、公知の方法に従って製造することができる。その剤形も種々のものとすることができる。   Accordingly, the present invention provides a pharmaceutical composition for treating or preventing a disease associated with enhanced gluconeogenesis, comprising the transcription factor of the present invention as an active ingredient. The present invention also provides a method for treating or preventing a disease associated with enhanced gluconeogenesis, such as diabetes, characterized by administering the transcription factor of the present invention. The pharmaceutical composition containing the transcription factor of the present invention as an active ingredient can be produced according to a known method. The dosage form can also be various.

本発明のＤＮＡあるいはそれを連結した発現ベクターを用いて本発明の転写因子を患者細胞にて発現させることによる治療方法、すなわち遺伝子治療により、糖新生の亢進に関連した疾病、例えば糖尿病を治療または予防することもできる。例えば、患者から得た細胞に本発明のＤＮＡあるいはそれを連結した発現ベクターを導入し、培養し、本発明の転写因子を発現させ、その後、該患者の体内に戻すという手法により、遺伝子治療を行うことができる。それゆえ、本発明は、本発明の転写因子をコードするＤＮＡまたは該ＤＮＡを含む発現ベクターを含有する、糖新生亢進に関連する疾病を治療または予防するための医薬組成物を提供するものである。   A treatment method by expressing the transcription factor of the present invention in patient cells using the DNA of the present invention or an expression vector linked thereto, that is, gene therapy to treat diseases associated with increased gluconeogenesis, such as diabetes or It can also be prevented. For example, gene therapy can be performed by introducing a DNA of the present invention or an expression vector linked thereto into cells obtained from a patient, culturing it, expressing the transcription factor of the present invention, and then returning it to the patient's body. It can be carried out. Therefore, the present invention provides a pharmaceutical composition for treating or preventing a disease associated with increased gluconeogenesis, comprising a DNA encoding the transcription factor of the present invention or an expression vector containing the DNA. .

以下に実施例を示して本発明を具体的に詳説するが、実施例は本発明を説明するものであって、何ら本発明を限定するものではない。   EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples. However, the examples illustrate the present invention and do not limit the present invention.

本発明の新規転写因子のクローニング
糖新生系の鍵酵素遺伝子であるＰＥＰＣＫ遺伝子（ヒト由来）プロモーター上流−４５８ｂｐから＋６５ｂｐ、−５９９ｂｐから＋６５ｂｐ、および−７４２ｂｐから＋６５ｂｐの、それぞれ長さの異なる領域をルシフェラーゼレポーターベクター（ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクター（Promega））のＸｈｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入した。これをラット肝初代培養細胞にリポフェクタミン法にて導入し、ＡＭＰＫの活性化剤である５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミド−１−β−Ｄ−リボフラノシド（ＡＩＣＡＲ）（最終濃度５００μＭ）を添加し、常法により転写活性を調べた。その結果、−７４２ｂｐから＋６５ｂｐを含む領域はＡＩＣＡＲ添加によって転写活性が約５０％に低下したのに対し、その他の−４５８ｂｐから＋６５ｂｐ、−５９９ｂｐから＋６５ｂｐの領域においてはＡＩＣＡＲ添加による変動は見られなかった（図１）。このことから、ＰＥＰＣＫ遺伝子プロモーター上流−７４２ｂｐから−５９９ｂｐ内に、ＡＩＣＡＲに応答して転写を負に制御する領域が存在することが示唆された。 Cloning of novel transcription factor of the present invention PEPCK gene (human origin) promoter key gene of gluconeogenic system upstream of -458 bp to +65 bp, −599 bp to +65 bp, and −742 bp to +65 bp, respectively, regions having different lengths are luciferase The reporter vector (pGL3-Basic vector (Promega)) was inserted into the XhoI / HindIII site. This was introduced into rat liver primary culture cells by the lipofectamine method, and AMPK activator 5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-β-D-ribofuranoside (AICAR) (final concentration 500 μM) was added, Transcriptional activity was examined by a conventional method. As a result, the transcriptional activity of the region containing -742 bp to +65 bp was reduced to about 50% by the addition of AICAR, while the other regions of -458 bp to +65 bp and -599 bp to +65 bp showed no variation due to the addition of AICAR. (FIG. 1). This suggested that a region that negatively regulates transcription in response to AICAR exists within -742 bp to -599 bp upstream of the PEPCK gene promoter.

転写因子の結合部位を調べるために、−７４２ｂｐから−５９９ｂｐの領域を７つに分断（フラグメントＡからＧまで、それぞれ配列番号：３〜９）し、プローブとした。上記と同じラット肝初代培養細胞をＡＩＣＡＲ添加（最終濃度５００μＭ）および未添加によって培養し、常法に従って核抽出液を調製した。各プローブと核抽出液を混合し、常法によりゲルシフトアッセイを行った。その結果、フラグメントＧに蛋白−ＤＮＡ複合体を示すバンドが確認された。またこのバンドがＡＩＣＡＲ添加によって消失した（図２）。このことは、フラグメントＧに結合する因子はＡＭＰＫによるリン酸化によってＤＮＡ結合性を調節されるものと推察された。   In order to examine the binding site of the transcription factor, the region from -742 bp to -599 bp was divided into seven (fragments A to G, SEQ ID NOs: 3 to 9, respectively) to obtain probes. The same rat liver primary cultured cells as described above were cultured with and without AICAR (final concentration 500 μM), and a nuclear extract was prepared according to a conventional method. Each probe and the nuclear extract were mixed, and gel shift assay was performed by a conventional method. As a result, a band indicating a protein-DNA complex was confirmed in fragment G. This band disappeared by adding AICAR (FIG. 2). This suggests that the factor binding to fragment G is regulated in DNA binding by phosphorylation by AMPK.

フラグメントＧをベイト（bait）とした酵母ワン・ハイブリッド（one-hybrid）法を用いて、ヒト肝臓由来ｃＤＮＡライブラリーよりスクリーニングし、本発明の新規転写因子をクローニングした。ｃＤＮＡの全長（配列番号：１）を得て、シークエンスにより全塩基配列を決定した（図３および配列番号：１）。これにより本発明の新規転写因子のアミノ酸配列を推定したところ、配列番号：１のヌクレオチド１６８からヌクレオチド１７２７までのオープンリーディングフレームによりコードされる５１９アミノ酸からなるポリペプチド（配列番号：２）であり、分子内に核移行シグナル、グルタミン酸リッチな領域、Ｃ２Ｈ２−タイプのＺｎフィンガー（リングフィンガー）構造などの転写因子に共通の構造を持つことが分かった。このポリペプチド中にはＡＭＰＫによってリン酸化されうるセリン、スレオニン部位が少なくとも６箇所存在した（図３）。Using the yeast one-hybrid method in which fragment G is bait, screening was performed from a cDNA library derived from human liver, and the novel transcription factor of the present invention was cloned. The full length of cDNA (SEQ ID NO: 1) was obtained, and the entire nucleotide sequence was determined by sequencing (FIG. 3 and SEQ ID NO: 1). Thus, when the amino acid sequence of the novel transcription factor of the present invention was estimated, it was a polypeptide (SEQ ID NO: 2) consisting of 519 amino acids encoded by the open reading frame from nucleotide 168 to nucleotide 1727 of SEQ ID NO: 1. It was found that the molecule has a structure common to transcription factors such as a nuclear translocation signal, a glutamate-rich region, and a C 2 H 2 -type Zn finger (ring finger) structure. This polypeptide had at least 6 serine and threonine sites that could be phosphorylated by AMPK (FIG. 3).

ヒト各臓器における本発明の転写因子の発現パターン
ヒト各臓器における本発明の転写因子の発現パターンをノザン法で調べた。その結果、本発明の転写因子は糖新生の主要な臓器である肝臓、腎臓以外にも広く発現が確認された（図４）。 Expression pattern of the transcription factor of the present invention in each human organ The expression pattern of the transcription factor of the present invention in each human organ was examined by the Northern method. As a result, the expression of the transcription factor of the present invention was widely confirmed in addition to the liver and kidney, which are major organs of gluconeogenesis (FIG. 4).

本発明の転写因子の調製およびＤＮＡ結合性
ウサギ網状赤血球を用いたインビトロ転写／翻訳によって本発明の転写因子を調製した。次に、ゲルシフト法によりフラグメントＡ〜Ｇに対する結合性を調べたところ、フラグメントＧに特異的に結合した（図５）。 The transcription factor of the present invention was prepared by preparation of the transcription factor of the present invention and in vitro transcription / translation using DNA-binding rabbit reticulocytes. Next, when the binding property to fragments A to G was examined by gel shift method, it specifically bound to fragment G (FIG. 5).

本発明の転写因子のインビトロＡＭＰＫアッセイ
以下に説明する手順により、大腸菌を用いてＧＳＴ融合蛋白を調製し、インビトロＡＭＰＫアッセイ（Hardie,G.D., et al., Ann.Rev.Biochem. 67:821-855, 1998; Carling,D., et al., Eur.J.Biochem. 186:129-136, 1989 および Davies,S.P., et al., Eur.J.Biochem. 186:123-128, 1989）を行った。その結果、配列番号：２の４７０番目のセリンがＡＭＰＫによってリン酸化されることが明らかになった（図６）。 In vitro AMPK assay of transcription factor of the present invention A GST fusion protein was prepared using Escherichia coli according to the procedure described below, and an in vitro AMPK assay (Hardie, GD, et al., Ann. Rev. Biochem. 67: 821-855). , 1998; Carling, D., et al., Eur. J. Biochem. 186: 129-136, 1989 and Davies, SP, et al., Eur. J. Biochem. 186: 123-128, 1989) It was. As a result, it became clear that the 470th serine of SEQ ID NO: 2 was phosphorylated by AMPK (FIG. 6).

本発明の転写因子のＰＥＰＣＫ遺伝子抑制作用
以下に説明する手順により、本発明の転写因子遺伝子をＣＭＶプロモーター下流に挿入し、培養細胞に導入して、転写活性を調べた。その手順を簡単に説明すると、ヒトＰＥＰＣＫ遺伝子上流プロモーター（−５９９ｂｐから＋６５ｂｐ）のさらに上流に、フラグメントＧを持つルシフェラーゼレポータープラスミドと共に培養細胞に導入し、ＡＩＣＡＲの存在、および非存在時におけるルシフェラーゼ活性を指標とした転写活性を調べた。その結果、本発明の転写因子は、活性型ＡＭＰＫ存在時にＰＥＰＣＫ遺伝子を負に制御することが明らかになった。一方、リン酸化部位をアラニンに置き換えた変異体（Ｓ４７０Ａ）は、この抑制効果が消失していた（図７）。 PEPCK gene inhibitory action of the transcription factor of the present invention The transcription factor gene of the present invention was inserted downstream of the CMV promoter and introduced into cultured cells by the procedure described below, and the transcriptional activity was examined. Briefly, the procedure is introduced into a cultured cell together with a luciferase reporter plasmid having a fragment G, further upstream of the human PEPCK gene upstream promoter (-599 bp to +65 bp), and the presence of AICAR and the luciferase activity in the absence of AICAR are measured. The transcriptional activity as an index was examined. As a result, it was revealed that the transcription factor of the present invention negatively regulates the PEPCK gene in the presence of active AMPK. On the other hand, the mutant (S470A) in which the phosphorylation site was replaced with alanine lost this inhibitory effect (FIG. 7).

以上のことから、本発明によって得られた転写因子は、ＡＭＰＫによってリン酸化される新規転写因子であり、糖新生系を調節する重要な機能を有するものであることがわかった。したがって、本発明の新規転写因子の使用により、糖尿病時における糖新生による血糖値の上昇を有効に治療または予防することができる。
From the above, it was found that the transcription factor obtained by the present invention is a novel transcription factor that is phosphorylated by AMPK and has an important function of regulating the gluconeogenic system. Therefore, by using the novel transcription factor of the present invention, an increase in blood glucose level due to gluconeogenesis during diabetes can be effectively treated or prevented.

本発明は、糖新生に関わる疾病の研究、ならびに糖代謝に関わる医薬品の研究および製造の分野などに幅広く利用できる。   INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention can be widely used in the research of diseases related to gluconeogenesis and the research and production of pharmaceuticals related to sugar metabolism.

Claims (13)

配列表の配列番号：１に記載のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ。   DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing. 配列表の配列番号：１に記載のヌクレオチド１６８からヌクレオチド１７２７までの配列を含むＤＮＡ。   DNA comprising a sequence from nucleotide 168 to nucleotide 1727 set forth in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing. 配列表の配列番号：２に記載のアミノ酸１からアミノ酸５１９までのアミノ酸配列を含む蛋白。   A protein comprising an amino acid sequence from amino acid 1 to amino acid 519 described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. 請求項３に記載の蛋白において１個もしくは複数個のアミノ酸が挿入、欠失もしくは置換されており、かつ以下の特性を有する蛋白をコードするＤＮＡ：
（ａ）ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子プロモーター上に結合する
（ｂ）ＡＭＰキナーゼ依存的に転写を抑制する。A DNA encoding a protein having one or more amino acids inserted, deleted or substituted in the protein according to claim 3 and having the following characteristics:
(A) binds to the phosphoenolpyruvate carboxykinase gene promoter (b) represses transcription in an AMP kinase-dependent manner. 請求項２に記載のＤＮＡ分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションし、かつ以下の特性を有する蛋白をコードするＤＮＡ：
（ａ）ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子プロモーター上に結合する
（ｂ）ＡＭＰキナーゼ依存的に転写を抑制する。A DNA that hybridizes with the DNA molecule of claim 2 under stringent conditions and encodes a protein having the following characteristics:
(A) binds to the phosphoenolpyruvate carboxykinase gene promoter (b) represses transcription in an AMP kinase-dependent manner. 請求項２に記載のＤＮＡ分子に対して少なくとも９０％以上の同一性を有し、かつ以下の特性を有する蛋白をコードするＤＮＡ：
（ａ）ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子プロモーター上に結合する
（ｂ）ＡＭＰキナーゼ依存的に転写を抑制する。DNA encoding a protein having at least 90% identity to the DNA molecule of claim 2 and having the following properties:
(A) binds to the phosphoenolpyruvate carboxykinase gene promoter (b) represses transcription in an AMP kinase-dependent manner. 請求項４〜６のいずれか１項に記載のＤＮＡによりコードされる蛋白。   A protein encoded by the DNA according to any one of claims 4 to 6. 請求項１、２または４〜６のいずれか１項に記載のＤＮＡを含む発現ベクター。   An expression vector comprising the DNA according to any one of claims 1, 2, and 4-6. 請求項８に記載の発現ベクターにより形質転換された形質転換体。   A transformant transformed with the expression vector according to claim 8. 請求項９に記載の形質転換体を請求項８に記載の発現ベクターの発現可能な条件下で培養することを特徴とする、組み換え蛋白の製造方法。   A method for producing a recombinant protein, comprising culturing the transformant according to claim 9 under conditions capable of expressing the expression vector according to claim 8. 請求項３または７に記載の蛋白あるいは請求項１０に記載の方法により得られた蛋白を含有する、糖新生亢進に関連する疾病を治療または予防するための医薬組成物。   A pharmaceutical composition for treating or preventing a disease associated with increased gluconeogenesis, comprising the protein according to claim 3 or 7 or the protein obtained by the method according to claim 10. 請求項１、２または４〜６のいずれか１項に記載のＤＮＡあるいは請求項８に記載の発現ベクターを含有する、糖新生亢進に関連する疾病を治療または予防するための医薬組成物。   A pharmaceutical composition for treating or preventing a disease associated with increased gluconeogenesis, comprising the DNA according to any one of claims 1, 2, or 4 to 6, or the expression vector according to claim 8. 疾病が糖尿病である請求項１１または１２に記載の医薬組成物。



The pharmaceutical composition according to claim 11 or 12, wherein the disease is diabetes.



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