JPWO2006016617A1 - 物質の定量方法及び物質の定量デバイス - Google Patents
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Abstract
Description
マイクロフロー抗体型チップによるFK506の定量は、直接競合ELISAにより行った。直接競合ELISAは、抗体をマクロプレートや試験管等にコーティング(固定化)したものに、測定対象物質(サンプルや標準物質)および酵素を標識した抗原を添加して競合反応させ、抗体に結合しなかった測定対象物質や標識抗原を洗浄除去後、酵素基質を添加して酵素による発光反応をさせ、ついで発光の程度を比色計等で測定し、測定対象物質の標準品の発光度と比較することにより測定対象物質の濃度を測定する方法である。
本実施例では、抗体をポリスチレンビーズ表面に固定し、マイクロフロー抗体型チップの微小流路中に配置させて測定を行なった。抗体固定化ビーズは、以下の手法により調製した。
次に、ビーズ表面への抗体の固定を確認するとともに、FK506−PODの必要量を検討した。ビーズ溶液10μl(ビーズ約100個)をPBSで洗浄し、FK506−POD(5000倍希釈液)をBT−PBSでさらに9段階(1倍〜107倍)に希釈した溶液をそれぞれ加え、終夜浸漬させ、抗原抗体反応を行った。T−PBSで3回洗浄し、基質溶液(OPD 0.5mg/ml、0.03%過酸化水素、リン酸−クエン酸バッファー(pH=5.4)200μlを加えて室温で20分間反応させた。次に、2M硫酸(50μl)を加えて酵素反応を止めた。反応液を96ウェルプレートに200μlずつ分注し、490nmの吸光度を測定した。検出原理を図8に示す。
FK506の10μl/mlメタノール溶液を作製し、これをメタノールで希釈して0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml溶液を作製した。それぞれ10μlずつガラス管に加えて、窒素気流下で濃縮乾固した。FK506−PODをBT−PBSで10倍希釈し、それぞれ200μlずつ加えて溶解した。得られたサンプル溶液を180μlずつエッペンチューブにとり、そこにビーズ溶液10μl(ビーズ約100個分)を加え、2時間、室温で抗原抗体反応を行った。得られた反応液をT−PBSで3回洗浄した後、基質溶液(OPD 0.5mg/ml、0.03%過酸化水素、リン酸−クエン酸バッファー(pH=5.4))200μlを加えて室温で20分間反応させた。次いで2M硫酸(50μl)を加えて酵素反応を止めた。反応液を96ウェルプレートに200μlずつ分注し、490nmの吸光度を測定した。
FK506の10μl/mlメタノール溶液を作製し、これらをメタノールで希釈して0.01ng/ml、0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml溶液を作製した。それぞれ50μlずつガラス管に加えて、窒素気流下で濃縮乾固した。FK506−PODをBT−PBSで3倍希釈し、それぞれ100μlずつ加えて溶解した。得られたサンプル溶液を90μlずつエッペンチューブにとり、そこにビーズ溶液5μlを加えて2時間室温で抗原抗体反応を行った。得られた反応液をT−PBSで9回洗浄した後、96ウェルプレートにビーズ1個、3個、10個をそれぞれ2連で配置した。基質溶液(OPD 0.5mg/ml、0.03%過酸化水素、リン酸−クエン酸バッファー(pH=5.4))200μlを加えて室温で20分間反応させた。次いで2M硫酸(50μl)を加えて酵素反応を止めた。反応液を96ウェルプレートに200μlずつ分注し、490nmの吸光度を測定した。
FK506の10μl/mLメタノール溶液を作製し、これらをメタノールで希釈して0.0001ng/ml、0.001ng/ml、0.01ng/ml、0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml溶液を作製した。それぞれ50μlずつガラス管に加えて、窒素気流下で濃縮乾固した。FK506−PODをBT−PBSで3倍希釈し、それぞれ100μlずつ加えて溶解した。得られたサンプル溶液を90μlずつエッペンチューブにとり、そこにビーズ溶液5μlを加えて、2時間、室温で抗原抗体反応を行った。得られた反応液をT−PBSで9回洗浄した後、96ウェルプレートにビーズ10個をそれぞれ配置した。基質溶液(OPD 0.5mg/ml、0.03%過酸化水素、リン酸−クエン酸バッファー(pH=5.4))200μlを加えて室温で20分間反応させた。次いで2M硫酸(50μl)を加えて酵素反応を止めた。反応液を96ウェルプレートに200μlずつ分注し、490nmの吸光度を測定した。
本研究で使用したマイクロフロー型抗体チップの作製手順は、以下のとおりである。シリコンウェハーをダイヤモンドカッターにて40mm×30mmに切り出し、洗浄を行なった。この洗浄は、純水による超音波洗浄、アセトン煮沸の後、フッ化水素酸、フッ化アンモニウム混合液(1:6)に5分間浸漬させ、自然酸化膜を除去した。次に、シリコン基板の表面へSU−8(MicroChem 社製、NANO XP SU−8 50)をスピンコーターにて塗布し、ホットプレートにて65℃:10分、95℃:30分の条件でプリベイクを行なった。なお、スピンコートの際、SU−8の膜厚が100μmとなるようにスピンコート条件を変え、塗布を行なった。そして、プリベイクしたシリコン基板にマスクパターン(山田写真製版社製)を通して、マスクアライメント装置により紫外線を照射した後、再度、ホットプレートにて65℃:3分、95℃:10分でポストベイクを行なった。この基板を、SU−8現像液に約10分浸漬し、マスクアライメント装置による紫外線照射の際、硬化していない基板上のSU−8を除去し乾燥させた後、目的とする鋳型を得た。
最終的にマイクロフロー型抗体チップを得る前に、実体顕微鏡を用いて微小流路を観察しながら、作製したPDMSチップの微小流路中にピンセットで抗体固定化ビーズを10個配置した。このとき、ピンセットで微小流路を損傷しないようにした。その後、PDMSチップの微小流路側とガラス平板を張り合わせ、図3〜図6に示すような単一流路型のマイクロフロー抗体型チップを得た。なお、PDMSに形成された微小流路は、長さ30mm、幅1000μm、深さ100μmの溝状であり、微小流路の中ほどには、微小流路の底部から高さ50μmだけ開口した狭隘部が設けられている。
マイクロフロー型抗体チップの特性評価における操作手順は、基本的には図1に準じる。先ず、抗体固定化ビーズが配置されたチップの微小流路に、各濃度に希釈したFK506とわさびペルオキシダーゼ(POD)標識されたFK506(FK506−POD)との混合液を、シリンジポンプを用いて流量1μl/分で5分間導入し、抗体固定化ビーズ表面で競合法による抗原抗体反応を行なった。
マイクロフロー抗体チップに配置するビーズの個数を1個とし、前述のマイクロフロー型抗体チップにおける検量特性評価−1と同様の操作でFK506の濃度測定を行なった。また、実際の血液サンプルを想定し、血液サンプルを調製した。血液サンプルも同様に、マイクロフロー抗体チップにてFK506の濃度を測定した。
<抗体固定化の確認及びFK506−POD最適濃度の評価(96ウェルプレート)>
ポリスチレンビーズへの抗体の固定を確認し、及びFK506−PODの最適濃度を算出するために、FK506−POD各濃度に対する吸光度変化を測定した。この結果を図10に示す。この結果から、ビーズの結合部位全てを埋めるFK506−POD溶液として、15000倍希釈以下のものを使用する必要があることが示唆された。したがって、以降の実験では全て、FK506−PODとして15000倍希釈したものを使用することとした。
最適FK506−POD濃度が確認されたので、実際にFK506希釈液を用いてアッセイを行った。このとき、正確にビーズを100個数えるのは非常に時間がかかるので、方法を簡略化するために、所定濃度のビーズの懸濁液を分注することにより、ビーズが約100個含まれるようにした。結果を図11に示す。図11に示すように、ばらつきは大きいが、0.1ng/mlの濃度までは相関性が得られた。このばらつきの原因は、ビーズの個数のばらつきであると考えられた。懸濁状態でビーズ溶液を分注した場合のビーズ個数を実際に数えたところ、1割程度の誤差が生じていた。このことから、この方法及びビーズ個数でビーズ個数の精度を得るのは困難であると判断される。したがって、以下ではビーズの個数を減らすとともに、実際にビーズの数を数えることでビーズの数を正確なものとし、同様の実験を行なった。
実際に短流路のマイクロチップで濃度評価を行なうことを考慮し、1個、3個、10個のビーズでそれぞれ実験を行なった。しかしながら、ビーズ1個及びビーズ3個では、1ng/mlまでは相関性が得られたが、さらに濃度の希薄なポイントでは、相関性が認められなかった。また、ビーズ個数が少ない場合、吸光度の変化率が不十分であるため、定量に適していないと考えられた。一方、ビーズ10個の場合、0.1pg/mlまで相関性が得られた(図12)。したがって、十分な感度を確保するためには、ビーズ個数を10個とすることが適当であると考えられた。
ビーズ10個を用いた際の検量特性を、0.1pg/ml〜1000ng/mlまで検討した。その結果、1pg/ml〜1000ng/mlまで良好な相関性(r2=0.947)を示した(図13)。この結果から、ビーズ10個を用いることにより、FK506の濃度測定に充分な感度を得られることが判明した。したがって、マイクロフロー抗体チップには、充分な感度が得られるビーズ10個を用いることにした。
抗原抗体反応、続くPBSによる洗浄後、チップの微小流路に基質溶液を流したところ、基質溶液がビーズ周辺に到達し始めると、蛍光発光が開始した。約30秒程度で定常状態となり、その後15分間までは少なくとも蛍光強度に差は見られなかった。作製した単一流路マイクロフロー抗体チップのチップ周辺の写真を図14に、検量特性を図15に示した。この結果から、本マイクロフロー抗体チップを用いることにより、0.01pg/ml〜1000ng/mlの濃度のFK506の定量が可能であった(r2=0.966)。また、本実験は同じ日に行った実験ではないが、それにもかかわらず良好な相関性を示したことから、非常に再現性の高いものであることが示唆された。この検量特性は、ビーズを用いた96ウェルプレート上でのアッセイに比較して約10倍の感度を有していた。以上の結果から、ビーズ10個を用いて蛍光発光基質を用いることにより、これまで報告されているELISA法に比較して約1000倍の感度を有していることが判明した。
ビーズ1個を用いたマイクロフロー抗体チップによるFK506の検量特性は、図16に示すように、0.01ng/ml〜1000ng/mlの範囲で良好な相関性(r2=0.987)を示した。本実験の感度は、ビーズ10個を用いた際よりも100分の1になったが、それでも従来のELISA法に比較して約10倍の感度を有していることが判明した。
Claims (14)
- 酵素免疫測定法により試料溶液中の測定対象物質を定量する方法であって、
測定対象物質と特異的に結合する抗体又は抗原が固定されたビーズ担体を微小流路内に1個又は当該微小流路の幅方向にほぼ1列に配列するように配置し、前記試料溶液と酵素標識した測定対象物質を含む溶液とを混合した混合溶液を送液した後、基質を含む基質溶液を送液しながら、前記ビーズ担体近傍における発光又は発色を検出することを特徴とする物質の定量方法。 - 前記発光が蛍光であることを特徴とする請求項1記載の物質の定量方法。
- 前記混合溶液の送液の後、洗浄溶液を送液し、次いで前記基質溶液を送液することを特徴とする請求項1記載の物質の定量方法。
- 前記微小流路に前記混合溶液、前記洗浄溶液及び前記基質溶液を連続的に送液することを特徴とする請求項3記載の物質の定量方法。
- 前記微小流路内に前記ビーズ担体を高さ方向に重なり合わないように配置することを特徴とする請求項1記載の物質の定量方法。
- 前記基質溶液の送液時の流量を1μl/分以上、10μl/分以下とすることを特徴とする請求項1記載の物質の定量方法。
- 前記混合溶液の送液時の流量を1μl/分以上、10μl/分以下とすることを特徴とする請求項1記載の物質の定量方法。
- 液体を導入する試料導入部を共用するとともに送液後の液体を排出する試料排出部が個別に形成されている複数の微小流路を用いる場合において、
全ての前記試料排出部を閉じた後、前記試料排出部のいずれか1つを開放するとともに前記試料導入部から前記混合溶液を導入し前記微小流路のいずれかに送液する工程を有し、各微小流路に対し前記工程を順次行うことを特徴とする請求項1記載の物質の定量方法。 - 酵素免疫測定法による試料溶液中の測定対象物質の定量に用いられる定量デバイスであって、
測定対象物質と特異的に結合する抗体又は抗原が固定されたビーズ担体が配置される微小流路と、前記微小流路の途中に設けられ、液体を流しかつ前記ビーズ担体の下流への移動を妨げる狭隘部とを有し、
前記狭隘部において前記ビーズ担体が1個又は当該微小流路の幅方向にほぼ1列に配列されるとともに、前記微小流路に前記試料溶液と酵素標識した測定対象物質を含む溶液とを混合した混合溶液が送液された後、基質を含む基質溶液が送液されながら前記ビーズ担体近傍における発光又は発色が検出されることを特徴とする定量デバイス。 - 前記微小流路は基板上に形成された溝であることを特徴とする請求項9記載の定量デバイス。
- 前記基板上に配置され、前記基板の前記溝が形成された面と対向する面に凸部を有する蓋体を有し、
前記狭隘部が前記凸部と前記溝とにより形成されることを特徴とする請求項10記載の定量デバイス。 - 前記ビーズ担体が高さ方向に重なり合わないように配置されることを特徴とする請求項10記載の定量デバイス。
- 前記微小流路の深さが、前記ビーズ担体の直径を超え、前記ビーズ担体の直径の2倍以下であることを特徴とする請求項10記載の定量デバイス。
- 前記微小流路を複数有し、各微小流路は液体が導入される試料導入部を共用するとともに、送液後の液体が排出される試料排出部が個別に形成され、各試料排出部は独立して開閉可能であることを特徴とする請求項9記載の定量デバイス。
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