JPWO2005073373A1

JPWO2005073373A1 - 傷害を受けたｄｎａ断片の収集法

Info

Publication number: JPWO2005073373A1
Application number: JP2005517480A
Authority: JP
Inventors: 伸哉豊國; 慎也赤塚; 修二階堂
Original assignee: 社団法人芝蘭会; 日研ザイル株式会社
Priority date: 2004-01-29
Filing date: 2005-01-27
Publication date: 2007-09-13
Also published as: WO2005073373A1

Abstract

本発明は、ＤＮＡを含む試料中の酸化ストレスにより傷害された領域のＤＮＡ断片を選択的に収集する方法であって、試料からＤＮＡを抽出し、断片化した後、傷害により修飾された修飾ヌクレオシドまたは該修飾ヌクレオシドを含むポリヌクレオチドに特異的な一次抗体とインキュベートし、沈降した複合体を回収し、該複合体から傷害されたＤＮＡ断片を回収することを特徴とする方法を提供する。

Description

本発明は、傷害を受けたＤＮＡの選択的な収集法に関し、さらに詳しくは酸化ストレスに曝されたゲノム中、該ストレスで傷害を受けたＤＮＡ領域に相当するＤＮＡ断片を選択的に収集する方法、そのようにして収集したＤＮＡ断片を用いるゲノム傷害の解析に関する。

放射線、紫外線、大気汚染あるいは種々の化学物質などの環境ストレスによる生体傷害の初期過程、遺伝子の発現調節や生体情報伝達、種々の疾患の発生やそれらの制御、等における活性酸素・フリーラジカルの影響が世界的に注目されている。特に、老化や発がんの要因の一つとして活性酸素・フリーラジカルが関与する酸化ストレスによる遺伝子の損傷が様々な弊害をもたらすことから、その防御機構の研究、さらには防御方法の開発研究も行われている。

酸化ストレスとは、フリーラジカル・活性酸素の発生量から、それらに対する消去能力・防御能力・傷害の修復能力などを差し引いたものを意味する概念であり、ヒトにおいては動脈硬化症、がんなどの生活習慣病等に関係することが明らかとなっている。ＤＮＡに代表される核酸もフリーラジカル・活性酸素の標的分子であるが、核酸を構成する塩基のうち、プリン塩基の一つ、グアニンは傷害されやすいことが知られている。ヒドロキシラジカル、一重項酸素あるいは光力学反応によって生成する修飾塩基として、２’−デオキシグアノシンの８位ヒドロキシル化体、8−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシンが記載されている（非特許文献１）。この、8−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシンがＤＮＡ中に存在すると、その複製過程でＧＣ（グアニン―シトシン）からＴＡ（チミン―アデニン）のトランスバージョン変異（遺伝子変異）を引き起こす可能性があることが記載されている（非特許文献２）［澁谷ら（Shibutani et al.）, Nature 349: 431, 1991］。従って、8−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシンは老化、細胞の突然変異及び癌化などを引き起こす要因であるＤＮＡ損傷のマーカーとして用いられている。

従来から、尿中に排泄される8−ヒドロキシデオキシグアノシンは、癌の発生、糖尿病患者の管理、放射線被曝後の監視など、発症や病勢を反映するマーカーとして使用されており、その測定は、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーおよび電気化学検出器（HPLC−ECD）、ガスクロマトグラフィー質量分析計などを使用して行われていたが、合成8−ヒドロキシ-２’−デオキシグアノシン（８−ＯＨｄＧ）に対するモノクローナル抗体（特許文献１，非特許文献３）を用いるイムノアッセイ用のキットも利用されるようになっている。８−ＯＨｄＧに対する抗体は、核内で８−ヒドロキシグアニン含有量の高い細胞を同定するために高頻度に使用され、医学、薬学、農学などの広範な分野で極めて大きな役割を果たしている。

しかし、従来法では動植物から得た生体サンプルや病理標本、あるいはゲノムＤＮＡなど多様な混合物における8−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシン（８−ヒドロキシデオキシグアノシン）の検出および量の多寡の評価は可能であるが、ゲノム情報と結びつけて、例えば遺伝子上の傷害に対する感受性の高い部位を特定することはできなかった。そのような感受性の高い部位を特定し、その構造（配列等）を解析することによって、例えば、遺伝子変異を回避し細胞の癌化を予防することが可能と考えられる。また、そのような効果を有する化合物の研究開発にも寄与しうる。しかしながら、ＤＮＡは蛋白とは性質が全く異なるために、たとえ８−ＯＨｄＧに対するモノクローナル抗体を用いても、アフィニティークロマトグラフィーによって、特異的に８−ＯＨｄＧ含む長鎖のＤＮＡを収集することは困難であった。ポストゲノム時代の現在、損傷を受けたＤＮＡ、即ち８−ＯＨｄＧを含むゲノムＤＮＡ断片を特異的に収集する簡便で経済的な方法が強く求められている。

特許第３０９１９７４号葛西、Mutat. Res. 387: 147, 1997 澁谷ら、Nature 349: 431, 1991 豊國ら、Lab. Invest. 76: 365, 1997

本発明はストレスによる損傷を受けやすい遺伝子（ＤＮＡ）上の領域/部位を特定し、解析する手段を提供することを目的としており、より直接的には、検体より得られたＤＮＡ断片の集団から、損傷を受けた１またはそれ以上のヌクレオシドを含むＤＮＡ断片を選択的に収集する方法を提供することを目的としている。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究した結果、初めて、免疫沈降法により傷害されたＤＮＡ断片を選択的に収集することに成功し、本発明を完成した。
即ち、本発明は以下の通りである。
（１）ＤＮＡを含む試料中の酸化ストレスにより傷害された領域のＤＮＡ断片を収集する方法であって、試料からＤＮＡを抽出し、断片化した後、傷害により修飾された修飾ヌクレオシドまたは該修飾ヌクレオシドを含むポリヌクレオチドに特異的な一次抗体とインキュベートし、沈降した複合体を回収し、該複合体から傷害されたＤＮＡ断片を回収することを特徴とする方法。
（２）断片化により得られた修飾ヌクレオシドを含むＤＮＡ断片１個に対して抗体分子の数が５０倍以上である、（１）記載の方法。
（３）修飾ヌクレオシドが８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシン、シクロブタン型ピリミジン二量体およびアクロレイン付加２’−デオキシヌクレオシドから選択される、（１）又は（２）記載の方法。
（４）アクロレイン付加２’-デオキシヌクレオシドがアクロレイン付加２’-デオキシアデノシンである、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）抗体がモノクローナル抗体である（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法によって回収したＤＮＡ断片を臭化エチジウム法によって定量し、その多寡により当該ＤＮＡ試料の酸化ストレスによる傷害の程度を評価する方法。
（７）上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法によって回収したＤＮＡ断片をクローニングし、塩基配列を決定し、その配列情報と既知のゲノムの配列情報とを比較することにより、酸化ストレスに対して感受性の遺伝子領域を同定する方法。

本発明により、傷害されたヌクレオシドを含むＤＮＡ断片を収集することが初めて可能となった。こうして得られたＤＮＡ断片をクローニングすることにより、遺伝子上で傷害された、または傷害され易い領域を同定し、解析する手段を得ることができる。その結果、遺伝子傷害に対する防御手段の開発が可能となり、また傷害を受けやすい部位（領域）を同定することにより、該部位が癌の種類や臓器に特異的な領域であれば、それらの診断に用いることが可能となり、ＤＮＡ傷害による癌等の発症メカニズムの解明、さらには各個人の遺伝子面での特徴を把握することで将来の予防治療にも貢献しうる。

メチレンブルー処理したゲノムＤＮＡ試料より、８−ＯＨｄＧに対する抗体を使って収集したＤＮＡ断片量を示す。酸化ストレス負荷状態（Fe-NTA投与後６時間）のマウス腎より抽出したDNAより収集した8-ヒドロキシグアニン含有断片について、個々の断片のゲノム内での位置を決定した結果を示す。ラット血漿から得たＤＮＡ試料より、８−ＯＨｄＧに対する抗体を使って収集したＤＮＡ断片量を示す。ＵＶ−Ｃ処理したゲノムＤＮＡ試料より、ＣＰＤに対する抗体を使って収集したＤＮＡ断片量を示す。酸化ストレス負荷状態（Fe-NTA投与後６時間）のマウス腎より抽出したＤＮＡより、アクロレイン付加−２’−デオキシアデノシンに対する抗体を使って収集したＤＮＡ断片量を示す。

本明細書中、「修飾ヌクレオシド」とは、紫外線、放射線、化学物質等による酸化ストレスによって傷害を受けたヌクレオシドを意味し、例えば、２’−デオキシグアノシンの８位がヒドロキシル化された8-ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシン、以下、（「８−ＯＨｄＧ」とも呼称）、グアノシンの8位がニトロ化された8-ニトログアノシン、シクロブタン型ピリミジン二量体（以下、「ＣＰＤ」と呼称）、アクロレインとの反応により修飾されたヌクレオシド等を挙げることができる。
なお、シクロブタン型ピリミジン二量体（ＣＰＤ）は、紫外線によって最も高頻度に生成されるＤＮＡ傷害の一つである。また、アクロレインは膜脂質の過酸化によって生成する不飽和アルデヒドの一つであり、広く環境中に検出されると同時に、酸化ストレス下の細胞内にも認められる［内田ら（Uchida et al.）, J. Biol. Chem.273: 16058, 1998］。アクロレインは非常に反応性が高く、核酸と反応して付加物を形成するので、酸化ストレス下でヌクレオシドがアクロレインと反応して付加物を形成することが知られている。本発明は、酸化ストレス下でアクロレインと反応して修飾される任意のヌクレオシドを対象としているが、本発明方法にとって、アクロレイン付加２’-デオキシヌクレオシドが好ましく、アクロレイン付加２’−デオキシアデノシンが特に好ましい。

「修飾ヌクレオシドまたは該修飾ヌクレオシドを含むポリヌクレオチドに特異的な抗体」としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体が挙げられる。
ポリクローナル及びモノクローナル抗体の製造法は、既知である。例えば、Antibodies; A Laboratory Manual，Lane，H，D.ら編，Cold Spring Harbor Laboratory Press出版 New York 1989年、Kohlerら，Nature，256:495-497（1975）及びEur．J．Immunol．6:511-519（1976）； Milsteinら，Nature 266: 550-552（1977）；Koprowskiら、米国特許第4,172,124号）等を参照。修飾デオキシヌクレオシドに対する抗体は、適当な担体（例えば、カサガイヘモシアニン（ＫＬＨ））等）とハプテン抗原として合成修飾デオキシヌクレオシドとの複合体を免疫原ＤＮＡとし、通常の方法で製造することができる。修飾ヌクレオシドを含むポリヌクレオチド（ＤＮＡ断片）は、上記修飾デオキシヌクレオシドに対する抗体により認識される。

ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体を得るには、前記のようにして調製した免疫原ＤＮＡを用いて動物を免疫する。哺乳動物（例えばラット、マウス、ウサギ、ヒトなど）に静脈内、皮下又は腹腔内に適当量を投与することにより行う。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは２〜３週間間隔で、１〜１０回、好ましくは４〜５回である。最終の免疫日から７〜１０日後に抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血し、抗血清を得る。抗体価の測定は、酵素免疫測定法（ELISA）、放射性免疫測定法（RIA）、免疫組織染色法等により行うことができる。
抗血清から抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。

モノクローナル抗体
モノクローナル抗体を得るには、免疫原ＤＮＡを用いて動物を免疫する。免疫は、哺乳動物（例えばラット、マウスなど）に静脈内、皮下又は腹腔内に適当量を投与することにより行う。免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは２〜３週間間隔で、最低４〜５回行う。そして、最終免疫後、抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞が好ましい。

脾臓細胞等の抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合に用いるミエローマ細胞としては、マウスなどの動物由来の細胞であって一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株として、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。例えば、ミエローマ細胞の具体例としてはPSUI、P3X63−Ag、X63Ag8.653などのマウスミエローマ細胞株が挙げられる。血清を含まないDMEM、RPMI-1640培地などの動物細胞培養用培地中に、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを所定の割合（例えば３：１）で混合し、細胞融合促進剤存在の下で、あるいは電気パルス処理（例えばエレクトロポレーション）により行う。

次いで、例えばヒポキサンチン（100μm）、アミノプテリン（0.4μm）及びチミジン（16μM）を含むＨＡＴ培地を用いて培養し、生育する細胞をハイブリドーマとして得ることができる。増殖したハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かを酵素抗体法（ＥＩＡ）等でスクリーニングする。最終的に抗体産生を確認した融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行い、最終的に単クローン抗体産生細胞であるハイブリドーマを樹立する。樹立したハイブリドーマから単クローン抗体を採取するには、通常の細胞培養法等を採用することができる。抗体の精製が必要とされる場合は、硫安分画法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜に選択して、又はこれらの方法を組み合わせることにより精製することができる。

具体的には、特許文献１に記載されているように、合成８−ＯＨｄＧとＫＬＨとの複合体を免疫原としてマウスを免役し、ハイブリドーマを作製し、得られたハイブリドーマを用いて腹水を調製し、硫酸アンモニウム塩析法により分画精製する方法によって８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシンに対するマウスモノクローナル抗体（クローンＮ４５.１（日研ザイル）、以下、「Ｎ４５.１」と呼称）が得られる。
また、クロブタン型ピリミジン二量体（ＣＰＤ）に対するモノクローナル抗体としてＴＤＭ−２［森ら（Mori et al.）, Photochem Photobiol 54: 225, 1991］が知られている。さらに、８−ニトログアノシンに対する抗体も提供されている（Clone#NO2G52、同仁)。
さらに、アクロレインと２’−デオキシアデノシンとの反応物に対するモノクローナル抗体も文献既知の方法で作製できる［河井ら（Kawai et al.）, J. Biol. Chem. 278: 50346, 2003］。

＜方法＞
本発明方法の概略を、主として８−ＯＨｄＧとそのモノクローナル抗体Ｎ４５．１を用いて説明するが、当業者ならば、本発明は任意の修飾デオキシヌクレオシドまたは修飾デオキシヌクレオシドを含むＤＮＡに対する抗体を用いて実施可能であることを理解するであろう。

酸化ストレス傷害を有するＤＮＡ断片は、８−ＯＨｄＧに対するマウスモノクローナル抗体Ｎ４５．１により特異的に認識される。従って、抗原抗体複合物としてこれらを沈降させる。免疫沈降法は、特定の抗体に対応する抗原蛋白質を分離、精製するための実験技術として当該技術分野で周知である。８−ヒドロキシデオキシグアノシンを含むＤＮＡ断片は、Ｎ４５．１を用いて、後述する条件下で免疫沈降することにより、雑多なＤＮＡ断片の集団から分離することができる。

このようにして収集された、修飾デオキシヌクレオシドを含む傷害を受けたＤＮＡ断片の量の多寡は、出発物質である元のＤＮＡ断片集団の調製に供された検体が受けた酸化ストレスの程度を反映しており、本発明方法によって生体の酸化ストレスレベルを適切に評価することができる。

さらに、本発明方法によって収集されたＤＮＡ断片の各々を、適当なベクター‐宿主系によりクローニングすることができる。そのようなベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。

プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐBR322等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110等）、酵母由来のプラスミド（例えばYEp13等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（例えばλgt10等）が挙げられる。また、レトロウイルス、アデノウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルスやバキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
ベクターにＤＮＡ断片を挿入するには、まず、精製したＤＮＡ断片を適当な制限酵素酵素で切断して、ベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。

上記の組換えベクターを、ＤＮＡ断片の発現に適した宿主中に導入することにより形質転換体を得ることができる。宿主は特に限定されるものではなく、例えばエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等のEscherichia属、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）等のバチルス属の細菌、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等の酵母、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞、及びSf9、Sf21等の昆虫細胞が挙げられる。
また、組換えベクターの宿主への導入方法も当該技術分野で既知であり、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。

形質転換体の培養は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われ、それぞれの宿主に適した培地、培養条件も既知である。なお、本発明にとっては微生物宿主が適しており、そのような場合の培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、３７℃で８〜１２時間行う。

本発明におけるクローニングは市販のクローニングキットを用いても実施でき、そのようなキットとして平滑末端ＰＣＲ産物クローニングのための市販キット（インビトロジェン；Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit for Sequencing）がある。

クローニングされた個々の収集ＤＮＡ断片について塩基配列を解読して配列情報を得、ゲノムデータベースを照会することにより、全ゲノム配列中の当該傷害ＤＮＡ断片に一致する染色体の位置を決定することができる。実際には、傷害ＤＮＡ断片をマーカーとして染色体上へマッピングする。染色体上に傷害ＤＮＡの場所を位置付ける（マッピング）方法として、例えば、Celera社のゲノムデータベースより入手できる染色体上での位置座標情報をもとに分布地図を作成する方法がある。

酸化ストレスによる病態の研究では、フリーラジカル・活性酸素の標的となって傷害を受けやすい遺伝子又は遺伝子の領域を同定することが必須である。本発明の方法によって収集されたＤＮＡ断片は、そのような目的にとって極めて有用な情報を提供する。

傷害ＤＮＡの収集法
本発明の方法によるＤＮＡ断片の収集は、一般に、以下の工程は通常用いられる方法を採用しているが、目的物がＤＮＡ中に極微量（一般に出発物質としての試料ＤＮＡの量の１００分の１〜１,０００分の１程度）しか存在しない傷害ＤＮＡであることから、後述の特別な処置を採用し、初めて傷害ＤＮＡの収集に成功した。

Ａ）試料ＤＮＡの調製
検体としては、培養細胞、実験動物の組織細胞、人体から採取した血液などＤＮＡを含有するあらゆる試料を使うことが可能である。検体からのＤＮＡの調製は、通常の方法で行うことができるが、その過程で人為的にＤＮＡ（デオキシヌクレオシド）が修飾されない条件を選択する必要がある。例えば、８−ヒドロキシデオキシグアノシンの生成を極少量に抑制するためには、ＤＮＡの精製操作として、フェノール等の有機溶媒を使用した除蛋白処理を適用することができない。従って、カオトロピック剤（ヨウ化ナトリウムなど）を添加し、ＤＮＡと蛋白質の共沈現象を抑制することにより、フェノール処理を省略する方法が有効である。

Ｂ）ＤＮＡの断片化
検体から得たＤＮＡを制限酵素処理により断片化する。酵素消化後のＤＮＡ断片の平均長が、１，０００塩基程度となるように、使用する制限酵素の種類を選択する。そのような制限酵素は対象（動物、植物、組織など）により異なるが、例えば、制限酵素HaeIII（認識塩基配列：ＧＧ↓ＣＣ）は上記要件を満たしている。この制限酵素処理の場合、人為産物としての修飾ＤＮＡ（例、８−ＯＨｄＧ）の生成をより少なくするため、制限酵素反応の時間は必要最小限（１時間）に抑える。制限酵素反応の溶媒、温度等は使用する制限酵素により異なる。１時間で完全に試料ＤＮＡを消化するために、可能な限り多くの制限酵素を反応系に添加することが望ましい。

Ｃ）免疫沈降
免疫沈降反応は以下の方法で行うことができる。本発明の対象である修飾デオキシヌクレオシドを含む傷害ＤＮＡ断片を効率よく沈降させるために、抗体が抗原と安定的に複合物を形成し、沈降する条件を選択した。
（１）抗原‐抗体反応
ＤＮＡ断片の雑多な集団から例えば８−ＯＨｄＧを含む断片だけを分離する。適当な容量のＰＢＳ（リン酸緩衝生理的食塩水、pＨ７.４）に、断片化したＤＮＡとモノクローナル抗体（Ｎ４５．１）を添加する。使用する抗体量は、ＤＮＡ量とそれに含まれる８−ＯＨｄＧ量（予想値）に依存するが、抗体分子がＤＮＡ分子に対して過剰になるように加える。ＤＮＡ断片１個（１分子）に対して抗体分子が約５０倍以上、好ましくは３００倍以上、より好ましくは６２５倍以上になるように調整する。ＤＮＡ断片に対する抗体分子の上限は当業者が目的や使用する反応系に応じて適宜決定することができる。一般に、生理的条件下にある哺乳動物の組織細胞より抽出したゲノムＤＮＡを平均１ｋｂ長に断片化したものを試料とする場合、抗体と断片化ＤＮＡの重量比は０.０８：１、好ましくは０.４８：１、最も好ましくは約１：１である。ＤＮＡと抗体を試験管内で緩衝液、例えばＰＢＳ中、濃度０.０１〜０.０５μｇ/μｌ、好ましくは０.０１〜０.０２μｇ/μｌで混合し、これを鉛直面にて回転し、各成分を混和させる。この混和操作は低温（４℃）で行い、１〜３時間続ける。

（２）ビーズへの結合反応
抗原‐抗体複合体を沈降させる担体として、例えば、マウス免疫グロブリンＧに親和性をもつ分子をその表面に結合したビーズ粒子を、（１）で得られた混和液に添加する。このような担体粒子として、Protein AまたはProtein Gを結合させたセファロースおよびアガロースのビーズ、マウス免疫グロブリンＧに対する他の動物由来の抗体を結合させた磁気ビーズ（例、Dynabeads)などが利用可能である。ビーズの添加後、さらに１〜３時間、４℃で混和操作を続ける。

（３）収集した傷害ＤＮＡの分離
ＰＢＳを界面活性剤を含む洗浄バッファーと交換し、新しいバッファーと混和させることによりビーズを洗浄する。この操作を５回以上繰り返す。洗い終わったビーズを溶出バッファー中、６５℃で１０〜３０分加熱する。ビーズ粒子から収集ＤＮＡが遊離するので、溶液成分だけを遠心分離やマグネットを使う方法等によって回収する。

Ｄ）収集した傷害ＤＮＡの精製
上記Ｂ）で得た回収溶液には、ＤＮＡとともに抗体や制限酵素などの蛋白質が残存している。蛋白成分を除去するために、ＴＥバッファー中で、蛋白分解酵素Proteinase Kを３７℃、１時間作用させる。さらに、常法に従い、フェノール‐クロロフォルム抽出、エタノール沈殿を行い、傷害ＤＮＡを精製・濃縮する。

Ｅ）収集した傷害ＤＮＡの定量
本発明の方法によって収集した修飾デオキシヌクレオシド（例、８−ＯＨｄＧ）を含む傷害ＤＮＡ断片量の多寡を調べるには、下記の方法を用いる。
一般に、酸化ストレスで傷害されるＤＮＡ断片量は少量であり、本発明の方法によっても収集されるＤＮＡ断片の量は極めて微量である（出発物質としての試料ＤＮＡの量の約１００分の１〜１,０００分の１程度）。哺乳動物細胞のゲノムＤＮＡにおける８−ヒドロキシデオキシグアノシンの残存レベルは、およそ１００万グアニンにつき１個のオーダーである。そのため、通常ＤＮＡの定量に使われる分光光度計による測定法は、検出限界濃度以下となるため適用することができない。本発明者らは、臭化エチジウムを使って、微量のＤＮＡを検出・定量することに成功した。定量の手順は以下の通りである。濃度既知の標準ＤＮＡ溶液と収集した傷害ＤＮＡ断片溶液をそれぞれ適量の臭化エチジウムと混合する。ＤＮＡ‐臭化エチジウムの混合液を液滴として紫外線照射装置の上に並べ、紫外線照射による蛍光の強度を標準液と試料液で比較して、目的の傷害ＤＮＡ含有量を定める。

Ｆ）収集した傷害ＤＮＡのマッピング
本発明の方法によって得られる傷害を受けたＤＮＡ断片の収集液中に含まれている個々のＤＮＡ断片について、全ゲノム配列における当該断片の由来場所を同定するには、例えば以下の方法で行う。
まず、適当なベクター‐宿主系で収集した傷害ＤＮＡを、例えば上記の方法でクローニングし、断片集団を別々のクローンとして分離する。次に、各クローンについて、その塩基配列（の一部）を決定する。この配列をもとに、公開されているゲノムデータベースを検索し、染色体上で、当該ＤＮＡ断片と一致する配列を有する部位、その周辺の詳細なゲノム情報を得ることができる。本解析法によれば、酸化ストレスによるＤＮＡ傷害の残存部位を全ゲノムにわたって網羅的に同定することが可能となる。

本発明は、免疫沈降法と修飾デオキシヌクレオシド（例、８−ＯＨｄＧ）に対するモノクローナル抗体とを組合わせ、最適な条件を設定することにより、初めてゲノムＤＮＡに存在する極微量の傷害ＤＮＡ断片を選択的に単離し、同定する方法を提供するものである。
ここで、「最適な条件」は以下の点に基づいて決定することができる。
（ａ）免疫沈降に際して、断片化ＤＮＡ集団中に含まれる傷害されたＤＮＡ断片を効率よく認識し複合体を形成するよう、抗体の量を上記のごとく調整する。
（ｂ）また、抗体と担体ビーズの量が一致するよう、それぞれの添加量を調整する。ＤＮＡ断片も担体ビーズに非特異的に吸着するが、目的とする傷害ＤＮＡ断片の含有割合が極めて低いため、ビーズ１個に対して抗体（分子）の数が少ないと、非特異的吸着の影響が無視できない。逆に抗体が多すぎると、目的断片と抗体の複合体のうちビーズと結合できないものがあらわれ、それらは洗い流されてしまうことになるので、回収量がさらに少なくなる。
（ｃ）抗原−抗体複合体の沈殿後、徹底的に洗浄する。
抗原−抗体反応せずに非特異的にビーズに付着または近接している非目的断片を完全に除去するために洗浄操作を徹底した。界面活性剤の組成を変えた４種類のバッファーを使い、計８回の洗浄を行った。
（ｄ）微少な回収ＤＮＡを定量するために特別な検出法を使用する。
通常、ＤＮＡの定量は、核酸の吸光特性を利用して、分光光度計により行うが、傷害ＤＮＡの量は通常の分光光度計の検出感度以下であるため、臭化エチジウムと混ぜた液滴の蛍光シグナル強度により定量する。
（e）操作中にグアニンが修飾を受けて８−ヒドロキシグアニンが生成しないよう、断片を分離するまでは、遮光、遮酸素および低温（氷上）の状態に維持する。また、フリーラジカル反応の起点となる鉄イオンをキレート剤デスフェリオキサミンで除去する。

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
実施例１マウスゲノムＤＮＡ断片集団からの８−ヒドロキシデオキシグアノシン含有断片の収集
（１）試料ＤＮＡの調製
ゲノムＤＮＡをマウス（１６週齢、雄性Ｃ５７ＢＬ／６）の腎組織より調製した。組織細胞からのＤＮＡ抽出は、よう化ナトリウム法［ワンら（Wang et al.）, Nucleic Acids Res. 22: 1774, 1994］のための市販試薬キット（和光純薬工業；ＤＮＡ Extractor WB Kit）を用い、添付の指示書に従い、実施した。なお、抽出過程における８−ヒドロキシグアニン（即ち、修飾デオキシヌクレオシドとしては８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシン）の新たな生成を抑えるため、抽出操作中は、できるかぎり、試料を低温（氷上）および遮光の状態に保った。また、緩衝液類はアルゴンガスで飽和し、触媒性鉄を不活性化するために0.1ｍＭデスフェリオキサミン(desferrioxamine)を添加した。

（２）ＤＮＡの断片化
上記（１）で得られたマウスゲノムＤＮＡを、10ｍＭ Tris-HCl (pH 7.5)、10mM MgCl2、1 mM ジチオスレイトール及び50mM NaCl中、３７℃で制限酵素HaeIIIにより切断処理し、断片化した。酵素反応時間１時間で完全に切断できるように、反応系を調節した。

（３）８−ヒドロキシデオキシグアノシンの導入
本発明の方法によって収集されたＤＮＡ断片の量の多寡が、元のＤＮＡ断片集団における８−ヒドロキシデオキシグアノシンの含有量を反映することを確認するため、組織から抽出したゲノムＤＮＡに人為的に８−ヒドロキシデオキシグアノシンを導入し、８−ヒドロキシデオキシグアノシンの含有量がそれぞれ異なる試料を準備した。ＤＮＡをメチレンブルーと光で処理することにより、ＤＮＡ中のグアニンを８−ヒドロキシデオキシグアノシンに人工的に変化させることができる。哺乳動物細胞のゲノムＤＮＡにおける８−ヒドロキシデオキシグアノシンの残存レベルは、通常、およそ１００万グアニンにつき１個のオーダーである。同ゲノムＤＮＡをメチレンブルーで処理すれば、最高で対グアニン比２％のレベルまで８−ヒドロキシデオキシグアノシンを増加させることができる［シュナイダーら（Schneider et al.）, Nucleic Acids Res. 18: 631-635, 1990］。９６穴マイクロタイターのウェルに１００μｇ／ｍｌＤＮＡ、５〜５０μＭメチレンブルー、0.1 ｍＭデスフェリオキサミン、１０ｍＭ Tris（pH 8.0）からなる反応系を設定した。マイクロタイター・プレートから１２ｃｍ上に６０Ｗ電球を設置し、３０分間の光照射により反応を促した。本処理後のゲノムＤＮＡの８−ヒドロキシデオキシグアノシン含有量をHPLC-ECD法により実測した。結果を表１に示す。

表１：メチレンブルーと光により処理したゲノムＤＮＡの８−ＯＨｄＧ含有量

（４）免疫沈降
１．５ｍｌチューブに０.１％のウシ血漿アルブミンを含むＰＢＳを分注し、（３）で調製した断片化ゲノムＤＮＡ（２０μｇ）と一次抗体（モノクローナル抗体Ｎ４５．１、日研ザイル）（２０μｇ）を加えた。最初に入れておくＰＢＳの量は、混合系全体の容量が９００μｌとなるように調整した。このチューブを低温室（４℃）においてロータリーシェーカーを用いて３時間撹拌した。沈降用の担体として、Ｄｙｎａｌ社製の二次抗体（Sheep anti-Mouse IgG結合済み磁気ビーズ（Dynabeads M-280）を使用した。磁気ビーズ懸濁液（０.１％のウシ血漿アルブミンを含むＰＢＳ中）（１００μｌ）を混合系に追加した後、さらに３時間、低温でのロータリーシェーカーによる撹拌操作を継続した。結合反応の終了後、ビーズを４種類のバッファーを用いて順次洗浄した。

各バッファーの組成は次の通りである：
１．可溶化バッファー（140mM NaCl）；0.1% デオキシコール酸ナトリウム，1mM EDTA，50mM Hepes-KOH（pH7.5），140mM NaCl，1% TritonX-100
２．可溶化バッファー（500mM NaCl）；0.1% デオキシコール酸ナトリウム，1mM EDTA，50mM Hepes-KOH（pH7.5），500mM NaCl，1% TritonX-100
３．洗浄バッファー；0.1% デオキシコール酸ナトリウム，1mM EDTA，250mM LiCl，0.5% Nonidet P-40，10mM Tris-HCl（pH8.0）

４．ＴＥバッファー
上記１〜４の順に、各バッファーにつき２回ずつ洗浄を実施した。洗浄後、８０μｌの溶出バッファー（10mM EDTA，1% SDS，50mM Tris-HCl（pH8.0））にビーズを懸濁した。６５℃、１５分間の加熱処理により収集したＤＮＡ断片を溶離させた。次いで、マグネットを使って溶液成分からビーズを分離した。溶出バッファーの追加→加熱→分離の操作をもう一度繰り返した。

（５）収集ＤＮＡの精製
上記（４）の最終回収物をProteinase K（Invitrogen）で３７℃、１時間処理した後、フェノール‐クロロフォルム抽出およびエタノール沈殿によるＤＮＡの精製・濃縮操作を定法に従って実施した。

（６）結果
免疫沈降に供する初期ＤＮＡ断片を０，５，１０，５０μＭのメチレンブルーで処理して人為的に傷害を起こした場合の結果を図１に示す。図の縦軸は、段階的に８−ＯＨｄＧの含有量を増加させたＤＮＡ試料から、本発明の方法によって収集した傷害ＤＮＡ断片の量を表している。この結果は、収集した傷害を受けたＤＮＡ断片の量は、出発物質であるＤＮＡ試料の８‐ヒドロキシデオキシグアノシン量に依存することを示している。

実施例２鉄ニトリロ三酢酸（Ｆｅ−ＮＴＡ）による酸化ストレス負荷状態でのゲノム内８−ヒドロキシグアニン分布の解析
（１）実験動物に対する酸化ストレスの人為的負荷
鉄ニトリロ三酢酸（以下、Ｆｅ−ＮＴＡと記す）を酸化ストレス負荷剤として使用した。この生体傷害物質を齧歯類の腹腔内に投与すると、腎臓特異的に酸化ストレスが発生する［豊國ら（Toyokuni et al.）, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2616, 1994］。１２〜１３週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、マウスｋｇ体重あたり鉄３ｍｇ相当量のＦｅ−ＮＴＡを投与した。臓器試料は、投与６時間後にマウスを屠殺し、摘出した。

（２）酸化ストレス傷害ＤＮＡ断片の収集
腎組織からのＤＮＡ抽出とその断片化、およびそれに続く８−ヒドロキシグアニン含有断片の収集・精製は、実施例１に記載した通りに実施した。但し、次の（３）の手順で使用するＤＮＡクローニングキットへの適用要件に適合するために、収集したＤＮＡ断片の精製操作の前に、当該ＤＮＡ断片の５’末端リン酸基を除去するアルカリフォスターゼ処理を追加した。即ち、収集したＤＮＡ断片を、ウシ小腸アルカリフォスファターゼ（タカラバイオ）で５０℃、３０分間処理した。

（３）ＤＮＡ断片のクローニング
収集したＤＮＡ断片のクローニングには、平滑末端ＰＣＲ産物クローニングのための市販キット（インビトロジェン；Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit for Sequencing）を用いた。キットに添付の指示書に従って収集ＤＮＡ断片をプラスミドベクター（pCR4Blunt-TOPO）に組み込み、大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体を寒天プレート上で培養した。これを収集断片クローンのライブラリーとした。

（４）ＤＮＡ断片の塩基配列決定
上記（３）の寒天プレートより大腸菌コロニーを順次拾い上げ、オートシークエンサー（ABI PRISM377）を用いてＤＮＡ断片クローンの塩基配列決定を網羅的に実施した。

（５）マウスゲノム・データベースの検索
上記（３）で得られた塩基配列を検索の条件として、Celera社データベース（Celera Discovery System）のBLAST検索を実施した。検索結果から、該ＤＮＡ断片の一致するゲノム部位について染色体上での位置情報および付近０.５Ｍｂ範囲の塩基配列データと遺伝子リストを取得した。これらの個々の解析情報を、酸化ストレス負荷状態（Ｆｅ−ＮＴＡ投与後６時間）および無処置状態の検体より収集したＤＮＡ断片について集積し、それぞれの状態における８−ヒドロキシグアニン残存点の染色体へのマッピングならびに８−ヒドロキシグアニン集中部位周辺の特性分析を実施した。解析結果として、酸化ストレス負荷状態における８‐ヒドロキシグアニン残存点のマッピング結果を図２に示す。図中の黒い四角で示した点は染色体上での各収集断片の由来位置を表している。

実施例３ラット血漿中のＤＮＡからの酸化ストレスによる傷害ＤＮＡ断片の収集
（１）血漿からのＤＮＡ抽出
１１週令のＷｉｓｔａｒラットに、ラットｋｇ体重あたり鉄１０ｍｇ相当量のＦｅ−ＮＴＡを腹腔内投与し、腎臓における酸化ストレス傷害を惹起した。２４時間経過後、眼窩静脈叢採血法により、５〜７ｍｌのラット血液を採取した。遠心分離後、血漿成分を試料として回収した。血漿からのＤＮＡ抽出は、実施例１と同様、よう化ナトリウム法による市販キットを用いて実施した。

血漿におけるＤＮＡ含有量は、実施例の１および２で使用した腎組織と比べて極めて少ない。ラット１匹から採った血液（５〜７ｍｌ）より得られたＤＮＡの量は以下の表２に記載の通りである。

※Ｆｅ−ＮＴＡ投与の条件下では、傷害組織において多数の細胞が壊死あるいはアポトーシスに陥るため、血漿中のＤＮＡレベルが上昇する。

（２）酸化ストレス傷害断片の収集
上記（１）で得た血漿ＤＮＡを、実施例１に記載の方法と同様に断片化し、免疫沈降により８−ヒドロキシデオキシグアノシン含有ＤＮＡ断片を収集・精製した。但し、免疫沈降に供する初期ＤＮＡ量は１.５μｇとした。無処置条件の試料については３匹分の抽出ＤＮＡを合わせたものから、１.５μｇのＤＮＡを用いた。この初期ＤＮＡ量は、実施例１のときの量の約１３分の１である。

（３）結果
ラット血漿中のＤＮＡから、本発明の方法によって８−ヒドロキシデオキシグアノシン含有断片を収集した結果を図３に示す。この結果から、Ｆｅ−ＮＴＡ投与により酸化ストレスを負荷したラットのほうが無処置のラットよりも、その血漿中のＤＮＡにおいて８−ヒドロキシデオキシグアノシンの含有量が高くなっていることがうかがえる。すなわち、本発明方法によれば、生体全体での酸化ストレスの程度は、直接傷害を受けた組織から抽出したＤＮＡを用いなくても、血漿から得られるＤＮＡを用いて評価することができることが明らかになった。

実施例４別種の酸化的ＤＮＡ傷害を含有する断片の収集（１）
（１）シクロブタン型ピリミジン二量体
一般に紫外線照射も酸化ストレスの一つと考えられており、シクロブタン型ピリミジン二量体（ＣＰＤ）は、紫外線によって最も高頻度に生成されるＤＮＡ傷害の一つである。ＴＤＭ−２［森ら（Mori et al.）, Photochem Photobiol 54: 225, 1991］は、ＣＰＤに対するモノクローナル抗体である。

（２）ゲノムＤＮＡ断片集団の調製
実施例１と同様にして制限酵素ＨａｅＩＩＩによって切断された、マウスゲノムＤＮＡを調製した。

（３）紫外線処理
組織から抽出したＤＮＡにＵＶＣ（２５４ｎｍ）を照射し、人為的にＣＰＤをＤＮＡ断片中に導入した試料を作成した。９６穴マイクロタイターのウェルに分注した１００μｇ／ｍｌのＤＮＡ溶液に対し、ＵＶクロスリンカー（SPECTROLINKER XL-100）を用いて２５４ｎｍＵＶＣを照射した。

（４）免疫沈降
実施例１と同手順の免疫沈降において、一次抗体としてＴＤＭ−２、２０μｇを使用した。

（５）結果
本発明の方法によって、ＣＰＤを含有するＤＮＡ断片を収集した結果を図４に示す。この結果から、収集ＤＮＡ断片の量は紫外線照射量に依存していることが分かる。

実施例５別種の酸化的ＤＮＡ傷害を含有する断片の収集（２）
（１）アクロレイン（Acrolein）
酸化的な傷害は、脂質の過酸化も含まれる。アクロレインは、膜脂質の過酸化によって生成する不飽和アルデヒドのひとつであり、酸化ストレス下の細胞内にも認められる（内田ら、前掲）。アクロレインは、核酸と反応して付加物を形成する。mAb21は、アクロレインと２’−デオキシアデノシンとの反応物に対するモノクローナル抗体である（河井ら、前掲）。

（２）腎組織からのＤＮＡ抽出
１２週齢および１７週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス１匹ずつに、マウスｋｇ体重あたり鉄３ｍｇ相当量のＦｅ−ＮＴＡを投与した。臓器試料は、投与６時間後にマウスを屠殺し、摘出した。対照のために、同じ週齢の無処置のマウスからも試料を採取した。実施例１と同様に、よう化ナトリウム法によるキットを用いて、腎組織からゲノムＤＮＡを抽出した。

（３）酸化ストレス傷害断片の収集
腎ゲノムＤＮＡを、実施例１に記載の方法と同様に断片化した。さらに、実施例１の手順に準じて、免疫沈降によるアクロレイン付加断片の収集及び精製を実施した。但し、一次抗体としてアクロレインと２’−デオキシアデノシンとの反応物に対するモノクローナル抗体（mAb21）２μｇを使用した。

（４）結果
本発明の方法によって、アクロレインの付加したＤＮＡ断片を収集した結果を、図５に示す。１２週齢のマウスのゲノムＤＮＡからは免疫沈降を２度行い、１７週齢のマウスから得たデータも含めた、これら３点を１群として、収集ＤＮＡ量の統計的な有意差を検討した（ｐ＝０．０１３２）。この結果から、Ｆｅ−ＮＴＡ投与により酸化ストレスを負荷したマウスの方が、無処置のマウスよりも、腎ゲノムＤＮＡにおけるアクロレインの付加量が高くなっていると考えられる。実施例４、５により、酸化的ＤＮＡ傷害に特異的に結合する抗体一般に対して、本発明の方法が適用可能であることが示された。

酸化ストレスに曝されて傷害されたＤＮＡ断片を特異的に収集することにより、その傷害されたＤＮＡの配列情報を用いて、傷害を受けやすいゲノム上の場所（あるいは遺伝子）を検索することが可能となる。傷害を受けやすい遺伝子とは、変異しやすい遺伝子の候補であり、そのような情報は、例えば、発がんの最も初期の段階に対する知見を与える。よって、最終的には、がん予防手段の確立において必須となる情報を導きだすための基礎情報として利用し得る。
また、血清あるいは血漿内には、破壊された細胞のＤＮＡが微量ながら存在することがわかっており、臓器によって、傷害を受けやすいゲノム部位が異なれば、少量の血液から、体内のどの臓器において、活性酸素が発生し酸化ストレスに曝されているかを簡単に判定することが可能となる（例えば実施例３参照）。

Claims

ＤＮＡを含む試料中の酸化ストレスにより傷害された領域のＤＮＡ断片を収集する方法であって、試料からＤＮＡを抽出し、断片化した後、傷害により修飾された修飾ヌクレオシドまたは該修飾ヌクレオシドを含むポリヌクレオチドに特異的な一次抗体とインキュベートし、沈降した複合体を回収し、該複合体から傷害されたＤＮＡ断片を回収することを特徴とする方法。
断片化により得られた修飾ヌクレオシドを含むＤＮＡ断片１個に対して抗体分子の数が５０倍以上である、請求項１記載の方法。
修飾ヌクレオシドが８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシン、シクロブタン型ピリミジン二量体およびアクロレイン付加２’-デオキシヌクレオシドから選択される、請求項１又は２記載の方法。
アクロレイン付加２’-デオキシヌクレオシドがアクロレイン付加２’-デオキシアデノシンである、請求項３記載の方法。
抗体がモノクローナル抗体である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
請求項１〜５のいずれかに記載の方法によって回収したＤＮＡ断片を臭化エチジウム法によって定量し、その多寡により当該ＤＮＡ試料の酸化ストレスによる傷害の程度を評価する方法。
請求項１〜５のいずれかに記載の方法によって回収したＤＮＡ断片をクローニングし、塩基配列を決定し、その配列情報と既知のゲノムの配列情報とを比較することにより、酸化ストレスに対して感受性の遺伝子領域を同定する方法。