CN108530539B - 一组识别dna受紫外线照射造成的嘧啶二聚体的抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一组对于特异性识别DNA链受紫外线照射造成的嘧啶二聚体的抗体，所述的抗体的轻链可变区基础氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述抗体的重链可变区基础氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的抗体的轻链可变区为：在所述的轻链可变区基础氨基酸序列上，包含至少一个如下突变：S26N、L88Q、Q95L；所述的抗体的重链可变区为：在所述的重链可变区基础氨基酸序列上，包含至少一个如下突变：V73D、T74P、T97A。

Description

一组识别DNA受紫外线照射造成的嘧啶二聚体的抗体
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体而言，涉及一组识别DNA受紫外线照射造成的嘧啶二聚体的抗体。
背景技术
DNA蕴藏着生物体赖以生存和繁衍的遗传信息。在细胞分裂过程中，DNA通过精确地复制将遗传信息传给下一代，因此保持DNA分子的完整性以及复制的高忠实性对细胞是至关重要的。但是，生物体细胞中的DNA无时无刻都在产生损伤，外界环境以及来自生物体内部的因素都可能造成DNA分子的损伤和改变。如果这些损伤不能被及时修复，会对细胞的功能甚至生存造成影响。如果这些损伤发生在生物体的生殖细胞，还有可能会影响到后代。因此在进化过程中生物体获了一套非常精致的修复细胞中DNA损伤的系统，该系统保证了生物体基因组的完整性和正常功能[1]。
造成DNA损伤的来源主要分为两类：一类是内源性损伤因素，包括细胞代谢产物，如活性氧物质(reactive oxygen species，ROS)的攻击；DNA的自发损伤，如碱基丢失、碱基脱氨和DNA复制错误等。另一类是外源性损伤因素，包括照射(UV照射、X射线和伽马射线等)、水解或热稳定性的破坏、某些植物毒素、人造的化学突变剂，致癌物和病毒等[2]。在外源和內源因素的双重压力下，平均每天，每个细胞中会发生1万～1百万个损伤[3]。然而这在庞大的人类基因组(约6亿个碱基)中，只占0.000165％，某些关键基因(例如抑癌基因)上未修复的损伤会阻碍细胞执行它的正常功能，并且很大程度地增加了肿瘤生成的可能性或造成肿瘤的异质性。常见的DNA损伤类型有碱基的插入、缺失和替换(点突变)、碱基修饰(脱氨基、化学修饰、光损伤等)、碱基错配、DNA复制错误、倒位或转位、单链或双链断裂和链间交联等。
光损伤指的是细胞受到紫外线照射后，核酸吸收紫外线的能量会产生一些化学变化而形成光损伤物质。根据波长可将紫外线光谱分为三个部分：UV-A(320-400nm)、UV-B(295-320nm)和UV-C(100-295)。其中，UV-A穿透能力最强，但能量较小，极少会造成DNA损伤，而UV-C虽然能量较高，但在地球表面被完全吸收，所以生物体在自然界中并没有受到这一部分波长紫外的照射。因此，自然光照中，对生物体造成较多DNA损伤的主要是UV-B[4]。最常见的一种光产物(尤其在100-295nm波长的UV-C照射下)就是在一条DNA链上的两个相邻的嘧啶碱基之间产生了一条共价键，形成嘧啶二聚体(pyrimidine dimers)(图1.19)[5,6]。主要的嘧啶二聚体包括两种，一种为环丁烷嘧啶二聚体(cyclobutane pyrimidinedimers，CPDs)，一种为(6-4)光产物((6-4)photoproducts，6-4PPs)[7,8]。其中，(6-4)光产物在持续的313nm的紫外照射下会转换成它的同分异构体Dewar式光产物(Dewarphotoproducts，Dewar PP)[9]。除了嘧啶二聚体，近年来，研究人员还发现一些新的光产物，如5甲基胞嘧啶或5甲基腺嘌呤[10]。
常用的DNA损伤检测方法主要由间接检测方法：包括单细胞电泳(single-cellgel electrophoresis，又称彗星实验)、脉冲场凝胶电泳(Pulsed Field GelElectrophoresis，PFGE)、-H2AX foci分析、色谱鉴定等方法，以及直接使用结合损伤的碱基复合物如嘧啶二聚体(CPD、6-4PPs或Dewar式光产物)的抗体检测DNA损伤的直接检测方法，与间接检测相比，直接检测所需要样本量较少，而且也是最直观的检测方法。
虽然DNA损伤检测抗体在使用上具有上述的优势，但目前，高质量的检测DNA损伤的抗体极为罕见。比如，目前最为广泛使用的抗6-4PPs抗体64M-2对6-4PPs的结合灵敏度不够高。64M-2是1991年，由日本的Toshi Mori等人从杂交瘤中获得的抗体，能够特异性识别由UV照射造成的6-4PPs[12]。该抗体也是目前研究6-4PPs中应用最为广泛的一株抗体。根据以往的研究，64M-2最低可以检测到5J/m2的UVC造成的6-4PPs，而5J/m2对于细胞来说，是一个非常大的剂量[13]，超过生理水平的UV照射剂量。因此，以往的研究几乎都是以大剂量UV对细胞或组织进行照射，再进行后续的检测，这对于研究机体生理水平产生的6-4PP及了解其修复过程是不够准确的。显然，各种DNA损伤和修复的研究及临床应用急需高质量的DNA损伤抗体。
发明内容
本发明首先涉及一组对于特异性识别DNA受紫外线照射受造成的嘧啶二聚体的抗体，所述的抗体的轻链可变区基础氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述抗体的重链可变区基础氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其特征在于，
所述的抗体的轻链可变区为：在所述的轻链可变区基础氨基酸序列上，包含至少一个如下突变：S26N、L88Q、Q95L；
所述的抗体的重链可变区为：在所述的重链可变区基础氨基酸序列上，包含至少一个如下突变：V73D、T74P、T97A。
SEQ ID NO.1：
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSLVPTFGGGTKLEIK；
SEQ ID NO.2：
EVQLQQSGTVLARPGASVKMSCKASGYSFTSFWMHWVKQRPGQGLEWIGTIYPGNSDTSYNQKFKGKAKLTAVTSASTAYMEVSSLTNEDSAVYYCTRRSGYKYYALDYWGQGTSVTVSS。
优选的，所述的抗体的轻链可变区为：在所述的轻链可变区基础氨基酸序列上，至少包含S26N、L88Q、Q95L三个突变，同时包含任意数量的如下突变：N33D、N35I、L98R、L98M；
优选的，所述的抗体的重链可变区为：在所述的重链可变区基础氨基酸序列上，至少包含V73D、T97A两个突变，同时包含任意数量的如下突变：A12V、F32S/L、R40S、Y52H、D57G、D57N/Y/G、A72T、T74P、Y109S、Y109H/N。
最优选的，所述的抗体的轻链可变区为：在所述的轻链可变区基础氨基酸序列上，包含S26N、N33D、N35I、L88Q、Q95L、L98R六个突变；
最优选的，所述的抗体的重链可变区为：在所述的重链可变区基础氨基酸序列上，包含Y52H、D57G、V73D、T97A四个突变；
或Y52H、D57G、V73D、T97A、Y109S五个突变；
或A12V、Y52H、D57G、A72T、V73D、T97A六个突变。
所述的嘧啶二聚体为(6-4)光产物(6-4PPs)。
本发明还涉及所述的抗体在识别DNA受紫外线照射造成的嘧啶二聚体中的应用。
所述的抗体的Fc区优选为人或鼠IgG的Fc区。
本发明还涉及所述的抗体在制备鉴定生物体因紫外线照射导致的损伤的试剂盒中的应用，所述的生物体包括但不限于，病毒、支原体、细菌、真菌、单细胞真核生物、多细胞真核生物。
本发明还涉及所述的抗体在制备与DNA受紫外线照射引起的损伤相关的疾病的诊断试剂盒中的应用，所述疾病包括但不限于，皮肤衰老、皮肤癌、以及由紫外线照射导致的视网膜病变或癌变。所述的皮肤癌症优选为黑色素瘤。
附图说明
图1、嘧啶二聚体的形成，DNA链上两个相邻的嘧啶(以T和C为例)在紫外线照射下会在两个嘧啶之间形成新的共价键从而形成嘧啶二聚体，主要包含环丁烷嘧啶二聚体(CPD)和6-4光产物(6-4PP)，其中6-4光产物在313nm照射下还可能形成它的同分异构体Dewar光产物[11]。
图2、6-4PP探针的分离纯化及鉴定，图2A为使用高效液相色谱(HPLC)对6-4PP探针进行分离纯化的各物质峰吸收图，其中可以同时监测到260nm和325nm(6-4PPs产物的特征吸收波长)吸收峰的则为带有6-4PP产物的探针。图2B为使用质谱对从HPLC中纯化回收的样品进行鉴定，其中荷质比(m/z)从545.1484迁移到432.1408是T(6-4)T产物在进行二级质谱时特有的。
图3、64M-2ccFv与长链抗原和短链探针的结合情况及抗体筛选策略，(3A)64M-2与长链或短链探针结合的情况，其中anti-digoxigenin为抗-地高辛抗体，作为阴性对照抗体，横坐标表示抗体与探针的结合能力，纵坐标为抗体重链展示的情况。(3B)为抗体筛选的基本策略，包括：一级突变库的构建、流式筛选富集目的克隆、克隆的鉴定、二级抗体突变库的建立、流式筛选富集(有竞争和非竞争两种)目的克隆、克隆鉴定及检测。
图4、原始抗体库的分选和分析，(4A)为原始抗体库经四轮分选的流式检测结果，empty plasmids指转入的是空质粒，即不表达任何抗体的原生质体；anti-digoxigenin表示展示抗-地高辛抗体的原生质体，与转入空质粒的原生质体共同作为阴性对照；64M-2即为野生型抗体，Sort 0～Sort 4是从原始突变库开始，在四轮分选中，每一轮回收抗体基因重新构建的小库。(4B)为从Sort 4中随机挑选50个VH克隆和50个VL克隆进行测序后得到的突变热点发生的频率(横坐标表示突变氨基酸所在的位置，纵坐标表示突变发生的频率)。(4C)为分选得到的四种突变体与探针结合能力的检测，右上角的数字表示与探针结合的原生质体占所有原生质体总数的百分比。
图5、H43-L4克隆的特异性检测，图中anti-digoxigenin表示展示抗-地高辛抗体的原生质体，与转入空质粒的原生质体共同作为阴性对照；64M-2即为野生型抗体。(5A)为用流式分析H43-L4与不同的长链探针(1μg/mL)结合的情况；(5B)为用流式分析H43-L4与短链纯化探针(10ng/mL)结合的情况。所有探针序列见表1。
图6、H43-L4抗体突变库的非竞争筛选与突变热点分析，(6A)为用Sh-probe1(10ng/mL)作为抗原，对H43-L4进行的流式分选，(6B)为从Sort 5中随机挑取50个重链克隆和50个轻链克隆进行测序后，对突变热点进行的统计，横坐标表示突变氨基酸所在的位置，纵坐标表示突变发生的频率。
图7、H43-L4突变的竞争筛选与突变热点分析，(7A)为用Sh-probe1(10ng/mL)作为抗原，用Sh-probe3(400ng/mL)作为竞争抗原对H43-L4的Sort 2亚库进行的竞争筛选。(7B)为从Sort 2-5中随机挑取50个重链克隆和50个轻链克隆进行测序后，对突变热点进行的统计，横坐标表示突变氨基酸所在的位置，纵坐标表示突变发生的频率。
图8、筛选到的重组克隆与抗原的结合情况，图中上面一排是流式检测四种重组克隆与Sh-probe1(10ng/mL)的结合情况；下面一排是四种克隆在用Sh-probe1标记后，再用40倍浓度的竞争抗原Sh-probe3竞争标记，最终得到的流式检测结果。
图9、9c3抗体与不同短链/长链抗原结合的特异性，(9A)是9c3抗体与不同短链探针的结合情况。(9B)是9c3抗体与不同长链探针的结合情况。其中，anti-digoxigenin为阴性对照抗体，所有探针的序列见表1。
图10、64M-2、64M-5和9c3抗体对不同碱基侧链的抗原的结合情况，(10A)是三种抗体与含有不同侧链碱基的长链探针的结合情况。(10B)为三种抗体与含有不同侧链碱基的短链纯化探针的结合情况。其中，不同短链或长链探针的具体序列见表1。
图11、各抗体的SPR亲和力测定曲线，图中展示的是在表面等离子共振(SPR)实验中测定的抗体亲和动力学曲线，该曲线包括两部分，结合相(association phase)和解离相(dissociation phase)，分别反映了抗原抗体结合和解离的速率，其中，结合相分别为抗体与五个对比稀释浓度梯度的探针依次结合。该实验中使用到两种抗原，5'AGGT(6-4)TGGCAG3'(Sh-probe3)和5’AAAT(6-4)TAACAG3’(Sh-probe6)。每个抗体的亲和力测定均重复了三次。
图12、ELISA实验检测HeLa基因组中的6-4PPs，ELISA实验共重复三遍，所有检测值均以平均值±标准误的形式进行统计及作图。
图13、免疫荧光测试三种抗体对基因组DNA中6-4PPs的识别能力，(13A)为激光共聚焦显微镜下观察的实验结果，三种抗体均使用Alexa488进行荧光标记，细胞核DNA通过DAPI染色，每种抗体的检测图中均挑选两个细胞进行放大(如a-f所示)；(13B)为三种抗体对基因组6-4PPs识别能力的统计图，纵坐标为6-4PP阳性的细胞百分比，即可检测到6-4PP损伤点的细胞占所有细胞的百分比。实验重复了三次，每次实验对三种抗体的检测结果均统计了大于200个细胞。数据以平均值±标准误的形式进行分析，图中显著性差异符号标记如下：*(p<0.05)，**(p<0.01)，***(p<0.001)。
图14、流式检测三种抗体对基因组6-4PPs的识别情况，用不同剂量(2J/m2、5J/m2、10J/m2)的UV照射HeLa后，用三种抗体对细胞基因组中产生的6-4PPs进行检测，以未经UV照射的细胞作为阴性对照，圈画阳性细胞门(R3)。最后一行为PI标记的基因组DNA，反映了不同细胞周期。
图15、流式检测三种抗体对基因组6-4PPs识别的统计图，纵坐标为图14中R3区域的细胞百分比，我们统计了三次实验的R3值，以平均值±标准误的形式表示。图中的显著性差异符号标记如下：*(p<0.05)，**(p<0.01)，***(p<0.001)，****(p<0.0001)。
图16、9c3和64M-2对基因组中6-4PPs修复动态的检测，图为三种细胞在10J/m2的UV照射后，使细胞进行修复，在不同的修复时间点收集细胞，提取基因组并用9c3和64M-2抗体进行ELISA检测。(16A)为人正常成纤维细胞GM00637的6-4PPs修复动态，(16B)为XPC缺陷型细胞XP4PA-SV的6-4PPs修复动态，(16C)为HeLa细胞的6-4PPs的修复动态。其中，对两种抗体的检测信号值进行了差异性比较，显著性差异符号标记如下：*(p<0.05)，**(p<0.01)。
图17、64M-5、64M-2以及突变抗体H43-L4和9c3的氨基酸序列，图中列出了64M-5、64M-2、H43-L4和9c3四种抗体重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。H43-L4是64M-2一级突变库筛选出来的突变抗体，9c3是64M-2二级突变库中筛出来的抗体。图中，标红色字体的表示各抗体与64M-2不同的氨基酸，序列上方标记的数字表示64M-2的突变抗体H43-L4和9c3与64M-2的序列相比，发生氨基酸突变的位置。
具体实施方式
实施例1、相关质粒的构建：
抗(6-4)photoproducts(6-4PPs)的抗体64M-2和64M-5的可变区基因序列(具体序列)从RCSB蛋白数据库(http://www.rcsb.org)获得并由金斯瑞公司合成作为目的片段。在本实验室前期构建的质粒基础上，采用常规克隆方法，利用PCR或overlap PCR将质粒中的VH区和VL区替换成64M-2抗体的重链和轻链可变区。
其中，64M-2VH插入到EcoRI和ClaI的位点中，64M-2VL插入到EcoRI和KpnI的位点中，最终得到两个可以将64M-2ccFv展示在大肠杆菌内膜上的质粒。详细的质粒构建方法可参考本实验室已发表的论文《高效大肠杆菌抗体展示及人工进化平台的建立》[14]。
本申请中使用pCDNA3.1(+)(Invitrogen,Darmstadt,Germany)[15]构建用于全长抗体表达和纯化的质粒。本申请中使用到的鼠抗体重链和轻链分别是IgG2a和Igk亚型[16,17]，与64M-2抗体保持一致，并由金斯瑞公司合成。VH-CH和VL-CL通过overlap PCR扩增。
64M-5抗体以及后期分选得到的所有克隆与64M-2的质粒构建方式(包括用于ccFv展示的载体和重组全长抗体的表达载体)基本一致，所使用的引物也与64M-2相同，因为64M-5以及其他分选得到的克隆基因两端与64M-2碱基序列相同，这里不再做详细说明。
实施例2、光产物(6-4PP)探针的制备及通过HPLC纯化含有6-4PP的探针：
1、探针制备
为了满足流式分选和检测的要求，我们制备了两种含有6-4PP的探针：一种含有36个碱基的长链探针(L-probe)和一种含有10个碱基的短链探针(Sh-probe)。所有探针的序列可见表1。因为流式分析需要检测荧光信号，所以我们在所有进行流式分选和检测的探针3’端偶联了生物素，这样可以用带有链霉亲和素的荧光分子标记探针来标记。
表1中，除了Sh-probe5是从TriLink BioTechnologies购买的，其他所有探针序列均由上海博尚生物技术有限公司合成。长链探针序列L-probe1-8用双蒸水溶解至终浓度50μM，除了L-probe2，其他探针置于冰上，在254nm，2.5mW/cm2紫外线下照射30分钟(总剂量为45kJ/m2)，照射后的探针直接用于流式分析标记。经过紫外处理的长链探针中成分较为复杂，可能含有6-4PP、CPD和其他不同的光产物。L-probe2的碱基序列与L-probe1相同，但是不经过紫外线照射，在实验中作为对照探针。短链探针用于制备纯化的6-4PP抗原。所有短链探针用双蒸水溶解至终浓度100μM，Sh-probe2(碱基序列与Sh-probe1相同)和Sh-probe5可冻存备用，其他短链探针溶液置于冰上，在254nm，1mW/cm2的紫外光下照射2个小时(总剂量约72kJ/m2)，收集照射后的探针溶液可置于4℃保存，准备用于HPLC分离纯化。
表1、实验中用到的所有抗原序列
Figure GDA0001669773330000071
2、探针纯化
含有6-4PP的纯化探针通过HPLC可与原料物质和其他副产物分离开，具体的分离条件如下：实验中用到的色谱柱为Venusil MP C18反相色谱柱(Agela Technologies)。
首先，25分钟内以线性梯度10-25％(vol/vol)的甲醇在5mM乙酸铵溶液(pH8.0)中比例缓慢升高；
接着，25％甲醇比例维持10分钟；
最后15分钟，线性梯度25-10％的甲醇比例缓慢降低回初始浓度。
在整个过程中，液体的流速为0.8ml/min。6-4光产物的检测是使用Waters model多波长检测仪，通过对260nm和325nm(6-4光产物的特征吸收波长)[18]波长的同步监测，可将含有6-4光产物的纯化探针与其他物质分离开并收集起来(图2A)。
收集的产物重复上样进行再次纯化后进行氮气吹干，4℃保存备用。氮吹干后的产物取出少量用双蒸水溶解并用DNA限制性内切酶进行完全消化，通过质谱(UHPLC-Q-TOF/MS质谱检测仪)对6-4PP产物进行鉴定。鉴定依据为260nm和325nm的同步吸收峰，以及进行二级质谱检测时，有545→532的峰迁移[19]，如图2B。Sh-probe1和Sh-probe4由于在3’端连接生物素，冻融后会破坏，因此保存在50％甘油的水溶液里，-20℃可长时间放置，而Sh-probe2和3可直接用双蒸水溶解，储存在-20℃备用。
实施例3、以64M-2抗体为基础，人工进化针对光产物(6-4PP)的高质量抗体
1、64M-2抗体库的构建和进化
选择64M-2抗体的V区基因序列作为模板，先克隆将64M-2的VH与VL连在一起，再通过易错PCR，得到了平均每个基因上有4-6个突变的原始抗体库。这里我们使用的引物对为：
5’-CGGACTACAAAGATGAATTCGAAGTTCAGCTGCAGCAGAG和
3’-CCGCCGCCCTCGAGGTCGACTTTAATTTCCAGTTTGGTGCC。
我们根据生产商的说明书(Takara，Japan)进行了一些调整：
PCR缓冲液(50ul)里含有：
1ul低保真聚合酶(rTaq，Takara)、
40ng 64M-2基因模板、
引物(10mM)、
MnCl2(5mM)、MgCl2(25mM)、dNTP(2.5mM)和dCTP及dTTP各20mM。
PCR程序为：
(1)94℃：30s，(2)55℃：30s，(3)72℃，45s，共计15个循环；
最后94℃持续3min，72℃延伸10min。
PCR产物通过测序鉴定，达到平均每个基因4-6个碱基突变。
从上述突变后的PCR产物中分别扩增出VH库和VL库片段(使用高保真酶)，引物分别为：
重链的：VH-5’GCAGCGAATTCGAAGTTCAGCTGCAG和
VH-3’GCTGCATCGATGCTGCTAACGGTAAC，
以及轻链的：VL-5’GCAGCGAATTCGATGTTCTGATG和
VL-3’GCTGCGGTACCTTTAATTTCCAG。
扩增后的片段连接到载体上，得到pAK201-SP-Flag-VH mutant library(anti-6-4PPs)-GR1和pBAD30-SP-His-VL mutant library(anti-6-4PPs)-GR2。连接产物通过化学转化到Trans10化转感受态细胞(Transgen Biotech,China)中并涂布在含有100μg/mL氨苄(轻链库)或40μg/mL氯霉素(重链库)的SOB固体培养基上，37度培养12小时左右，即可刮板收集菌体(轻链库和重链库的克隆数均大于30000)进行质粒的提纯(QIAGEN中提试剂盒，German)。我们将提纯的重链和轻链库质粒通过电转的方式共转入电转感受态细胞DH10B(Invitrogen，USA)中，然后涂布在SOB固体培养基上。约2×108个克隆被收集起来作为anti-6-4PP的原始抗体库，用于后续的分选。本实验中，我们为了进一步筛选，还进行了二次建库。我们从第一次分选后得到的高亲和力抗体中选择了一个最好的克隆H43-L4，并以它为模板进行了二次建库，具体方法与原始库的方法基本一致，只是我们将易错PCR的循环数提高到20个循环，得到平均每个基因上有6-8个碱基突变的基因库，最终我们也收获了比原始库大一个数量级的2×109个克隆，用于进一步分选。
2、原生质体制备和标记、流式进化分选、基因的回收和克隆
(1)原生质体制备和标记
含有ccFv内膜展示质粒的大肠杆菌细胞(DH10B)接种到LB液体培养基中，加入氨苄和氯霉素到培养基中用于筛选含有VL和VH质粒的克隆。当菌体密度(OD600)达到0.5～0.6时，加入诱导剂IPTG和阿拉伯糖，继续培养进行抗体的诱导表达。制备原生质体，接下来将制备好的原生质体与一抗(mouse anti-flag或mouse anti-His，from Sigma，USA)和实施例2制备的抗原(长链抗原1ug/ml或纯化的短链抗原10ng/ml)在缓冲液中孵育，然后用TBS缓冲液洗一次。原生质体在TBS中重悬，加入1μL Alexa Fluor 488-AffiniPure RabbitAnti-Mouse IgG(H+L)(Jackson ImmunoRes，USA)和1μL Alexa Fluor 647Streptavidin(Jackson ImmunoRes，USA)室温孵育1小时，然后再用TBS洗一遍，最后用1ml含1mg/mLBSA的TBS缓冲液重悬，用于流式检测或分选。
(2)流式进化分选
采用BD influx流式细胞仪。Alexa488和Alexa647分别被488和640nm的激光器激发，并在530/30nm和670/30nm发射荧光，从而被仪器检测到。
每1×108个细菌原生质体流过流式分选器，收集约250个目的细菌；收集的细菌中编码VH和VL的基因通过PCR扩增分别回收，所用到的引物分别为：
用于重链的：VH-rescue-5’-ATGAAATACCTATTGCCTACGGCAG和
VH-rescue-3’-AGTTCAGAGACACGCTCCTCTTTCT，
用于轻链的：VL-rescue-5’-TGAAATACCTATTGCCTACGGCAG和
VL-rescue-3’-AGTTCAGAGACACGCTCCTCTTTCT。
PCR扩增后，所有的DNA产物通过酶切分别连接到pAK201-SP-Flag-VH和pBAD30-SP-His-VL质粒中，这样就构建了一个新的重链库和一个新的轻链库，用于下一轮的流式分选，以此类推。分选结束后，轻重链各挑选50个克隆进行测序，分析突变富集的情况。
3、抗体库的构建和原生质体展示的轻链重链的进化结果
(1)筛选策略
当用浓度为1μg/mL的长链探针L-probe1标记原生质体并进行流式检测时，与阴性对照抗体抗-地高辛(anti-digoxigenin)抗体相比，64M-2与长链探针L-probe1有明显的阳性结合信号(图3A)。但是，长链探针经UV照射后，会产生含有不同类型6-4PP产物的DNA混合物，由于实验技术的限制，我们无法将它们彼此区分开。而短链的探针则相对容易，我们可以通过高效液相色谱将含有T(6-4)T的短链探针纯化出来。因此，我们的进化策略是：先用混合的长链探针对64M-2ccFv抗体突变库进行初步的筛选，提高一定的亲和力后，再用纯化的短链探针进行进一步的抗体优化，从而筛选到能与T(6-4)T特异性结合并具有高亲和力的抗体克隆(图3B)。
因为需要用两种探针来进行筛选，所以我们进行了两次抗体突变库的建立，第一次是在64M-2抗体的基础上建立64M-2的抗体突变库，通过流式分选富集，得到一些与探针结合能力较强的克隆后，从中挑选出一个最好的克隆再进行重新建库。第二次建库后，需要用纯化的短链探针筛选，在这里，我们设计了两种分选路线：一种是竞争筛选，一种是非竞争筛选。非竞争筛选与第一次建库的筛选方式相同，而竞争筛选是指在抗体与探针孵育后，加入无法标记荧光的探针进行竞争标记，这一筛选方式的使用是为了筛选到与探针结合能力较强且不易解离的抗体克隆。筛到的克隆通过流式分析以及SPR实验进行亲和力的测定，挑选出若干最优的克隆进行纯化并进行抗体功能检测(ELISA、免疫荧光、流式等)。
(2)第一轮进化筛选结果
流式分析结果显示，原始抗体库(S0)中，只有少数的突变体与长链探针结合(右上方的区域)，与野生型抗体64M-2相比，原始库中大部分突变体都处于与长链探针结合的阴性区域(左上及下方区域)(图4A)。在第一轮原始库的分选中共分选了4×108个原生质体。但是经过一轮分选，并没有对与探针结合能力较强的突变体产生明显的富集。然而在接下来的几轮富集中，与长链探针结合能力较强的突变体产生了明显的富集，从Sort1到Sort4，每一轮分选，都会产生更高的探针-抗体结合信号。
接下来，我们从Sort4的重链VH和轻链VL突变库中分别随机挑选了50个克隆进行测序。统计的突变热点如图4B所示。我们发现，
1)在VH库中主要有三个突变热点，即V73D,T74P和T97A；
2)在VL库中也有三个突变热点，即S26N,L88Q和Q95L。
其中，
VH库的3号克隆H3包含T74P和T97A，43号克隆H43包含V73D和T97A；
VL库中的4号克隆L4包含S26N,L88Q和Q95L，16号克隆L16包含S26N和L88Q。
我们将这些重链和轻链的基因进行随机搭配，产生了四种克隆：H3-L4、H3-L16、H43-L4和H43-L16。对这四种克隆与长链探针L-probe1的结合情况进行了流式分析(图4C)。右上区域的原生质体百分比反映了抗体与探针的结合能力。实验结果显示，与野生型抗体64M-2相比，四种重组克隆与探针的结合能力都有了显著提高，其中，H43-L4表现出了最强的探针结合能力。轻链库4号克隆L4比16号克隆L16多了一个Q95L突变，而H3-L4和H43-L4克隆与L-probe1的结合能力明显高于H3-L16和H43-L16克隆，表明轻链95位氨基酸的突变对于提高抗体与探针的结合能力发挥了重要作用。
我们对克隆H43-L4(在所有检测的突变体中与探针结合能力最强)的结合特异性进行了检测。与我们预想的结果一致，H43-L4与L-probe2和L-probe3均没有结合。其中，虽然L-probe2的序列与分选所用的探针L-probe1的序列相同，但没有经过UV照射，所以没有产生嘧啶二聚体或其他UV损伤物质，而L-probe3因为在其序列中没有相邻的嘧啶碱基，即使经过UV照射也不会产生嘧啶二聚体。所以，这一结果表明，H43-L4只能结合含有嘧啶二聚体的抗原物质(图5A)。因此，我们继续检测了H43-L4对低浓度(10ng/mL)的短链纯化探针Sh-probe1的结合情况(图5B)。结果显示，与原始抗体64M-2相比，经过流式筛选得到的克隆H43-L4与的6-4PP纯化探针的结合能力有了明显提高，可以通过流式检测到明显的抗体-探针结合信号，这为进一步提高抗体对T(6-4)T的结合能力提供了基础。
(3)非竞争性进化筛选与竞争性进化筛选结果
为了进一步提高H43-L4抗体对6-4PPs的亲和力，我们以H43-L4的基因为模板，通过易错PCR重新构建了一个库容量为2×109的新的抗体突变库(非竞争筛选)。在这个突变库中，平均每个基因上有6-8个突变碱基。与原始库分选使用的探针不同，在这次突变库的分选中，我们采用的是低浓度(10ng/mL)的短链纯化探针Sh-probe1 5’-AGGT(6-4)TGGCAG-3’-biotin。我们进行了5轮分选富集和克隆(图6A)，如图所示，从Sort 0到Sort 4，每一轮都在不断富集与探针具有较高结合能力的抗体，而在Sort 5中，与探针结合的原生质体百分比(右上区域)与Sort 4中大致相同，表明抗体的富集几近结束。于是，我们从Sort 5的重链和轻链库中分别挑取50个克隆进行测序分析，突变热点如图6B所示。
我们还采取了另外一种竞争筛选模式对H43-L4的抗体突变库进行了分选，目的是筛选到与探针结合后，解离较慢(具有低解离速率常数koff)的抗体。竞争筛选是从非竞争筛选得到的Sort2开始，当展示有抗体库的原生质体与带有生物素的探针Sh-probe1(5’-AGGT(6-4)TGGCAG-3’-biotin)孵育一个小时后，再与竞争探针Sh-probe3(5’-AGGT(6-4)TGGCAG-3’)孵育一个小时，标记荧光后进行流式分选。其中，Sh-probe3的浓度是Sh-probe1的40倍(400ng/mL)。因为只有带有生物素的探针才能标记上荧光，所以在流式检测中所检测到阳性信号是与带有生物素的Sh-probe1结合能力较强而没有被竞争探针竞争结合而无法标记荧光的原生质体。经过五轮竞争分选(图7A)，从Sort 2-5中随机挑取50个重链克隆和50个轻链克隆进行测序，所得到的突变热点如图7B所示。
如图6B和7B所示，无论是非竞争筛选还是竞争筛选，我们都观察到明显的突变热点的富集，尤其是轻链库中，突变热点的发生频率非常高。于是，我们为了明确两种筛选策略(非竞争和竞争筛选)富集得到的抗体与探针的结合能力是否不同，我们分别从非竞争筛选的Sort5和竞争筛选的Sort 2-5中挑选了一些克隆进行了检测(图8)。我们发现，无论是使用非竞争筛选方法还是竞争筛选方法，我们都得到了与探针具有更高亲和力的抗体(与H43-L4相比)。其中，从Sort 5中选取的20nc1和64nc1(nc：noncompetitive，即来自非竞争筛选；20和64代表重链测序的克隆号，即VH20和VH64，1是轻链测序的克隆号VL1)以及从Sort2-5中选取的9c3and 28c3(c:competitive，即来自竞争筛选；9和28代表重链测序的克隆号VH9和VH28，3是轻链测序的克隆号VL3)是在所检测的重组克隆中与探针结合能力最强的克隆(见表2)。从图8可以看到，在竞争条件下，9c3和28c3对探针的结合能力要比20nc1和64nc1强很多，这与我们之前推测的结果是一致的。同时，因为第二次突变库的筛选是在原始库筛选出的H43-L4克隆的基础上进行的，所以，在所有筛到的重组克隆中，除了第二次筛选富集的氨基酸突变还包含了第一轮筛选富集的氨基酸突变(H43-L4上的氨基酸突变，即VH库的V73D和T97A；和VL库的S26N,L88Q和Q95L)。
表2、H43-L4抗体突变库中筛选得到的重组克隆与抗原结合能力的检测
Figure GDA0001669773330000131
实施例4、全长抗体的构建、表达纯化以及亲和力测定
1、全长抗体的构建、表达和纯化
采用与64M-2一致相同的IgG2a和Igκ链的恒定区基因片段，将它们分别与筛选到的抗体的VH和VL基因片段连接起来并插入到表达载体pcDNA3.1(+)vector(LifeTechnologies,USA)的多克隆位点中来构建不同的重组全长抗体表达质粒。
将含有全长抗体的表达载体转入293F细胞(Invitrogen,USA)中，然后在SMM293-T1S培养基(Sino Biological Inc.,China)中，37℃，8％CO2，125rpm培养60小时左右，转染24小时后加一次培养基补料。培养后的细胞悬液800rpm离心3分钟，将上清液倒入新的离心管中，8500rpm离心10分钟将细胞碎片全部离到管底，上清液用0.45μm的滤膜过滤，然后用截留分子量30KDa的浓缩管，4℃，3800rpm离心浓缩约20倍左右即可获得可直接用于亲和力的鉴定实验的全长抗体。
部分抗体需要纯化后才可用于后续实验的，采用Pierce Protein AChromatography Cartridges(Thermo scientific，USA)进行抗体纯化，具体步骤参照商品说明书。浓缩的上清液或纯化的抗体通过SDS-PAGE考马斯亮蓝染色粗略估计抗体的浓度，纯化抗体也可通过用Nanodrop ND2000(Gene)进行测定。
2、抗体亲和力测定(Biacore分析)
抗体亲和力的测定使用表面等离子共振(SPR)方法，本实验中进行检测的仪器是Biacore T100(GE Healthcare)，实验过程中使用的反应缓冲液为0.05％PBST(含有0.05％Tween-20的PBS溶液)。实验开始前，首先将抗鼠Fc的抗体(二抗)在pH4.5的条件下，通过氨基偶联试剂盒(GE Healthcare)偶联在CM5芯片上，然后稀释抗体上清液若干倍或将纯化的抗体溶液稀释到浓度为2-5μg/mL(具体浓度需要通过预实验确定)，流速30mL/min流过CM5芯片表面，直到抗体捕获水平达到1000RU左右。纯化的短链抗原包括5'-AGGT(6-4)TGGCAG-3’或者5'-AAAT(6-4)TAACAG-3’，根据不同抗体的亲和力不同，用0.05％PBST对比稀释成五个不同浓度梯度(如3.125nM-50nM,25nM-400nM等)，具体的浓度梯度也需要通过预实验确定。稀释后的抗原以30μl/min的流速流过一侧流动室，另一侧流动室则以相同流速流过缓冲液作为对照基线，持续60s用于记录抗原抗体的结合相；接下来的600s将抗原稀释液换成0.05％PBST用于记录解离相。每一个抗体的亲和力反应进行结束均需要用pH1.7的甘氨酸溶液进行再生即将捕获的抗体从芯片表面洗掉以用于下一个抗体的亲和力反应。抗原抗体的结合解离动态曲线则通过Biacore T100evaluation software(GE Healthcare)进行拟合分析，并可得到结合速率常数Kon、解离速率常数Koff并计算出平衡解离常数KD(Koff/Kon)。
3、9c3抗体与合成探针中6-4PPs结合的灵敏度和特异性检测结果
(1)流式检测结果
为了鉴定9c3抗体对6-4PPs识别的特异性，我们通过流式检测了9c3与多种不同的短链探针(Sh-probe1、2和5)和多种长链探针(L-probe1-8)的结合情况，不同probe的具体序列可见表2.2。首先，短链探针的使用是为了鉴定9c3抗体是否只结合6-4PP，而不是与probe本身的DNA链或者由UV造成的另外一种主要光产物CPD结合(图9A)。如图所示，虽然三种Sh-probe的碱基序列完全一致，但9c3与未经过UV照射的Sh-probe2和用CPD替换6-4PP的Sh-probe5均显示结合阴性，这表明9c3抗体与6-4PP结合是具有特异性的。因为不同的相邻嘧啶在UV照射下会形成不同的6-4PP产物，如T(6-4)T、T(6-4)C、C(6-4)C或C(6-4)T并且不同的(6-4)光产物产生的效率也不相同[20]。所以我们设计了含有不同相邻碱基的长链探针并通过流式对9c3与这些不同的长链探针结合的情况进行了测定(图9B)。可以看到，在该图中9c3对L-probe2(未经UV照射)和L-probe3(没有相邻的嘧啶碱基)均没有结合，表明9c3只结合含有嘧啶二聚体即6-4PPs的探针，而与探针本身的DNA链并无非特异性结合。9c3对L-probe1和L-probe4(与L-probe1的差别在于将相邻的嘧啶碱基两侧的A与G调换)的结合能力相似，表明9c3与6-4PPs的结合与其周围的碱基序列关系不大。L-probe5-8中所含的相邻嘧啶碱基分别只含有TT、TC、CC、CT，而周围碱基都相同。图9的实验结果表明，9c3与这几种探针结合时，表现出明显的结合差异(L-probe5>L-probe6>L-probe7>L-probe8)，这与之前TOSHIO MoR等人发表的野生型抗体64M-2与不同嘧啶形成的(6-4)光产物的结合情况基本一致。以上数据充分体现了9c3与6-4PPs的亲和特异性。
图9B中，我们观察到9c3对不同侧链碱基的L-probe4与L-probe1的亲和力基本相似，所以，我们比较感兴趣的是，抗体与6-4PPs的结合是否受到6-4PPs周围的序列的影响。于是，我们通过流式检测对比了野生型抗体64M-2、进化得到的抗体9c3以及与64M-2同时从杂交瘤中获得的抗6-4PPs的抗体克隆64M-5[21]对含有不同侧链碱基的长链探针(L-probe1和L-probe4)和短链探针(Sh-probe1和Sh-probe4)的亲和特异性(图10)。
从流式检测的结果中可以观察到，无论是短链探针还是长链探针，9c3在与含有不同碱基侧链的探针结合后，均表现出相似的亲和力，表明9c3与6-4PPs结合时几乎不受其周围的碱基序列影响。而同样是抗6-4PPs的抗体64M-2与64M-5对不同侧链碱基的探针表现出明显的结合差异，尤其在与短链的纯化探针结合时，64M-2对T(6-4)T两侧为GG的Sh-probe1几乎没有结合能力或结合能力极低而无法通过流式检测到阳性信号。但当64M-2与两侧为AA的Sh-probe4结合时，就表现出较强的亲和力(结合探针的原生质体占总数的31.5％)。同样的情况也发生在64M-5抗体上(与Sh-probe1结合的能力约为与Sh-probe4结合能力的1.7倍)。这表明6-4PPs周围碱基序列的不同大大影响了64M-2和64M-5与6-4PPs的结合能力，9c3与6-4PPs结合时几乎不受其周围的碱基序列影响。而这一结果同样在表面等离子共振实验(SPR)中得到证实(图11，表3和4)。
(2)表面等离子共振实验(SPR)检测结果
在SPR实验中，我们将不同的抗体可变区基因与鼠抗体恒定区基因融合，重组为全长抗体，并在293F细胞中进行了表达。虽然与流式检测中的ccFv抗体形式有所不同，但检测的结果是基本一致的。在该实验中我们使用的两个探针与前面进行流式检测时使用的Sh-probe1和Sh-probe4的碱基序列完全相同，只是去掉了3’端的生物素(biotin)。当我们使用5’AAAT(6-4)TAACAG3’(Sh-probe6)作为探针时，9c3、64M-5、64M-2的平衡解离常数分别为KD(9c3)＝9.9×10-10、KD(64M-5)＝7.1×10-10、KD(64M-2)＝5.8×10-9。当我们使用5'AGGT(6-4)TGGCAG3'(Sh-probe3)作为抗原时，9c3、64M-5和64M-2的平衡解离常数分别为KD(9c3)＝7.6×10-10、KD(64M-5)＝2.8×10-9、KD(64M-2)＝5.4×10-7。9c3的两个平衡解离常数KD相差0.77倍,而64M-5和64M-2的KD分别相差3.9和93倍。而且，从动力学曲线(图11)也可以看出，64M-2在与Sh-probe3结合时结合的较慢，解离的较快；而与Sh-probe6结合时，结合的较快且解离较慢，使得它与这两种探针结合的平衡解离常数相差将近100倍。从这个结果中，我们就可以很好的理解了前面流式检测分析中，64M-2与Sh-probe1结合时检测不到阳性信号，是因为它们的亲和力太低了，而当与Sh-probe4结合时，可以观察到明显的阳性信号。
因为在整个抗体库的分选过程中，我们使用的是T(6-4)T两边均为GG的探针，所以与野生型抗体64M-2相比，9c3与两边为GG的Sh-probe3的结合能力比64M-2提高了将约710倍。这表明我们有针对性的进化取得了定向的结果。因为9c3对两种不同侧链的抗原结合能力几乎没有差异，我们推测9c3在检测细胞基因组中由UV照射造成的6-4PPs时应该表现的更好。
表3、抗体与5'AGGT(6-4)TGGCAG3'(Sh-probe3)结合的动力学常数
Figure GDA0001669773330000161
表4、抗体与5'AAAT(6-4)TAACAG3'(Sh-probe6)结合的动力学常数
Figure GDA0001669773330000162
注：将图11中的动力学曲线通过Biacore T100evaluation software进行拟合和分析，得到每一个抗体与抗原的结合速率常数kon和解离速率常数koff，并计算出平衡解离常数KD(KD＝koff/kon)，表3和4中的所有数据表现形式为平均值±标准误。
4、SDS-PAGE考马斯亮蓝染色及Western Blot
1)培养上清液或细胞团加入等体积的2×SDS裂解液，吹打混匀，沸水浴5min裂解样品；
2)离心，取上清在12％的SDS PAGE胶中进行电泳；
3)电泳结束后，将蛋白胶放入考马斯亮蓝染液(SpeedyStain蛋白染色剂，康为世纪)中进行染色约2h,然后进行脱色，在微波炉中煮至液体沸腾取出，根据条带的颜色深浅进行蛋白表达量的粗略估计，或者利用半干法将蛋白质从SDS-PAGE胶转移到PVDF膜上进行后续wertern blot实验；
4)将膜浸在含有5％脱脂奶粉的PBS封闭液中室温封闭1小时；
5)一抗溶液用含5％脱脂奶粉的PBST(0.1％Tween-20的PBS)稀释，将膜浸在一抗溶液中室温孵育1小时；
6)用PBST洗5次，每次5min；
7)二抗用含5％脱脂奶粉的PBST稀释，将膜浸在二抗溶液中室温孵育1h；
8)用PBST洗5次，每次5分钟；
9)显色，用化学发光底物(Pierce)显色；
10)用X-ray(Kodak)底片显影。
实验中用到的抗体有：rabbit anti-XPC(C-terminal)antibody(sigma)、HRPconjunct rabbit anti-mouse IgG antibody(Promega)、HRP conjunct goat anti-rabbit IgG antibody(Promega)。
5、酶联免疫吸附反应(ELISA)
本实验中使用到3种细胞系：人HeLa细胞、人成纤维细胞GM00637和人成纤维细胞XP4PA-SV。GM00637是野生型细胞，而XP4PA-SV是Xpc基因缺陷型细胞。这三种细胞系均用加入10％FBS(Hyclone,USA)和0.4％青链霉素双抗的DMEM/HIGH GLUCOSE(Hyclone,USA)培养基培养。在定量实验中，Sh-probe3 5’-AGGT(6-4)TGGCAG-3’作为抗原。在基因组修复实验中，成纤维细胞GM00637、XP4PA-SV以及HeLa细胞在254nm紫外光下照射(10J/m2)后，分别在不同的时间点收细胞即让细胞修复不同的时间。基因组DNA采用Wizard genomic DNApurification Kits(Promega)进行提取纯化并用Nanodrop ND2000(Gene)测定DNA浓度。在抗体灵敏度分析实验中，HeLa细胞依次用1.5J/m2、3J/m2、6J/m2、12J/m2几个不同剂量的254nm紫外照射，收细胞，提取基因组DNA。
ELISA实验的操作步骤如下：
1)鱼精蛋白硫酸盐铺板：配制0.003％的鱼精蛋白硫酸盐(Sigma,USA)溶液，即将0.003g的鱼精蛋白硫酸盐粉末溶解于100mL双蒸水中，置于混合搅拌器上，搅拌溶解1h，在96孔板(Thermo Fisher Scientific，USA)中，每孔加入50μL，37℃孵育过夜，至板子完全干。板子用蒸馏水洗三次，每次100μL，置于暗处备用；
2)DNA样品与鱼精蛋白硫酸盐结合：回收的细胞基因组DNA样品用PBS稀释成4.0μg/μL的溶液，将DNA溶液在沸水中加热10min，然后迅速插在冰上使DNA变性。96孔板每孔加入50μL变性的DNA溶液，37℃过夜至完全干，使DNA与鱼精蛋白硫酸盐结合；
3)配制PBST(含有0.05％Tween-20的PBS溶液)，取出包被的板子洗五次，150μL/孔每次；
4)封闭：配制含有2％FBS的PBS封闭液，每孔加入150μL，37℃孵育30min，用来防止非特异性结合；
5)加一抗：板子用PBST洗一次，150μL/孔，用PBS稀释抗体(64M-2、64M-5和9c3)，100μL/孔，37℃孵育30min；
6)加二抗：板子用PBST洗五次，150μL/孔，加入用PBS 1比2000稀释的二抗HRPconjunct rabbit anti-mouse IgG antibody(Promega)，100μL/孔，37℃孵育30min；
7)显色：板子用PBST洗五次，150μL/孔，加入TMB显色底物(SERVA)，50μL/孔，静置10～15min至颜色不再改变，加入2M硫酸终止反应，50μL/孔，酶标仪检测450nm的吸收峰。
6、免疫荧光
1)细胞培养和UV照射：免疫荧光实验中用到的细胞适合在35mm细胞培养皿或六孔板里培养，2×105细胞/盘，培养18-24小时。用PBS洗一遍细胞，吸干，只留残留的薄层，覆盖5微米多聚碳酸酯膜(Millipore)，从一侧开始轻轻覆盖，防止出现气泡，254nm UV照射2J/m2或5J/m2。照射后，需加入PBS，使膜飘上来，用镊子取走；
2)细胞固定和通透：加入1ml含4％多聚甲醛的PBS到每个盘中，室温固定细胞10min。用PBS洗两次，每次2ml，每盘加入2ml含0.5％TritonX-100的PBS，冰上通透5min。用PBS洗两次，每次2ml；
3)基因组DNA变性：加入2ml 2M HCL，室温孵育30min，变性DNA，加2ml PBS洗5次；
4)封闭：加2ml含20％FBS的PBS封闭，37℃，30min，PBS洗5次；
5)加一抗：将抗体(64M-2、64M-5、9c3)稀释于含5％FBS的PBS中，取出一张薄膜，将一抗溶液滴在薄膜上，约80μL每个样品，用镊子夹取玻璃片倒扣在液滴上，37℃孵育30min，PBS洗5次；
6)加荧光二抗：二抗(Alexa Fluor488-AffiniPure Rabbit Anti-Mouse IgG(H+L))稀释于含5％FBS的PBS中，与一抗相同，将玻璃片倒扣在滴有二抗溶液的薄膜上，37℃孵育30min，PBS洗5次；
7)DAPI染色、封片：加20μL带有DAPI的封片剂(Southern Biotech)滴在载玻片上，将玻片倒扣在液滴上，四周封指甲油，用锡箔纸包住，4度冰箱中保存，待指甲油干；
8)使用激光共聚焦显微镜FV1200(Olympus)进行拍摄。
7、ELISA及免疫荧光的实验结果
在ELISA实验(图12)中，我们将HeLa细胞用254nm的紫外线分别照射不同的剂量，提取基因组DNA后，用三种抗体进行检测。在该实验中，9c3和64M-5使用的抗体浓度(0.83μg/mL)是64M-2抗体浓度(6.6μg/mL)的1/8，但结果显示，在同等UV照射剂量下，用9c3抗体进行检测，显示出更高的信号值，并且UV剂量越高，这种差异越明显。其次是64M-5，而64M-2虽然使用了较高的抗体浓度，依然显示出较低的检测信号值。同样的现象在免疫荧光的实验中也存在(图13)。
实施例5、检测优化后的抗体对UV造成的细胞基因组损伤的识别
1、方法步骤
(1)将HeLa细胞种在10cm的细胞培养皿中，细胞满度约80％，37℃培养18小时后，用PBS洗一遍，吸干残夜。将培养皿置于254nm紫外灯下照射(不同UV剂量为2,5和10J/m2)，然后胰酶消化，用1mL预冷的培养基重悬细胞并插在冰上备用；
(2)细胞悬液800rpm离心3min，倒掉上清，轻弹细胞团，加入10mL PBS洗一遍，800rpm离心3min，倒掉上清，再离心1min，洗净残余的PBS，加入0.5mL冷的PBS重悬细胞团插在冰上备用；
(3)固定细胞：将每管细胞样品置于涡旋搅拌器上缓慢旋转，并向每管细胞悬液中悬空滴加1.5mL无水乙醇固定细胞，-20℃过夜放置；
(4)变性：固定完的细胞800rpm离心3min，倒掉上清，加入10mL PBS洗一遍，再800rpm离心3min，倒掉上清，再离心1min，洗净残余的PBS，加入0.5％Triton-X-100/0.2NHCL重悬细胞，22℃孵育10分钟变性DNA；
(5)中和：变性后迅速插在冰上，向每管中加入冷的0.1mol/L Na2B4O7(pH 9.0)进行中和，离心，弃上清，再用10mLPBS洗一遍，吸尽上清；
(6)封闭：用1ml PBS-B(含10％BSA的PBS)重悬细胞至1.5mL EP管中，37℃孵育1h；
(7)封闭后，离心，300g,3min，吸尽上清，加入PBS-TB(含有0.25％Tween-20的PBS-B)稀释好的一抗溶液，150mL/管，室温孵育1h；
(8)用PBS-TB洗一次，吸尽上清，加二抗溶液(同样是PBS-TB稀释)，150μL/管，室温孵育1h；
(9)用PBS-TB洗两次，吸尽上清，每管加入1mL PI溶液(5mL PI溶液中加入50μLRNase)重悬，4℃放置1h；
(10)离心，吸走500μL PI溶液，用剩余的PI溶液重悬细胞团并加到流式管中，BDFACS Calibur流式细胞仪进行检测。
2、结果统计
在流式检测中，我们用UV照射HeLa细胞并立即收集细胞，经过处理的细胞分别用三种抗体进行标记，再用荧光二抗标记后，进行流式检测。流式检测图14中，我们可以看到，9c3对损伤细胞的标记能力要远远高于64M-5和64M-2，9c3对基因组中的6-4PPs的识别灵敏度远远高于64M-5和64M-2。此外，我们观察到一个有趣现象，在用9c3进行检测时，G1和G2期的荧光信号均存在一个较长的拖尾，我们推测可能是这两个时期细胞的6-4PPs减少了。因为实验中收集的细胞是在UV照射后立刻回收的，因此减弱的荧光信号应该不是由于修复作用造成的，而是G1和G2期可能存在相当一部分细胞产生了较少的6-4PPs。接下来，我们统计了流式图中，不同抗体检测不同UV剂量造成的基因组6-4PPs时，细胞被抗体标记的百分比(图中R3区域的细胞百分比)。统计结果如图15所示，9c3对基因组中6-4PPs的识别灵敏度在流式检测中体现的非常充分，与64M-5和64M-2相比，均有极显著差异。
此外，我们还用9c3和64M-2对细胞基因组中UV造成的6-4PPs的修复动态进行了检测(图16)。结果显示，与64M-2相比，9c3能够检测到正常人成纤维细胞(GM00637)、XPC缺陷型成纤维细胞(XP4PA-SV)以及HeLa细胞中更多的6-4PPs。用64M-2进行检测时，GM00637细胞中的6-4PPs水平随着UV(10J/m2)照射后修复时间的延长逐渐降低，并且在修复6h时进入一个平台状态，而相同的样品在用9c3检测时，由于9c3可以检测到更多的6-4PPs产物，所以，可以观察到从0h到24h的修复过程中，6-4PPs水平一直在下降(图16A)，其中从修复6h开始，6-4PPs水平下降的速率减慢。这些数据表明，细胞经紫外照射后，可能存在两个修复阶段，快修复和慢修复，而慢修复过程因为损伤物质总体水平较低，只有用9c3检测时才能观察到。XP4PA-SV细胞因为缺乏了XPC修复蛋白，所以用9c3或64M-2均没有检测到6-4PPs的修复。HeLa细胞中6-4PPs的修复速率要比成纤维细胞GM00637中6-4PPs的修复快一些，到6h已基本修复结束，但在修复初期，可以观察到9c3比64M-2检测到更多的6-4PPs。
64M-2、64M-5、H43-L4、9c3抗体所有氨基酸突变如图17所示。
实施例6、64M-2抗体基因三级(9c3抗体基因)突变库的建立及流式分选
虽然通过两次建库和分选，我们获得了目前为止对6-4PPs亲和力最强的抗体9c3，但并不清楚，这种亲和力的提高是否还有上升的空间。因此，我们将9c3抗体的V区基因作为模板，通过易错PCR的方法，再次建立了库容量为2×109个克隆的抗体突变库(方法与H43-L4抗体突变库的方法基本相同)。我们仍然使用纯化的短链探针作为流式筛选的抗原，但与之前筛选的方式不同，在这次筛选中，我们使用Sh-probe1(5’-AGGT(6-4)TGGCAG-3’biotin)和Sh-probe4(5’-AAAT(6-4)TAACAG-3’biotin)两种探针进行交替分选，即一轮使用Sh-probe1，下一轮使用Sh-probe4，并且每一轮均进行竞争筛选(与64M-2抗体基因二级突变库的筛选方式一样)，探针的使用浓度也比第二次筛选低了10倍(1ng/mL)，目的是进化抗体与6-4PPs亲和力的同时，排除由于侧链碱基不同而对二者结合造成的影响，最大限度的提高抗体与核心区域T(6-4)T的结合能力。最终，我们进行了共五轮分选(包括三次使用Sh-probe1的分选和两次使用Sh-probe4的分选)，然后将几轮分选后分别重新构建的亚库进行汇总，并用两种探针分别标记，结果显示，无论是用Sh-probe1标记还是Sh-probe4标记抗体突变库从Sort0到Sort5，高探针结合能力的抗体富集的速率并没有前面两次筛选明显，最终Sort5的探针结合阳性率甚至比突变前的9c3还要低一些。
我们从最后一轮分选得到的Sort 5的轻链和重链库中，各挑取了50个克隆进行测序，经过分析，统计结果显示，重链中12位、72位和109位氨基酸突变频率较高，但轻链中并无明显的突变富集现象，或者说没有突变热点。因此，我们挑选了出现频率较高的两个重链基因T6和T15(T表示突变来自三级抗体突变库的分选；6和15表示测序的重链克隆编号，即6号重链和15号重链；6号重链包括的氨基酸突变有Y109S，50个克隆中出现了7个与6号基因相同的克隆；15号重链包括的氨基酸突变有A12V和A72T，50个克隆中出现了4个与15号相同基因的克隆)与9c3抗体的轻链基因进行搭配，得到两个突变抗体T6c3和T15c3(c：与前文一致，表示来自竞争筛选)，在接下来的实验中，我们对这两个抗体与6-4PPs的识别情况进行了检测。
我们用流式检测了这两种抗体对纯化的短链探针Sh-probe1和Sh-probe4的结合情况，与突变前的9c3抗体相比，T6c3和T15c3与两种含有不同碱基侧链的探针的结合能力都强一些，但没有前面两次进化得到的抗体克隆亲和力增加的明显，而且T6c3和T15c3这两个抗体克隆也没有明显的区别。为了进一步鉴定这两种抗体与6-4PPs的亲和力，我们将它们构建成了鼠全长抗体，并进行纯化，得到的纯化抗体用来进行表面等离子共振(SPR)实验。动力学曲线显示，T6c3和T15c3与Sh-probe3(5’-AGGT(6-4)TGGCAG-3’)和Sh-probe6(5’-AAAT(6-4)TAACAG-3’)的结合速率(结合相association phase达到平台期的时间长短体现了结合的快慢)和解离速率(解离相dissociation phase，即探针脱离抗体的总量达到10％所用的时间越长，表示解离越慢)无明显差异，虽然与Sh-probe6的解离速率要比Sh-probe3快一些，但区别不大，最终通过软件对曲线的拟合和计算，得到的平衡解离常数KD也较为接近(表4)。T6c3和T15c3与Sh-probe3的亲和力约为9c3与Sh-probe3亲和力的2.5倍，而T6c3和T15c3与Sh-probe6的亲和力是9c3与Sh-probe6亲和力的不到2倍。
表4T15c3和T6c3与抗原Sh-probe3和Sh-probe6结合的动力学常数
Figure GDA0001669773330000221
最后需要说明的是，以上实施例仅用作帮助本领域技术人员理解本发明的实质，而不用做对本发明保护范围的限定。
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SEQUENCE LISTING
<110> 北京博雅捷康生物科技有限公司
<120> 一组识别DNA受紫外线照射造成的嘧啶二聚体的抗体
<130> CP11802048C
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 111
<212> PRT
<213> 嘧啶二聚体的抗体
<400> 1
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser Leu Val Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 2
<211> 120
<212> PRT
<213> 嘧啶二聚体的抗体
<400> 2
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Phe
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Val Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Arg Ser Gly Tyr Lys Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cggactacaa agatgaattc gaagttcagc tgcagcagag 40
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ccgccgccct cgaggtcgac tttaatttcc agtttggtgc c 41
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gcagcgaatt cgaagttcag ctgcag 26
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gctgcatcga tgctgctaac ggtaac 26
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gcagcgaatt cgatgttctg atg 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gctgcggtac ctttaatttc cag 23
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
atgaaatacc tattgcctac ggcag 25
<210> 10
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
agttcagaga cacgctcctc tttct 25
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tgaaatacct attgcctacg gcag 24
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
agttcagaga cacgctcctc tttct 25

Claims (7)

1.一组特异性识别DNA受紫外线照射造成的嘧啶二聚体的抗体，所述的抗体的轻链可变区基础氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述抗体的重链可变区基础氨基酸序列如SEQID NO.2所示，其特征在于：
所述的抗体的轻链可变区为：在所述的轻链可变区基础氨基酸序列上进行如下三个突变：S26N、L88Q、Q95L；
所述的抗体的重链可变区为：在所述的重链可变区基础氨基酸序列上进行如下三个突变：V73D、T97A。
2.一组特异性识别DNA受紫外线照射造成的嘧啶二聚体的抗体，所述的抗体的轻链可变区基础氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述抗体的重链可变区基础氨基酸序列如SEQID NO.2所示，其特征在于：
所述的抗体的轻链可变区为：在所述的轻链可变区基础氨基酸序列上进行如下六个突变：S26N、N33D、N35I、L88Q、Q95L、L98R；
所述的抗体的重链可变区为：
在所述的重链可变区基础氨基酸序列上进行如下四个突变：Y52H、D57G、V73D、T97A；
或，在所述的重链可变区基础氨基酸序列上进行如下五个突变：Y52H、D57G、V73D、T97A、Y109S；
或，在所述的重链可变区基础氨基酸序列上进行如下六个突变：A12V、Y52H、D57G、A72T、V73D、T97A。
3.根据权利要求1或2所述的抗体，其特征在于，所述的嘧啶二聚体为6-4光产物。
4.根据权利要求1或2所述的抗体，其特征在于，所述的抗体Fc区为人或鼠IgG的Fc区。
5.权利要求1-4任一所述的抗体在制备鉴定紫外线照射引起的组织或器官损伤的试剂盒或药物中的应用。
6.权利要求1-4任一所述的抗体在制备鉴定生物体因紫外线照射导致的损伤的试剂盒中的应用，所述的生物体为病毒、支原体、细菌、真菌、单细胞真核生物、多细胞真核生物。
7.权利要求1-4任一所述的抗体在制备与DNA受紫外线照射引起的损伤相关的疾病的诊断试剂盒中的应用，所述疾病为皮肤衰老、皮肤癌、以及由紫外线照射导致的视网膜病变或癌变。
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