JPWO2005071405A1 - 膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成方法とその装置 - Google Patents

膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成方法とその装置 Download PDF

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Abstract

装置を小型化するとともに、簡便であり、多チャンネル化を図ることができる膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成方法とその装置を提供する。小孔１４を有する水平の隔壁１３の下側のマイクロ流路１２にバッファ溶液１８を満たし、前記隔壁１３の小孔１４に対応して形成されるチャンバー１７とこのチャンバー１７内に液だめ溝１５を備え、前記バッファ溶液１８で満たした小孔１４上に微量の脂質溶液２０を滴下し、薄い脂質溶液層２１を形成し、前記チャンバー１７に上部よりバッファ溶液２３を滴下し、平面脂質二重膜２４を形成する。

Description

本発明は、バイオテクノロジー、バイオチップ、膜タンパク質分析、創薬スクリーニング、バイオセンサーなどの分野に用いられる膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成方法とその装置に関するものである。
イオンチャンネル等膜タンパク質分析のための平面脂質二重膜作製の代表的な従来方法として、はけ塗り法やＬＢ法（Ｌｏｎｇｍｕｉｒ−Ｂｌｏｄｇｅｔｔｅ法）が挙げられる。両者とも、バッファを満たしたチャンバー内でテフロン(登録商標)シートなどに開けた数百ミクロン程度の小孔に、平面脂質二重膜を形成する方法であるが、前者は脂質溶液をはけで小孔に塗る方法、後者は、液体表面に脂質の単分子膜が形成されることを利用して、テフロン(登録商標)シートの両側のチャンバーの溶液表面を徐々に上昇させることによって平面脂質二重膜を形成する方法である。
図１はそのＬＢ法による平面脂質二重膜形成法を示す模式図である。
この図において、１はテフロン(登録商標)シート、２はそのテフロン(登録商標)シート１に開口された小孔、３は表面に脂質の単分子膜４が形成される溶液、５はバッファ溶液であり、テフロン(登録商標)シート１の両側のチャンバーの溶液３表面を徐々に上昇させることによって平面脂質二重膜６を形成するようにしている。
特開平０２−３５９４１号公報 特開平０５−２５３４６７号公報 特開平０７−２４１５１２号公報 特表２００２−５０５００７号公報 特表２００３−５１１６７９号公報 特願２００３−３２９６６７号 Ｈ．Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，"Ｇｌｏｂａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｃｈｉｐｓ"，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２９３，ｐｐ．２１０１−２１０５，２００１． Ｂ．Ａｌｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ；４ｔｈ Ｅｄ．，"Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２． Ｃ．Ｍｉｌｌｅｒ，ｅｄ．，"Ｉｏｎ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ，"Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９８６． Ｔ．Ｉｄｅ ａｎｄ Ｔ．Ｙａｎａｇｉｄａ，"Ａｎ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｌｉｐｉｄ Ｂｉｌａｙｅｒ Ｆｏｒｍｅｄ ｏｎ ａｎ Ａｇａｒｏｓｅ−Ｃｏａｔｅｄ Ｇｌａｓｓ ｆｏｒ Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ａｎｄ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ Ｉｏｎ Ｃｈａｎｎｅｌｓ，"Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２６５，ｐｐ．５９５−５９９，１９９９． Ｔ．Ｉｄｅ，Ｙ．Ｔａｋｅｕｃｈｉ ａｎｄ Ｔ．Ｙａｎａｇｉｄａ，"Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｐｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ Ｓｉｇｎａｌｓ ｆｒｏｍ Ｓｉｎｇｌｅ Ｉｏｎ Ｃｈａｎｎｅｌｓ，"Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，３（１），ｐｐ．３３−４２，２００２． Ｊ．Ｔ．Ｇｒｏｖｅｓ，Ｎ．Ｕｌｍａｎ，ａｎｄ Ｓ．Ｇ．Ｂｏｘｅｒ，"Ｍｉｃｒｏｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ Ｆｌｕｉｄ Ｌｉｐｉｄ Ｂｉｌａｙｅｒｓ ｏｎ Ｓｏｌｉｄ Ｓｕｐｐｏｒｔｓ，"Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２７５，ｐｐ．６５１−６５３． Ｍ．Ｍａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，"Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ Ｔｅｆｌｏｎ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｆｏｒ Ｌｏｗ−Ｎｏｉｓｅ Ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ ｏｆ Ｉｏｎ Ｃｈａｎｎｅｌｓ ｉｎ Ｐｌａｎａｒ Ｌｉｐｉｄ Ｂｉｌａｙｅｒｓ，"Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，Ｖｏｌ．８５，ｐｐ．２６８４−２６９５，２００３． Ｆｅｒｔｉｇ ｅｔ ａｌ．，"Ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ Ｇｌａｓｓ Ｃｈｉｐ ｆｏｒ Ｉｏｎ−Ｃｈａｎｎｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，"Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｅ，Ｖｏｌ．６４，０４０９０１（Ｒ），２００１． 鈴木宏明，野地博行，竹内昌治．生物物理，４３巻，ＳＵＰＰＬＥＭＥＮＴ １ Ｓ１１８頁 Ｂ３７４，２００３年８月
しかしながら、上記した両形成方法とも、数ｃｍ程度の大きなチャンバーが必要であり、デッドボリュームが大きく、顕微鏡観察も不可能である。また、これらの方法により流路内に複数の小孔を設けて、複数の平面脂質二重膜を同時に形成した場合、隣り合う小孔（平面脂質二重膜）同士は流路中のバッファ液により電気的に導通しているため、個々の電気生理計測を行うことは難しい。
また、一度に形成できる平面脂質二重膜は基本的に一つであり、分析の多チャンネル化は不可能である。さらに、これらの形成方法で平面脂質二重膜を形成するには職人的熟練を要し、再現性にも乏しい。
そこで、本願発明者らは既に、第１及び第２のマイクロ流路を形成して、第２のマイクロ流路へ脂質溶液を流して、その脂質溶液を制御することにより、平面脂質二重膜を形成する人工脂質膜の形成方法及びその装置を提案している（上記特許文献６）。
これによれば、まず、第１のマイクロ流路にバッファ溶液（水溶液）を満たし、次に、小孔を有する第２のマイクロ流路に脂質溶液を満たし、次に、この第２のマイクロ流路に空気を注入することにより脂質溶液を排出する。このとき小孔のバッファ溶液の界面には脂質溶液の一部が残留する。次に、第２のマイクロ流路にバッファ溶液が注入されて空気を押し出し、空気をバッファ溶液に置換する。すると小孔には平面脂質二重膜が形成される。
しかしながら、この方法によれば、平面脂質二重膜の形成工数が多くなり、複雑であり、また、平面脂質二重膜の膜厚の制御が難しい。
また、近年、マルチチャンバーに複数種類の試薬や、複数種類のタンパク質を供給してそれらの反応・結合を計測することが要請されており、従来は、この要請に応えられていないのが現状である。
本発明は、上記状況に鑑みて、装置を小型化するとともに、簡便であり、分析の多チャンネル化を図ることができる膜タンパク質分析用平面脂質二重膜アレイの形成方法とその装置を提供することを目的とする。
本発明は、上記目的を達成するために、
〔１〕膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成方法において、小孔を有する水平の隔壁の下側のマイクロ流路にバッファ溶液を満たし、前記隔壁の小孔に対応して形成されるチャンバーとこのチャンバー内の前記隔壁上に液だめ溝を備え、前記バッファ溶液で満たした小孔上に微量の脂質溶液を滴下し、薄い脂質溶液層を形成し、前記チャンバーに上部よりバッファ溶液を滴下し、平面脂質二重膜を形成することを特徴とする。
〔２〕上記〔１〕記載の膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成方法において、前記薄い脂質溶液層の膜厚を制御することを特徴とする。
〔３〕上記〔１〕又は〔２〕記載の膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成方法において、前記バッファ溶液に目的の膜タンパク質を組み込んだリポソーム（脂質二重膜の球形ベシクル）をいれておき、前記平面脂質二重膜と融合させ、前記膜タンパク質を前記平面脂質二重膜に組み込むことを特徴とする。
〔４〕上記〔１〕記載の膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成方法において、前記チャンバーを一体的に複数個形成することを特徴とする。
〔５〕上記〔４〕記載の膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成方法において、前記複数個のチャンバーをアレイ状に形成することを特徴とする。
〔６〕上記〔４〕又は〔５〕記載の膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成方法において、前記個々のチャンバーに異種のタンパク質を含むリポソームを与え、多種類のタンパク質を一括して同時計測できるようにすることを特徴とする。
〔７〕上記〔４〕又は〔５〕記載の膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成方法において、前記個々のチャンバーにおける複数種類の試薬や、複数種類のタンパク質との反応・結合を一括して同時計測できるようにすることを特徴とする。
〔８〕上記〔４〕又は〔５〕記載の膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成方法において、個々のチャンバーを温度の異なるように制御して異種のタンパク質を含むリポソームを与え、温度の異なるタンパク質を一括して同時計測できるようにすることを特徴とする。
〔９〕膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成装置において、基板と、この基板と平行に、この基板上に設けられる隔壁と、前記基板と前記隔壁との間に形成されるマイクロ流路と、前記隔壁に形成される小孔と、この小孔の周囲に形成される液だめ溝を備えるチャンバーと、このチャンバーに上部より脂質溶液及びバッファ溶液を滴下する微小注入装置を具備することを特徴とする。
〔１０〕上記〔９〕記載の膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成装置において、さらに、前記チャンバーに対応する前記基板上に形成される第１の薄膜電極と、前記液だめ溝の近傍に配置される第２の薄膜電極とを具備することを特徴とする。
〔１１〕上記〔９〕又は〔１０〕記載の膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成装置において、前記脂質溶液層の膜厚を制御するために前記隔壁に前記液だめ溝に連通する通路を具備することを特徴とする。
〔１２〕上記〔９〕又は〔１０〕記載の膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成装置において、一体的に形成される複数個のチャンバーを具備することを特徴とする。
〔１３〕上記〔１２〕記載の膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成装置において、前記複数個のチャンバーはアレイ状に配置されることを特徴とする。
〔１４〕上記〔１２〕又は〔１３〕記載の膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成装置において、前記微小注入装置が各チャンバー毎に位置決めされるカバーを具備することを特徴とする。
〔１５〕上記〔１２〕又は〔１３〕記載の膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成方法において、前記個々のチャンバーに異種のタンパク質を含むリポソームを与え、多種類のタンパク質を一括して同時計測する手段を具備することを特徴とする。
〔１６〕上記〔１２〕又は〔１３〕記載の膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成方法において、アレイ状の個々のチャンバーを温度の異なるように制御して異種のタンパク質を含むリポソームを与え、温度の異なるタンパク質を一括して同時計測する手段を具備することを特徴とする。
〔１７〕上記〔９〕記載の膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成装置において、前記小孔は下方から上方に向かって径が小さくなるテーパを具備することを特徴とする。
〔１８〕上記〔９〕記載の膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成装置において、前記隔壁はシリコン基板からなり、このシリコン基板をエッチングすることにより前記小孔を形成することを特徴とする。
〔１９〕上記〔１０〕記載の膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成装置において、前記第１の薄膜電極と、前記第２の薄膜電極との間に電圧を印加し、膜タンパク質の特性を計測する手段を具備することを特徴とする。
従来のＬＢ法による平面脂質二重膜形成法を示す模式図である。 本発明の第１実施例を示す平面脂質二重膜の形成装置の模式図である。 本発明にかかる脂質溶液を示す模式図である。 本発明の第２実施例を示す平面脂質二重膜の形成装置の模式図である。 本発明にかかるリポソームを用いた膜タンパク質の平面脂質二重膜への組み込みを示す図である。 本発明の第３実施例を示す平面脂質二重膜の形成装置の模式図である。 本発明の第４実施例を示す平面脂質二重膜の形成装置の模式図である。 本発明の第４実施例を示す平面脂質二重膜の形成装置のウエルアレイチップの製造工程断面図である。 本発明の第４実施例を示すアレイ状の平面脂質二重膜の形成装置の部分拡大平面図である。 本発明の第５実施例を示すアレイ状の平面脂質二重膜の形成装置の微小注入装置の斜視図である。
本発明は、小孔を有する水平の隔壁の下側のマイクロ流路にバッファ溶液を満たし、前記隔壁の小孔に対応して形成されるチャンバーとこのチャンバー内の隔壁上に液だめ溝を備え、前記バッファ溶液で満たした小孔上に微量の脂質溶液を滴下し、薄い脂質溶液層を形成し、前記チャンバーに上部よりバッファ溶液を滴下し、平面脂質二重膜を形成する。よって、精密に脂質溶液の量を制御して注入することができ、簡便に、再現性よく平面脂質二重膜を形成（再構成）することができる。
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
図２は本発明の第１実施例を示す平面脂質二重膜の形成装置の模式図、図３は脂質溶液を示す模式図である。
図２において、１１はガラス基板、１２はマイクロ流路、１３は隔壁、１４はその隔壁１３に形成される小孔（開口部分）、１５はその隔壁１３上に形成される液だめ溝、１７はウエル１６により構成されるチャンバー、１８はマイクロ流路１２及び小孔（開口部分）１４に満たされるバッファ液、１９は微小注入装置（マイクロインジェクタ）、２０は微小注入装置１９から滴下される脂質溶液、２１は脂質溶液層、２２はバッファ液を滴下する微小注入装置（マイクロインジェクタ又はピペット）、２３はこの微小注入装置２２から滴下されるバッファ液、２４は平面脂質二重膜である。
この平面脂質二重膜の形成（再構成）装置は、上述したように、マイクロ流路１２とチャンバー１７が、小孔（開口部分）１４を有する隔壁１３で隔てられている構造をとる。
そこで、まず、図２（ａ）に示すように、マイクロ流路１２及び小孔１４をバッファ液１８（ＫＣｌ又は水溶液）で満たす。このとき、表面張力によって、バッファ液１８の界面は小孔（開口部分）１４で止まる。なお、ここでは、バッファ液１８の界面が小孔（開口部分）１４で止まりやすくするために、小孔（開口部分）１４の径が下方から上方に向かって小さくなるようなテーパ１３Ａを小孔１４に形成するようにしている。
次に、図２（ｂ）に示すように、微小注入装置１９を用いて脂質溶液２０を小孔（開口部分）１４に滴下する。このとき、余分な脂質溶液２０は、小孔（開口部分）１４の周囲に設けられた液だめ溝１５に流れ込むため、バッファ液１８の界面に残留する脂質溶液２０の膜（脂質溶液層２１）は十分に薄く（サブマイクロメートル）なる。
最後に、図２（ｃ）に示すように、微小注入装置２２を用いてバッファ液２３をチャンバー１７に滴下すると、平面脂質二重膜（１０ｎｍ程度）２４が自発的に形成される。
上記したように、（１）マイクロ流路１２及び小孔１４をバッファ液１８で満たす、（２）微量の脂質溶液２０を滴下する、（３）チャンバー１７にバッファ液２３を滴下すると、脂質溶液２０の層（脂質溶液層２１）が自発的に平面脂質二重膜２４となる。
ここで、図３（ａ）に示すように、脂質溶液（デカン）２０は親水基２０Ａと疎水基２０Ｂを有しており、薄膜化することにより、図３（ｂ）に示すように、疎水基２０Ｂを内側として整列し、さらに疎水基２０Ｂ同士が係合し、互いに結合して平面脂質二重膜２４が形成される。
そのためには、脂質溶液を極力薄膜化（ｎｍオーダー）する必要がある。そこで、後述するように、液だめ溝１５に連通するような膜厚制御手段を講じることができる。
図４は本発明の第２実施例を示す平面脂質二重膜の形成装置の模式図である。
この第２実施例では、上記した第１実施例に加え、マイクロ流路１２のガラス基板１１上に第１の薄膜電極２５と、ウエル１６により構成されるチャンバー１７内の隔壁１３上に第２の薄膜電極２６を形成する。つまり、ウエル１６により構成されるチャンバー１７の中には独立した薄膜電極２５，２６が配置されているため、膜電位、電流の計測ができる。
なお、分析の対象となる膜タンパク質をバッファ液１８の界面に形成された平面脂質二重膜２４に組み込むには、同じ脂質二重膜からなる球形のベシクル（リポソーム：ｌｉｐｏｓｏｍｅ）を用いる。
図５に示すように、チャネルタンパク質の一種であるアラメチシン（Ａｌａｍｅｔｈｉｃｉｎ）３２を含むリポソーム３１を調製し、それを液滴としてバッファ液２３に混入し平面脂質二重膜２４に滴下する。リポソーム３１が平面脂質二重膜２４に接触すると、それらは自発的に融合し、アラメチシン３２は平面脂質二重膜２４に組み込まれる。本発明者らは、テストケースとして、従来の平面脂質二重膜法によって形成された平面脂質二重膜にアラメチシンを含むリポソームを融合させることによってアラメチシンを平面脂質二重膜に組み込むことに成功した。このアラメチシンは常にオープンの状態であるチャネル状のペプチドであり、これを含むバッファ液の注入に伴い膜電流が計測され、膜タンパク質（ペプチド）の融合が確認された。
図６は本発明の第３実施例を示す平面脂質二重膜の形成装置の模式図である。
この実施例では、液だめ溝１５に連通する通路１２Ａを形成して、バッファ液１８の界面に残留する脂質溶液層２１の膜厚を制御できるように構成している。つまり、バッファ液１８の界面に残留する脂質溶液２０からなる脂質溶液層２１の膜厚が厚い場合には、液だめ溝１５に連通する通路１２Ａから過剰な脂質溶液２０を吸引することにより、形成される脂質溶液層２１の膜厚を薄くすることができ、逆にバッファ液１８の界面に残留する脂質溶液２０からなる脂質溶液層２１の膜厚が薄い場合には、液だめ溝１５に連通する通路１２Ａから脂質溶液２０を押し返すことにより形成される脂質溶液層２１の膜厚を厚くすることができる。
図７は本発明の第４実施例を示す平面脂質二重膜の形成装置の模式図であり、図７（ａ）はそのチャンバーがアレイ状に配置された上面を示す斜視図、図７（ｂ）はそのウエルアレイチップの断面図である。
これらの図において、４１はガラス基板、４２はマイクロ流路、４３はシリコンからなる隔壁、４４はそのシリコンからなる隔壁４３がエッチングされて形成される小孔、４５はその小孔４４の回りに形成される液だめ溝、４７はウエル４６で形成されるチャンバー、４８はマイクロ流路４２及び小孔４４に満たされるバッファ溶液、４９は平面脂質二重膜、５０はその平面脂質二重膜４９上に滴下されるバッファ溶液、５１はガラス基板４１上であって小孔４４の下部に配置される第１の薄膜電極、５２は液だめ溝４５の外周に形成される第２の薄膜電極、５３は第１の薄膜電極５１と第２の薄膜電極５２間に配置される電流計付き電源である。なお、隔壁４３はシリコンに代えて、機械的に加工されたアクリルプラスチックを用いるようにしてもよい。
上記したように、この実施例では、各チャンバー４７がウエル４６で区画されたアレイ状に配置される。
したがって、個々のチャンバー４７に異種の膜タンパク質を含むリポソームを与え、多種類の膜タンパク質を一括して同時計測することができる。すなわち、試薬の微小注入装置を用い、本実施例によりアレイ状に構成された複数の平面脂質二重膜各々へ、異種の膜タンパク質を組み込み、多チャンネルでの同時電気計測を行う。例えば、膜タンパク質ＡとＢを別個の平面脂質二重膜に組み込んだ後、どちらかの膜タンパク質を抑制または活性化させるような試薬を、流路を通して与えた場合、膜タンパク質ＡとＢでは異なった電気信号が得られる。さらに、別の効果を持つ試薬を流せば、また別の信号が得られる。このように、膜タンパク質がどの試薬にどのように反応するかを、複数同時に感度よく計測できる。
本発明による平面脂質二重膜を用いた計測システムは、図示しないが、平面脂質膜チップに加え、膜タンパク質（リポソーム）注入装置、試薬注入用シリンジポンプ、微弱な膜電流・電圧を増幅するためのアンプ（パッチアンプ）、結果解析用のコンピュータからなる。はじめに本発明によりアレイ状に平面脂質二重膜を構成し、そこに微小注入装置により対象となる膜タンパク質を含むリポソームを与える。マイクロ流路から、様々な試薬を与えた場合の膜電流・電圧が薄膜電極により計測され、アンプで増幅された信号がコンピュータに取り込まれる。出力信号は、コンピュータ上で解析され、それぞれの膜タンパク質の同定、機能解析を行うことができる。
また、アレイ状の個々のチャンバーを温度の異なるように制御して異種のタンパク質を含むリポソームを与え、温度の異なるタンパク質を一括して同時計測するようにしてもよい。その場合にはチャンバー毎に加熱装置（図示なし）を備えるようにする。
図８は本発明の第４実施例を示す平面脂質二重膜の形成装置のウエルアレイチップの製造工程断面図である。
（１）まず、図８（ａ）に示すように、シリコン基板６１の上下面に酸化膜６２を形成する。
（２）次に、図８（ｂ）に示すように、酸化膜６２をパターニングして反応性イオンエッチングにより微小な孔（幅５０〜１００μｍ、深さ２００μｍ）６３を形成する。
（３）次に、図８（ｃ）に示すように、ＴＭＡＨ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）エッチングによりマイクロ流路６４及び小孔６５を形成する。
（４）次に、図８（ｄ）に示すように、小孔６５の回りに液だめ溝６６を酸化膜６２及びシリコン基板６１のエッチングにより形成する。
（５）次に、図８（ｅ）に示すように、電気的絶縁のためチップ全体をパリレンＣ６７でコーティングする。
（６）次に、図８（ｆ）に示すように、下部電極６８とガラス基板６９を下側に接着する。上側には上部電極（金）７０がパターニングされるとともに、厚さ４０μｍのレジスト（ＳＵ８；商品名）ウエル７１が形成される。
図９は本発明の第４実施例を示すアレイ状の平面脂質二重膜の形成装置の部分拡大平面図であり、図９（ａ）はそのアレイ状のチップを示し、図９（ｂ）はその拡大図である。
これらの図において、小孔６５の回りには４角形状の堀状の液だめ溝６６が形成され、その４角形状の堀状の液だめ溝６６外周には上部電極７０が形成され、各チャンバーを区画するようにＳＵ８ウエル７１が形成されている。
因みに、この図において、中央の小孔６５のサイズは２００μｍ、ウエル７１のサイズは９００μｍである。液だめ溝６６のサイズは５００μｍで深さは４０μｍ、液だめ溝６６の容量は８ｎｌ（８ナノリットル）である。上部電極７０は個々のチャンバー毎に電気的に分離されており、下部電極６８は共通となっている。
図１０は本発明の第５実施例を示すアレイ状の平面脂質二重膜の形成装置の微小注入装置の斜視図である。
この図において、８１〜８９はウエルアレイチップ９２の各チャンバーに対応する微小注入装置のノズル、９０はそれらの微小注入装置のノズル８１〜８９をウエルアレイチップ９２の各チャンバーに位置決めするために一体化されたカバーである。９１はウエルアレイチップ９２に位置決めするために係合する係合部材である。
また、膜タンパク質を含むアレイ状の平面脂質二重膜が形成された直後にそのカバー９０をウエルアレイチップ９２上に装着することにより平面脂質二重膜の乾燥による計測への支障を緩和することもできる。
計測時には、各チャンバー毎に対応する微小注入装置のノズル８１〜８９から適宜、バッファ溶液を滴下し、バッファ溶液の乾燥を回避することができる。
なお、本発明は上記実施例に限定されるものではなく、本発明の趣旨に基づき種々の変形が可能であり、これらを本発明の範囲から排除するものではない。
以上、本発明によれば、以下のような効果を奏することができる。
（１）膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成装置において、基板と、この基板と平行に、この基板上に設けられる隔壁と、前記基板と前記隔壁との間に形成されるマイクロ流路と、前記隔壁に形成される小孔と、この小孔の周囲に形成される液だめ溝を備えるチャンバーを設け、このチャンバーに上部より微小注入装置（マイクロインジェクタ）によって、精密に脂質溶液の量を制御して注入することができ、簡便に、再現性よく平面脂質二重膜を形成（再構成）することができる。
（２）アレイ状に配置された小孔およびチャンバーは、それぞれ計測系として独立しているため、多種類の計測を同時に一括して行うことができる。そのため、膜タンパク質分析を高速化することができる。
（３）計測系および試薬等注入のための流路などもマイクロサイズ（１ｍｍ以下）であるため、デッドボリュームが飛躍的に縮小され、必要な試薬・サンプル量が激減する。
（４）計測系が微小であるため、外部の電気的ノイズの影響を受け難く、より精密な電気的計測が可能となる。
本発明は、バイオテクノロジー、バイオチップ、膜タンパク質分析、創薬スクリーニング、バイオセンサーに適しており、超高感度膜タンパク質分析装置、超高感度・多チャンネル創薬スクリーニング装置、超高感度イオンセンサーに適用可能である。

Claims (19)

  1. （ａ）小孔を有する水平の隔壁の下側のマイクロ流路にバッファ溶液を満たし、
    （ｂ）前記隔壁の小孔に対応して形成されるチャンバーと該チャンバー内の前記隔壁上に液だめ溝を備え、前記バッファ溶液で満たした小孔上に微量の脂質溶液を滴下し、薄い脂質溶液層を形成し、
    （ｃ）前記チャンバーに上部よりバッファ溶液を滴下し、平面脂質二重膜を形成することを特徴とする膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成方法。
  2. 請求項１記載の膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成方法において、前記薄い脂質溶液層の膜厚を制御することを特徴とする膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成方法。
  3. 請求項１又は２記載の膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成方法において、前記バッファ溶液に目的の膜タンパク質を組み込んだリポソーム（脂質二重膜の球形ベシクル）をいれておき、前記平面脂質二重膜と融合させ、前記膜タンパク質を前記平面脂質二重膜に組み込むことを特徴とする膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成方法。
  4. 請求項１記載の膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成方法において、前記チャンバーを一体的に複数個形成することを特徴とする膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成方法。
  5. 請求項４記載の膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成方法において、前記複数個のチャンバーをアレイ状に形成することを特徴とする膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成方法。
  6. 請求項４又は５記載の膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成方法において、前記個々のチャンバーに異種のタンパク質を含むリポソームを与え、多種類のタンパク質を一括して同時計測できるようにすることを特徴とする膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成方法。
  7. 請求項４又は５記載の膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成方法において、前記個々のチャンバーにおける複数種類の試薬や、複数種類のタンパク質との反応・結合を一括して同時計測できるようにすることを特徴とする膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成方法。
  8. 請求項４又は５記載の膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成方法において、個々のチャンバーを温度の異なるように制御して異種のタンパク質を含むリポソームを与え、温度の異なるタンパク質を一括して同時計測できるようにすることを特徴とする膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成方法。
  9. （ａ）基板と、
    （ｂ）該基板と平行に、該基板上に設けられる隔壁と、
    （ｃ）前記基板と前記隔壁との間に形成されるマイクロ流路と、
    （ｄ）前記隔壁に形成される小孔と、該小孔の周囲に形成される液だめ溝を備えるチャンバーと、
    （ｅ）該チャンバーに上部より脂質溶液及びバッファ溶液を滴下する微小注入装置を具備することを特徴とする膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成装置。
  10. 請求項９記載の膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成装置において、さらに、前記チャンバーに対応する前記基板上に形成される第１の薄膜電極と、前記液だめ溝の近傍に配置される第２の薄膜電極とを具備することを特徴とする膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成装置。
  11. 請求項９又は１０記載の膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成装置において、前記脂質溶液層の膜厚を制御するために前記隔壁に前記液だめ溝に連通する通路を具備することを特徴とする膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成装置。
  12. 請求項９又は１０記載の膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成装置において、一体的に形成される複数個のチャンバーを具備することを特徴とする膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成装置。
  13. 請求項１２記載の膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成装置において、前記複数個のチャンバーはアレイ状に配置されることを特徴とする膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成装置。
  14. 請求項１２又は１３記載の膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成装置において、前記微小注入装置が各チャンバー毎に位置決めされるカバーを具備することを特徴とする膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成装置。
  15. 請求項１２又は１３記載の膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成方法において、前記個々のチャンバーに異種のタンパク質を含むリポソームを与え、多種類のタンパク質を一括して同時計測する手段を具備することを特徴とする膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成装置。
  16. 請求項１２又は１３記載の膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成方法において、アレイ状の個々のチャンバーを温度の異なるように制御して異種のタンパク質を含むリポソームを与え、温度の異なるタンパク質を一括して同時計測する手段を具備することを特徴とする膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成装置。
  17. 請求項９記載の膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成装置において、前記小孔は下方から上方に向かって径が小さくなるテーパを具備することを特徴とする膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成装置。
  18. 請求項９記載の膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成装置において、前記隔壁はシリコン基板からなり、該シリコン基板をエッチングすることにより前記小孔を形成することを特徴とする膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成装置。
  19. 請求項１０記載の膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成装置において、前記第１の薄膜電極と、前記第２の薄膜電極との間に電圧を印加し、膜タンパク質の特性を計測する手段を具備することを特徴とする膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の形成装置。
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