JPWO2003091727A1 - 血液適合性の評価方法 - Google Patents
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Abstract
フィブリノーゲンと少なくとも１種の他の血漿蛋白との混合物を溶解してなる水溶液を提供し、該水溶液を医用材料の試験片と接触させて、該水溶液に含まれるフィブリノーゲンを該試験片に吸着させ、該試験片に吸着したフィブリノーゲンの量を測定し、そして該吸着したフィブリノーゲンの量から該医用材料の血液適合性を評価することを包含する、医用材料の血液適合性を評価するための方法を開示する。
Description
技術分野
本発明は、医用材料の血液適合性を評価するための方法に関する。更に詳細には、フィブリノーゲンと少なくとも１種の他の血漿蛋白との混合物を溶解してなる水溶液を提供し、該水溶液を医用材料の試験片と接触させて、該水溶液に含まれるフィブリノーゲンを該試験片に吸着させ、該試験片に吸着したフィブリノーゲンの量を測定し、そして該吸着したフィブリノーゲンの量から該医用材料の血液適合性を評価することを包含する、医用材料の血液適合性を評価するための方法に関する。本発明の血液適合性の評価方法を用いると、個体差などによって評価結果に違いが生じる血小板過剰血漿を使うことなく、再現性良く、簡便に血液適合性を評価することが可能となる。
従来技術
近年、各種の高分子材料の医用への適応について検討が進められており、人工腎臓用膜、血漿分離用膜、カテーテル、人工肺用膜、人工血管、癒着防止膜、人工皮膚等への高分子材料の利用が期待されている。これらの用途においては、生体にとって異物である合成材料（高分子材料）を生体組織や体液と接触させて使用することになるので、医用材料となる高分子材料は生体適合性を有することが必要である。医用材料に要求される生体適合性はその目的や使用法によって異なるが、血液と接する医用材料には、血液凝固系の抑制、血小板の粘着・活性化の抑制、補体系の活性化の抑制という特性が求められる。このような特性を有する抗血栓性材料は、疾患の診断や治療に使われる機器や用具などに使われており、例えば、ディスポーザブル注射針、ディスポーザブル注射筒、ディスポーザブルチューブ、ディスポーザブルカテーテル、人工腎臓用ディスポーザブルカニューレ、採血用器具、血液バッグ、輸血用器具、輸液用器具、人工腎臓用血液回路、中空糸透析器、人工関節、眼内レンズ、人工肺、人工血管などに使用されている。
種々の材料を生体組織や血液と接触させた場合、最初に起こる現象が蛋白質吸着であり、吸着した蛋白質を介して細胞接着が生じる。このような細胞接着によって血栓形成、炎症、貧食などが生じることになる。血栓形成は血液中の多成分が関与する複雑な階級反応であるが、主に２つのプロセスからなるとされている。１つは凝固因子のカスケード反応による不溶性フィブリンの生成であり、他の１つは血小板の凝集による血栓の生成である。この２つのプロセスにより典型的な血栓が形成される。医療器具等に血栓が形成されると、器具の本来果たすべき機能は著しく損なわれることになる。例えば、人工血管であれば栓塞し、機能の発現は困難となるばかりでなく、剥離した血栓が血流に乗り、他の臓器において栓塞を起こすことも十分予想される。
また、血清中には補体系という２０種の血漿蛋白より構成される生体防御に重要な役割を担う系が存在する。補体系は抗体の殺菌活性に重要な役割を果たし、その活性経路は古典経路および第２経路の２つに大別される。血液が医用材料に接触すると、補体の活性化が主に第２経路によって起こり、免疫応答の異常や血圧上昇といった症状を引き起こす。
上述したように、医用材料にはその目的、使用法に応じた生体適合性が要求されるが、特に血小板吸着量評価は抗血栓性との相関の良さから、抗血栓性材料を評価する際に初めに選択する評価方法となっている。血栓形成反応には、凝固因子に加え血小板も重要な役割を担っている。血小板の働きは血管への付着から始まるが、これには凝固第ＶＩＩＩ因子が関与し、続く凝固反応には第ＸＩＩ因子が関与する。現在使用されている医用材料の多くは血液と接触する箇所で使用されているため、生体から血小板過剰血漿（Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｒｉｃｈ Ｐｌａｓｍａ、“ＰＲＰ”と略す）を調製し、ＰＲＰを用いてそこに存在する血小板の材料に対する付着を評価することで血小板吸着量評価が行われている。この方法は、測定手技が確立されており、血栓形成の評価として採用されている（”Ｂｌｏｏｄ ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｐｏｌｙ（２−ｍｅｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌａｃｒｙｌａｔｅ）（ＰＭＥＡ）−ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｏｎ ＰＭＥＡ ｓｕｒｆａｃｅ”，Ｍａｓａｒｕ Ｔａｎａｋａ，Ｔａｄａｓｈｉ Ｍｏｔｏｍｕｒａ，Ｍｉｈｏ Ｋａｗａｄａ，Ｔａｋａｏ Ａｎｚａｉ，Ｙｕｕ Ｋａｓｏｒｉ，Ｔｏｓｈｉｆｕｍｉ Ｓｈｉｒｏｙａ，Ｋｅｎｉｃｈｉ Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｍａｋｏｔｏ Ｏｎｉｓｈｉ，Ａｋｉｒａ Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２１，１４７１−１４８１（２０００））。
上述した血液適合性の評価方法は生体由来の材料であるＰＲＰを用いるため、個体差や血漿採血の日時、採血方法などがＰＲＰの血小板量および血小板の形態に影響を与える。このようなＰＲＰの性質のばらつきが測定系の不安定要因となっている。従って、再現性の高い、簡便な血液適合性の評価方法の確立が望まれている。
その他の血液適合性の評価方法としては、例えば、単離した血小板をＲＩ（１１１Ｉｎ等の放射性同位元素）でラベルし、材料に接触させ、材料に吸着した血小板の放射活性を評価することで、血小板吸着量を求める方法（”Ｂａｂｏｏｎ Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ａｄｈｅｓｉｏｎ ｔｏ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ Ｍａｔｅｒｉ−ａｌｓ”，Ｊｏｓｅｐｈ Ａ．Ｃｈｉｎｎ，Ｔｈｏｍａｓ Ａ．Ｈｏｒｂｅｔｔ，ａｎｄ Ｂｕｄｄｙ Ｄ．Ｒａｔｎｅｒ，Ｔｈｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｔａｓｉｓ，６５，６０８−６１７（１９９１））が報告されている。しかし、この評価方法は、血小板の単離やＲＩによるラベル化といった複雑な操作が必要であるため、再現性の高い、簡便な血液適合性の評価方法の確立が望まれている。
発明の概要
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究の結果、驚くべきことに、フィブリノーゲンと少なくとも１種の他の血漿蛋白との混合物を溶解してなる水溶液を医用材料の試験片と接触させることで、試験片に吸着させたフィブリノーゲンの量は、ＰＲＰを用いて測定した血小板吸着量と良好な相関性を示すことを知見し、本発明を完成するに至った。
従って、本発明の主の目的は、再現性良く、簡便に血液適合性の評価を行うための方法を提供することにある。
本発明の上記及びその他の諸目的、諸特徴ならびに諸利益は、添付の図面を参照しながら行う以下の詳細な説明及び請求の範囲から明らかになる。
発明の詳細な説明
本発明によれば、（ａ）フィブリノーゲンと少なくとも１種の他の血漿蛋白との混合物を溶解してなる水溶液を提供し、
（ｂ）該水溶液を医用材料の試験片と接触させて、該水溶液に含まれるフィブリノーゲンを該試験片に吸着させ、
（ｃ）該試験片に吸着したフィブリノーゲンの量を測定し、そして
（ｄ）該吸着したフィブリノーゲンの量から該医用材料の血液適合性を評価する、
ことを包含する、医用材料の血液適合性を評価するための方法が提供される。
次に、本発明の理解を容易にするために、まず本発明の基本的特徴及び好ましい態様を列挙する。
１．（ａ）フィブリノーゲンと少なくとも１種の他の血漿蛋白との混合物を溶解してなる水溶液を提供し、
（ｂ）該水溶液を医用材料の試験片と接触させて、該水溶液に含まれるフィブリノーゲンを該試験片に吸着させ、
（ｃ）該試験片に吸着したフィブリノーゲンの量を測定し、そして
（ｄ）該吸着したフィブリノーゲンの量から該医用材料の血液適合性を評価する、
ことを包含する、医用材料の血液適合性を評価するための方法。
２．該少なくとも１種の他の血漿蛋白がアルブミン及び免疫グロブリンを包含することを特徴とする、前項１に記載の方法。
３．該水溶液中のフィブリノーゲン／アルブミン／免疫グロブリンの重量比が、２／６０／１０〜８／９０／４０であることを特徴とする、前項２に記載の方法。
４．該水溶液が１００〜４００ｐｐｍのフィブリノーゲン、３，０００〜４，５００ｐｐｍのアルブミン及び５００〜２，０００ｐｐｍの免疫グロブリンを含むことを特徴とする、前項２又は３に記載の方法。
５．該水溶液が２００〜４００ｐｐｍのフィブリノーゲン、３，５００〜４，５００ｐｐｍのアルブミン及び６００〜１，７００ｐｐｍの免疫グロブリンを含むことを特徴とする、前項４に記載の方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、（ａ）フィブリノーゲンと少なくとも１種の他の血漿蛋白との混合物を溶解してなる水溶液を提供し、
（ｂ）該水溶液を医用材料の試験片と接触させて、該水溶液に含まれるフィブリノーゲンを該試験片に吸着させ、
（ｃ）該試験片に吸着したフィブリノーゲンの量を測定し、そして
（ｄ）該吸着したフィブリノーゲンの量から該医用材料の血液適合性を評価する、
ことを包含する、医用材料の血液適合性を評価するための方法である。
本発明の評価方法の工程（ａ）においては、フィブリノーゲンと少なくとも１種の他の血漿蛋白との混合物を溶解してなる水溶液（以下、屡々、「血漿蛋白混合水溶液」と称する）を提供する。フィブリノーゲンは血漿蛋白の１種であり、血栓形成に最も関与する細胞の一つである血小板の粘着に影響を与える吸着蛋白質である。フィブリノーゲンは細胞の接着を強めることが知られていることから、本発明においては、フィブリノーゲンに着目した。
本発明で用いるフィブリノーゲン以外の血漿蛋白に特に限定はないが、アルブミン、α１−セロムコイド、α１−アンチトリプシン、α１−マクログロブリン、α１−ハプトグロブリン、α１−セルロプラスミン、トランスフェリン、リポプロテイン、ＩｇＡ、γ−グロブリン（ＩｇＧ）、ＩｇＭ等の免疫グロブリン、Ｃｌｑ、Ｃ３、Ｃ４、フィブロネクチン等が挙げられる。本発明者は、フィブリノーゲンのみならず、フィブリノーゲンと少なくとも１種の他の血漿蛋白とを組み合わせて用いると、フィブリノーゲン吸着量と血小板吸着量との間に良好な相関性が存在することを知見した。その理由は明らかではないが、フィブリノーゲンと少なくとも１種の他の血漿蛋白とを組み合わせて用いると、生体内における環境と同様の相互作用が血漿蛋白の間に生じるためであると考えられる。
フィブリノーゲンと共に用いる少なくとも１種の他の血漿蛋白としては、アルブミンと免疫グロブリンが好ましい。血小板の接着に影響を与える血中に存在する吸着蛋白質は、フィブリノーゲン、アルブミン、γ−グロブリンの３種類であると言われており（「バイオマテリアル（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、ｐ．５６−６５、中原宣男、石原一彦、岩崎泰彦共著、コロナ社（１９９９））、フィブリノーゲンは細胞の接着を強め、アルブミンやγ−グロブリンは細胞の接着を弱めると報告されている。これら３種の血漿蛋白を組み合わせて用いた場合に、フィブリノーゲン吸着量と血小板吸着量との間に極めて良好な相関性が見られる。本発明で使用する免疫グロブリンに特に限定はなく、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭやＩｇＥなどが挙げられ、入手容易性からＩｇＧが好ましい。
フィブリノーゲンやその他の血漿蛋白としては、ヒト、牛、羊、ウサギ、ラット、マウスなどの蛋白や、遺伝子組み換え蛋白を用いることができる。しかし、ヒトの血液に対する血液適合性を評価する場合には、ヒト由来の蛋白を用いることが好ましい。
本発明の評価方法は、医用材料のヒト血液に対する適合性を評価することを主な目的とするため、血漿蛋白混合水溶液に含まれる血漿蛋白の割合（即ち、フィブリノーゲンに対する他の血漿蛋白の重量比）が、ヒト血液中に存在する血漿蛋白の割合と同一であることが好ましい。血漿蛋白の割合が血液中に存在する割合と同一であるということは、フィブリノーゲンの置かれている環境がヒト血液中の環境に近いということであり、このことが血小板吸着量とフィブリノーゲン吸着量との間に高い相関性が見られる理由の一つと考えられる。
血液中に存在する血漿蛋白の割合は、血液中の血漿蛋白濃度から容易に求めることができる。例えば、ワラック検査値ハンドブック（Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｔｅｓｔｓ、原著第６版、Ｊａｃｑｕｅｓ Ｗａｌｌａｃｈ著、福井次矢監訳、田島裕訳、医歯薬出版株式会社、（１９９７））によると、フィブリノーゲン、アルブミン及びγ−グロブリンのヒトの正常値は以下の値である。
本発明で用いる血漿蛋白混合水溶液がフィブリノーゲン、アルブミン及び免疫グロブリンの３種の血漿蛋白を含有する場合には、血漿蛋白混合水溶液におけるフィブリノーゲン／アルブミン／免疫グロブリンの重量比は、２／６０／１０〜８／９０／４０であることが好ましく、４／７０／１２〜８／９０／３４であることが更に好ましい。
更に本発明においては、血漿蛋白混合水溶液に含まれる血漿蛋白濃度に特に限定はないが、血液に存在する蛋白濃度の１／１０であることが好ましい。本発明の方法においては、血漿蛋白混合水溶液の血漿蛋白濃度が血液に存在する蛋白濃度の１／１０でも医用材料の血液適合性を評価するのに十分である。本発明で用いる血漿蛋白混合水溶液がフィブリノーゲン、アルブミン及び免疫グロブリンの３種の血漿蛋白を含有する場合には、上記表１に記載のヒト血液の血漿蛋白濃度に基づき、好ましいフィブリノーゲンの濃度は１００〜４００ｐｐｍ（即ち、ｍｇ／リットル）、更に好ましくは２００〜４００ｐｐｍとする。また、好ましいアルブミン濃度は３，０００〜４，５００ｐｐｍ、更に好ましくは３，５００〜４，５００ｐｐｍとし、好ましい免疫グロブリン濃度は５００〜２，０００ｐｐｍ、更に好ましくは６００〜１，７００ｐｐｍとする。
フィブリノーゲンと少なくとも１種の他の血漿蛋白との混合物を溶解する水系の溶媒としては、蛋白の変性などを防ぐためにｐＨ６〜８を維持することが可能な緩衝液であれば特に限定はない。入手の容易さから、生理食塩水やリン酸緩衝液が好ましい。血漿蛋白の混合物を溶解してなる水溶液は、蛋白溶液の調製に通常用いる方法で調製すればよく、水系の溶媒に血漿蛋白を０℃〜室温で静かに溶解するだけで調製することが可能である。
このようにして得られた血漿蛋白混合水溶液には、血漿蛋白の他に、緩衝液中の塩が含まれる。また、例えばショ糖などの糖類が含まれていてもかまわない。
本発明の評価方法の工程（ｂ）においては、血漿蛋白混合水溶液を医用材料の試験片と接触させて、血漿蛋白混合水溶液に含まれるフィブリノーゲンを該試験片に吸着させる。血漿蛋白混合水溶液と試験片を接触させる方法は、フィブリノーゲンが試験片に吸着することのできる方法であれば特に限定はなく、例えば、３７℃の血漿蛋白溶液に試験片を１〜３時間浸漬すればよい。
次に、本発明の評価方法の工程（ｃ）においては、試験片に吸着したフィブリノーゲンの量を測定する。試験片にはフィブリノーゲンと共に、少なくとも１種の他の血漿蛋白も吸着しているので、フィブリノーゲンの吸着量を選択的に測定しなければならない。具体的には、ＲＩ（放射性同位元素、例えば、１２５Ｉ）でラベルしたフィブリノーゲンを用い、試験片の放射活性を評価することで、フィブリノーゲンの吸着量を求める方法（Ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ ｆｉｂｉｒｉｎｏｇｅｎ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｔｏ ｐｏｌｙｓｔｙｌｅｎｅ，Ｗｅｉ−Ｂｏｒ Ｔｓａｉ，Ｊｏｈｎ Ｍ．Ｇｒｕｎｋｅｍｅｉｅｒ，Ｔｈｏｍａｓ Ａ．Ｈｏｒｂｅｔｔ，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，４４，１３０−１３９（１９９９））や、ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）で標識したフィブリノーゲンに特異的に結合する抗体を用いる酵素免疫学的評価法（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ；以下、屡々、“ＥＬＩＳＡ”と略す）が挙げられる。特異性が高いことと測定の簡便さから、本発明の工程（ｃ）で用いる方法としてはＥＬＩＳＡが好ましい。
次に、本発明の評価方法の工程（ｄ）においては、吸着したフィブリノーゲンの量から医用材料の血液適合性を評価する。上述したように、本発明の方法で測定したフィブリノーゲンの吸着量と血小板吸着量の間には高い相関性が見られるので、フィブリノーゲン吸着量から血小板吸着量を算出することができる。具体的には、本願の図１のような、フィブリノーゲンの吸着量と血小板吸着量との関係を示す検量線を作成し、それを用いてフィブリノーゲン吸着量から血小板吸着量を求めることができる。従って、本発明の方法によれば、血漿、ＰＲＰや血小板といった生体由来材料を使うことがないので、個体差や採血日時、採血方法などの影響による評価結果のばらつきを考慮することなく、血小板吸着量に基づく血液適合性を評価することができる。また、本発明の方法においては、例えば、評価対象となる高分子などで被覆したフィルムと未被覆フィルムのそれぞれのフィブリノーゲン吸着量を測定し、被覆したフィルムと未被覆フィルムの間に見られるフィブリノーゲン吸着量の差から血液適合性を比較することもできる。
本発明の方法によって血液適合性を評価することのできる医用材料に特に限定はないが、疾患の診断や治療に使われる機器・用具などを構成する材料もしくはそれらの表面に被膜を形成するための材料が挙げられる。具体的には、ディスポーザブル注射針、ディスポーザブル注射筒、ディスポーザブルチューブ、ディスポーザブルカテーテル、人工腎臓用ディスポーザブルカニューレ、採血用器具、血液バッグ、輸血用器具、輸液用器具、人工腎臓用血液回路、中空糸透析器、人工関節、眼内レンズ、人工肺や人工血管を構成する材料もしくはその表面に被膜を形成するための材料の血液適合性を本発明の方法によって評価することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下に、参考例、実施例及び比較例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
参考例１
医用材料の試験片となるポリスルフォンフィルムの調製
５ｇのポリスルフォン（平均分子量３，５００）を１００ｍｌの１，２−ジクロロエタンに溶解してポリスルフォンポリマー溶液を調製した。この溶液１０ｇを直径９ｃｍのシャーレ上に塗布して常圧・室温下で乾燥し、膜厚が約７０μｍのフィルムを得た。得られたフィルムを直径１２．７ｍｍの円状に切り抜き、これを基盤フィルムとした。このフィルムをポロクサマー（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）（日本国、旭電化工業（株）製のアデカプルロニックＦ−６８（商標））の水溶液（ポロクサマー濃度は０．１，０．５，１，２又は５重量％）に浸漬し、常圧・室温下で乾燥することで基盤フィルムを被覆し、被覆量の異なる５種の医用材料の試験片を得た。
実施例１
フィブリノーゲンと少なくとも１種の他の血漿蛋白との混合物を溶解してなる水溶液を用いた血液適合性の評価
血漿蛋白としてヒト フィブリノーゲン、ヒトＩｇＧおよびヒト アルブミンを用いて血液適合性を評価した。精製抗原であるヒトＩｇＧ、ヒト フィブリノーゲンおよびヒト アルブミンをＰＢＳに溶解し、ヒトＩｇＧが１，０００ｐｐｍ、ヒト フィブリノーゲンが３００ｐｐｍ、そしてヒト アルブミンが４，０００ｐｐｍの水溶液を得た。参考例１で作製した、被覆量の異なる種々の試験片をそれぞれ上記の水溶液に浸漬し、３７℃で２時間試験片と血漿蛋白を接触させ、血漿蛋白を試験片に吸着させた。フィブリノーゲン、ＩｇＧおよびアルブミンの吸着量をそれぞれの精製抗原に対応するＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅ Ｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）標識化抗体を用いたＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法により定量した。試験片に対する精製抗原（フィブリノーゲン、ＩｇＧ又はアルブミン）の吸着量は、吸光度（波長４５０ｎｍ）で表した。
更に参考例１で作製した試験片について、ヒト血小板過剰血漿（Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｒｉｃｈ Ｐｌａｓｍａ；以下、“ＰＲＰ”と略す）に由来する血小板の吸着量を測定した。クエン酸で抗凝固したヒト新鮮全血を１，２００ｒｐｍで１０分間遠心し、遠心分離後の上層となるＰＲＰを分取した。参考例１で作成した、被覆量の異なる種々の試験片を２４穴プレートのウエルに入れ、そこに１ｍｌのＰＲＰを添加し、３７℃で２時間浸漬することで血小板を試験片に吸着させた。ヒトＰＲＰ由来血小板吸着量は、Ｍａｓａｒｕ Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２１，１４７１−１４８１（２０００）を参考に、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）観察によって求めた。具体的には、拡大倍率５００倍の条件下で、同一視野に存在する血小板の数（ｘ１０４／ｃｍ２）を血小板吸着数とした。
フィブリノーゲン吸着量と血小板吸着量との関係を図１に示し、ＩｇＧ吸着量と血小板吸着量との関係を図２に示し、アルブミン吸着量と血小板吸着量との関係を図３に示した。フィブリノーゲン吸着量（図１）と血小板吸着量との間に相関性（相関係数＝０．７４７）が見られた。一方、ヒトＩｇＧ（図２）およびヒトアルブミン（図３）の場合は、いずれも血漿蛋白吸着量と血小板吸着量との間に相関性は見られなかった。
比較例１〜３
血漿蛋白として、ヒトＩｇＧのみを含む溶液、ヒトフィブリノーゲンのみを含む溶液及びヒトアルブミンのみを含む溶液をそれぞれ用いて血液適合性を評価した。
５，０００ｐｐｍのヒトＩｇＧ溶液、３００ｐｐｍのヒトフィブリノーゲン溶液及び５，０００ｐｐｍのヒトアルブミン溶液をそれぞれ用い、実施例１と同様に、参考例１で作成した被覆量の異なる種々の試験片に対する各血漿蛋白の結合量を測定した。
更に参考例１で作製した被覆量の異なる種々の試験片について、実施例１と同様にヒトＰＲＰ由来血小板の吸着量を測定した。
フィブリノーゲン吸着量と血小板吸着量との関係を図４に示し、ＩｇＧ吸着量と血小板吸着量との関係を図５に示し、アルブミン吸着量と血小板吸着量との関係を図６に示した。図４〜６から明らかなように、フィブリノーゲン単独や、他の血漿蛋白を単独で用いても、図１に見られるようなフィブリノーゲン吸着量と血小板吸着量との間の相関性は見られなかった。
参考例２
ＰＲＰを用いた血小板吸着量の測定
実施例１と同様にクエン酸で抗凝固したヒト新鮮全血からＰＲＰを調製し、ＰＥＴ製の試験フィルムに対するヒトＰＲＰ由来血小板の吸着量を測定した。ＰＥＴ製の試験フィルムを２４穴プレートのウエルに入れ、そこに１ｍｌのＰＲＰを添加した。試験フィルムをＰＲＰに３７℃で２時間浸漬することで血小板を吸着させた。血小板の吸着したフィルムは走査型電子顕微鏡（倍率２，０００倍）で観察した。この血小板吸着実験は、同じ試験フィルムと異なる個体の供血から調製したＰＲＰを用いて再度実施した。１回目の結果を図７に示し、２回目の結果を図８に示す。図７及び図８から明らかなように、同じ試験フィルムに吸着した血小板でも、ヒト個体差および血漿採血の日時、採血方法などの影響を大きく受けて、吸着量および血小板の形態が大きく異なっている。従って、ＰＲＰを用いた従来の血液適合性の評価方法は、ＰＲＰの調製などの複雑な工程が必要な上に、再現性が低い。
産業上の利用可能性
本発明の血液適合性の評価方法を用いると、生体由来の材料である血漿、血小板過剰血漿や血小板などを用いることなく、医用材料の血液適合性を評価することができる。従って、個体差や血漿採血の日時、採血方法などによる評価結果のばらつきを考慮することなく、再現性良く、簡便に血液適合性を評価することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
図面において：
図１は、フィブリノーゲン、ＩｇＧ及びアルブミンを含む水溶液を用いて測定した、フィブリノーゲン吸着量と血小板吸着量の相関関係を示すグラフであり；
図２は、フィブリノーゲン、ＩｇＧ及びアルブミンを含む水溶液を用いて測定したＩｇＧ吸着量と血小板吸着量の相関関係を示すグラフであり；
図３は、フィブリノーゲン、ＩｇＧ及びアルブミンを含む水溶液を用いて測定したアルブミン吸着量と血小板吸着量の相関関係を示すグラフであり；
図４は、フィブリノーゲンのみを含む水溶液を用いて測定したフィブリノーゲン吸着量と血小板吸着量の相関関係を示すグラフであり；
図５は、ＩｇＧのみを含む水溶液を用いて測定したＩｇＧ吸着量と血小板吸着量の相関関係を示すグラフであり；
図６は、アルブミンのみを含む水溶液を用いて測定したアルブミン吸着量と血小板吸着量の相関関係を示すグラフであり；
図７は、ＰＲＰ由来血小板の吸着した試験片のＳＥＭ画像であり；そして
図８は、ＰＲＰ由来血小板の吸着した試験片のＳＥＭ画像である。
本発明は、医用材料の血液適合性を評価するための方法に関する。更に詳細には、フィブリノーゲンと少なくとも１種の他の血漿蛋白との混合物を溶解してなる水溶液を提供し、該水溶液を医用材料の試験片と接触させて、該水溶液に含まれるフィブリノーゲンを該試験片に吸着させ、該試験片に吸着したフィブリノーゲンの量を測定し、そして該吸着したフィブリノーゲンの量から該医用材料の血液適合性を評価することを包含する、医用材料の血液適合性を評価するための方法に関する。本発明の血液適合性の評価方法を用いると、個体差などによって評価結果に違いが生じる血小板過剰血漿を使うことなく、再現性良く、簡便に血液適合性を評価することが可能となる。
従来技術
近年、各種の高分子材料の医用への適応について検討が進められており、人工腎臓用膜、血漿分離用膜、カテーテル、人工肺用膜、人工血管、癒着防止膜、人工皮膚等への高分子材料の利用が期待されている。これらの用途においては、生体にとって異物である合成材料（高分子材料）を生体組織や体液と接触させて使用することになるので、医用材料となる高分子材料は生体適合性を有することが必要である。医用材料に要求される生体適合性はその目的や使用法によって異なるが、血液と接する医用材料には、血液凝固系の抑制、血小板の粘着・活性化の抑制、補体系の活性化の抑制という特性が求められる。このような特性を有する抗血栓性材料は、疾患の診断や治療に使われる機器や用具などに使われており、例えば、ディスポーザブル注射針、ディスポーザブル注射筒、ディスポーザブルチューブ、ディスポーザブルカテーテル、人工腎臓用ディスポーザブルカニューレ、採血用器具、血液バッグ、輸血用器具、輸液用器具、人工腎臓用血液回路、中空糸透析器、人工関節、眼内レンズ、人工肺、人工血管などに使用されている。
種々の材料を生体組織や血液と接触させた場合、最初に起こる現象が蛋白質吸着であり、吸着した蛋白質を介して細胞接着が生じる。このような細胞接着によって血栓形成、炎症、貧食などが生じることになる。血栓形成は血液中の多成分が関与する複雑な階級反応であるが、主に２つのプロセスからなるとされている。１つは凝固因子のカスケード反応による不溶性フィブリンの生成であり、他の１つは血小板の凝集による血栓の生成である。この２つのプロセスにより典型的な血栓が形成される。医療器具等に血栓が形成されると、器具の本来果たすべき機能は著しく損なわれることになる。例えば、人工血管であれば栓塞し、機能の発現は困難となるばかりでなく、剥離した血栓が血流に乗り、他の臓器において栓塞を起こすことも十分予想される。
また、血清中には補体系という２０種の血漿蛋白より構成される生体防御に重要な役割を担う系が存在する。補体系は抗体の殺菌活性に重要な役割を果たし、その活性経路は古典経路および第２経路の２つに大別される。血液が医用材料に接触すると、補体の活性化が主に第２経路によって起こり、免疫応答の異常や血圧上昇といった症状を引き起こす。
上述したように、医用材料にはその目的、使用法に応じた生体適合性が要求されるが、特に血小板吸着量評価は抗血栓性との相関の良さから、抗血栓性材料を評価する際に初めに選択する評価方法となっている。血栓形成反応には、凝固因子に加え血小板も重要な役割を担っている。血小板の働きは血管への付着から始まるが、これには凝固第ＶＩＩＩ因子が関与し、続く凝固反応には第ＸＩＩ因子が関与する。現在使用されている医用材料の多くは血液と接触する箇所で使用されているため、生体から血小板過剰血漿（Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｒｉｃｈ Ｐｌａｓｍａ、“ＰＲＰ”と略す）を調製し、ＰＲＰを用いてそこに存在する血小板の材料に対する付着を評価することで血小板吸着量評価が行われている。この方法は、測定手技が確立されており、血栓形成の評価として採用されている（”Ｂｌｏｏｄ ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｐｏｌｙ（２−ｍｅｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌａｃｒｙｌａｔｅ）（ＰＭＥＡ）−ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｏｎ ＰＭＥＡ ｓｕｒｆａｃｅ”，Ｍａｓａｒｕ Ｔａｎａｋａ，Ｔａｄａｓｈｉ Ｍｏｔｏｍｕｒａ，Ｍｉｈｏ Ｋａｗａｄａ，Ｔａｋａｏ Ａｎｚａｉ，Ｙｕｕ Ｋａｓｏｒｉ，Ｔｏｓｈｉｆｕｍｉ Ｓｈｉｒｏｙａ，Ｋｅｎｉｃｈｉ Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｍａｋｏｔｏ Ｏｎｉｓｈｉ，Ａｋｉｒａ Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２１，１４７１−１４８１（２０００））。
上述した血液適合性の評価方法は生体由来の材料であるＰＲＰを用いるため、個体差や血漿採血の日時、採血方法などがＰＲＰの血小板量および血小板の形態に影響を与える。このようなＰＲＰの性質のばらつきが測定系の不安定要因となっている。従って、再現性の高い、簡便な血液適合性の評価方法の確立が望まれている。
その他の血液適合性の評価方法としては、例えば、単離した血小板をＲＩ（１１１Ｉｎ等の放射性同位元素）でラベルし、材料に接触させ、材料に吸着した血小板の放射活性を評価することで、血小板吸着量を求める方法（”Ｂａｂｏｏｎ Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ａｄｈｅｓｉｏｎ ｔｏ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ Ｍａｔｅｒｉ−ａｌｓ”，Ｊｏｓｅｐｈ Ａ．Ｃｈｉｎｎ，Ｔｈｏｍａｓ Ａ．Ｈｏｒｂｅｔｔ，ａｎｄ Ｂｕｄｄｙ Ｄ．Ｒａｔｎｅｒ，Ｔｈｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｔａｓｉｓ，６５，６０８−６１７（１９９１））が報告されている。しかし、この評価方法は、血小板の単離やＲＩによるラベル化といった複雑な操作が必要であるため、再現性の高い、簡便な血液適合性の評価方法の確立が望まれている。
発明の概要
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究の結果、驚くべきことに、フィブリノーゲンと少なくとも１種の他の血漿蛋白との混合物を溶解してなる水溶液を医用材料の試験片と接触させることで、試験片に吸着させたフィブリノーゲンの量は、ＰＲＰを用いて測定した血小板吸着量と良好な相関性を示すことを知見し、本発明を完成するに至った。
従って、本発明の主の目的は、再現性良く、簡便に血液適合性の評価を行うための方法を提供することにある。
本発明の上記及びその他の諸目的、諸特徴ならびに諸利益は、添付の図面を参照しながら行う以下の詳細な説明及び請求の範囲から明らかになる。
発明の詳細な説明
本発明によれば、（ａ）フィブリノーゲンと少なくとも１種の他の血漿蛋白との混合物を溶解してなる水溶液を提供し、
（ｂ）該水溶液を医用材料の試験片と接触させて、該水溶液に含まれるフィブリノーゲンを該試験片に吸着させ、
（ｃ）該試験片に吸着したフィブリノーゲンの量を測定し、そして
（ｄ）該吸着したフィブリノーゲンの量から該医用材料の血液適合性を評価する、
ことを包含する、医用材料の血液適合性を評価するための方法が提供される。
次に、本発明の理解を容易にするために、まず本発明の基本的特徴及び好ましい態様を列挙する。
１．（ａ）フィブリノーゲンと少なくとも１種の他の血漿蛋白との混合物を溶解してなる水溶液を提供し、
（ｂ）該水溶液を医用材料の試験片と接触させて、該水溶液に含まれるフィブリノーゲンを該試験片に吸着させ、
（ｃ）該試験片に吸着したフィブリノーゲンの量を測定し、そして
（ｄ）該吸着したフィブリノーゲンの量から該医用材料の血液適合性を評価する、
ことを包含する、医用材料の血液適合性を評価するための方法。
２．該少なくとも１種の他の血漿蛋白がアルブミン及び免疫グロブリンを包含することを特徴とする、前項１に記載の方法。
３．該水溶液中のフィブリノーゲン／アルブミン／免疫グロブリンの重量比が、２／６０／１０〜８／９０／４０であることを特徴とする、前項２に記載の方法。
４．該水溶液が１００〜４００ｐｐｍのフィブリノーゲン、３，０００〜４，５００ｐｐｍのアルブミン及び５００〜２，０００ｐｐｍの免疫グロブリンを含むことを特徴とする、前項２又は３に記載の方法。
５．該水溶液が２００〜４００ｐｐｍのフィブリノーゲン、３，５００〜４，５００ｐｐｍのアルブミン及び６００〜１，７００ｐｐｍの免疫グロブリンを含むことを特徴とする、前項４に記載の方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、（ａ）フィブリノーゲンと少なくとも１種の他の血漿蛋白との混合物を溶解してなる水溶液を提供し、
（ｂ）該水溶液を医用材料の試験片と接触させて、該水溶液に含まれるフィブリノーゲンを該試験片に吸着させ、
（ｃ）該試験片に吸着したフィブリノーゲンの量を測定し、そして
（ｄ）該吸着したフィブリノーゲンの量から該医用材料の血液適合性を評価する、
ことを包含する、医用材料の血液適合性を評価するための方法である。
本発明の評価方法の工程（ａ）においては、フィブリノーゲンと少なくとも１種の他の血漿蛋白との混合物を溶解してなる水溶液（以下、屡々、「血漿蛋白混合水溶液」と称する）を提供する。フィブリノーゲンは血漿蛋白の１種であり、血栓形成に最も関与する細胞の一つである血小板の粘着に影響を与える吸着蛋白質である。フィブリノーゲンは細胞の接着を強めることが知られていることから、本発明においては、フィブリノーゲンに着目した。
本発明で用いるフィブリノーゲン以外の血漿蛋白に特に限定はないが、アルブミン、α１−セロムコイド、α１−アンチトリプシン、α１−マクログロブリン、α１−ハプトグロブリン、α１−セルロプラスミン、トランスフェリン、リポプロテイン、ＩｇＡ、γ−グロブリン（ＩｇＧ）、ＩｇＭ等の免疫グロブリン、Ｃｌｑ、Ｃ３、Ｃ４、フィブロネクチン等が挙げられる。本発明者は、フィブリノーゲンのみならず、フィブリノーゲンと少なくとも１種の他の血漿蛋白とを組み合わせて用いると、フィブリノーゲン吸着量と血小板吸着量との間に良好な相関性が存在することを知見した。その理由は明らかではないが、フィブリノーゲンと少なくとも１種の他の血漿蛋白とを組み合わせて用いると、生体内における環境と同様の相互作用が血漿蛋白の間に生じるためであると考えられる。
フィブリノーゲンと共に用いる少なくとも１種の他の血漿蛋白としては、アルブミンと免疫グロブリンが好ましい。血小板の接着に影響を与える血中に存在する吸着蛋白質は、フィブリノーゲン、アルブミン、γ−グロブリンの３種類であると言われており（「バイオマテリアル（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、ｐ．５６−６５、中原宣男、石原一彦、岩崎泰彦共著、コロナ社（１９９９））、フィブリノーゲンは細胞の接着を強め、アルブミンやγ−グロブリンは細胞の接着を弱めると報告されている。これら３種の血漿蛋白を組み合わせて用いた場合に、フィブリノーゲン吸着量と血小板吸着量との間に極めて良好な相関性が見られる。本発明で使用する免疫グロブリンに特に限定はなく、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭやＩｇＥなどが挙げられ、入手容易性からＩｇＧが好ましい。
フィブリノーゲンやその他の血漿蛋白としては、ヒト、牛、羊、ウサギ、ラット、マウスなどの蛋白や、遺伝子組み換え蛋白を用いることができる。しかし、ヒトの血液に対する血液適合性を評価する場合には、ヒト由来の蛋白を用いることが好ましい。
本発明の評価方法は、医用材料のヒト血液に対する適合性を評価することを主な目的とするため、血漿蛋白混合水溶液に含まれる血漿蛋白の割合（即ち、フィブリノーゲンに対する他の血漿蛋白の重量比）が、ヒト血液中に存在する血漿蛋白の割合と同一であることが好ましい。血漿蛋白の割合が血液中に存在する割合と同一であるということは、フィブリノーゲンの置かれている環境がヒト血液中の環境に近いということであり、このことが血小板吸着量とフィブリノーゲン吸着量との間に高い相関性が見られる理由の一つと考えられる。
血液中に存在する血漿蛋白の割合は、血液中の血漿蛋白濃度から容易に求めることができる。例えば、ワラック検査値ハンドブック（Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｔｅｓｔｓ、原著第６版、Ｊａｃｑｕｅｓ Ｗａｌｌａｃｈ著、福井次矢監訳、田島裕訳、医歯薬出版株式会社、（１９９７））によると、フィブリノーゲン、アルブミン及びγ−グロブリンのヒトの正常値は以下の値である。
更に本発明においては、血漿蛋白混合水溶液に含まれる血漿蛋白濃度に特に限定はないが、血液に存在する蛋白濃度の１／１０であることが好ましい。本発明の方法においては、血漿蛋白混合水溶液の血漿蛋白濃度が血液に存在する蛋白濃度の１／１０でも医用材料の血液適合性を評価するのに十分である。本発明で用いる血漿蛋白混合水溶液がフィブリノーゲン、アルブミン及び免疫グロブリンの３種の血漿蛋白を含有する場合には、上記表１に記載のヒト血液の血漿蛋白濃度に基づき、好ましいフィブリノーゲンの濃度は１００〜４００ｐｐｍ（即ち、ｍｇ／リットル）、更に好ましくは２００〜４００ｐｐｍとする。また、好ましいアルブミン濃度は３，０００〜４，５００ｐｐｍ、更に好ましくは３，５００〜４，５００ｐｐｍとし、好ましい免疫グロブリン濃度は５００〜２，０００ｐｐｍ、更に好ましくは６００〜１，７００ｐｐｍとする。
フィブリノーゲンと少なくとも１種の他の血漿蛋白との混合物を溶解する水系の溶媒としては、蛋白の変性などを防ぐためにｐＨ６〜８を維持することが可能な緩衝液であれば特に限定はない。入手の容易さから、生理食塩水やリン酸緩衝液が好ましい。血漿蛋白の混合物を溶解してなる水溶液は、蛋白溶液の調製に通常用いる方法で調製すればよく、水系の溶媒に血漿蛋白を０℃〜室温で静かに溶解するだけで調製することが可能である。
このようにして得られた血漿蛋白混合水溶液には、血漿蛋白の他に、緩衝液中の塩が含まれる。また、例えばショ糖などの糖類が含まれていてもかまわない。
本発明の評価方法の工程（ｂ）においては、血漿蛋白混合水溶液を医用材料の試験片と接触させて、血漿蛋白混合水溶液に含まれるフィブリノーゲンを該試験片に吸着させる。血漿蛋白混合水溶液と試験片を接触させる方法は、フィブリノーゲンが試験片に吸着することのできる方法であれば特に限定はなく、例えば、３７℃の血漿蛋白溶液に試験片を１〜３時間浸漬すればよい。
次に、本発明の評価方法の工程（ｃ）においては、試験片に吸着したフィブリノーゲンの量を測定する。試験片にはフィブリノーゲンと共に、少なくとも１種の他の血漿蛋白も吸着しているので、フィブリノーゲンの吸着量を選択的に測定しなければならない。具体的には、ＲＩ（放射性同位元素、例えば、１２５Ｉ）でラベルしたフィブリノーゲンを用い、試験片の放射活性を評価することで、フィブリノーゲンの吸着量を求める方法（Ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ ｆｉｂｉｒｉｎｏｇｅｎ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｔｏ ｐｏｌｙｓｔｙｌｅｎｅ，Ｗｅｉ−Ｂｏｒ Ｔｓａｉ，Ｊｏｈｎ Ｍ．Ｇｒｕｎｋｅｍｅｉｅｒ，Ｔｈｏｍａｓ Ａ．Ｈｏｒｂｅｔｔ，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，４４，１３０−１３９（１９９９））や、ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）で標識したフィブリノーゲンに特異的に結合する抗体を用いる酵素免疫学的評価法（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ；以下、屡々、“ＥＬＩＳＡ”と略す）が挙げられる。特異性が高いことと測定の簡便さから、本発明の工程（ｃ）で用いる方法としてはＥＬＩＳＡが好ましい。
次に、本発明の評価方法の工程（ｄ）においては、吸着したフィブリノーゲンの量から医用材料の血液適合性を評価する。上述したように、本発明の方法で測定したフィブリノーゲンの吸着量と血小板吸着量の間には高い相関性が見られるので、フィブリノーゲン吸着量から血小板吸着量を算出することができる。具体的には、本願の図１のような、フィブリノーゲンの吸着量と血小板吸着量との関係を示す検量線を作成し、それを用いてフィブリノーゲン吸着量から血小板吸着量を求めることができる。従って、本発明の方法によれば、血漿、ＰＲＰや血小板といった生体由来材料を使うことがないので、個体差や採血日時、採血方法などの影響による評価結果のばらつきを考慮することなく、血小板吸着量に基づく血液適合性を評価することができる。また、本発明の方法においては、例えば、評価対象となる高分子などで被覆したフィルムと未被覆フィルムのそれぞれのフィブリノーゲン吸着量を測定し、被覆したフィルムと未被覆フィルムの間に見られるフィブリノーゲン吸着量の差から血液適合性を比較することもできる。
本発明の方法によって血液適合性を評価することのできる医用材料に特に限定はないが、疾患の診断や治療に使われる機器・用具などを構成する材料もしくはそれらの表面に被膜を形成するための材料が挙げられる。具体的には、ディスポーザブル注射針、ディスポーザブル注射筒、ディスポーザブルチューブ、ディスポーザブルカテーテル、人工腎臓用ディスポーザブルカニューレ、採血用器具、血液バッグ、輸血用器具、輸液用器具、人工腎臓用血液回路、中空糸透析器、人工関節、眼内レンズ、人工肺や人工血管を構成する材料もしくはその表面に被膜を形成するための材料の血液適合性を本発明の方法によって評価することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下に、参考例、実施例及び比較例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
参考例１
医用材料の試験片となるポリスルフォンフィルムの調製
５ｇのポリスルフォン（平均分子量３，５００）を１００ｍｌの１，２−ジクロロエタンに溶解してポリスルフォンポリマー溶液を調製した。この溶液１０ｇを直径９ｃｍのシャーレ上に塗布して常圧・室温下で乾燥し、膜厚が約７０μｍのフィルムを得た。得られたフィルムを直径１２．７ｍｍの円状に切り抜き、これを基盤フィルムとした。このフィルムをポロクサマー（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）（日本国、旭電化工業（株）製のアデカプルロニックＦ−６８（商標））の水溶液（ポロクサマー濃度は０．１，０．５，１，２又は５重量％）に浸漬し、常圧・室温下で乾燥することで基盤フィルムを被覆し、被覆量の異なる５種の医用材料の試験片を得た。
実施例１
フィブリノーゲンと少なくとも１種の他の血漿蛋白との混合物を溶解してなる水溶液を用いた血液適合性の評価
血漿蛋白としてヒト フィブリノーゲン、ヒトＩｇＧおよびヒト アルブミンを用いて血液適合性を評価した。精製抗原であるヒトＩｇＧ、ヒト フィブリノーゲンおよびヒト アルブミンをＰＢＳに溶解し、ヒトＩｇＧが１，０００ｐｐｍ、ヒト フィブリノーゲンが３００ｐｐｍ、そしてヒト アルブミンが４，０００ｐｐｍの水溶液を得た。参考例１で作製した、被覆量の異なる種々の試験片をそれぞれ上記の水溶液に浸漬し、３７℃で２時間試験片と血漿蛋白を接触させ、血漿蛋白を試験片に吸着させた。フィブリノーゲン、ＩｇＧおよびアルブミンの吸着量をそれぞれの精製抗原に対応するＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅ Ｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）標識化抗体を用いたＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法により定量した。試験片に対する精製抗原（フィブリノーゲン、ＩｇＧ又はアルブミン）の吸着量は、吸光度（波長４５０ｎｍ）で表した。
更に参考例１で作製した試験片について、ヒト血小板過剰血漿（Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｒｉｃｈ Ｐｌａｓｍａ；以下、“ＰＲＰ”と略す）に由来する血小板の吸着量を測定した。クエン酸で抗凝固したヒト新鮮全血を１，２００ｒｐｍで１０分間遠心し、遠心分離後の上層となるＰＲＰを分取した。参考例１で作成した、被覆量の異なる種々の試験片を２４穴プレートのウエルに入れ、そこに１ｍｌのＰＲＰを添加し、３７℃で２時間浸漬することで血小板を試験片に吸着させた。ヒトＰＲＰ由来血小板吸着量は、Ｍａｓａｒｕ Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２１，１４７１−１４８１（２０００）を参考に、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）観察によって求めた。具体的には、拡大倍率５００倍の条件下で、同一視野に存在する血小板の数（ｘ１０４／ｃｍ２）を血小板吸着数とした。
フィブリノーゲン吸着量と血小板吸着量との関係を図１に示し、ＩｇＧ吸着量と血小板吸着量との関係を図２に示し、アルブミン吸着量と血小板吸着量との関係を図３に示した。フィブリノーゲン吸着量（図１）と血小板吸着量との間に相関性（相関係数＝０．７４７）が見られた。一方、ヒトＩｇＧ（図２）およびヒトアルブミン（図３）の場合は、いずれも血漿蛋白吸着量と血小板吸着量との間に相関性は見られなかった。
比較例１〜３
血漿蛋白として、ヒトＩｇＧのみを含む溶液、ヒトフィブリノーゲンのみを含む溶液及びヒトアルブミンのみを含む溶液をそれぞれ用いて血液適合性を評価した。
５，０００ｐｐｍのヒトＩｇＧ溶液、３００ｐｐｍのヒトフィブリノーゲン溶液及び５，０００ｐｐｍのヒトアルブミン溶液をそれぞれ用い、実施例１と同様に、参考例１で作成した被覆量の異なる種々の試験片に対する各血漿蛋白の結合量を測定した。
更に参考例１で作製した被覆量の異なる種々の試験片について、実施例１と同様にヒトＰＲＰ由来血小板の吸着量を測定した。
フィブリノーゲン吸着量と血小板吸着量との関係を図４に示し、ＩｇＧ吸着量と血小板吸着量との関係を図５に示し、アルブミン吸着量と血小板吸着量との関係を図６に示した。図４〜６から明らかなように、フィブリノーゲン単独や、他の血漿蛋白を単独で用いても、図１に見られるようなフィブリノーゲン吸着量と血小板吸着量との間の相関性は見られなかった。
参考例２
ＰＲＰを用いた血小板吸着量の測定
実施例１と同様にクエン酸で抗凝固したヒト新鮮全血からＰＲＰを調製し、ＰＥＴ製の試験フィルムに対するヒトＰＲＰ由来血小板の吸着量を測定した。ＰＥＴ製の試験フィルムを２４穴プレートのウエルに入れ、そこに１ｍｌのＰＲＰを添加した。試験フィルムをＰＲＰに３７℃で２時間浸漬することで血小板を吸着させた。血小板の吸着したフィルムは走査型電子顕微鏡（倍率２，０００倍）で観察した。この血小板吸着実験は、同じ試験フィルムと異なる個体の供血から調製したＰＲＰを用いて再度実施した。１回目の結果を図７に示し、２回目の結果を図８に示す。図７及び図８から明らかなように、同じ試験フィルムに吸着した血小板でも、ヒト個体差および血漿採血の日時、採血方法などの影響を大きく受けて、吸着量および血小板の形態が大きく異なっている。従って、ＰＲＰを用いた従来の血液適合性の評価方法は、ＰＲＰの調製などの複雑な工程が必要な上に、再現性が低い。
産業上の利用可能性
本発明の血液適合性の評価方法を用いると、生体由来の材料である血漿、血小板過剰血漿や血小板などを用いることなく、医用材料の血液適合性を評価することができる。従って、個体差や血漿採血の日時、採血方法などによる評価結果のばらつきを考慮することなく、再現性良く、簡便に血液適合性を評価することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
図面において：
図１は、フィブリノーゲン、ＩｇＧ及びアルブミンを含む水溶液を用いて測定した、フィブリノーゲン吸着量と血小板吸着量の相関関係を示すグラフであり；
図２は、フィブリノーゲン、ＩｇＧ及びアルブミンを含む水溶液を用いて測定したＩｇＧ吸着量と血小板吸着量の相関関係を示すグラフであり；
図３は、フィブリノーゲン、ＩｇＧ及びアルブミンを含む水溶液を用いて測定したアルブミン吸着量と血小板吸着量の相関関係を示すグラフであり；
図４は、フィブリノーゲンのみを含む水溶液を用いて測定したフィブリノーゲン吸着量と血小板吸着量の相関関係を示すグラフであり；
図５は、ＩｇＧのみを含む水溶液を用いて測定したＩｇＧ吸着量と血小板吸着量の相関関係を示すグラフであり；
図６は、アルブミンのみを含む水溶液を用いて測定したアルブミン吸着量と血小板吸着量の相関関係を示すグラフであり；
図７は、ＰＲＰ由来血小板の吸着した試験片のＳＥＭ画像であり；そして
図８は、ＰＲＰ由来血小板の吸着した試験片のＳＥＭ画像である。
Claims (5)
- （ａ）フィブリノーゲンと少なくとも１種の他の血漿蛋白との混合物を溶解してなる水溶液を提供し、
（ｂ）該水溶液を医用材料の試験片と接触させて、該水溶液に含まれるフィブリノーゲンを該試験片に吸着させ、
（ｃ）該試験片に吸着したフィブリノーゲンの量を測定し、そして
（ｄ）該吸着したフィブリノーゲンの量から該医用材料の血液適合性を評価する、
ことを包含する、医用材料の血液適合性を評価するための方法。 - 該少なくとも１種の他の血漿蛋白がアルブミン及び免疫グロブリンを包含することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- 該水溶液中のフィブリノーゲン／アルブミン／免疫グロブリンの重量比が、２／６０／１０〜８／９０／４０であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
- 該水溶液が１００〜４００ｐｐｍのフィブリノーゲン、３，０００〜４，５００ｐｐｍのアルブミン及び５００〜２，０００ｐｐｍの免疫グロブリンを含むことを特徴とする、請求項２又は３に記載の方法。
- 該水溶液が２００〜４００ｐｐｍのフィブリノーゲン、３，５００〜４，５００ｐｐｍのアルブミン及び６００〜１，７００ｐｐｍの免疫グロブリンを含むことを特徴とする、請求項４に記載の方法。
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