JPWO2003066677A1 - Egf/egfr複合体 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、上皮増殖因子(以下、EGFまたはEGFリガンドと呼ぶ場合がある)と上皮増殖因子受容体(以下、EGFR、EGF受容体またはEGFレセプターと呼ぶ場合がある)の複合体の結晶およびEGFRとEGFR活性調節物質の複合体の結晶、X線結晶構造解析に供することが可能なEGFRとEGFR活性調節物質(特にEGF)の複合体の結晶化方法、その結晶を構造解析することによって得られるEGFRとEGFR活性調節物質(特にEGF)の複合体の構造座標、該構造座標を用いたEGFR活性調節物質のスクリーニング方法および設計方法、EGF/EGFR複合体におけるEGF/EGFR結合部位またはEGFR二量体化部位の同定方法、EGFR活性調節物質のファルマコフォアの設計方法、EGFR活性調節物質のファルマコフォアを用いたEGFR活性調節物質のスクリーニング方法および設計方法、ファルマコフォアに適合するEGFRアンタゴニスト、EGFRアンタゴニストを用いたEGFR活性の阻害方法、EGF/EGFR複合体の構造座標を用いたEGFR変異体の設計方法および製造方法、ならびに該製造方法により得られるEGFR変異体、EGF/EGFR複合体の構造座標を用いたEGF変異体の設計方法および製造方法、ならびに該製造方法により得られるEGF変異体、EGF/EGFR複合体の構造座標を用いて未知の構造の蛋白質の構造座標を取得する方法および該方法により得られる構造座標、EGF/EGFR複合体の構造座標を用いてエピトープを設計する方法、抗EGFR抗体の製造方法および該方法により得られる抗EGFR抗体、抗EGF抗体の製造方法および該方法により得られる抗EGF抗体、EGFR二量体化部位を形成する領域を含むポリペプチドまたはその塩などに関する。
背景技術
上皮増殖因子受容体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)は、受容体チロシンキナーゼスーパーファミリーの1つのメンバーであり、細胞増殖、成熟および分化の調節に関与することが知られている(Carpenter,G.& Cohen,S.J.Biol.Chem.265,7709−7712(1990))。
上皮増殖因子(EGF)のEGFR細胞外ドメインとの結合は受容体の二量体化を誘導するものと考えられ、この二量体化は2つの受容体の細胞質チロシンキナーゼドメインを接近させ、それにより細胞内ドメインの内因性チロシンキナーゼ受容体を活性化し、続いて多数の下流シグナル経路を活性化すると考えられている(Schlessinger,J.Cell 103,211−225(2000))。この活性化機序の他、最近、EGFにより活性化されたEGFRの一部分が核に転移して、転写因子として機能することにより、高度な増殖活性に必要な遺伝子を活性化することが証明された(Lin,S.Y.et al.,Nat.Cell Biol.3,802−808(2001))。一方、チロシンのリン酸化に伴う自発性オリゴマー化は、細胞外ドメインの一部分または大部分を欠損する発癌性突然変異体について報告されている(Haley,J.D.et al.,Oncogene 4,273−283(1989);Huang,H.S.et al.,J.Biol.Chem.272,2927−2935(1997))。細胞外ドメインはまた、リガンド依存的自発性オリゴマー化の抑制に重要な役割を果たす可能性がある。
EGFRの3つの相同体として、ヒトにおいてErbB−2、ErbB−3およびErbB−4が同定されている。多数の研究によって、EGFリガンドが、ホモ二量体化に加えてEGFRファミリーのメンバーの異なるペアで組み合わせたヘテロオリゴマー化も誘導することが証明されている(Olayioye,M.A.et al.,Embo J.19,3159−3167(2000))。
ヒトEGFの単量体立体構造に関しては高分解能NMRを用いた解析が行われてきている(J.Mol.Biol.(1992)227,271−282)。この結果、2つのヘリカル断片(Leu8−Tyr13、Leu47−Glu51)が見つかり、1つ目はジスルフィド架橋(Cys6−Cys20、Cys14−Cyh31)を経た主要β−シートを形成し、2つ目は蛋白質のC末端におけるタイプIIターンを形成することが報告されている。このヘリックスは疎水面上のLeu47、Trp50、Trp49およびLeu52と、親水面上のLys48およびGlu51との両親媒性の特徴を示していると報告されている。このヘリックスは保存された残基であるTyr37の周辺の疎水性コア(Val34、Arg45、Trp50)の形成に関与していると考えられている。近年、EGFの二量体化に関してNMRを用いた解析結果の報告もなされている(J.Biol.Chem(2001)276,34913−34917)。この結果、3つのジスルフィド架橋(Cys6−Cys20、Cys14−Cys31、Cys33−Cys42)が確認され、Nドメイン(1−32番残基)とCドメイン(33−53番残基)から成っていることが明らかとなった。Nドメインは不規則なN末端ペプチドセグメント(1−12番残基)を有し、逆平行なβ−シート(19−23および28−32番残基)を有することが報告されている。また、Cドメインは短い逆平行β−シート(36−38および44−46番残基)を含み、そしてC末端セグメント(48−53番残基)を含むことが報告されている。
また、Arg41とLeu47に対する変異化の研究が行われ、その結果EGFとそのレセプターとの結合に際し、これら残基が不可欠であり、リシンによるアルギニンの置換も許容されない事が知られている。(Mol.Cell.Biol(1989)9,4083−4086;FEBS Letters(1990)261,392−396;FEBS Letters(1990)271,47−50;Biochemistry(1991)30,8891−8898;Proc.Nat.Acad.Sci.,USA(1989)86,9836−9840)。これは、EGFのアルギニン側鎖(グアニジノ基)がEGFRとの特異的な相互作用に関与していることを示す。その他に、ポイントミューテーションによる研究で、Ile23、Ala25、Leu26、Ala30、Asn32に対してアミノ酸改変体を作製し、これを用いて実験検討が加えられた結果から各残基はEGFRと直接的な相互作用をするアミノ酸である可能性が示唆されている。しかしながら、ポイントミューテーション実験において相互作用に重要なアミノ酸残基の推定がなされつつあるものの、そのアミノ酸側鎖の活性コンフォメーションや、EGFRとの相互作用の形式、EGFRアミノ酸側鎖の活性コンフォメーションが不明であるため、産業応用に必要な情報は、未だもたらされていない状況であった。
EGFRに関しては結晶構造を解明する努力はされているものの、未だ達成されておらず(J.Biol.Chem(1990)265,22082−22085;Acta Crystallogr D Biol Crystallogr(1998)54,999−1001)、ホモロジーモデリングにより立体構造がモデリングされているのみである(Biochim.Biophys.Acta(2001)1550,144−152)。この報告ではインスリンレセプターとリンパ細胞タンパク−チロシンキナーゼをテンプレートとして用い、EGFRのモデル構造を構築している。またIGF−1R(インシュリン様増殖因子−1受容体)をテンプレートとして用いている報告もある(Jorissen R.N.et al.,Protein Sci.2000,9(2)1310−324;WO99/62955)。
ポイントミューテーション実験では、Glu367、Gly441、Glu472をLysに変異化し、Glu367LysおよびGlu472Lys変異化ではリガンドとの結合に影響を及ぼさないことが明らかとなった。一方でGly441Lysでの変異化はEGFとのアフィニティーをかなり減少させたことが報告されている(Biochemistry(2001)40,8930−8939)。
現在、EGFRを標的とした医薬品候補化合物の開発が進行中である(Drugs 2000;Vol.60 Suppl.1:15−23、Clinical Cancer Research 2001;Vol.7:2958−2970)。またEGFRの細胞内ドメインのキナーゼ活性を抑制する低分子阻害剤も数多く報告されている(Drugs 2000;Vol.60 Suppl.1:25−32)。しかしながら、低分子化合物において、EGFR細胞外ドメインに結合することで、選択的に活性化を促進する薬物、もしくはこれを選択的に阻害する薬物は医薬品として未だ上市されるまでには至っていない。一般に、抗体や組換えタンパク製剤に比較して低分子化合物のアゴニストやアンタゴニストのほうが、多くのケースで経口投与可能となるため、医薬品として有用である。従って、多くの疾患においてタンパク製剤の低分子化が試みられているが、通常はその開発に試行錯誤が加わるため多大な費用と時間がかかり、その結果として、患者にとって有用な薬の開発に、長期間・高コストを要するのが常である。また、細胞内キナーゼドメインを標的としたアンタゴニストは、細胞膜を透過させる必要があるのでその骨格に制限がかかり、かつ過剰な投与量を必要とすることが予測される。加えてEGFRキナーゼドメインの実験的な立体構造(結晶構造やNMR構造)は存在せず、選択性を付与する上で多くの試行錯誤的な誘導合成が必要となる。更にATP結合領域に作用するアンタゴニストの場合、多くのケースでATP様の化学的性質を有する薬理作用団を分子内に含むために、化合物の性質として核酸類似物質となることが多く、将来的な副作用が懸念される可能性もある。
発明の開示
かかる状況下においてEGFとEGFRの相互作用を阻止する低分子化合物、またはEGFR細胞外ドメインに選択的に結合・活性化し、EGFシグナルを伝える低分子化合物を見出すために、EGFとEGFRの相互作用部位をミミックする技術が切望されてきた。分子設計的手法によりEGFRアゴニストやアンタゴニストあるいは、アゴニスト・アンタゴニスト抗体を構築・設計することで、従来に比較してはるかに合理的にEGF/EGFRに対する選択的医薬品を作製可能となる。このような構造情報に基づく分子設計や構造情報に基づくコンピュータスクリーニングには、EGF/EGFRの複合体の実験構造とその解析結果が非常に重要な意味を持つ。
しかし上述のように、EGFリガンドに関してはNMR構造で単量体もしくはホモダイマーの構造が取得されているが、EGFRとの結合時のアミノ酸側鎖や、主鎖の活性コンフォメーションは知られていないうえ、EGFRに至っては、モデリングによりリガンドが結合していない状態でのEGFR構造が予測されていたに過ぎなかった。さらに、EGF/EGFR複合体の構造については全く未知であった。リガンドと結合していない状況でのレセプター構造と単体のリガンド構造からでは、両者が結合し、活性化したときの活性コンフォメーションを推測することは不可能であった。従って、EGF/EGFR複合体結晶構造とその相互作用部位の解析から得られるファルマコフォアの特定や、分子設計的手法の発明は、これまで切望の極みであった。
本発明者らは、上記の課題を解決すべく、優れたEGFRアゴニストまたはアンタゴニストの提供を目的として鋭意研究した結果、X線結晶構造解析においてその立体構造を特定可能なEGF/EGFR複合体の結晶化手法の確立に成功し、この結晶を用いて、多くの研究者が試みたがこれまで誰もなしえなかった複合体構造の座標を明らかにした。さらにその解析を通じて、EGFR活性調節物質のスクリーニング方法および設計方法、EGF/EGFR複合体におけるEGF/EGFR結合部位またはEGFR二量体化部位の同定方法、EGFR活性調節物質(特にEGF)のファルマコフォアの設計方法、EGFR活性調節物質のファルマコフォアを用いたEGFR活性調節物質のスクリーニング方法および設計方法、ファルマコフォアに適合するEGFRアンタゴニスト、EGFRアンタゴニストを用いたEGFR活性の阻害方法、EGF/EGFR複合体の構造座標を用いたEGFR変異体の設計方法および製造方法、ならびに該製造方法により得られるEGFR変異体、EGF/EGFR複合体の構造座標を用いたEGF変異体の設計方法および製造方法、ならびに該製造方法により得られるEGF変異体、EGF/EGFR複合体の構造座標を用いて未知の構造の蛋白質の構造座標を取得する方法および該方法により得られる構造座標、EGF/EGFR複合体の構造座標を用いてエピトープを設計する方法、抗EGFR抗体の製造方法および該方法により得られる抗EGFR抗体、抗EGF抗体の製造方法および該方法により得られる抗EGF抗体、EGFR二量体化部位を形成する領域を含むポリペプチドまたはその塩などを提供することで本発明を完成した。
以下、本発明を詳細に説明する。
1.結晶およびその製造方法
本発明はEGF/EGFR複合体の結晶を提供する。該結晶はEGFとEGFRが1:1で結合しており、かつEGF結合EGFR(EGFが結合した状態のEGFR)が二量体を形成しているEGF/EGFR複合体を含むことを特徴とする。より詳細には、EGF結合EGFRはEGFを介さずに受容体同士の結合によって二量体化している。EGF結合EGFRは、図1aに示すように、EGFRのドメインII、より詳細には配列番号1に示すヒトEGFRのアミノ酸配列の240〜267番目のアミノ酸からなる領域を介して二量体化している。また、EGFはEGFRのドメインIおよびIIIと相互作用している。EGFRのドメインIおよびIIIはEGFを挟み込むかたちで二量体化部位の反対側へと湾曲している。このような特徴を有するEGF/EGFR複合体の結晶であれば、本発明の範囲内に含まれる。EGF/EGFR複合体におけるEGFとEGFRとの相互作用部位を「EGF/EGFR結合部位」、EGF結合EGFRが相互作用して二量体化している部位を「二量体化部位」または「EGFR二量体化部位」と呼ぶ。また、EGF/EGFRと同様のメカニズムで複合体を形成するリガンド/受容体複合体についても同様に、リガンドと受容体との相互作用部位を「リガンド/受容体結合部位」、リガンド結合受容体が相互作用して二量体化している部位を「二量体化部位」または「受容体二量体化部位」と呼ぶ。
本発明に用いるEGFおよびEGFRは哺乳動物、好ましくはマウス、ヒト、特に好ましくはヒト由来のものである。EGFおよびEGFRのアミノ酸配列は公知である。ヒトEGF(成熟ペプチド)はアクセッション番号AAA72173(配列番号2)としてNCBI ProteinDBに登録されている。マウスEGFはアクセッション番号NP_034243としてNCBI ProteinDBに登録されている。ラットEGFはアクセッション番号NP_036974としてNCBI ProteinDBに登録されている。ヒトEGFRはアクセッション番号NP_005219(配列番号15)としてNCBI ProteinDBに登録されている。マウスEGFRはアクセッション番号CAA55587としてNCBI ProteinDBに登録されている。ラットEGFRはアクセッション番号AAF14008としてNCBI ProteinDBに登録されている。上記以外の種のEGFおよびEGFRについても公知のデータベースより配列情報を取得することが可能である。
またその機能が保持されることを条件として、天然のアミノ酸配列に対して1個以上、好ましくは1もしくは数個のアミノ酸の欠失、置換および/または挿入されたアミノ酸配列からなる蛋白質、あるいは、N末端および/またはC末端にアミノ酸が付加したものも包含される。通常、このような一次構造上の僅かな差異は全体の立体構造に大きな影響を与えず、機能は保たれると考えられる。ヒトEGFRの全長アミノ酸配列を配列番号15に示す。配列番号15に示されるアミノ酸配列の1〜24番目のアミノ酸からなる領域はシグナル配列として除去されるので、天然の成熟ヒトEGFRは配列番号15に示されるアミノ酸配列の25〜1210番目のアミノ酸で構成される。
EGFRとしてはEGFRの細胞外ドメインを用いることが好ましい。EGFRは細胞膜を一回貫通した構造をしており、N端より、細胞外ドメイン、膜貫通領域、チロシンキナーゼ領域と自己リン酸化部位を有する細胞内ドメインから構成されている。さらに、細胞外ドメインは4つのドメイン(N端よりドメインI、ドメインII、ドメインIII、ドメインIVと呼ぶ、またはそれぞれ、L1、S1、L2、S2ドメインとも呼ばれる)から構成されている(Bajaj,M.et.al.Biochim.Biophys.Acta 916,220−226(1987))。ヒトEGFRのドメインIは、成熟ヒトEGFRのアミノ酸配列の1〜165番目のアミノ酸、ドメインIIは166〜312番目のアミノ酸、ドメインIIIは313〜512番目のアミノ酸、ドメインIVは513〜619番目のアミノ酸から構成される。EGF/EGFR複合体形成には、EGFRのドメインI、ドメインIIおよびドメインIIIが関与していることが本発明により明らかになった。よって、EGFRとしては、少なくともドメインI、ドメインIIおよびドメインIIIを含む細胞外ドメインを使用することが好ましい。
1−1 蛋白質精製
本発明において結晶構造解析に使用するEGFの採取源は特に限定されず、ブタ、ラット、雄牛などの肝臓、脾臓または腎臓を用いることができる。また、摘出されたヒト肝臓などから採取することもできる。上記採取源をホモジナイズし、可溶化成分を数種類のカラムクロマトグラフにより精製することにより、EGFを採取する。さらに、遺伝子工学的手法を用いて、EGFをコードする遺伝子を細菌や動物細胞等により発現させて大量生産することも可能である。例えば、EGF遺伝子が組み込まれた組換えDNAを、EGF遣伝子が発現し得るように大腸菌、酵母、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞などの宿主中に導入して形質転換体を得、その形質転換体を培養することによりEGFを得ることができる。
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、EGF遺伝子を含む組換えDNAが細胞中で自律複製可能であることが必要である。また、転写プロモーター、リボゾームRNA結合領域としてのSD配列等が連結されていてもよい。転写ターミネーターなどを適宜挿入することもできる。宿主への組換えベクターの導入は、市販のキットを使用する方法等により容易に導入することができる。
EGFは、上記形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞もしくは培養菌体自体、または細胞もしくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。培養方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。例えばCHO細胞を宿主とした場合、通常の動物細胞に使用される培地中で、5%CO2条件下、37℃で培養する。培養の際、必要に応じてウシ血清、抗生物質を培地に添加して行ってもよい。
培養後、EGFが菌体内または細胞内に生産される場合には、ホモジナイザー処理などを施して菌体または細胞を破砕することにより目的のEGFを採取する。その後、前記培養物から各種クロマトグラフ等を用いてEGFを単離精製し調製試料とする。
EGFRについても、EGFの単離精製法に準じて得ることができる。なお、市販の遺伝子組換え型EGFまたはEGFRを使用することも可能である。
EGFとEGFRとの複合体を調製するには、精製したEGFRの溶液に精製EGFを溶解すればよい。二量体は、EGFとEGFRとを混合した反応系においてEGFとEGFRとの複合体同士が結合することにより調製される。
本発明の結晶調製に用いるのに好適なEGFRのアミノ酸配列を配列番号1に、EGFのアミノ酸配列を配列番号2に示す。配列番号1のアミノ酸配列の1〜619番目のアミノ酸からなる領域は、天然の成熟ヒトEGFRの1〜619番目のアミノ酸からなる領域(配列番号15に示されるアミノ酸配列の25〜643に該当)に相当する。配列番号1のアミノ酸配列の620〜633番目のアミノ酸配列からなる領域は精製のためのFLAGタグを含む領域である。但し、これらのアミノ酸配列に限定されるものではなく、上記アミノ酸配列において1個以上(例えば2個〜10個)のアミノ酸に欠失、置換または付加等の変異が生じ、かつ、EGFR活性またはEGF活性を有するものも、本発明に使用することができる。EGFR活性とは、少なくともEGFと結合できること、より好ましくはEGFと結合し、かつそれにより二量体化することを意味し、EGF活性とは、少なくともEGFRと結合できること、より好ましくはEGFRと結合し、かつそれによりEGFRの二量体化を引き起こすことを意味する。たとえば、配列番号15に示されるアミノ酸配列の25〜643番目のアミノ酸からなる領域に対して、N端および/またはC端に1アミノ酸以上伸長したアミノ酸配列を有するEGFRのアミノ酸配列を使用することが可能である。
なお、上記アミノ酸の変異は、当業者に周知の部位特異的突然変異誘発法により変異させることができ、そのためのキットを使用することができる(例えばMutan−G、Mutan−K(いずれも宝酒造社)など)。
本発明はまた、結晶化可能なEGFRの製造方法を提供する。当該製造方法は、
(A)Lec8細胞を用いてEGFR蛋白質を産生する工程;および
(B)グリコシダーゼを用いてEGFRを脱グリコシル化する工程;
を含むことを特徴とする。さらに(C)EGFR蛋白質を塩析により粗精製する工程を含むことができる。本発明者らは、EGFRの細胞外ドメインには10本のN型糖鎖が結合しており、そのうち一本はグリコシダーゼ処理では除去しにくい糖鎖であることを明らかにした。この知見に基づき末端シアル酸およびガラクトース残基欠損型N−結合オリゴ糖を有する蛋白質を産生する細胞であるLec8細胞(ATCCCRL−1737)を用いることが結晶化可能なEGFRを製造する上で有効であることを見出した。また、Lec8細胞を用いて産生したEGFR蛋白質を精製する際に、塩析を用いて粗精製することが有効であることを見出した。塩析としては硫安沈殿を用いることが好ましい。グリコシダーゼの具体例としては、エンドグリコシダーゼD、エンドグリコシダーゼHを挙げることができる。本発明は、上記製造方法により製造される結晶化可能なEGFRも提供するものである。当該EGFRは、少なくともEGFに結合する活性を保持していることを特徴とする。少なくともEGFに結合する活性を保持している限りにおいては、EGFRとしては、天然のアミノ酸配列に対して1個以上、好ましくは1または数個のアミノ酸が欠失、置換および/または挿入されたアミノ酸配列からなる蛋白質、あるいは、N末端および/またはC末端にアミノ酸が付加したものも包含される。また、本発明の結晶化可能なEGFRは、それを用いて得られる結晶(EGFR単独の結晶でもEGFRとEGFR活性調節物質の複合体の結晶でもよい)がX線結晶構造解析に供した際に少なくとも10Å以下の分解能、好ましくは4.0Å以下の分解能、更に好ましくは3.5Å以下の分解能を与えるだけの品質を有していることが好ましい。
上記方法により製造されたEGFRは、本発明においてEGF/EGFR複合体またはEGFRとEGFR活性調節物質の複合体を結晶化する方法において用いることができ、このEGFRを使用することにより、結晶を容易に得ることが可能となる。
1−2 蛋白質の結晶の調製
次いで、EGF/EGFR複合体の結晶を調製する。蛋白質を結晶化する方法としては、蒸気拡散法、バッチ法、透析法などの一般的な蛋白質結晶手法を用いることができる。また、蛋白質の結晶化においては、蛋白質濃度、塩濃度、pH、沈殿剤の種類、温度等の物理的および化学的因子の決定が重要であり、これらの因子の決定については当業者に一般的に知られている。従って、複数のパラメーター(例えば沈殿剤、pHおよび塩濃度)を能率よく調べるために、フェーズダイアグラムを作成しておくことが好ましい。一旦結晶が析出した後は、さらにパラメーターを細かく変えて最良の結晶が出現する条件を精密化する。
(1)「蒸気拡散法」とは、沈澱剤を含む蛋白質溶液の液滴を、より高濃度の沈澱剤を含む緩衝液(外液)の入った容器中に置き、密封後静置する方法である。液滴の置き方によって、ハンギングドロップ法およびシッティングドロップ法があるが、本発明ではいずれの方法も採用することが可能である。ハンギングドロップ法は、蛋白質溶液の小さな液滴をカバーグラス上に配置し、カバーグラスを溶液溜め(リザーバー)上で反転させ、密封する方法である。一方、シッティングドロップ法は、リザーバー内部に適切な液滴台を設置し、蛋白質溶液の小滴を液滴台上に配置し、カバーグラス等でリザーバーを密封する方法である。この場合、リザーバー中の溶液には沈澱剤を含有させ、また沈澱剤は蛋白質小滴中にも少量含有させることが好ましい。
蒸気拡散法で使用する沈澱剤溶液は、当業者であれば適切なものを任意に調製することができる。例えば以下の(a)〜(c)の成分を含有するように調製する。
(a)沈殿剤:分子量400〜2000、0〜50重量%の濃度のポリエチレングリコール(PEG)または硫酸アンモニウムや、MPD(メチルペンタンジオール)など
(b)添加塩:0.1〜0.3Mの濃度のNaCl、塩化リチウム、塩化マグネシウムなど
(c)緩衝剤:リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、トリス−HClなど
なお、成分としては上記に限られるわけではなく、当業者が通常使用する成分を適宜使用し得る。
(2)「バッチ法」とは、蛋白質溶液に沈澱剤溶液を少しずつ加え、わずかに濁ったところで不溶物を遠心分離して除去し、上清を小さな試験管に入れて密封した後に静置する方法である。
(3)「透析法」とは、蛋白質溶液を沈澱剤の入った緩衝液(外液)に対して、半透膜を用いて透析する方法である。
蛋白質の結晶化においては、複合体または二量体を保ったままの条件で結晶化することが必須である。本発明においては、EGFおよびEGFRが溶解している溶液(蛋白質溶液)に、沈殿剤を添加してEGF/EGFRの結晶を析出させることができる。上記蛋白質溶液の溶媒としては、水または緩衝液等が挙げられる。緩衝液としては、例えば0.2M Tris−HCl pH8.0、約0.1M NaCl等が使用可能である。「添加して」とは、蛋白質溶液と緩衝剤溶液を接触させることも含む。例えば、以下の条件に限定するものではないが、EGF/EGFR複合体の場合、蒸気拡散法を用い、pH=7.0〜9.0、蛋白質濃度3〜15mg/ml、温度20℃の条件下で、沈殿剤としてポリエチレングリコールを用いた場合に、X線結晶解析に適した結晶を得ることができる。本発明の結晶製造方法は、EGFRの精製過程において糖鎖処理をする工程を含むことが好ましい。
またさらに本発明は、EGFRとEGFR活性調節物質の複合体の結晶の製造方法を提供する。当該製造方法は、以下の工程を含むことを特徴とする:(A)結晶化可能なEGFRを製造する工程;および(B)EGFRとEGFR活性調節物質を接触させる工程。EGFR活性調節物質の代表例としてはEGFが挙げられるが、これに限定されるものではなく、後述するEGFRアゴニストまたはEGFRアンタゴニストであれば、ペプチド、オリゴヌクレオチド、合成化合物、天然由来化合物のいずれでもよい。EGFR活性調節物質は、当技術分野で公知の手法により調製することができる。当該結晶の製造方法は、さらに(C)EGFRとEGFR活性調節物質の複合体を結晶化する工程;を含むことができ、上述した蒸気拡散法、バッチ法、透析法などの一般的な蛋白質結晶化手法を採用して当該複合体を結晶化させることができる。
(C)の工程はさらに、(C−1)EGFRとEGFR活性調節物質を含有する溶液と沈殿剤を含有する溶液を接触させる工程;(C−2)結晶を生成させる工程;および(C−3)結晶を単離する工程;を含み得る。EGFRとEGFR活性調節物質を含有する溶液と沈殿剤を含有する溶液を接触させる工程は、例えば、透析膜を介した接触、ハンギングドロップ法におけるシールされた空間を介する接触、溶液同士の混合などにより行うことができる。結晶を生成させる工程は、EGFRとEGFR活性調節物質を含有する溶液における蛋白質および沈殿剤の濃度の緩やかな上昇による蛋白質の過飽和状態を生じさせることにより実現される。またこの工程は、蛋白質溶液に種結晶を導入することによっても実現され得る。
1−3 結晶のX線結晶回折
蛋白質の3次元構造を明らかにする手法として最も一般的に行われているものは、X線結晶構造解析の手法である。すなわち、蛋白質を結晶化し、その結晶に単色化されたX線を当て、得られたX線の回折像をもとに、蛋白質の3次元構造を明らかにしていくものである。本発明はEGFRとEGFR活性調節物質の複合体の構造座標を決定する方法を提供する。当該方法は、以下の工程を含むことを特徴とする:
(A)EGFRとEGFR活性調節物質の複合体の結晶を製造する工程;および
(B)(A)により得られた結晶を用いたX線結晶構造解析によりEGFRとEGFR活性調節物質の複合体の構造座標を取得する工程
(A)の工程は上記「1−2」において説明したとおりである。(B)の工程はさらに、(b−1)(A)により得られた結晶にX線を照射し回折データを取得する工程;(b−2)(b−1)により得られた回折データの解析により複合体の電子密度図を取得する工程;および(b−3)(b−2)により得られた電子密度図の解析により複合体の構造座標を取得する工程;を含み得る。複合体結晶の構造解析は、実験室のX線回折計または大型放射光施設(ESRF、APS、SPring−8、PF、ALS、CHESS、SRS、LLNL、SSRL、Brookhavenなど)を用いて、振動写真法やラウエ法によってイメージングプレートまたはCCDカメラなどの2次元検出器を用いて回折データの収集を行い、該データより複合体の3次元構造をX線結晶構造解析により明らかにすることができる。具体的には、X線回折実験により収集された回折イメージをデータ処理ソフトウエアで処理することで、個々の回折斑点の指数と積分によって得られた回折強度を算出できる。これらの回折斑点の回折強度と位相情報を用いて逆フーリエ変換を行うことで3次元空間の電子密度を導くのであるが、回折実験では電子密度の計算に必要な各回折斑点の位相の情報を測定することは原理的に不可能である。そこで電子密度を得るために、分子置換法、重原子同型置換法、多波長異常分散法(MAD法)またはそれらの改変法によって、失われた情報である位相を推定する。こうして得られた電子密度図に合わせて、3次元モデルをグラフィックスワークステーション上で稼動するソフトウエアを用いて構築する。このモデル構築の後、最小二乗法、最尤法、Simulated Annealing法などによる構造の精密化を行うことで最終的な複合体の3次元構造を得る。
MAD法においては放射光を使って、入射X線波長を変えて結晶の回折データを測定する。MAD法に使うことのできる放射光は、例えば大型放射光施設SPring−8構造生物学ビームラインI(BL41XU)により発生させることができる。
蛋白質結晶はX線照射により損傷を受け、回折能が劣化する場合が多いため、低温測定により高分解能のX線回折を行うことが好ましい。低温測定とは、結晶を急激に−173℃程度に冷却凍結して、その状態で回折データを収集する方法である。一般に、蛋白質結晶の凍結には、凍結による結晶の崩壊を防ぐ目的で、グリセロールなどの保護剤を含む溶液で処理するなどの工夫がなされる。凍結結晶は、例えば保護剤を添加した保存液に浸漬した結晶を、液体窒素に直接浸漬して瞬時に凍結させることにより調製することができる。
本発明では、EGFRとEGFR活性調節物質の複合体、例えばEGFとEGFRとの複合体が結合した二量体の結晶を、適切なX線源を用いてX線回折する。
X線回折データは、複合体の3次元構造を詳細に解析できるように、少なくとも10Å以下の分解能、好ましくは4.0Å以下、更に好ましくは3.5Å以下の分解能に回折する結晶で収集する。
本発明者は、EGFとEGFRとの複合体結晶の構造を、X線による結晶構造解析技術を用いて解析した。配列番号2に示されるアミノ酸配列を有するEGFと、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するEGFRとの複合体の結晶は、晶系P3121に属するものであり、単位格子としてa軸、b軸およびc軸の方向にa=220.2±1.5Å、b=220.2±1.5Åおよびc=113.1±1.5Åの大きさを有する。すなわち、本発明のEGF/EGFR複合体の結晶は、単位格子定数がa=220.2±1.5Å、b=220.2±1.5Åおよびc=113.1±1.5Åであることを特徴とする。更に、その複合体の結晶を用いたX線回折による結晶構造解析の手法により、EGFとEGFRとの複合体の3次元構造座標(各原子の空間的な位置関係を示す値)が得られる。得られた構造座標を、当業者において一般的に用いられている蛋白質の3次元の構造座標の表記方法に従って表したものを表1および表2に示す。表1は3.5Åの分解能で決定された構造座標であり、表2は3.3Åの分解能で決定された構造座標である。
表1および表2のデータは、プロテインデータバンク(PDB)のフォーマットに準じて記載されているものである。PDBフォーマットは、蛋白質分子を構成するそれぞれの原子の座標等を記載したものであり、生体高分子の座標を扱う際の標準的形式の一つである。表1または表2に記載の記号または数字において、最も左側の列(第1列目)に記載の「ATOM」は、原子座標の原子一つ一つを意味する。表2における「HETATM」も同様だが、その行に記載された原子はアミノ酸に属する原子ではない(例;NAGや水分子)ことを意味する。「TER」はペプチド鎖のC末端であることを意味する。その右側の列(第2列目)の数字は原子の通し番号(1〜8767または1〜8896)であり、その右側の列(第3列目)に記載のアルファベットは原子の種類を意味する(下記参照)。
C:アミノ酸残基の炭素原子
N:アミノ酸残基の窒素原子
O:アミノ酸残基の酸素原子
S:アミノ酸残基の硫黄原子
ここで、上記原子の右側に併記したアルファベット(A、B、D、G等)は、その原子の位置関係を示すものであり、例えばCA、CB、NE、NZ、OE、SG等のように記載する。
さらに、上記原子の種類を示すアルファベットの右側の列(第4列目)に記載したアルファベットは、この原子が属するアミノ酸残基を意味し、3文字表記されている(例えば「GLU」「LYS」「VAL」等)。但し、原子の通し番号8614番以降の「NAG」はN−アセチルグルコサミンを意味する。「TIP」は水分子を意味する。さらにその右側の列(第5列目)のアルファベット(A、B、C、D)は、蛋白質鎖の識別記号であり、それぞれEGFR1、EGFR2、EGF1、EGF2を表す。さらにその右側の列(第6列目)に記載の数字はアミノ酸残基のN末端からの番号を意味する。EGFRのアミノ酸残基の番号は、配列番号1に記載のアミノ酸配列に対応している。EGFのアミノ酸残基の番号は、配列番号2に記載のアミノ酸配列に対応している。さらに、この数字の右側の列(第7列目)から第9列目までは、順にX座標(a座標)(オングストローム単位)、Y座標(b座標)(オングストローム単位)、Z座標(c座標)(オングストローム単位)を示す。さらにその右側の列(第10列目)から最も右側の列(第12列目)に向かって、順に占有率(「1.00」等)、等方性温度因子(例えば表1の原子の通し番号1番では120.73、2番では131.35)、原子番号または原子記号(6:C、7:N、8:O、16:S、等)を意味する。
2.EGF/EGFR複合体の構造座標
本発明はEGF/EGFR複合体の構造座標、具体的には、EGF/EGFR複合体の結晶であって,EGF/EGFR複合体が以下の(A)および(B)の特徴を有する結晶を用いたX線結晶構造解析により得られるEGF/EGFR複合体の構造座標を提供する。
(A)EGFとEGFRが1:1で結合している
(B)EGF結合EGFRが二量体を形成している
本発明において「構造座標」とは、結晶形態における蛋白質の原子に含まれる電子によるX線の回折により得られる個々の回折点の回折強度を数値化し、解析することによって導かれる数学的座標であって、上記蛋白質の原子の位置を3次元座標として表したものを意味する。すなわち構造座標とは、実質的には化学構造を構成する分子(原子)間の各距離によって定まる空間配置を意味する。この空間配置をコンピューター上で情報として処理する場合には、相対的な配置をある座標系における特定座標として数値情報化する(座標化という)が、これはコンピューター処理を行うにあたり便宜上必要な処理であって、構造座標の本質は、先に示した通り各分子(原子)間相互の距離によって定まる配置であって、コンピューター処理時に一時的に特定される座標値ではないと理解されるべきである。また、本明細書中において原子座標とは、物質(蛋白質、アミノ酸など)を構成する個々の原子についての座標を意味する。
本発明者は、EGFリガンドの結合が受容体の二量体化と活性化を誘導するという機構を解明するために、EGFと複合体を形成したEGFRの細胞外ドメインを結晶化し、X線結晶学により解析した。そして、ヒトEGFと複合体を形成したヒトEGFRの細胞外ドメインのうち、ドメインI、IIおよびIIIの結晶構造を3.5Å分解能および3.3Å分解能で解析することに成功した。解析結果によれば、2つの受容体(EGFR)がそれぞれリガンド(EGF)と複合体を形成していることが判明した。その複合体は、各リガンドが各受容体のドメインIとIIIの表面の間に捕捉される形態をとっている。また、二量体は、各受容体のドメインIIから突き出した2つのループ間の相互作用により形成され、安定化している。上記二量体の形成は、EGF誘導型受容体二量体化の構造的機構を示すものである。
以下に、本発明のEGF/EGFR複合体の結晶構造解析の経緯と解析結果の詳細な検討から導き出される事項を説明する。
2−1 構造決定
本発明において、ヒトEGFRの細胞外ドメインは、末端シアル酸およびガラクトース残基を欠損しN結合オリゴ糖を有する蛋白質を産生するチャイニーズハムスター卵巣Lec8細胞において発現させ、精製した。得られた蛋白質をエンドグリコシダーゼDおよびHで消化して脱グリコシル化し、そしてヒトEGF(hEGF)と共に結晶化した。本発明者はまた、Lec8細胞からセレノメチオニン置換型組換え蛋白質を発現させ、精製し、脱グリコシル化してネイティブ結晶として結晶化した。全ての回折データはSPring−8で収集した。これにより、ネイティブ結晶構造を、MAD法および分子置換解析法により3.5Åに決定した(図1aおよび1b)。得られた電子密度図は、複合体のモデル構築(図1c)に十分に使用可能であった。構造精密化の最終段階の後で、RcrystおよびRfreeはそれぞれ28%および34%となった。これは、75%という比較的大きな溶媒含量と、複合体を構成するアミノ酸残基のうちの18%に対応する比較的大きな欠損領域に起因するものである。データ収集および構造精密化の統計値を表3に示す。
2−2 全体の構造
本発明では、EGFR/EGF複合体の二量体を3.5Åにおいて結晶構造決定することによって、EGF/EGFR結合部位およびEGFR二量体化部位の原子構造が明らかとなった。結晶の非対称単位における二量体は、EGFが結合したEGFRを2つ含むものである。リガンド/受容体相互作用領域(interface)は、EGFRのドメインIにおいて1箇所、ドメインIIIにおいて2箇所の部位からなる。EGFが受容体のドメインIおよびIIIと広範囲に相互作用する溝は、EGFRのドメインI、IIおよびIIIにより形成されており、EGFともう一つの受容体との間に相互作用は全くない。二量体構造は、受容体/受容体相互作用により安定化されている。まず、EGFがEGFRと結合し、その結果EGFRのドメインIおよびIIIがEGF側に湾曲してそのポケット内にEGFを収めている。そして、湾曲部の外側同士が背を向けるようにしてドメインII(S1ドメインともいう)を介して結合して二量体を形成し、EGFRは互いに剣のつばを向き合せた形態をとっている。従って、2つのEGFは直接接触しておらず、その距離は79Å離れている。
ドメインIおよびIIIは繰り返しβシートの右巻き構造からなり、その主鎖は、リガンドが付加していないIGF−1R(インシュリン様増殖因子−1受容体)のL1およびL2ドメインと個々に類似し、対応する各ドメインのCα原子の平均二乗偏差の平方根(RMSD値)がそれぞれドメインIについて2.1Å、ドメインIIIについて4.0Åである。リガンドが付加していないIGF−1Rの構造との比較によって、本発明における複合体のドメインII〜III間の配向は、S1〜L2間の配向に対して明らかに相違することが明らかとなった。そして、EGFR/EGF複合体の二量体構造は、EGFRとEGFが結合したことにより受容体のドメインII(S1ドメイン)からループが突き出し、この突き出たループによって、各複合体同士が結合することが分かった。この結合様式は、従来のEGFRの細胞外ドメインのモデリング構造(Protein Sci.2000,9,310−324)には示されておらず、本発明において初めて見出された知見であり、新規な構造的特徴を示すものである。この二量体化に必要なループ領域は、蛋白質のアミノ酸配列アライメントからEGFRファミリーに特異的であり、インシュリン受容体ファミリーでは欠損していることがわかった。ドメインIIは、IGF−1RのS1と類似した折りたたみ様式を示す。EGFR/EGF複合体における湾曲の外側(EGFを結合している領域とは反対側)に位置するCys240とCys267との間のループと、IGF−1R分子の内側に位置するCys252とCys273との間のループとは異なるもののそれ以外の対応するCα原子の平均二乗偏差の平方根が3.2Åである。ドメインIIIのC末端残基(Val481)は互いに77Å離れており、二量体のドメインIVが存在しない場合には細胞質ドメインが互いに接近できないと考えられる。
なお、本明細書においてアミノ酸(3文字表記)に併記した数字は、EGFRを説明している場合はEGFRのアミノ酸配列(配列番号1)に対応するアミノ酸番号を示す。EGFを説明している場合はEGFのアミノ酸配列(配列番号2)に対応するアミノ酸番号を示す。IGF−1Rを説明している場合はIGF−1Rのアミノ酸配列(配列番号3)に対応するアミノ酸番号を示す。
2−3 リガンド−受容体相互作用
EGFは、EGFRの3つの部位と相互作用し、これはドメインIにおける部位1(Site 1)、ドメインIIIにおける部位2(Site 2)および部位3(Site 3)からなる(図2a)。これらのリガンドと受容体との相互作用領域は広範囲にわたっており、その接触面積は、ドメインIでは約720Å2、ドメインIIIでは730Å2におよび、疎水性相互作用が支配している。部位1におけるLeu14、Tyr45、Leu69およびLeu98側鎖、ならびにEGFのB−ループにおけるMet21、Ile23およびLeu26側鎖は疎水性環境を形成している(図2b)。部位2におけるVal350およびPhe357側鎖、ならびにEGFにおけるTyr13およびLeu15側鎖は疎水性環境を形成している(図3a)。部位3におけるPhe412およびIle438側鎖、ならびにEGFにおけるLeu47側鎖は疎水性環境を形成している(図3b)。上記特性を有するアミノ酸残基はEGFファミリーメンバーにおいて保存されており、このことは、受容体とリガンドとの上記相互作用領域が、他のEGFRファミリーメンバーの保存されている相互作用部位に存在する可能性があることを示唆している。
リガンドのアミノ酸配列を部位特異的突然変異誘発法により置換することによって、受容体結合における上記疎水性残基のTyr13、Met21、Ile23およびLeu26の重要性が示唆されている(Tadaki,D.K.&Niyogi,S.K.J.Biol.Chem.268,10114−10119(1993);Campion,S.R.et al.,Biochemistry 29,9988−9993(1990);Koide,H.et al.,Biochim.Biophys.Acta 1120,257−261(1992))。
突然変異誘発法によりEGFのIle23をAla、Val、Leu、Phe、Trpなどに置換した実験から、EGFにおけるIle23は、受容体との強い結合に必要であり、その結合部位はイソロイシン残基の大きさとちょうど良いことがわかっている。このことは、EGFRドメインIにおけるLeu14、Tyr45およびLeu69の側鎖が形成するEGFIle23結合領域が、結晶構造のイソロイシン側鎖とほぼ相補的であることと十分に一致する。
同様に、突然変異誘発法によりEGFのTyr13をPhe、Leu、Val Alaなどに置換してレセプターへの結合の実験を行った結果、Tyr13が最適な大きさであることが示唆されているが、このことは、ドメインIIIにおけるPhe357側鎖とHis10、Tyr29およびArg41側鎖が形成するTyr13結合領域が、結晶構造のチロシン側鎖と相補的であることと十分に一致する。結晶構造において、部位1におけるGlu90側鎖はリガンドに由来するLys28側鎖と塩橋を形成し、また部位2におけるAsp355側鎖はリガンドに由来するArg41側鎖と塩橋を形成する。突然変異誘発および生化学研究によって、EGFにおけるArg41のグアニジウム基が受容体との結合にとって重要な決定因子であることが示されている(Engler,D.A.et al.,J.Biol.Chem.267,2274−2281(1992))。このことは、上記側鎖がリガンドに由来するTyr13側鎖および受容体に由来するPhe357側鎖と接近して疎水環境を形成しているという結晶構造の結果とよく一致する。突然変異誘発法によってEGFのLys28をLeuに変異させてレセプターへの結合実験を行った結果、当該ロイシンへの置換が受容体結合にほとんど影響を及ぼさない結果が得られている。この結果は、結晶構造とは明らかに一致しないものであり、28番の位置におけるイオン性相互作用(Campion,S.R.et al.,Biochemistry 29,9988−9993(1990))は必ずしも必要ないことを示している。
いくつかの水素結合によってさらにリガンドと受容体との相互作用領域が強化されている。部位1におけるGln16側鎖は、リガンドに由来するAsn32側鎖と水素結合を形成している。突然変異誘発法によってEGFのAsn32をHis、Phe、Val、Aspなどに置換した結果、EGFにおけるAsn32が受容体との強い結合に必要であることが示唆されている(Koide,H.et al.,FEBS Lett.302,39−42(1992))。部位3におけるGln384側鎖は、リガンドにおけるGln43およびArg45の主鎖原子と水素結合を形成している。
キメラEGF/ヒレグリンペプチドの研究(Barbacci,E.G.et al.,J.Biol.Chem.270,9585−9589(1995))から、ヒレグリンのN末端にある5残基が、ヒレグリン受容体(ErbB−4)との結合に特に重要であることがわかっている。しかしながら、結晶構造においてN末端領域に相互作用は認められておらず、このことは、リガンドの結合部位の違いによって受容体の結合部位が異なり、またこの違いがEGFRファミリーメンバーにおけるリガンド−受容体特異性を付与している可能性があることを示唆している。EGFファミリーメンバーにおいて保存されていない特性を有するアミノ酸との特異的な相互作用は、結晶構造においてはEGFのAsn32以外に認められない。EGFとリガンド結合部位を共有するTGF−αの対応する位置はValに置換されており、このことは、Asn32がEGFRにリガンド特異性を付与するものではないことを示唆している。EGFのN末端は、残基Tyr101およびLys336と架橋し得ることが示されている。EGFのN末端領域(ディスオーダーしているため構造は見えない)とEGFRとの相互作用は結晶構造に認められないが、結晶構造におけるそれらのEGF構造のN末端であるGlu5のCαとの推定距離はそれぞれ16Åおよび39Åである。
このことは、EGFのN末端はTyr101とは架橋可能であるが、Lys336とは架橋不可能であることを示している。また、安定なEGF結合EGFRの二量体は、その形成過程において複数の中間状態を経る可能性があり、その中間状態では、EGFが結晶構造では説明されない受容体の異なるいくつかの部位でEGFRと結合することも考えられる。ドメインIにおける残基10−17、85−94および101−107、ならびにドメインIIIにおける残基316−325、353−362および404−413は、繰り返しβシートの右巻き構造から形成される円筒部分の外側にループアウトしているようである。上記ループのうちループ10−17および353−362はEGF結合に関与しており、これは、リガンド競合モノクローナル抗体(LA22)(Wu,D.G.et al.,J.Biol.Chem.264,17469−17475(1989))に対するエピトープ(残基351−364)の大部分を包含するループ353−362と一致するものである。
以上の説明の中でEGF/EGFR複合体構造解析の結果からEGF/EGFR相互作用に関与していることが示されたアミノ酸残基は、EGF/EGFR結合部位において重要な相互作用を形成しているアミノ酸の例である。
2−4 受容体−受容体相互作用
二量体における2つのEGFR分子間の相互作用は、ほぼドメインIIに限定される(図4a〜c)。この相互作用領域の全体的な接触面積は、約1270Å2である。特に、Cys240とCys267との間のループが受容体の二量体化に関与している。ダイマー間の相互作用は2回回転対称となっている。Tyr246、Pro248およびTyr251側鎖は、他の受容体に由来するPhe230、Phe263、Ala265、Tyr275およびArg285側鎖と共に疎水性環境を形成し、これはTy275とArg285側鎖の間の水素結合により達成される。
Gln252側鎖は、主鎖の窒素およびAla286のカルボニル酸素と水素結合を形成している。Tyr246側鎖と他の受容体のCys283の主鎖酸素との水素結合によって、相互作用領域が強化されている。上記アミノ酸残基の大部分の特性がEGFRファミリーメンバーにおいて保存されており、このことは、各受容体のループ間における相互作用領域が、他のEGFRファミリーメンバーの保存されている二量体化部位に存在する可能性があることを示唆している。本明細書に開示する結晶構造では各ドメインII間の上記相互作用の他に、ドメインIIにおける1つのアミノ酸残基と他の受容体のドメインIにおける1つのアミノ酸残基との唯一の相互作用も観察される。詳細に説明すると、二量体化ループから突き出たThr249側鎖は、他の受容体のドメインIに由来するAsn86側鎖と水素結合を形成している。
以上の説明の中でEGF/EGFR複合体構造解析の結果から二量体化に関与していることが示されたアミノ酸残基は、EGFR二量体化部位において重要な相互作用を形成しているアミノ酸の例である。
2−5 リガンド誘導型受容体二量体化の機構
最初に、シグナル伝達に関与する受容体活性化機構を理解する必要がある。EGFRは、膜を横切るシグナル伝達に関する多数の研究において代表的な標的の1つとなっている。過去四半世紀の間に、EGFRの活性化機構に関する生化学および物理生物学データが徐々に蓄積された。EGFとEGFR細胞外ドメインとの結合は、安定な二量体の形成を誘導すると考えられていたが、二量体化の様式(EGFを介して二量体化しているのか、受容体側で二量体化しているのか)は不明であった(Lemmon,M.A.et al.,Embo J.16,281−294(1997))。本発明者は、この安定な二量体EGFR−EGF複合体の構造を初めて明らかにした。
EGF/EGFR複合体の結晶構造とリガンドが付加していないIGF−1R結晶構造との比較に基づいて、本発明者はEGF誘導型受容体二量体化の機構を推定した。結晶構造は、受容体の二量体化はEGFが関与する相互作用により媒介されていないが、2つのEGFRそれぞれのドメインII間の直接的な相互作用により媒介されており、EGFの受容体への結合によって、受容体−受容体相互作用部位を露出するコンホメーション変化がもたらされることを示している。EGFRファミリーに特異的なループ領域の1つは、EGFRのCys240とCys267との間に位置する。二量体化部位として機能するというこのループの重要な役割は、本発明の結晶構造から初めて明らかとなった。
本発明者は、リガンドが付加されていないIGF−1Rとの比較によって、リガンドのEGFR細胞外ドメインとの結合が、推定ヒンジ領域(Lys303〜Lys311)のドメイン間の配向の変化を誘導し、ドメインIIIをドメインIIに接近させる可能性があることを推測した(図5a)。本発明者は、Glu293側鎖が、未結合EGFR単量体におけるドメインIIのArg285側鎖と塩橋を形成する可能性があると仮定する。この仮定は、未結合IGF−1R構造との比較によって合理的に得られたものである。リガンドが未結合のIGF−1Rでは、対応する位置にあるR283側鎖がS1ドメインにおけるGlu276側鎖と塩橋を形成している(図5b)。リガンド依存的コンホメーション変化により、Glu293側鎖の届く範囲内にドメインIIIのArg405側鎖が接近し、続いてこれらの側鎖間に塩橋が形成される。相互作用パートナーと離れたArg285側鎖は、Tyr275側鎖と相互作用すると考えられる。結果として、疎水性環境はPhe263、Tyr275およびArg285側鎖と共に形成され、そこでは、他の受容体のドメインIIから突き出したTyr251側鎖は結晶構造で示すように疎水性接触をする(図5c)。本発明者は、受容体のリガンド誘導型コンホメーション変化が、上記相互作用および他の未同定の構造変化を制御するものと推測する。
本発明者は、以下に、他の潜在的な構造変化について考察する。二量体化ループがドメインIIから突き出た形ではなく、受容体の活性化前にループ自体にくるみ込まれると仮定すると、リガンド依存的レセプター活性化はより効果的に起こるだろう。この目的のため、本発明者は、Arg273側鎖が未結合EGFR単量体のドメインIIにおけるAsp254側鎖と塩橋を形成すると試行的に仮定して、以下のようなモデルを提案する(図5c)。
受容体のEGF依存性コンホメーション変化により、Arg273の届く範囲内にドメインIIIのGly458の主鎖が接近し、続いてGly458の主鎖酸素とArg273に由来する側鎖との間で水素結合が形成される。Asp254側鎖はいずれの相互作用からも解放されて、Asp254を包含する二量体化ループはドメインIIから突き出た形となり、それにより他の受容体それぞれの二量体化ループ間における相互作用が可能となる。
EGFRの細胞外ドメインの二量体化によって、2つの受容体の細胞質チロシンキナーゼドメインが接近して存在し、その結果、エリスロポエチン受容体(Remy,I.et al.,Science 283,990−993(1999))と同様に、細胞内ドメインにおいて内在性チロシンキナーゼ受容体が活性化される。
2−6 まとめ
本発明者は、EGFR/EGF複合体の二量体構造を3.5Åおよび3.3ÅにおけるX線回折データに基づいて初めて解明した。本発明の結晶構造は、二量体における受容体の各ドメインIIから突き出した2つのループのみが主な二量体化部位であるという新規な構造的特徴を示すものである。本発明の結晶構造は、リガンド誘導型EGFR活性化を原子レベルで説明する情報を初めて提供するだけではなく、EGFRファミリーのアンタゴニストまたは活性化阻害剤を例えば新規抗腫瘍剤として開発するために、重要な情報を提供するものである。
従来技術で得られているEGF結晶構造およびEGFRモデリング構造を、本発明で得られたEGF/EGFR複合体結晶構造の座標と比較解析すれば、そのアミノ酸主鎖の流れや、側鎖配座が、ドラッグデザインなどの産業応用に活用する際には、十分な精度を有さないことが判然とする。
2001年に明らかとされたEGF結晶構造1JL9(J.Biol.Chem.276 pp.34913(2001))とEGFR/EGF複合体構造を比較すると、Cys6−Leu47の主鎖でスーパーインポーズ(最小2乗法による重ね合わせ)した場合、1JL9A鎖で1.5オングストローム、1JL9B鎖では、2.9オングストロームもRMSD(root mean square deviation)値(平均二乗偏差の平方根)に差があった。EGF活性を発揮するのに重要な側鎖を含めてスーパーインポーズを行った際には、更に構造のずれは拡大し、A鎖で3.5オングストローム、B鎖とでは、4.2オングストロームもRMSD値に差があった。従来技術のEGF構造は、EGFRと結合していない状態での構造を反映したものであるに過ぎず、薬理活性を発揮するEGFRとの複合体中で観察される活性コンフォメーションを提供するには十分な情報ではないことが判明した。EGF/EGFR共結晶構造中のEGFの活性コンフォメーションと従来技術で提示されているフリーの状態でのEGFのコンフォメーションがかくのごとく異なるのは、EGFが、EGFRと結合することによって、そのコンフォメーションや側鎖の向きが、EGF活性を発揮する上で変化することに他ならない。この変化した構造こそが活性コンフォメーションであり、これが提供されることによって、医薬品の創出や開発に有用なものとなる。従って、EGF/EGFRの活性コンフォメーションが、本発明で明らかにされたことは、非常に進歩性があると考えられる。
EGFRの蛋白質立体構造の先行技術に至っては、EGF/EGFR複合体構造が知られていなかっただけではなく、モデリング構造で単量体のEGFR構造が予測されていたに過ぎなかった。従来は、インシュリン様増殖因子−1受容体のリガンド結合部位が、リガンドの結合していない状況下において結晶化され構造が特定されていたが、この構造では、リガンドが結合した際の活性コンフォメーションを予測することができないため、学術的解析や、分子設計を行う際に十分な情報を提供することが困難であった。特に、EGFRの活性コンフォメーションはダイナミックに変化を起こすため、リガンドが結合していない構造で、その活性コンフォメーションを推測することが不可能である。ホモロジーモデリング法においてテンプレートの構造は、モデリングを行う際の標的蛋白質(EGFR単量体)モデル構造のコンフォメーションを規定するので、リガンド非結合時のIGF−1Rの構造をテンプレートにEGFRのモデリングを行えば、リガンド非結合時のIGF−1Rと同様のコンフォメーションのEGFRモデルが得られる。EGFRのモデリング構造のテンプレートとなったインシュリン様増殖因子−1レセプター単量体結晶構造と、本発明によって明らかにされたEGF/EGFR複合体のEGFR構造とを比較すれば、視覚的解析においてさえ、リガンドが結合していない構造からでは活性コンフォメーションのモデリングは極めて困難であることが理解できる(図8参照)。
本発明の複合体共結晶構造が与える構造座標は、EGFR活性調節物質(すなわちアゴニストやアンタゴニスト)のファルマコフォア抽出、複合体構造座標の全部または一部を用いたコンピュータスクリーニング、EGFRアゴニストやアンタゴニストの分子設計(活性上昇、選択性付与など)、産業上有用なEGFまたはEGFRの変異体設計およびスクリーニング、EGF中和抗体・アゴニスト抗体の作製、EGF/EGFR結晶構造を利用した分子置換法、インシュリンレセプター等EGFRと同様のフォールドを有すると考えられる蛋白質のモデリングとその構造の活用(コンピュータスクリーニング、分子設計、抗体設計、改変体設計、分子置換法など)などにおいて有用であり、本発明はこれらに使用可能なEGF/EGFR複合体の構造座標を提供するものである。
より詳細には、本発明は下記(a)〜(zc)の構造座標を提供する:
(a)表1に示される構造座標の全部または一部;
(b)表1に示される構造座標により特定されるEGF/EGFR複合体のα炭素に対して、平均二乗偏差の平方根が2.0Å以下であるα炭素の原子座標を有する構造座標により特定されるEGF/EGFR複合体の構造座標;
(c)表1に示される構造座標の原子の通し番号1から3957により特定されるEGFRの構造座標;
(d)表1に示される構造座標の原子の通し番号1から3957により特定されるEGFRのα炭素に対して、平均二乗偏差の平方根が2.0Å以下であるα炭素の原子座標を有する構造座標により特定されるEGFRの構造座標;
(e)以下の(e−1)〜(e−4)のいずれかに記載の構造座標のうち少なくとも一つを含んでなるEGFRの一部の構造座標;
(e−1)表1に示される構造座標の原子の通し番号1から3957により特定されるEGFRのドメインIに相当する部分の構造座標;
(e−2)表1に示される構造座標の原子の通し番号1から3957により特定されるEGFRのドメインIIに相当する部分の構造座標;
(e−3)表1に示される構造座標の原子の通し番号1から3957により特定されるEGFRのドメインIIIに相当する部分の構造座標;
(e−4)(e−1)〜(e−3)のいずれかにより特定されるEGFRのドメインI、IIまたはIIIに相当する部分のα炭素に対して、平均二乗偏差の平方根が2.0Å以下であるα炭素の原子座標を有する構造座標により特定されるEGFRのドメインI、IIまたはIIIに相当する部分の構造座標;
(f)表1に示される構造座標の原子の通し番号3958から7887により特定されるEGFRの構造座標;
(g)表1に示される構造座標の原子の通し番号3958から7887により特定されるEGFRのα炭素に対して、平均二乗偏差の平方根が2.0Å以下であるα炭素の原子座標を有する構造座標により特定されるEGFRの構造座標;
(h)以下の(h−1)〜(h−4)のいずれかに記載の構造座標のうち少なくとも一つを含んでなるEGFRの一部の構造座標;
(h−1)表1に示される構造座標の原子の通し番号3958から7887により特定されるEGFRのドメインIに相当する部分の構造座標;
(h−2)表1に示される構造座標の原子の通し番号3958から7887により特定されるEGFRのドメインIIに相当する部分の構造座標;
(h−3)表1に示される構造座標の原子の通し番号3958から7887により特定されるEGFRのドメインIIIに相当する部分の構造座標;
(h−4)(h−1)〜(h−3)のいずれかにより特定されるEGFRのドメインI、IIまたはIIIに相当する部分のα炭素に対して、平均二乗偏差の平方根が2.0Å以下であるα炭素の原子座標を有する構造座標により特定されるEGFRのドメインI、IIまたはIIIに相当する部分の構造座標;
(i)表1に示される構造座標の原子の通し番号7888から8250により特定されるEGFの構造座標;
(j)表1に示される構造座標の原子の通し番号7888から8250により特定されるEGFのα炭素に対して、平均二乗偏差の平方根が2.0Å以下であるα炭素の原子座標を有する構造座標により特定されるEGFの構造座標;
(k)表1に示される構造座標の原子の通し番号8251から8613により特定されるEGFの構造座標;
(l)表1に示される構造座標の原子の通し番号8251から8613により特定されるEGFのα炭素に対して、平均二乗偏差の平方根が2.0Å以下であるα炭素の原子座標を有する構造座標により特定されるEGFの構造座標;
(m)表2に示される構造座標の全部または一部;
(n)表2に示される構造座標により特定されるEGF/EGFR複合体のα炭素に対して、平均二乗偏差の平方根が2.0Å以下であるα炭素の原子座標を有する構造座標により特定されるEGF/EGFR複合体の構造座標;
(o)表2に示される構造座標の原子の通し番号1から3957により特定されるEGFRの構造座標;
(p)表2に示される構造座標の原子の通し番号1から3957により特定されるEGFRのα炭素に対して、平均二乗偏差の平方根が2.0Å以下であるα炭素の原子座標を有する構造座標により特定されるEGFRの構造座標;
(q)以下の(q−1)〜(q−4)のいずれかに記載の構造座標のうち少なくとも一つを含んでなるEGFRの一部の構造座標;
(q−1)表2に示される構造座標の原子の通し番号1から3957により特定されるEGFRのドメインIに相当する部分の構造座標;
(q−2)表2に示される構造座標の原子の通し番号1から3957により特定されるEGFRのドメインIIに相当する部分の構造座標;
(q−3)表2に示される構造座標の原子の通し番号1から3957により特定されるEGFRのドメインIIIに相当する部分の構造座標;
(q−4)(q−1)〜(q−3)のいずれかにより特定されるEGFRのドメインI、IIまたはIIIに相当する部分のα炭素に対して、平均二乗偏差の平方根が2.0Å以下であるα炭素の原子座標を有する構造座標により特定されるEGFRのドメインI、IIまたはIIIに相当する部分の構造座標;
(r)表2に示される構造座標の原子の通し番号3958から7905により特定されるEGFRの構造座標;
(s)表2に示される構造座標の原子の通し番号3958から7905により特定されるEGFRのα炭素に対して、平均二乗偏差の平方根が2.0Å以下であるα炭素の原子座標を有する構造座標により特定されるEGFRの構造座標;
(t)以下の(t−1)〜(t−4)のいずれかに記載の構造座標のうち少なくとも一つを含んでなるEGFRの一部の構造座標;
(t−1)表2に示される構造座標の原子の通し番号3958から7905により特定されるEGFRのドメインIに相当する部分の構造座標;
(t−2)表2に示される構造座標の原子の通し番号3958から7905により特定されるEGFRのドメインIIに相当する部分の構造座標;
(t−3)表2に示される構造座標の原子の通し番号3958から7905により特定されるEGFRのドメインIIIに相当する部分の構造座標;
(t−4)(t−1)〜(t−3)のいずれかにより特定されるEGFRのドメインI、IIまたはIIIに相当する部分のα炭素に対して、平均二乗偏差の平方根が2.0Å以下であるα炭素の原子座標を有する構造座標により特定されるEGFRのドメインI、IIまたはIIIに相当する部分の構造座標;
(u)表2に示される構造座標の原子の通し番号7906から8291により特定されるEGFの構造座標;
(v)表2に示される構造座標の原子の通し番号7906から8291により特定されるEGFのα炭素に対して、平均二乗偏差の平方根が2.0Å以下であるα炭素の原子座標を有する構造座標により特定されるEGFの構造座標;
(w)表2に示される構造座標の原子の通し番号8292から8677により特定されるEGFの構造座標;
(x)表2に示される構造座標の原子の通し番号8292から8677により特定されるEGFのα炭素に対して、平均二乗偏差の平方根が2.0Å以下であるα炭素の原子座標を有する構造座標により特定されるEGFの構造座標;
(ya)以下の(ya−1)〜(ya−8)のいずれかから選ばれる第一のEGF/EGFR結合部位の構造座標;
(ya−1)少なくともEGFのLeu26およびLys28、ならびにEGFRのLeu69およびLeu98に相当するアミノ酸残基の原子座標を含んでなるEGF/EGFR結合部位の構造座標;
(ya−2)少なくともEGFのLeu26およびLys28、ならびにEGFRのLeu69およびLeu98に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつEGFのMet21、Ile23、Ala25、Cys31、Asn32およびCys33、ならびにEGFRのLeu14、Gln16、Gly18、Glu35、Tyr45、Ala68、Glu90およびTyr101に相当するアミノ酸残基から選ばれる1つ以上のアミノ酸残基の原子座標を含んでなるEGF/EGFR結合部位の構造座標;
(ya−3)少なくともEGFのLeu26およびLys28、ならびにEGFRのLeu69およびLeu98に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつEGFのMet21、Ile23、Ala25、Cys31、Asn32およびCys33、ならびにEGFRのLeu14、Gln16、Gly18、Glu35、Tyr45、Ala68、Glu90およびTyr101に相当するアミノ酸残基から選ばれる1つ以上のアミノ酸残基の原子座標からなるEGF/EGFR結合部位の構造座標;
(ya−4)少なくともEGFのLeu26およびLys28、ならびにEGFRのLeu69およびLeu98に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつEGFのMet21、Ile23、Ala25、Cys31、Asn32およびCys33、ならびにEGFRのLeu14、Gln16、Gly18、Glu35、Tyr45、Ala68、Glu90およびTyr101に相当するアミノ酸残基から選ばれる1つ以上のアミノ酸残基およびその近傍アミノ酸残基の原子座標からなるEGF/EGFR結合部位の構造座標;
(ya−5)少なくともEGFのIle23、Leu26およびLys28、ならびにEGFRのLeu14、Tyr45、Leu69、Glu90およびLeu98に相当するアミノ酸残基の原子座標を含んでなるEGF/EGFR結合部位の構造座標;
(ya−6)少なくともEGFのIle23、Leu26およびLys28、ならびにEGFRのLeu14、Tyr45、Leu69、Glu90およびLeu98に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつEGFのMet21、Ala25、Cys31、Asn32およびCys33、ならびにEGFRのGln16、Gly18、Glu35、Ala68およびTyr101に相当するアミノ酸残基から選ばれる1つ以上のアミノ酸残基の原子座標を含んでなるEGF/EGFR結合部位の構造座標;
(ya−7)少なくともEGFのIle23、Leu26およびLys28、ならびにEGFRのLeu14、Tyr45、Leu69、Glu90およびLeu98に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつEGFのMet21、Ala25、Cys31、Asn32およびCys33、ならびにEGFRのGln16、Gly18、Glu35、Ala68およびTyr101に相当するアミノ酸残基から選ばれる1つ以上のアミノ酸残基の原子座標からなるEGF/EGFR結合部位の構造座標;
(ya−8)少なくともEGFのIle23、Leu26およびLys28、ならびにEGFRのLeu14、Tyr45、Leu69、Glu90およびLeu98に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつEGFのMet21、Ala25、Cys31、Asn32およびCys33、ならびにEGFRのGln16、Gly18、Glu35、Ala68およびTyr101に相当するアミノ酸残基から選ばれる1つ以上のアミノ酸残基およびその近傍のアミノ酸残基の原子座標からなるEGF/EGFR結合部位の構造座標;
(yb)以下の(yb−1)〜(yb−8)のいずれかから選ばれる第二のEGF/EGFR結合部位の構造座標;
(yb−1)少なくともEGFのLeu15およびArg41、ならびにEGFRのVal350およびAsp355に相当するアミノ酸残基の原子座標を含んでなるEGF/EGFR結合部位の構造座標;
(yb−2)少なくともEGFのLeu15およびArg41、ならびにEGFRのVal350およびAsp355に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつEGFのHis10、Asp11、Tyr13、His16、Cys31、Asn32、Cys33、Ile38、Gly39およびGlu40、ならびにEGFRのThr10、Asn12、Lys13、Gln16、Leu17、Gly18、Leu27、Leu325、Ser356、Phe357、Gln384およびHis409に相当するアミノ酸残基から選ばれる1つ以上のアミノ酸残基の原子座標を含んでなるEGF/EGFR結合部位の構造座標;
(yb−3)少なくともEGFのLeu15およびArg41、ならびにEGFRのVal350およびAsp355に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつEGFのHis10、Asp11、Tyr13、His16、Cys31、Asn32、Cys33、Ile38、Gly39およびGlu40、ならびにEGFRのThr10、Asn12、Lys13、Gln16、Leu17、Gly18、Leu27、Leu325、Ser356、Phe357、Gln384およびHis409に相当するアミノ酸残基から選ばれる1つ以上のアミノ酸残基の原子座標からなるEGF/EGFR結合部位の構造座標;
(yb−4)少なくともEGFのLeu15およびArg41、ならびにEGFRのVal350およびAsp355に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつEGFのHis10、Asp11、Tyr13、His16、Cys31、Asn32、Cys33、Ile38、Gly39およびGlu40、ならびにEGFRのThr10、Asn12、Lys13、Gln16、Leu17、Gly18、Leu27、Leu325、Ser356、Phe357、Gln384およびHis409に相当するアミノ酸残基から選ばれる1つ以上のアミノ酸残基およびその近傍のアミノ酸残基の原子座標からなるEGF/EGFR結合部位の構造座標;
(yb−5)少なくともEGFのTyr13、Leu15およびArg41、ならびにEGFRのVal350、Asp355およびPhe357に相当するアミノ酸残基の原子座標を含んでなるEGF/EGFR結合部位の構造座標;
(yb−6)少なくともEGFのTyr13、Leu15およびArg41、ならびにEGFRのVal350、Asp355およびPhe357に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつEGFのHis10、Asp11、His16、Cys31、Asn32、Cys33、Ile38、Gly39およびGlu40、ならびにEGFRのThr10、Asn12、Lys13、Gln16、Leu17、Gly18、Leu27、Leu325、Ser356、Gln384およびHis409に相当するアミノ酸残基から選ばれる1つ以上のアミノ酸残基の原子座標を含んでなるEGF/EGFR結合部位の構造座標;
(yb−7)少なくともEGFのTyr13、Leu15およびArg41、ならびにEGFRのVal350、Asp355およびPhe357に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつEGFのHis10、Asp11、His16、Cys31、Asn32、Cys33、Ile38、Gly39およびGlu40、ならびにEGFRのThr10、Asn12、Lys13、Gln16、Leu17、Gly18、Leu27、Leu325、Ser356、Gln384およびHis409に相当するアミノ酸残基から選ばれる1つ以上のアミノ酸残基の原子座標からなるEGF/EGFR結合部位の構造座標;
(yb−8)少なくともEGFのTyr13、Leu15およびArg41、ならびにEGFRのVal350、Asp355およびPhe357に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつEGFのHis10、Asp11、His16、Cys31、Asn32、Cys33、Ile38、Gly39およびGlu40、ならびにEGFRのThr10、Asn12、Lys13、Gln16、Leu17、Gly18、Leu27、Leu325、Ser356、Gln384およびHis409に相当するアミノ酸残基から選ばれる1つ以上のアミノ酸残基およびその近傍のアミノ酸残基の原子座標からなるEGF/EGFR結合部位の構造座標;
(yc)以下の(yc−1)〜(yc−8)のいずれかから選ばれる第三のEGF/EGFR結合部位の構造座標;
(yc−1)少なくともEGFのArg45およびLeu47、ならびにEGFRのLeu382、Gln384、Phe412およびIle438に相当するアミノ酸残基の原子座標を含んでなるEGF/EGFR結合部位の構造座標;
(yc−2)少なくともEGFのArg45およびLeu47、ならびにEGFRのLeu382、Gln384、Phe412およびIle438に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつEGFのGln43、Tyr44、Asp46およびLys48、ならびにEGFRのArg29、Leu325、His346、Gln408、Gln411、Ala415およびVal417に相当するアミノ酸残基から選ばれる1つ以上のアミノ酸残基の原子座標を含んでなるEGF/EGFR結合部位の構造座標;
(yc−3)少なくともEGFのArg45およびLeu47、ならびにEGFRのLeu382、Gln384、Phe412およびIle438に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつEGFのGln43、Tyr44、Asp46およびLys48、ならびにEGFRのArg29、Leu325、His346、Gln408、Gln411、Ala415およびVal417に相当するアミノ酸残基から選ばれる1つ以上のアミノ酸残基の原子座標からなるEGF/EGFR結合部位の構造座標;
(yc−4)少なくともEGFのArg45およびLeu47、ならびにEGFRのLeu382、Gln384、Phe412およびIle438に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつEGFのGln43、Tyr44、Asp46およびLys48、ならびにEGFRのArg29、Leu325、His346、Gln408、Gln411、Ala415およびVal417に相当するアミノ酸残基から選ばれる1つ以上のアミノ酸残基およびその近傍のアミノ酸残基の原子座標からなるEGF/EGFR結合部位の構造座標;
(yc−5)少なくともEGFのGln43、Arg45およびLeu47、ならびにEGFRのLeu382、Gln384、Phe412およびIle438に相当するアミノ酸残基の原子座標を含んでなるEGF/EGFR結合部位の構造座標;
(yc−6)少なくともEGFのGln43、Arg45およびLeu47、ならびにEGFRのLeu382、Gln384、Phe412およびIle438に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつEGFのTyr44、Asp46およびLys48、ならびにEGFRのArg29、Leu325、His346、Gln408、Gln411、Ala415およびVal417に相当するアミノ酸残基から選ばれる1つ以上のアミノ酸残基の原子座標を含んでなるEGF/EGFR結合部位の構造座標;
(yc−7)少なくともEGFのGln43、Arg45およびLeu47、ならびにEGFRのLeu382、Gln384、Phe412およびIle438に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつEGFのTyr44、Asp46およびLys48、ならびにEGFRのArg29、Leu325、His346、Gln408、Gln411、Ala415およびVal417に相当するアミノ酸残基から選ばれる1つ以上のアミノ酸残基の原子座標からなるEGF/EGFR結合部位の構造座標;
(yc−8)少なくともEGFのGln43、Arg45およびLeu47、ならびにEGFRのLeu382、Gln384、Phe412およびIle438に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつEGFのTyr44、Asp46およびLys48、ならびにEGFRのArg29、Leu325、His346、Gln408、Gln411、Ala415およびVal417に相当するアミノ酸残基から選ばれる1つ以上のアミノ酸残基およびその近傍のアミノ残残基の原子座標からなるEGF/EGFR結合部位の構造座標;
(yd)(ya)に記載の第一のEGF/EGFR結合部位および(yb)に記載の第二のEGF/EGFR結合部位を含んでなるEGF/EGFR結合部位の構造座標;
(ye)(yb)に記載の第二のEGF/EGFR結合部位および(yc)に記載の第三のEGF/EGFR結合部位を含んでなるEGF/EGFR結合部位の構造座標;
(yf)(ya)に記載の第一のEGF/EGFR結合部位および(yc)に記載の第三のEGF/EGFR結合部位を含んでなるEGF/EGFR結合部位の構造座標;
(yg)(ya)に記載の第一のEGF/EGFR結合部位、(yb)に記載の第二のEGF/EGFR結合部位および(yc)に記載の第三のEGF/EGFR結合部位を含んでなるEGF/EGFR結合部位の構造座標;
(yh)以下の(yh−1)〜(yh−3)のいずれかから選ばれるEGF/EGFR結合部位の構造座標;
(yh−1)少なくともEGFのTyr13、Glu40、Arg41、Asp46およびLeu47、ならびにEGFRのPhe357、Lys13、Asp355、Arg29、Leu382、Ala415およびVal417に相当するアミノ酸残基の原子座標を含んでなるEGF/EGFR結合部位の構造座標;
(yh−2)EGFのHis10、Asp11、Tyr13、Leu15、His16、Met21、Ile23、Ala25、Leu26、Lys28、Ala30、Cys31、Asn32、Cys33、Val35、Tyr37、Ile38、Gly39、Glu40、Arg41、Gln43、Tyr44、Arg45、Asp46、Leu47、Lys48およびTrp49、ならびにEGFRのAsn12、Lys13、Leu14、Thr15、Gln16、Leu17、Gly18、Asp22、Arg29、Tyr45、Ala68、Leu69、Tyr89、Glu90、Leu98、Ser99、Tyr101、Leu325、His346、Leu348、Pro349、Val350、Asp355、Ser356、Phe357、Thr358、Leu382、Gln384、Gln408、His409、Gln411、Phe412、Ala415、Val417、Ile438およびLys465に相当するアミノ酸残基の原子座標からなる構造座標;
(yh−3)EGFのHis10、Asp11、Tyr13、Leu15、His16、Met21、Ile23、Ala25、Leu26、Lys28、Ala30、Cys31、Asn32、Cys33、Val35、Tyr37、Ile38、Gly39、Glu40、Arg41、Gln43、Tyr44、Arg45、Asp46、Leu47、Lys48およびTrp49、ならびにEGFRのAsn12、Lys13、Leu14、Thr15、Gln16、Leu17、Gly18、Asp22、Arg29、Tyr45、Ala68、Leu69、Tyr89、Glu90、Leu98、Ser99、Tyr101、Leu325、His346、Leu348、Pro349、Val350、Asp355、Ser356、Phe357、Thr358、Leu382、Gln384、Gln408、His409、Gln411、Phe412、Ala415、Val417、Ile438およびLys465に相当するアミノ酸残基およびその近傍のアミノ酸残基の原子座標からなる構造座標;
(yi)EGF/EGFR結合部位の構造座標;
(yj)少なくとも二量体を形成している第一のEGFRのThr249、Tyr246およびGln252、ならびに第二のEGFRのAsn86、Cys283およびAla286に相当するアミノ酸残基の原子座標を含んでなるEGFR二量体化部位の構造座標;
(yk)少なくとも二量体を形成している第一のEGFRのThr249、Tyr246およびGln252、ならびに第二のEGFRのAsn86、Cys283およびAla286に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつ両方のEGFRのAsn86、Gln194、Pro204、Ser205、Lys229、Phe230、Thr239、Pro242、Tyr246、Pro248、Thr249、Tyr251、Gln252、Met253、Ser262、Phe263、Gly264、Ala265、Tyr275、His280、Ser282、Cys283、Val284、Arg285、Ala286およびLys303に相当するアミノ酸残基から選ばれる1つ以上のアミノ酸残基の原子座標を含んでなるEGFR二量体化部位の構造座標;
(yl)二量体を形成している両方のEGFRのAsn86、Gln194、Pro204、Ser205、Lys229、Phe230、Thr239、Pro242、Tyr246、Pro248、Thr249、Tyr251、Gln252、Met253、Ser262、Phe263、Gly264、Ala265、Tyr275、His280、Ser282、Cys283、Val284、Arg285、Ala286およびLys303に相当するアミノ酸残基の原子座標からなるEGFR二量体化部位の構造座標;
(ym)二量体を形成している両方のEGFRのAsn86、Gln194、Pro204、Ser205、Lys229、Phe230、Thr239、Pro242、Tyr246、Pro248、Thr249、Tyr251、Gln252、Met253、Ser262、Phe263、Gly264、Ala265、Tyr275、His280、Ser282、Cys283、Val284、Arg285、Ala286およびLys303に相当するアミノ酸残基ならびにその近傍のアミノ酸残基の原子座標からなる構造座標;
(yn)少なくともEGFRのArg405およびGlu293に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつEGFRのArg285、Arg273、Asp254およびGly458に相当するアミノ酸残基から選ばれる1つ以上のアミノ酸残基の原子座標を含んでなるEGFR二量体化部位の構造座標;
(yo)少なくともEGFRのArg405およびGlu293に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつEGFRのArg285、Arg273、Asp254およびGly458に相当するアミノ酸残基から選ばれる1つ以上のアミノ酸残基の原子座標からなるEGFR二量体化部位の構造座標;
(yp)少なくともEGFRのArg405およびGlu293に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつEGFRのArg285、Arg273、Asp254およびGly458に相当するアミノ酸残基から選ばれる1つ以上のアミノ酸残基ならびにその近傍のアミノ酸残基の原子座標からなる構造座標;
(yq)EGFR二量体化部位の構造座標;
(za)(ya)〜(yi)のいずれかに記載のEGF/EGFR結合部位を構成するアミノ酸残基のα炭素に対して、平均二乗偏差の平方根が1.5Å以下であるα炭素の原子座標を有する構造座標により特定されるリガンド/受容体結合部位の構造座標;
(zb)(yj)〜(yq)のいずれかに記載のEGFR二量体化部位を構成するアミノ酸残基のα炭素に対して、平均二乗偏差の平方根が1.5Å以下であるα炭素の原子座標を有する構造座標により特定される受容体二量体化部位の構造座標;
(zc)(a)〜(zb)のいずれかに記載の構造座標を含んでなるEGF/EGFR複合体またはその構造ホモログの構造座標
上記構造座標の説明において、α炭素とはアミノ酸のα位の炭素原子を意味し、Cαと表記することもある。蛋白質の立体構造は強固に固定されたものでなく、ある程度の揺らぎを持っている。蛋白質全体の構造として主鎖の位置のずれ、すなわちα炭素の平均二乗偏差の平方根が2.0Å以下であれば、実質的に同等の構造を有するものと考えることができるが、好ましくは1.5Å以下、より好ましくは1.0Å以下である。また、受容体二量体化部位やリガンド/受容体結合部位の構造の場合には、主鎖原子の平均二乗偏差の平方根が1.5Å以下であれば、機能的に同等の構造を有するものと考えることができるが、好ましくは1.0Å以下、より好ましくは0.7Å以下、更に好ましくは0.5Å以下である。
上記(a)または(m)における「一部」とは、表1または表2の構造座標の内、任意の1以上の原子座標からなる構造座標を意味する。例えば、表1または表2の構造座標はEGFを2分子、EGFRを2分子含むものであるが、その中のEGF1分子に相当する部分、EGFR1分子に相当する部分は「一部」の適当な例である。また、EGF/EGFR結合部位の座標、EGFR二量体化部位の座標も「一部」の適当な例である。好ましくは、最小限としてEGF/EGFR結合部位、またはEGFR二量体化部位の原子座標を含む構造座標のことである。EGF/EGFR結合部位、またはEGFR二量体化部位の構造座標を含む限り、それらに加えて表1または表2中の任意の1以上の原子座標を含んでもよい。別の「一部」の適当な例としては、EGFRのドメインI、II、またはIIIのいずれかに相当する部分が挙げられる。「一部」のより具体的な例は、(b)〜(l)、(o)〜(x)および(ya)〜(yq)の構造座標に示されている。
EGFR二量体化部位の構造座標は、例えば二量体を形成している両方のEGFRのAsn86、Gln194、Pro204、Ser205、Lys229、Phe230、Thr239、Pro242、Tyr246、Pro248、Thr249、Tyr251、Gln252、Met253、Ser262、Phe263、Gly264、Ala265、Tyr275、His280、Ser282、Cys283、Val284、Arg285、Ala286、Lys303に相当するアミノ酸残基の原子座標からなる構造座標が適当な例である。二量体を形成している片方のEGFRの上記アミノ酸の原子座標からなる構造座標でもよい。また、少なくとも、二量体化において重要な相互作用を形成しているアミノ酸を含む限りここにあげたアミノ酸の一部分でも、ここに上げたアミノ酸以外に1以上のアミノ酸を含んでもよい。「〜に相当する」とは、示されたアミノ酸番号が、EGFRのアミノ酸残基に関しては配列番号1に示されるアミノ酸配列に対応し、EGFのアミノ酸残基については配列番号2に示されるアミノ酸配列に対応していることを意味する。
二量体化において重要な相互作用を形成しているアミノ酸の例としては、二量体を形成しているEGFRの第一のEGFRのThr249、Tyr246、Gln252と第二のEGFRのAsn86、Cys283、Ala286が挙げられる。しかし、二量体化において重要な相互作用を形成しているアミノ酸は相互作用領域の解析の方法により差異を生ずることがあるので、上記に限定されるものではない。好適な例としては、二量体化部位を構成するアミノ酸は、少なくとも二量体を形成している第一のEGFRのThr249、Tyr246、Gln252、ならびに第二のEGFRのAsn86、Cys283、Ala286に相当するアミノ酸残基を含んでいる限りにおいては任意の1以上のアミノ酸を含んでもよい、と定義される。その好適な具体例は、(yk)〜(ym)の構造座標に挙げられている。また、二量体化における直接的な相互作用には関与していないが、リガンド依存的コンフォメーション変化が起こるときにスイッチのようにアミノ酸相互作用の切り替えに関与している残基(Glu293、Arg285、Arg405、Arg273、Asp254、Gly458)もまた二量体化において重要な相互作用を形成しているアミノ酸であるといえる。このようなアミノ酸残基からなる二量体化部位の例は、(yn)〜(yp)の構造座標に挙げられている。また「近傍のアミノ酸残基」とは5Å以内、好ましくは3Å以内にあることを言う。(zb)における「受容体二量体化部位」とは、EGFR二量体化部位のことを含むが、それに限定されるものではない。二量体化部位のように、蛋白質の機能を発揮する上で重要な部位は、ファミリー間や種差を越えて構造的に高度に保存されている場合がある。よって、EGF/EGFRと同様のメカニズムで複合体を形成するリガンド/受容体複合体は、本発明のEGFR二量体化部位と同等の構造を有するものと考えられる。よって本発明はEGF/EGFRと同様のメカニズムで複合体を形成するリガンド/受容体複合体の受容体二量体化部位の座標も提供するものである。このようなリガンド/受容体複合体の例としては、ErbBファミリーに属する受容体が挙げられる。
EGF/EGFR結合部位の構造座標は、例えば以下の(A)および(B):
(A)EGFのHis10、Asp11、Tyr13、Leu15、His16、Met21 Ile23、Ala25、Leu26、Lys28、Ala30、Cys31、Asn32、Cys33、Val35、Tyr37、Ile38、Gly39、Glu40、Arg41、Gln43、Tyr44、Arg45、Asp46、Leu47、Lys48、Trp49と、
(B)EGFRのAsn12、Lys13、Leu14、Thr15、Gln16、Leu17、Gly18、Asp22、Arg29、Tyr45、Ala68、Leu69、Tyr89、Glu90、Leu98、Ser99、Tyr101、Leu325、His346、Leu348、Pro349、Val350、Asp355、Ser356、Phe357、Thr358、Leu382、Gln384、Gln408、His409,Gln411、Phe412、Ala415、Val417、Ile438、Lys465に相当するアミノ酸残基の原子座標からなる構造座標が適当な例である。また、少なくとも、EGFとEGFRの結合において重要な相互作用を形成しているアミノ酸を含む限りここに挙げたアミノ酸の一部分でも、ここに挙げたアミノ酸以外に1以上のアミノ酸を含んでもよい。また、アミノ酸以外にも、糖鎖や水分子が相互作用に重要な役割を果たしている場合もあるので、EGF/EGFR複合体または結合部位の構造座標には糖鎖や水分子の原子座標を適宜含ませることも可能である。
EGFとEGFRの結合において重要な相互作用を形成しているアミノ酸の例としては、図9に示されるようにEGFのTyr13、Glu40、Arg41、Asp46、Leu47と、EGFRのPhe357、Lys13、Asp355、Arg29、Leu382、Ala415、Val417が挙げられる。しかし、EGFとEGFRの結合において重要な相互作用を形成しているアミノ酸は相互作用領域の解析の方法により差異を生ずることがあるので、上記アミノ酸に限定されるものではない。好適な例としては、EGF/EGFR相互作用部位を構成するアミノ酸は、(ya−1)、(yb−1)または(yc−1)のいずれかの構造座標に挙げられているEGFおよびEGFRのアミノ酸残基のセットを含んでいる限りにおいては任意の1以上のアミノ酸を含んでもよい、と定義される。その好適な具体例は、(ya)〜(yh)の構造座標に挙げられている。
また「近傍のアミノ酸残基」とは、5Å以内、好ましくは3Å以内にあるアミノ酸残基を言う。(za)における「リガンド/受容体結合部位」とは、EGF/EGFR結合部位のことを含むが、それに限定されるものではない。リガンド/受容体結合部位のように、蛋白質の機能を発揮する上で重要な部位は、ファミリー間や種差を越えて構造的に高度に保存されている場合がある。よって、EGF/EGFRと同様のメカニズムで複合体を形成するリガンド/受容体複合体は、本発明のEGF/EGFR結合部位と同等の構造を有するものと考えられる。よって本発明はEGF/EGFRと同様のメカニズムで複合体を形成するリガンド/受容体複合体のリガンド/受容体結合部位の座標も提供するものである。このようなリガンド/受容体複合体の例としては、ErbBファミリーに属する受容体が挙げられる。
(zc)における「構造ホモログ」とは、EGF/EGFR複合体と構造的に類似しているリガンド/受容体複合体のことである。構造的に類似しているとは、少なくとも受容体二量体化部位および/またはリガンド/受容体結合部位の構造に類似性があることをいう。類似性があるとは、EGF/EGFR複合体のペプチド鎖のα炭素の原子座標に対して、平均二乗偏差の平方根が1.5Å以下であるα炭素の原子座標を有する構造座標により特定される構造を有することを意味する。構造ホモログの例としては、EGF/EGFRと同様のメカニズムで複合体を形成するリガンド/受容体複合体であり、ErbBファミリーに属する受容体が挙げられる。
(ya)〜(yq)のアミノ酸残基により特定されるEGF/EGFR結合部位またはEGFR二量体化部位の構造座標は、アミノ酸の座標として表1または表2に示される座標を参照可能であるが、これらに限定されるものではない。例えば、表1または表2に示される構造座標により特定されるEGF/EGFR複合体のα炭素に対して、平均二乗偏差の平方根が2.0Å以下であるα炭素の原子座標を有する構造座標により特定されるEGF/EGFR複合体の構造座標も参照の対象となり得る。また、以下の(1)〜(4)に記載の特徴のうち少なくとも一つを満たすEGF/EGFR複合体の構造座標も参照の対象となり得る:
(1)EGFのIle23、Leu26およびLys28に相当するアミノ酸残基に対してEGFRのLeu14、Tyr45、Leu69、Glu90およびLeu98に相当するアミノ酸残基が相互作用可能な距離に存在する;
(2)EGFのTyr13、Leu15およびArg41に相当するアミノ酸残基に対してEGFRのVal350、Asp355およびPhe357に相当するアミノ酸残基が相互作用可能な距離に存在する;
(3)EGFのGln43、Arg45およびLeu47に相当するアミノ酸残基に対してEGFRのLeu382、Gln384、Phe412およびIle438に相当するアミノ酸残基が相互作用可能な距離に存在する;
(4)二量体を形成している第一のEGFRのThr249、Tyr246およびGln252に相当するアミノ酸残基に対して第二のEGFRのAsn86、Cys283およびAla286に相当するアミノ酸残基が相互作用可能な距離に存在する。
ここで、相互作用可能な距離とは5Å以内、好ましくは3Å以内である。
また、蛋白質の立体構造はその構造を構成する原子の相対的な空間配置により定義されるものであり、構造座標化は立体構造をコンピューター等で扱う上で必要な便宜的処理である。したがって、当業者であれば明らかなように、(a)〜(zc)の構造座標を回転および/もしくは並進操作して得られる構造座標も、操作前の構造座標と全く同一の立体構造を表すものである。
さらに、本発明は上述の構造座標(a)〜(zc)のいずれかを格納(記録)したコンピューター読み取り可能な記憶媒体(記録媒体)を提供する。コンピューター読み取り可能な記憶媒体としては、格納した構造座標をコンピューター上の各種プログラム(例えば構造座標を利用するプログラム)上に導くことができるものであれば特に限定されるものではない。例えば、メモリと呼ばれる電気的な一時記憶媒体でも、フロッピーディスク、ハードディスク、光ディスク、光磁気ディスク、磁気テープなどの半永久的な記憶媒体でも良い。
本発明の構造座標および構造座標を格納した記憶媒体は、EGFRの活性調節作用を有する化合物(本明細書中「EGFR活性調節物質」ともいう)のスクリーニングまたは設計に使用することができ、有用である。さらに本発明は、上述の構造座標(a)〜(z)のいずれかにより特徴付けられる立体構造を有するEGF/EGFRまたはEGF/EGFR複合体を提供するものである。
3.構造情報を用いたスクリーニングまたは設計方法
本発明であるEGF/EGFR複合体の構造座標を用いたEGFR活性調節物質のスクリーニングまたは設計方法は、以下の段階:
(a)被験物質の立体構造を構造座標化する段階;ならびに
(b)(a)の構造座標およびEGF/EGFR複合体の構造座標の全部または一部を同一座標系上で重ね合わせて、両者の適合状態を評価する段階;
を含むことを特徴とする。すなわち、本発明の方法は、上記のEGF/EGFR複合体の構造座標と任意の被験物質の立体構造を表す構造座標とをコンピューター上で適合させ、その適合状態を、例えば経験的スコアリング関数を指標とすることで数値化して、該被験物質のEGFRおよび/またはEGFに対する結合能を評価する方法である。ここでEGF/EGFR複合体の構造座標としては、該構造座標の全体、およびEGF/EGFR結合部位、EGFR二量体化部位などの一部を利用することができる。
本発明の方法は、スクリーニングまたは設計されたEGFR活性調節物質を生化学的アッセイに供し、EGFR活性調節作用について評価する段階を更に含めることができる。
本明細書においてEGFR活性調節物質とは、EGFRアゴニストまたはEGFRアンタゴニストのことである。EGFRアゴニストとは、少なくともEGFRと結合する活性を有し、好ましくはその結合によりEGFRの二量体化を引き起こす活性を有する物質のことである。EGFRアンタゴニストとは、EGFとEGFRの結合を阻害する活性および/またはEGFRの二量体化を阻害する活性を有する物質のことである。EGFに結合することでEGFのEGFRへの結合を阻害する物質もまた、EGFRアンタゴニストに含まれる。EGFに結合することでEGFとEGFRの結合を促進または安定化させ、EGFRの二量体化を引き起こす活性を有する物質はEGFRアゴニストに含まれる。EGFRアゴニストの好ましい例はEGFである。
EGFR活性調節物質のEGFRの二量体化を引き起こす活性または阻害する活性(すなわち、EGFR活性調節作用)は、EGFRの二量体化の成否を直接観察することで確認できるほか、二量体化によって生じるシグナル伝達の過程や結果(例:EGFRの細胞内領域のリン酸化、細胞増殖)の成否を検出する方法によっても確認できる。
本発明のスクリーニング方法に供される被験物質としては、蛋白質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、合成化合物、天然由来化合物、醗酵生成物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられるがこれに限定されず、新規物質でも公知物質でもよい。
3−1 EGF/EGFR結合部位およびEGFR二量体化部位の同定方法
本発明は、EGF/EGFR複合体におけるEGF/EGFR結合部位またはEGFR二量体化部位を同定する方法であって、EGF/EGFR複合体の構造座標を用いることを特徴とする方法を提供する。
EGF/EGFR複合体構造座標の全ての情報が本発明において有用であるが、その中でも特に重要な情報の抽出を図ることによって、その産業応用の可能性が大きく広がる。本発明の結晶構造座標を解析することによって、EGFがEGFRと相互作用するアミノ酸残基(EGF/EGFR結合部位)とEGFRの二量体化において相互作用するアミノ酸残基(EGFR二量体化部位)を特定することが可能となった。また、既存の分子設計ソフトウエア(トライポス社SYBYL,アクセルリス社InsightII等)によって複合体分子の座標を視覚的に表示させ、相互作用に関わるアミノ酸残基を抽出することで、特に産業応用に重要な性質や情報を抽出することも可能である。
すなわち、当該方法は、EGF/EGFR複合体の構造座標をコンピュータに入力する段階;およびEGF/EGFR複合体構造の解析によりEGF/EGFR結合部位またはEGFR二量体化部位を構成するアミノ酸残基を特定する段階;を含み得る。さらに、コンピュータ上でEGF/EGFR複合体の3次元構造を視覚的に表示させる段階を含んでもよい。EGF/EGFR複合体構造の解析によりEGF/EGFR結合部位またはEGFR二量体化部位を構成するアミノ酸残基を特定する段階は、目視および/またはコンピュータプログラムによる解析により実現され得る。
本発明によるEGF/EGFR複合体の結晶から得られる構造座標を、分子の3次元構造座標を表現するコンピューター・プログラムが動作するコンピューターまたはそのコンピューターの記憶媒体に入力することで、EGF/EGFR複合体の3次元的な化学的相互作用の様式を詳細に表現することが可能になる。コンピューターの記憶媒体としては、EGF/EGFR複合体の結晶から得られる構造座標をコンピューターの該プログラム上に導くことができるものであれば特に限定されるものではない。例えば、メモリと呼ばれる電気的な一時記憶媒体でも、フロッピーディスク、ハードディスク、光ディスク、光磁気ディスク、磁気テープなどの半永久的な記憶媒体でも良い。蛋白質分子の3次元構造座標を表現するコンピューター・プログラムは多数市販されているが、これらプログラムは、一般に、分子の3次元構造座標の入力手段、該座標をコンピューター画面に視覚的に表現する手段、表現された分子内における各原子間の距離や結合角などを測定する手段、該座標の追加修正を行う手段などを提供する。更に、分子の座標を元に分子の構造エネルギーを計算する手段、水分子などの溶媒分子を考慮して自由エネルギーを計算する手段を提供することができるように作成されたプログラムを用いることも可能である。アクセルリス社から市販されているコンピューター・プログラムであるInsightIIやQUANTAは、該目的に好適なプログラムの例であるが、本発明はこれらのプログラムに限定されるものではない。また、該プログラムは、通常シリコングラフィクス社やサンマイクロシステムズ社などから供給されているワークステーションと呼ばれるコンピューターに導入されて使用されるが、これらに限定されるものではない。構造座標としては、「2.EGF/EGFR複合体の構造座標」の項で説明された(a)〜(x)の構造座標を用いることが可能である。
目視および/またはコンピュータプログラムによりEGF/EGFR結合部位またはEGFR二量体化部位を構成するアミノ酸残基を特定する段階とは、蛋白質分子間の接触面を目視/またはコンピュータプログラムにより解析し、蛋白質間相互作用に関わっているアミノ酸残基を特定する段階である。このとき、アミノ酸残基間の相互作用の距離、強さ、種類等を考慮して、相互作用に関わるアミノ酸を特定する。たとえば、複合体結晶構造において、EGFの各アミノ酸残基から、数オングストローム以内の距離に存在するEGFRのアミノ酸残基を抽出すれば、直接的な相互作用を有しているEGFR上のアミノ酸残基を抽出可能であるし、逆にEGFRの各アミノ酸残基から数オングストローム以内の距離に存在するEGF中のアミノ酸残基を抽出すれば、直接的な相互作用を有しているEGF上のアミノ酸残基を特定できる。更に、二量体を形成する互いのEGFR間の距離が数オングストローム以内の距離に存在するEGFR中のアミノ酸残基を抽出すれば、EGFRの二量体化に重要なアミノ酸残基の特定が可能となる。
例えば、EGFRから、3オングストローム以内の距離にあるEGFのアミノ酸残基は、EGFRとの直接的結合に重要なアミノ酸残基である。逆にEGFから3オングストローム以内の距離にあるEGFR中のアミノ酸残基はEGF分子との直接的相互作用に重要なアミノ酸残基である。また、EGFRと二量体化するEGFR間の距離において3オングストローム以内のEGFR中のアミノ酸残基は、EGFRを二量体化させるために重要なEGFRのアミノ酸残基である。
相互作用の種類としては、静電相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合などがある。また、単に距離により相互作用を特定するだけではなくアミノ酸側鎖同士の配向も考慮して相互作用を特定することが好ましい。相互作用の強さは、距離、相互作用の種類、側鎖の配向、さらには水分子の存在などにより影響される。コンピュータプログラムにより解析する場合は、アミノ酸残基間の距離を計算するプログラム、相互作用を形成していると推定される2つのアミノ酸残基の種類から相互作用の種類を特定するプログラムなどを用いることが可能である。しかし近接した距離に、相互作用可能な複数のアミノ酸残基が存在する場合、どの残基のいかなる相互作用が蛋白質間相互作用に重要であるかを計算のみで導き出すのは難しい場合がある。よって、最終的には目視によりアミノ酸残基間の相互作用の距離、強さ、種類等を総合的に考慮して、相互作用に関わるアミノ酸を特定することが好ましい。
以下に相互作用の距離を主体としてEGF/EGFR複合体結晶構造解析から特定された相互作用解析に有用なアミノ酸残基を示す。
(i)EGFRとの結合部位を構成するEGF中のアミノ酸残基の例
His10,Asp11,Tyr13,Leu15,His16,Met21,Ile23,Ala25,Leu26,Lys28,Ala30,Cys31,Asn32,Cys33,Val35,Tyr37,Ile38,Gly39,Glu40,Arg41,Gln43,Tyr44,Arg45,Asp46,Leu47,Lys48,Trp49
(ii)EGFとの結合部位を構成するEGFR中のアミノ酸残基の例
Asn12,Lys13,Leu14,Thr15,Gln16,Leu17,Gly18,Asp22,Arg29,Tyr45,Ala68,Leu69,Tyr89,Glu90,Leu98,Ser99,Tyr101,Leu325,His346,Leu348,Pro349,Val350,Asp355,Ser356,Phe357,Thr358,Leu382,Gln384,Gln408,His409,Gln411,Phe412,Ala415,Val417,Ile438,Lys465
(iii)EGFRの二量体化部位を形成するEGFR中のアミノ酸残基の例Asn86,Gln194,Pro204,Ser205,Lys229,Phe230,Thr239,Pro242,Tyr246,Pro248,Thr249,Tyr251,Gln252,Met253,Ser262,Phe263,Gly264,Ala265、Tyr275,His280,Ser282,Cys283,Val284,Arg285,Ala286,Lys303
EGF/EGFR結合部位およびEGFR二量体化部位は上記の例に限定されない。
相互作用領域を上述のように、EGFから3オングストローム以内の距離にあるEGFR中のアミノ酸残基、のように定義することもできるし、相互作用の種類と強さに着目して相互作用に重要なアミノ酸のみをEGF/EGFR結合部位またはEGFR二量体化部位と定義することもできる。すなわち相互作用領域の解析の方法により差異を生ずることがあるが、依然として本発明に係るスクリーニング方法を実施可能であれば、そのような相互作用も本発明の範囲内に含まれる。アミノ酸残基間の相互作用の距離だけでなく、相互作用の種類や側鎖の配向を考慮して相互作用に重要なアミノ酸を抽出した例が、図9、図10、実施例6および前述の「2.EGF/EGFRの構造座標」の項で説明されている。
3−2 EGF/EGFR結合部位および二量体化部位の同定
EGF/EGFR複合体におけるEGF/EGFR結合部位またはEGFR二量体化部位を同定する方法であって、EGF/EGFR複合体の構造座標を用いることを特徴とする方法を用いることにより、本発明はさらに以下の方法を提供するものである:
・EGFR活性調節物質をスクリーニングする方法であって、以下の段階:
(1)EGF/EGFR複合体の構造座標を用いてEGF/EGFR結合部位またはEGFR二量体化部位を同定する段階;
(2)(1)により同定されたEGF/EGFR結合部位またはEGFR二量体化部位の構造座標を用いてEGFR活性調節候補物質をスクリーニングする段階;および
(3)(2)により得られたEGFR活性調節物質を生化学的アッセイに供し、EGFR活性調節作用について評価する段階;
を含むことを特徴とする方法。
・EGFR活性調節物質のスクリーニング方法であって、以下の段階:
(1)EGF/EGFR複合体の構造座標を用いてEGF/EGFR結合部位またはEGFR二量体化部位を同定する段階;
(2)(1)により同定されたEGF/EGFR結合部位またはEGFR二量体化部位の構造座標を用いてEGFR活性調節物質のファルマコフォアを設計する段階;
(3)(2)により得られたファルマコフォアを用いてEGFR活性調節物質をスクリーニングする段階;および
(4)(3)により得られたEGFR活性調節物質を生化学的アッセイに供し、EGFR活性調節作用について評価する段階;
を含むことを特徴とする方法。
・EGFR活性調節物質の設計方法であって、以下の段階:
(1)EGF/EGFR複合体の構造座標を用いてEGF/EGFR結合部位またはEGFR二量体化部位を同定する段階;
(2)(1)により同定されたEGF/EGFR結合部位またはEGFR二量体化部位の構造座標を用いてEGFR活性調節物質のファルマコフォアを設計する段階;
(3)(2)により得られたファルマコフォアを用いて化合物を設計する段階;および
(4)(3)により得られた化合物を生化学的アッセイに供し、EGFR活性調節作用について評価する段階;
を含むことを特徴とする方法。
これらの方法については以下に詳細に説明する。
3−3 EGF/EGFR複合体の構造座標を用いたスクリーニング方法
本発明に係るEGF/EGFR複合体の構造座標を用いたEGFR活性調節物質のスクリーニング方法は、以下の段階:
(a)被験物質の立体構造を構造座標化する段階;ならびに
(b)(a)の構造座標およびEGF/EGFR複合体の構造座標の全部または一部を同一座標系上で重ね合わせて、両者の適合状態を評価する段階;
を含むことを特徴とする。すなわち、かかる方法は、上記のEGF/EGFR複合体の構造座標と任意の被験物質の立体構造を表す構造座標とをコンピューター上で適合させ、その適合状態を、例えば経験的スコアリング関数を指標とすることで数値化して、該被験物質のEGFRおよび/またはEGFに対する結合能を評価する方法である。
上述のように、EGF/EGFR複合体の構造座標を用いて、EGF/EGFRの結合部位またはEGFR二量体化部位の形状を指定し、そこに結合可能な化合物を、DOCK(http://www.cmphar.ucsf.edu/kuntz/dock.html)、AutoDock(http://www.scripps.edu/pub/olson−web/dock/autodock/)、Ludi、Ligand fitなどの市販パッケージソフトを使用してコンピュータスクリーニングを行うことが可能である。例えば、EGFR中のアミノ酸残基で、EGFと相互作用可能なAsn12,Lys13,Leu14,Thr15,Gln16,Leu17,Gly18,Asp22,Arg29,Tyr45,Ala68,Leu69,Tyr89,Glu90,Leu98,Ser99,Tyr101,Leu325,His346,Leu348,Pro349,Val350,Asp355,Ser356,Phe357,Thr358,Leu382,Gln384,Gln408,His409,Gln411,Phe412,Ala415,Val417,Ile438,Lys465のアミノ酸残基は、EGFR活性調節物質(アゴニストまたはアンタゴニスト)が結合し得るポケットや、クレーブを提供するので、この場を足がかりに、コンピュータスクリーニングを行うことが可能となる。
被験物質の構造座標およびEGF/EGFR複合体の構造座標の全部または一部を同一座標系上で重ね合わせて、両者の適合状態を評価する段階は、上述のような市販パッケージソフトウェアと、該ソフトウェアを作動可能なコンピュータシステムを用いることにより実施可能である。当該コンピュータシステムは、例えば、化合物の構造式を格納する記憶手段、化合物の立体構造を構造座標化する手段、化合物の構造座標を格納する記憶手段、EGF/EGFR複合体の構造座標を格納する記憶手段、評価結果を格納する記憶手段、各記憶手段の内容を表示させる手段、キーボード等の入力手段、ディスプレイ等の表示手段、中央処理装置等の、目的のソフトウエアを作動させるのに必要な各種手段を適宜含むものである。
本明細書においては、解析用ソフトウェアとしてDOCKを用いた具体例を示すが、コンピュータ上で蛋白質にリガンドをドッキングさせる操作が可能なソフトウェアであれば何を用いても良く、例えばFlexX(トライポス社)、LigandFit(アクセルリス社)、Ludi(アクセルリス社)等を用いてもよい。
まず、SPHGENプログラムを用いてEGFR活性調節物質(アゴニストまたはアンタゴニスト)が結合し得ると考えられるポケットおよびクレーブの周囲に対してスフェアと呼ばれる仮想の球体を配置する。この球体は、リガンドをドッキングさせる際のアンカー(錨)として機能する。なお、スフェアの発生部位は特定のポケット、クレーブに限定することも可能であるし、複数の部位に発生させることもできる。発生したスフェアの数が多い際には、近接するスフェアを手動で除去することも可能である。
次に、GRIDプログラムを用いてEGFとEGFRが相互作用を起こしている部分とその周囲に対してグリッド(格子)を発生させ、指定された範囲の受容体残基における電子的および立体的な環境を、各グリッド上のスカラー値として表現する。なお、各グリッドの値を算出するためにAMBER(http://www.amber.ucsf.edu/amber/amber.html)等の力場を利用するが、他の力場を使用してもよく、必ずしもAMBERに限定するものではない。また、蛋白質側の形状によっては、グリッド情報を改変し、化合物のドッキングがより現実に近い形で表現されるように調節することも可能である。
次に、化合物データベースに対して検索を行う。DOCKプログラムを用いて、ポケットおよびクレーブの周囲に存在するスフェアの近傍に位置し、かつ、グリッド上の立体的要素または電子的要素と反発しないような3次元配座を取るような化合物を探索する。この際、ドッキングされた化合物の3次元配座は、DOCKプログラムに内蔵された配座発生機能により最適化されるが、最終的に適切なドッキングが行われたかどうかは、ドッキング時のスコア、目視等によって経験的な判断を加味して総合的に判断し、決定する。このようにして適切なドッキングが行われていると判断された一連のヒット化合物群は、EGFR活性調節物質(アゴニストまたはアンタゴニスト)と一定の確率でなり得る。
以上の方法は、創薬開発の効率化を推進する。すなわち、EGF/EGFR複合体の相互作用部位の性質および形状に適合する構造座標配置を予測し、これを埋めることの可能な構造を有する化合物を計算により選択することで、多数の化合物からEGFRに特異的な活性制御物質を効率的に選択することが可能となる。
EGFRに対する活性調節作用の有無を確認しようとする候補物質(被験物質)は、公知または新規いずれであっても差し支えなく、その構造、由来、物性等にも特に制限はない。天然化合物、合成化合物、高分子化合物、低分子化合物、ペプチド、核酸類似物のいずれでもよい。将来的に医薬開発を行う上では低分子化合物であることが好ましく、例えばAvailable Chemicals Directory(ACD)(MDL information systems,Inc.,San Leandro,CA)、CMC(Conprehensive Medical Chemistry)、MDDR(MDL Drug Data Report)等に登録されている化合物情報は有益である。
この様な低分子化合物の立体構造を座標化するプログラムとしては、CORINA(http://www2.chemie.uni−erlangen.de/software/corina/index.html)、Concord(http://www.tripos.com/sciTech/inSilicoDisc/chemInfo/concord.html)、あるいはConverter等が利用可能である。この様にして座標化した低分子化合物とEGF/EGFR複合体との結合は、分子ドッキングパッケージDOCK等を使用して自動的に行わせることも可能であるし、InsightII等の分子表示ソフトウエアを用いて対話的に行うことも可能である。その際、これらのプログラムを用いて適合状態を評価する際の指標としては、結合体全体の自由エネルギー計算値、経験的スコアリング関数、形の相補性の評価などを任意に選んで使用することができる。この指標により、結合の良否を客観的に評価することが可能となる。
本発明のEGF/EGFR複合体の構造座標を用いたEGFR活性調節物質のスクリーニング方法において、構造座標としては、「3−1」の項に記載の方法で同定したEGF/EGFR結合部位またはEGFR二量体化部位の構造座標を用いることができる。
EGF/EGFR結合部位またはEGFR二量体化部位の構造座標の例としては、「2.EGF/EGFR複合体の構造座標」の項で説明された、それぞれ(ya)〜(yh)、(yj)〜(yp)の構造座標が挙げられる。また、後述するホモロジーモデリング法や分子置換法によりEGF/EGFR複合体の構造座標を用いて取得したリガンド/受容体複合体の構造座標を用いることにより、該受容体アゴニスト・アンタゴニストのスクリーニングを同様の方法で行うことが可能である。
3−4 ファルマコフォアを用いたEGF活性調節物質のスクリーニング方法・設計方法
ファルマコフォアとは、標的蛋白質に結合するために必要とされる、化合物上の物理化学的特徴である。ファルマコフォアは、化合物の構造上の物理化学的特徴を特性球として表し、特性球間の相対距離を決定することで定義することができるし、特定の官能基間の相対距離を決定することで定義することも可能である。その他、当業者が通常用い得る手法を任意に使用してファルマコフォアを定義可能であり、前述の方法に限定されるものではない。
特性球は、疎水性、帯電性、水素結合を形成し得る能力、などの種々の物理化学的性質を保持した空間的領域を意味する。例えば、ファルマコフォア構築プログラムであるCatalyst(Accelrys Inc.,San Diego,CA)においては、「Hydrogen−bond Acceptor(さらに、Hydrogen−bond Acceptor lipidを分類することもできる)」、「Hydrogen−bond Donor」、「Hydrophobic(さらに、Hydrophobic AromaticとHydrophobic aliphaticを分類することもできる)」、「Negative Charge」、「Negative lonizable」、「Positive Charge」、「Positive Ionizable」、「Ring Aromatic」の8種類の特性球が示されているが、該プログラムのユーザーが新たな定義を加えることも可能であり、上記の構成要素以外を利用することも可能である。すなわち、疎水性領域、水素結合受容体領域、陽イオン領域、環状芳香族性領域、等を物理化学的性質として規定し、これら該物理化学的性質を有するÅ半径の球状の領域として、特性球を表すことができる。各特性球に適合する原子や官能基の例は、例えばCatalystなどのプログラムに付属のマニュアルに定義されている(Accelrys Inc.,Catalyst Documentation Release 4.5,1999)。
換言すれば、本発明のEGFR活性調節物質は、EGF/EGFR複合体の蛋白質間相互作用部位(リガンド−受容体相互作用領域、受容体−受容体相互作用領域を含む)に選択的に適合可能な、一定の物理化学的性質を有する特性球相互の構造座標を満足させる化学構造で表される物質として規定される。
EGF/EGFRの共結晶構造情報を解析することで、既に記述したアミノ酸残基の立体的配置や構造水の三次元的な配置が与える性質をファルマコフォアとして規定することにより、EGFR活性調節物質(アゴニストやアンタゴニスト)をコンピュータによってスクリーニングが可能となる。また、複合体を形成する上で、分子間に存在する水分子(構造水)も、複合体形成に役割を果たすことがあり、これを介した蛋白質間の相互作用は、グラフィックス観察などによって特定される。更に、相互作用可能なアミノ酸残基や水分子のうち、特に、疎水的な相互作用・イオン結合・水素結合を形成している部位やアミノ酸残基、更には、複合体構造のEGFやEGFRの活性コンフォメーションが与える分子形状(ポケットや、クレーブ)を解析することで、分子設計や、コンピュータスクリーニングに必要なファルマコフォアを提示することが可能となる。ファルマコフォアの構築に有用なEGF/EGFR複合体の相互作用の例は、図9および図10に示す。これらの図に示されるアミノ酸残基は、それぞれEGFとEGFRの結合やEGFRの二量体化において重要な相互作用を形成しているアミノ酸の例でもある。
3−4−1 ファルマコフォアの設計方法
本発明は、EGF/EGFR複合体構造座標を用いることを特徴とする、ファルマコフォアの設計方法を提供する。ここでいうファルマコフォアとは、EGFR活性調節物質のファルマコフォアを意味する。ファルマコフォアの設計方法は、EGF/EGFR複合体の構造座標により表される3次元構造を(目視および/または適切なコンピュータプログラムにより)解析し、ファルマコフォアとして使用し得る部分構造(アミノ酸残基、構造水、ポケット、クレーブ等)を特定する工程;および、該部分構造を特性球に変換し、ファルマコフォアを発生させる工程を含み得る。ファルマコフォアとして使用し得る部分構造を特定する工程は、「3−1」に説明した手段に準ずる。部分構造を特性球に変換し、ファルマコフォアを発生させる工程は、Catalystなどの市販のソフトウエアと該ソフトウェアを作動可能なコンピュータシステムを用いることにより実施可能である。
特性球の3次元空間上における相対的な位置関係を設定することによって、Catalyst上の検索式(ファルマコフォア)が構築可能である。なお、規定の方法は、座標(x,y,z)による規定でも、各点を結ぶ直線距離の集合による規定であっても構わない。また、実際に受容体と相互作用可能な距離、計算上の誤差等を考慮にいれると、各々の化学的機能の距離関係は必ずしも厳密である必要はない。Catalystでは各化学的機能の位置は、各点を中心とした半径1.5〜2.0Åの球内、あるいは、各点を結ぶ直線距離±3〜4Åの範囲によって定義されるのが一般的であるが、この数値は適宜変更することもできる。
本発明のEGF/EGFR複合体の構造座標を用いたファルマコフォアの設計方法において、EGF/EGFR複合体の構造座標としては、「3−1」に記載の方法で同定したEGF/EGFR結合部位またはEGFR二量体化部位の構造座標を用いることができる。EGF/EGFR結合部位またはEGFR二量体化部位の構造座標の例としては、「2.EGF/EGFR複合体の構造座標」の項で説明された、それぞれ(ya)〜(yh)、(yj)〜(yp)の構造座標が挙げられる。また、後述するホモロジーモデリング法や分子置換法によりEGF/EGFR複合体の構造座標を用いて取得したリガンド/受容体複合体の構造座標を用いることにより、該受容体アゴニスト・アンタゴニストのスクリーニングに有用なファルマコフォアの設計を同様の方法で行うことが可能である。
またファルマコフォアは、前述のコンピューターを用いたスクリーニング方法や実験的スクリーニング方法で得られたEGFR活性調節作用を示す化合物を基に、これら化合物に共通して存在する化合物に共通する構造上の特徴を特性球として表し、特性球間の相対距離を決定することで定義することができるし、特定の官能基間の相対距離を決定することで定義することも可能である。
また、化合物により蛋白質に結合する部位が異なると、全ての化合物に共通する物理化学的性質が存在しない場合がある。この場合は、化合物を適切にクラスタリングした後、各クラスター内で共通する物理化学的性質を決定する必要がある。
本発明者は、EGF/EGFR複合体の構造座標を利用して、EGFR活性調節物質ののファルマコフォアを設計することに成功した。具体的なファルマコフォアは、実施例5および実施例6に開示されている。
3−4−2 ファルマコフォアを用いたスクリーニング方法
本発明はファルマコフォアを用いたEGFR活性調節物質のスクリーニング方法を提供する。特定されたファルマコフォアを用いて、EGFRアゴニストやアンタゴニストを見出すことが可能となる。ここでは、解析用ソフトウェアとしてCatalyst(アクセルリス社)を使用した例を示すが、リガンドからの化学的機能の抽出および抽出した化学的機能と類似した空間配置を取り得る化合物の検索が可能なソフトウェアであれば何を用いても良く、例えばSybyl(トライポス社)のモジュールであるUnity等を用いてもよい。この際、化合物のクラスタリングが必要であれば、Daylight Clustering Package(Daylight Chemical Information Systems,Inc.,Mission Viejo,CA)等のプログラムを使用することが可能である。
設計したファルマコフォアを用いて、あらかじめ準備したコンピュータスクリーニング用の化合物構造データベースを対象としてスクリーニングを実施する。ファルマコフォアの情報とある化合物の立体構造の空間配置とを比較し、該化合物がファルマコフォアの性質を満足させるものであるかどうかを計算により決定する。コンピュータスクリーニングの利点として、検索対象が理論上考え得る全ての化合物の部分集合であることが挙げられる。通常は、自社で保有する化合物のデータベース、市販化合物データベース、例えばAvailable Chemical Directory(MDL社)や各化合物販売会社・代理店が作成したデータベース、もしくはバーチャルコンビナトリアル合成手法等を用いて発生させた仮想化合物のデータベース、天然物由来の化合物データベース、医薬品データベース等をコンピュータ検索用に変換して用いる。
上記コンピュータスクリーニングによりヒットした化合物群はEGFRのファルマコフォアに結合する可能性を有する化合物であるため、EGFRのアゴニストまたはアンタゴニスト(EGFR活性調節物質)となり得る可能性が、一定の確率で発生する。
ファルマコフォアを用いたスクリーニング方法は、(1)被験物質の立体構造を構造座標化する段階、および(2)(1)の構造座標とファルマコフォアを規定する特性球の構造座標とを同一座標系上で重ね合わせ、両者の適合状態を評価する段階、を含み得る。ここでファルマコフォアとは、「3−4−1」において設計されたEGFR活性調節物質のファルマコフォアを指す。このとき、(1)の構造座標がファルマコフォアにおける少なくとも3点以上の特性球の相対配置および特性を満足させることが望ましい。これらの工程は上述した市販のソフトウェアおよび当該ソフトウェアを作動可能なコンピュータシステムを用いることにより実行可能である。
また、検索式でヒットした化合物群をデータベース化し、引き続き蛋白質構造を市販のドッキングソフトウエアに適用することによってヒット率を増すこともできる。
また、EGF/EGFR複合体に対して結合する化合物は、DOCK等を用いてコンピュータスクリーニングする際に有効なフィルターとして使用することができるし、各ファルマコフォアに対して適合するフラグメントを配置した後に各フラグメントを適当な官能基で結合させて化合物を構築するDe Novo設計的使用も可能である。
3−4−3 ファルマコフォアを用いた設計方法
本発明のEGF/EGFR複合体の構造座標を用いることでEGFR活性調節物質(アゴニスト・アンタゴニスト)の分子設計(活性上昇、選択性付与など)も可能となる。
スクリーニングでヒットした化合物や、その誘導体の結合モデルを構築することで、得られた化合物の誘導最適化に活用することが可能となる。例えば、スクリーニングによって得られたEGFRアゴニストやアンタゴニストを、EGFまたはEGFRとコンピュータによってドッキングモデル構造を予測することも可能である。このモデル構造は、化合物と近傍のアミノ酸残基との相互作用を増強させるような誘導方向性を見出す上で、また、活性には影響を与えずに、代謝、毒性などの改善を進める上で適当な方向性を提示しうるため、非常に有用である。加えて、薬理試験や代謝試験における種差の考察や、副作用軽減を目的として標的蛋白質に対する選択性を向上させるための誘導合成を支援する上で最も有用な情報を提供する。
ファルマコフォアを用いたEGFR活性調節物質の設計方法は、(1)ファルマコフォアの各特性球に対応する官能基を有する各フラグメント群を作成する段階;および(2)(1)で作成した各フラグメント群より一つずつ選択された各フラグメントを結合させて、化合物を設計する段階;を含み得る。さらに、(3)設計した化合物の構造座標とEGF/EGFR複合体構造座標またはファルマコフォアを同一座標系上で重ね合わせて両者の適合状態を評価する段階;(4)化合物の1つ以上のフラグメントを、近傍のアミノ酸残基との相互作用を増強もしくは減弱させる性質を有するフラグメントに置換する段階;ならびに(5)(3)および(4)を反復する段階;を含んでもよい。
(1)の工程は、ファルマコフォアの各特性球に対応する官能基を有するフラグメント群を作成する工程である。本発明においてフラグメントとは、化合物の部分構造を意味する。例えば、一つのファルマコフォアの特性球に相当する官能基を有するフラグメントを収集し、フラグメント群とする。また別のファルマコフォアの特性球に相当する官能基を有するフラグメントを収集し、フラグメント群とする。このようにして、各条件に相当する官能基を有する各フラグメント群を作成する。この時複数のファルマコフォアを満たす官能基を有するフラグメント、もしくはファルマコフォアを満たす官能基ともう一つのファルマコフォアを満たす官能基を同時に有するフラグメントを収集してもよい。フラグメントの収集の仕方は特に限定するものではない。例えば、EGFR活性調節物質からフラグメントを収集してもよい。収集した一つのフラグメントに置換基をつける、炭素鎖を伸張もしくは縮減する、原子を置換する等の操作により、新たなフラグメントを作成してもよい。このときには、既知のEGFR活性調節物質を改善するようなフラグメントの作成がより有用である。例えば、EGFRとEGFR活性調節物質との間に存在する水分子(構造水)もまた、両者の複合体形成に役割を果たすことがあり、これを介したEGFR−EGFR活性調節物質間の相互作用は、グラフィックス観察などによって特定できる。更に、相互作用可能なアミノ酸残基や水分子のうち、特に、疎水的な相互作用・イオン結合・水素結合を形成している部位やアミノ酸残基、更には、複合体構造のEGFR活性調節物質の活性コンフォメーションが与える分子形状を解析することよって観察できる。このようにして、既知EGFR活性調節物質と近傍のアミノ酸残基との相互作用を増強させるような誘導の方向性を見出したり、または、活性には影響を与えずに、代謝、毒性などの薬理学的な改善を進める上で適当な方向性を提示するための新たなフラグメントの創作が可能である。
次に、上述のように作成したフラグメント群より一つずつ選択された各フラグメントを結合させて、化合物をモデル構築する。例えば、紙上において、段階(1)で決定した各フラグメント群より一つずつ選択された各フラグメントを結合させて、化合物をモデル構築してもよい。好ましくはコンピューターソフトウェアを用いて化合物をモデル構築する。用いるソフトウェアは、化合物の構造を構築可能なソフトウェアであればいずれのソフトウェアを用いてもよく、例えばLudi(アクセルリス社)またはSybyl(トライポス社)のモジュールであるCombiLibMaker等を用いることができる。
フラグメントを結合させるとは、フラグメント同志を直接結合させること、およびフラグメントの間にリンカーを用いることによりリンカーを介して両者を結合させることが含まれる。使用するリンカーは特に限定されず、例えば、直鎖もしくは側鎖を有する炭化水素の基、前記炭化水素の基がヘテロ化合物で置換された基等が挙げられる。
また、EGFまたはEGFR中の連続した配列中に存在する相互作用に関わるアミノ酸残基を有するペプチドを設計することによって、EGF/EGFR結晶構造情報に基づき、低分子化合物にミミックすることも可能である。例えば、EGFのCys33−Trp49(CVVGYIGERCQYRDLKW:配列番号10)、EGFRのドメインI領域におけるSer11−Asn32(SNKLTQLGTFEDHFLSLQRMFN:配列番号11)、ドメインII領域におけるPro241−Thr266(PPLMLYNPTTYQMDVNPEGKYSFGAT:配列番号12)、あるいはドメインIII領域におけるLeu345−Leu363(LHILPVAFRGDSFTHTPPL:配列番号13)の部分配列は、活性調節作用、例えばアゴニスト活性やアンタゴニスト活性を発揮し得るため、この配列をペプチドミミックし低分子化することで、薬剤として最適化することもできる。
「3−1」〜「3−4」に説明した方法は、単独で用いるのみでなく、組み合わせたり反復して用いることが可能である。例えばEGF/EGFR複合体の構造座標を用いた化合物のスクリーニングを行った後、ヒット化合物をさらにファルマコフォアを用いたスクリーニング方法に供することができる。複数の手法を組み合わせたり反復することにより、より確からしいEGFR活性調節物質を同定することが可能となる。
3−5 生化学的アッセイによる評価
上述に説明したEGF/EGFR複合体構造座標を用いたEGFR活性調節物質の設計またはスクリーニング方法、ファルマコフォアを用いたEGFR活性調節物質の設計またはスクリーニング方法は、コンピュータ上での迅速なスクリーニングを可能とするが、コンピューターを利用したスクリーニングにより選択された化合物群は、期待される活性を有する確率が高くはなるが、全ての化合物が活性を有するとは限らないため、多くの化合物を実験的に(生化学的アッセイを用いて)評価することが望ましい。すなわち、構造情報・ファルマコフォアを用いたスクリーニング・設計方法は、生化学的アッセイに供する段階を含まない場合、EGFR活性調節「候補」物質をスクリーニングする方法であると言える。
したがって、コンピュータースクリーニングの結果から実験的に評価する化合物を選択する際には、評価の結果期待される活性化合物数を考慮の上、実際に実験的に評価を行う化合物数を決定する必要がある。
一般的に、コンピュータースクリーニングを行うプログラムには評価システムが含まれるが、評価システムは、対応するプログラムのアルゴリズムに合わせた独自の手法が多い。評価システムとして各化合物の活性値が得られる場合は、その値を基準として実験的評価に供する化合物を選択することが可能であるが、活性値ではなく経験的な数値しか得られない評価システムも数多く存在する。一方で、コンピュータースクリーニングの目的が、実験的評価に供する化合物数を絞り込むことと考えると、評価システムにより順位付けられた化合物を、上位から実験に供することが可能な数だけ選択することも有意義である。例えばコンピュータースクリーニングにより選択された化合物が期待する活性を有する確率を5%〜30%と考えた場合、10化合物の活性制御物質を得るためには約30〜200の候補化合物を選択すれば良いし、50化合物の活性制御物質を得るためには約160〜1000の候補化合物を選択すれば良い。この際、最終的に得られる活性制御化合物に多様性を持たせることを目的として、評価の上位化合物を構造・物性等の類似度によりクラスタリングした後、各クラスターから実験的評価に供する化合物数を選択することも有意義である。
すなわち、コンピューター上でスクリーニングし選別したEGFR活性調節(候補)物質を、更にEGFRを発現する細胞またはEGFRを用いた生化学的アッセイに供することにより、より効果的にEGFR活性調節物質を選別することが可能になる。生化学的アッセイを用いるに際して、被験物質がEGFR活性調節作用を示すかどうかは、蛋白質の活性を確認できる系に該化合物を添加した場合と無添加の場合の蛋白質の活性に差があるかどうかを調べればよい。活性調節作用を有するとは、蛋白質の活性の測定値が、被験化合物添加群と、被験化合物無添加群との間で差があることをいう。たとえば、下記の式で計算される阻害(または抑制)率あるいは増強(または促進)率が10%以上、好ましくは30%以上、より好ましくは50%以上、更に好ましくは70%以上、特に好ましくは90%以上であることをいう。
阻害(抑制)率または増強(促進)率(%)=(無添加群の測定値−被験化合物添加群の測定値)の絶対値/無添加群の測定値×100
ここで、阻害・増強のどちらの作用であるかについておよび測定値については、蛋白質の活性を確認できる系の種類によって適宜定められる。たとえば、蛋白質の活性を確認できる系が以下に示す生化学的アッセイ例6に示す方法の場合には、吸光度を用いることができ、被験物質添加群の測定値<被験物質無添加群の測定値となる場合、被験物質はEGFRアンタゴニストであり、被験物質添加群の測定値>被験物質無添加群の測定値となる場合、被験物質はEGFRアゴニストであるといえる。測定系にバックグラウンドやノイズの値が含まれる場合には、そのようなものを差し引いた値を測定値とすることができる。
以下に生化学的アッセイの例を示すが、これらに限定されるものではない。
(生化学的アッセイ例1)EGFレセプターバインディングアッセイ
A431(ヒト扁平上皮癌)細胞などで代表されるEGFレセプター高発現細胞あるいは可溶型EGFレセプターをプレートに固相化する。ユーロピウム標識したEGFおよび被験物質を各ウェルに添加し一定時間インキュベートする。インキュベート後プレートを洗浄し、DELFIA増強試薬を添加した後に時間分解蛍光を測定する。被験物質のかわりにDMSOを添加したウェルの蛍光カウントをコントロールとし、これよりも低いカウントを示す被験物質をEGF結合阻害物質としてスクリーニングすることができる。
同様にRI等で標識したEGFを用いてレセプターバインディングアッセイを行なう事も可能である。
(生化学的アッセイ例2)ELISAアッセイ
A431細胞を含めたEGFレセプター高発現細胞あるいは可溶型EGFレセプターをプレートに固相化する。EGFおよび被験物質を各ウェルに添加し、一定時間インキュベートする。インキュベート後プレートを洗浄した後にHRP標識した抗EGF抗体を添加し、さらにインキュベートする。再び洗浄を行い、基質溶液を加えることにより酵素反応を開始する。一定時間後に反応を停止した後に吸光度を測定する。被験物質のかわりにDMSOを添加したウェルの吸光度をコントロールとし、これよりも低いカウントを示す被験物質をEGF結合阻害物質としてスクリーニングすることができる。
(生化学的アッセイ例3)BIACOREを用いた結合試験
センサーチップ上に可溶型EGFレセプターを固相化し、被験物質をBIACORE(登録商標)マイクロ流路系を介してチップ上に送液する。表面プラズモン共鳴によりセンサーチップ表面の質量変化を検出することにより、EGFレセプターに特異的に結合する被験物質をスクリーニングすることができる。
(生化学的アッセイ例4)EGFレセプターリン酸化試験(Western blot法)
A431細胞を含めたEGFレセプター高発現細胞をプレートに播種する。EGFおよび被験物質を各ウェルに添加し、一定時間インキュベートする。インキュベート後、細胞をLaemlli buffer(Laemlli,U.K.,1970,Nature227:680−685)を用いて溶解し、SDS−PAGEにて蛋白質を分離後、メンブランにブロッティングする。チロシンリン酸化されたEGFレセプターは、抗リン酸化EGF受容体抗体およびHRPなどで標識された2次抗体と適切な基質溶液を用いて発光させ、X線フィルム上等で検出する。被験物質のかわりにDMSOを添加した細胞におけるリン酸化レセプターの量(検出されたバンドの濃さ)をコントロールとし、これよりも薄いバンドを示す被験物質をEGF受容体活性化阻害薬としてスクリーニングすることができる。
またコントロールよりも濃いバンドを示す被験物質をEGF受容体活性化薬としてスクリーニングすることも可能である。
(生化学的アッセイ例5)レポータージーンアッセイ
c−fosやc−mycなどEGF刺激によって転写誘導される遺伝子のプロモーター領域の下流にルシフェラーゼ遺伝子を連結したプラスミドを構築する。これをA431細胞などで代表されるEGFレセプター発現細胞にトランスフェクトし、EGF刺激により一過性または恒常的にレポータージーンを発現する組替え細胞を作製する。本組替え細胞に対してEGFおよび被験物質を添加し、一定時間後のルシフェラーゼ活性を測定する。被験物質のかわりにDMSOを添加したウェルのルシフェラーゼ活性をコントロールとし、これよりも低いルシフェラーゼ活性を示す被験物質をEGF受容体活性化阻害薬としてスクリーニングすることができる。
またコントロールよりも高いルシフェラーゼ活性を示す被験物質をEGF受容体活性化薬としてスクリーニングすることも可能である。
(生化学的アッセイ例6)細胞増殖アッセイ
A431細胞およびSiHa細胞(ヒト扁平上皮癌)などに代表されるEGF依存的増殖を示す細胞をプレートに播種する。EGFおよび被験物質を添加し、数日後の生細胞数をMTT法等により定量する。被験物質のかわりにDMSOを添加したウェルの吸光度をコントロールとし、これよりも低い吸光度を示す被験物質をEGF受容体活性化阻害薬としてスクリーニングすることができる。またコントロールよりも高い吸光度を示す被験物質をEGF受容体活性化薬としてスクリーニングすることも可能である。
EGFの効果および作用は細胞膜に存在するEGF受容体を介して惹起されることが明らかになっており、EGF受容体に結合してこれを活性化させる化合物はEGFと同等の生理活性および薬理活性を有することが期待される。EGF受容体活性化薬の生物活性(薬効試験)の評価例を以下に示す。
(試験例1)腫瘍移植モデルマウスに対する作用
Colon−26(マウス結腸腺癌)またはA431細胞をBALB/c系雌マウス腹部皮下に移植し、一定期間後に癌の大きさ、すなわち腫瘍の長径(a mm)および短径(b mm)を測定して下式により癌重量を算出する。
癌重量(mg)=ab2/2
(これらの癌腫瘤は一般に回転楕円体の形状をとるため、回転楕円体の体積計算の公式を導入する。また、ガン細胞の比重を約1として体積=重量とする。)
被験物質投与直前に癌重量を測定した後、各々の群に被験物質を投与し、移植癌細胞の経時的重量変化を測定する。本発明により得られるEGF受容体活性化薬は癌重量を増加または減少させる。
(試験例2)急性肝障害モデルマウスに対する作用
ddY系雄マウスに被験物質を投与し,30分後に3vol%四塩化炭素を皮下注射する。そして、この時より24時間後に眼窩静脈叢より採血して、血清を調製する。この血清を希釈し、GOTおよびGPT値を測定する。本発明により得られるEGF受容体活性化薬はGOTおよびGPT値の上昇を抑制する。
(試験例3)胃潰瘍モデルラットに対する作用
SD系雄ラットを実験開始24時間前より絶食させ、麻酔下において正中線より切開し、胃を切り開く。胃壁の外側と内側とをリング付きピンセットで挟み、内側に60vol%酢酸を滴下する。一定時間後にこれを除去した後に縫合し、その後の食餌は自由摂取とする。翌日より被験物質の投与を開始し、粘膜層の厚さの変化を経時的に測定する。本発明により得られるEGF受容体活性化薬は粘膜層の厚さを増加させる。
(試験例4)肉芽形成に対する作用
Wistar系雄性ラットの背部皮下に麻酔下において被験物質を吸収させたペーパーディスクを移植し、形成された肉芽組織の乾燥重量、蛋白質含量、DNA含量および/またはハイドロキシプロリン含量の変化を経時的に測定する。本発明により得られるEGF受容体活性化薬は乾燥重量、蛋白質含量、DNA含量および/またはハイドロキシプロリン含量を増大させる。
(試験例5)パーキンソン病モデルラットに対する作用
SD系雌ラットの片側の黒質線条体ドーパミン経路に6−hydroxydopamine HBrを投与してパーキンソン病モデルラットを作成する。ここに胎生14日齢のラット胎児から得られた中脳腹側および被験物質を線条体に移植し、amphetamineを投与したときの運動性の変化を経時的に観察する。本発明により得られるEGF受容体活性化薬はamphetamine投与時の運動性を低下させる。
また、EGF受容体活性化阻害薬の生物活性は、例えば以下の各種方法により確認できる。
(試験例6)腫瘍移植モデルマウスに対する作用
試験例1と同様の手順で行う。ただし、被験物質とともにEGFを投与し、EGFのみを投与した群との生物活性を比較する。本発明により得られるEGF活性化阻害薬はEGFのみを投与した場合に観察される癌重量の変化を阻害する。(試験例7)卵巣摘出ラットに対する作用
SD系雌ラットから卵巣を摘出した後、被験物質を投与する。一定期間後に両大腿骨を摘出し、骨梁に含まれるカルシウムおよびハイドロキシプロリンの量を測定する。本発明により得られるEGF受容体活性化阻害薬はカルシウムおよびハイドロキシプロリン含量の低下を抑制する。
さらに、EGF受容体選択的薬物送達剤の生物活性は、例えば以下の方法により確認できる。
(試験例8)腫瘍移植モデルマウスに対する作用
試験例1と同様の手順で行う。ただし、被験物質とともに適切な殺細胞物質を投与し、殺細胞物質のみを投与した群との生物活性を比較する。本発明により得られるEGF受容体選択的薬物送達剤は殺細胞物質のみを投与した場合に観察される癌重量増加抑制作用を増強させる。
これまでにEGFの生理活性および薬理活性として報告されているものには、以下のものがある。
1)正常細胞および腫瘍細胞増殖の促進[Dev Biol.,12,394(1965),Science,201,515(1978)]または抑制[J.Biol.Chem.,259,7761(1984)]
2)損傷を受けた器官の自己再生の促進[Ciba Found Symp.,55,95(1977)]
3)胃酸分泌抑制作用[Gut,23,951(1982)]・消化管粘膜保護作用:[J.Clin.Gastroenterol.,13,S103(1991)]
4)創傷治癒促進作用[J.Surg.Res.,33,164(1982)]・角膜修正作用[Exp.Eye Res.,40,47(1985)]
5)神経保護作用[J.Neurosurg.Sci.,37,1(1993)]・神経細胞の分化・増殖作用[J.Neurosci.,12,4565(1992),J.Neurosci.,16,2649(1996)]
6)カルシウム遊離促進作用[Endocrinology,107,270(1980)]
EGF受容体に結合してこれを活性化させる物質(アゴニスト)は、1)腫瘍細胞の増殖調節剤、望ましくは抗腫瘍剤、あるいは細胞の賦活化・新陳代謝の促進剤および化粧品類、望ましくは脱毛剤、2)損傷を受けた器官の再生促進剤、望ましくは肝機能障害の治療剤、3)消化管機能障害改善薬、望ましくは胃酸分泌抑制剤・消化管粘膜保護剤・抗潰瘍剤、4)創傷治療促進剤望ましくは糖尿病・創傷・火傷等による皮膚潰瘍・角膜損傷の治療剤、5)神経細胞の再生・保護剤、望ましくは抗パーキンソン病薬として用いることができる。
また、EGF受容体に結合して活性化を阻害する物質(アンタゴニスト)は、1)正常細胞および腫瘍細胞の増殖調節剤、望ましくは抗腫瘍剤、乾癬治療剤および喘息を含む慢性閉塞性肺疾患治療剤、2)骨吸収抑制剤、望ましくは骨粗鬆症の予防・治療薬として用いることができる。
さらに、EGF受容体に結合する化合物はEGF受容体を有する細胞への選択的薬物送達剤、望ましくは腫瘍細胞への殺細胞物質の選択的薬物送達剤として用いることができる。
本発明はまた、上述に説明したEGF/EGFR複合体構造座標を用いたEGFR活性調節物質の設計またはスクリーニング方法、ファルマコフォアを用いたEGFR活性調節物質の設計またはスクリーニング方法により同定または設計されたEGFR活性調節物質を提供するものである。
3−6 EGFRアゴニストまたはEGFRアンタゴニスト
本発明はまた、具体的な特性球により定義されるファルマコフォアに適合する構造を有するEGFRアゴニストまたはEGFRアンタゴニストを提供する。ファルマコフォアに適合する構造を有するとは、このようなEGFRアゴニストまたはEGFRアンタゴニストを立体構造化した際の構造座標がファルマコフォアにおける少なくとも3点以上の特性球の相対配置および特性を満足させることを意味する。各特性球に適合する原子や官能基の例は、例えばCatalystなどのプログラムに付属のマニュアルに定義されている(Accelrys Inc.,Catalyst Documentation Release 4.5,1999)。具体的な特性球を有するファルマコフォアは実施例5および実施例6に開示されているがこれらに限定されるものではなく、本発明のファルマコフォアの設計方法により得られるファルマコフォアも含まれる。
3−7 EGFRの活性を調節する方法
本発明はまた、EGFRの活性を調節する方法であって、EGFRと、具体的な特性球により定義されるファルマコフォアに適合する構造を有するEGFR活性調節物質を接触させることを特徴とする方法を提供する。当該方法はさらに、EGFRの活性が調節されたことを確認する工程を含みうる。EGFRの活性が調節されたことを確認する工程は、EGFRの活性化の結果生起することが知られている事象(例、EGFR細胞内ドメインのリン酸化、細胞増殖等)のうち少なくとも一つについて阻害または促進が起こったことを検出することにより実現され得る。
4.構造情報を用いたEGF変異体およびEGFR変異体の作製
本発明は、EGF/EGFR複合体構造座標を用いることを特徴とする、EGFR変異体を設計する方法、またはEGF変異体を設計する方法を提供する。また、本発明は、当該設計方法を用いたEGFR変異体またはEGF変異体の製造方法および当該製造方法により得られるEGFR変異体またはEGF変異体を提供する。
本発明のEGF/EGFR複合体構造座標を用いることにより、EGF/EGFR間の相互作用部位や二量体化部位の観察を行って、EGFまたはEGFR中のアミノ酸残基にポイントミューテーションを目的に応じて導入することが可能となる。EGF/EGFR複合体構造座標を用いることを特徴とする、EGFR変異体を設計する方法、またはEGF変異体を設計する方法は、以下の工程を含み得る:EGF/EGFR複合体の構造座標をコンピュータに入力する段階;EGF/EGFR複合体構造の解析によりEGF/EGFR結合部位またはEGFR二量体化部位を構成するアミノ酸残基を特定する段階;および変異を導入するアミノ酸残基を特定する段階。
さらに、コンピュータ上でEGF/EGFR複合体の3次元構造を視覚的に表示させる段階を含んでもよく、EGF/EGFR複合体構造の解析によりEGF/EGFR結合部位またはEGFR二量体化部位を構成するアミノ酸残基を特定する段階および変異を導入するアミノ酸残基を特定する段階は、目視および/またはコンピュータプログラムによる解析により実現され得る。
当該設計方法を用いたEGFR変異体またはEGF変異体の製造方法は、以下の工程を含み得る:EGF/EGFR複合体構造座標を用いてEGFR変異体またはEGF変異体を設計する段階;変異蛋白質を調製する段階;および変異蛋白質を生化学的アッセイに供し所望の活性を有することを確認する段階。
例えば、EGF活性を増強させたEGF変異体を設計することも可能となる。単なる組み換えEGFに比較して、創傷などの薬剤として低容量で投与可能となるなどのメリットがある。
すなわち、アゴニスト(作用薬)としての活性を持つEGF変異体を設計するには、EGFRとの直接的な相互作用に関与するEGFのアミノ酸残基およびその近傍領域において、相互作用上において対応しているEGFR側の領域中にあるアミノ酸残基とより強く結合するように変異を導入する。ここに「その近傍領域」とは、該アミノ酸残基に対して、静電相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合などに関与する領域、具体的にはおよそ5Å以内にある領域をいう。更に、これ以外の部位に変異を導入することによりアゴニストとしての活性を持つ変異体EGFを設計する場合においても、そのような設計方法は、本発明における構造座標を使用する限り本発明の範囲に含まれる。
EGF/EGFR複合体の構造座標をコンピュータに入力する段階;コンピュータ上でEGF/EGFR複合体の3次元構造を視覚的に表示させる段階;およびEGF/EGFR複合体構造の解析によりEGF/EGFR結合部位またはEGFR二量体化部位を構成するアミノ酸残基を特定する段階の詳細は、上述の「3−1」に説明されている。変異を導入するアミノ酸残基を特定する段階において、考慮されるべき非共有結合の相互作用は、静電相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合などがあり、これらを総合的に考慮して最終的な変異体の設計を行うことができる。例えば、EGFR側のグルタミン酸、アスパラギン酸といった側鎖部分に負の電荷を持つアミノ酸残基の側鎖近傍には、近接するEGFのアミノ酸残基においてリジン、アルギニン、ヒスチジンといった正の電荷を持つアミノ酸残基の側鎖が配置されるように、また、その逆にEGFR側にリジン、アルギニン、ヒスチジンといった側鎖部分に正の電荷を持つアミノ酸残基の側鎖近傍には、近接するEGFのアミノ酸残基においてグルタミン酸、アスパラギン酸といった負の電荷を持つアミノ酸残基の側鎖が配置されるように変異させる。また、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンといった側鎖部分が疎水性の高いアミノ酸残基が主に集まって相互作用している部分においては、EGFにおいてセリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン、グルタミンといった親水性のアミノ酸残基やアスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジンといった荷電しているアミノ酸残基が存在している箇所を見つけだし、該アミノ酸残基を疎水性のアミノ酸残基で置き換え、疎水性相互作用が強まるようにする。また、水素結合をする主鎖部分やセリン、チロシンなどのアミノ酸残基の側鎖部分には、新たな水素結合ができるように、対応するアミノ酸残基を変異させる。以上の変異においては、アミノ酸残基の側鎖や主鎖部分において、ファンデルワールス相互作用ができるだけ大きく、しかも各原子間で立体的な障害が生じないように注意する必要がある。更には、変異により新たな空隙部分ができないように、また既に空隙部分が存在する領域においては、その空隙部分をできるだけ充填するような変異を考慮することも必要である。このように、静電相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合などやその他の因子を、コンピューター画面上で視覚的または/および適当なコンピュータプログラムを用いて総合的に考慮して、最終的な変異体の設計を行うことができる。
例えばEGFのMet21は、結晶構造の解析結果から、ある程度の確からしさでデルタ炭素以上の炭素を有する水素結合可能なアミノ酸残基に置換可能である。特にLys、Arg、Glu、Glnへの置換によって、Tyr45の側鎖の水酸基、Gln16の側鎖Leu14の主鎖カルボニルとの水素結合能が付与される可能性があり、EGFRへの結合活性上昇、EGF物性改善等を期待することができる。逆に、Cγまでしかないアミノ酸側鎖に置換すると活性を損なう可能性も考えられる(Thr,Serなど)。更にGln43は、ある程度の確からしさでLeu、Ileなどの疎水性残基に置換することも可能である。これは、EGFRの相互作用可能な残基がLeuであることから推測される。
また、アンタゴニスト(拮抗薬)としての活性を持つEGF変異体を設計するには、EGFRとの直接的な相互作用に関与するEGFのアミノ酸残基およびその近傍領域において変異を導入する。ついで、該変異体EGFがEGFRへ結合することによって、3次元空間における本来のEGFとEGFRの2分子の相対的な位置が保たれなくなるような変異体、または該変異体EGFとEGFRとが相互作用ができなくなり、その結果、天然型のEGFに対してアンタゴニストとしての活性を持つような変異体を選択する。または、EGFRに結合はするものの、EGFRの構造変化を引き起こさないような変異体も有用である。EGFRとの直接的な相互作用に関与する以外の部位に変異を導入することにより、アンタゴニストとしての活性を持つ変異体EGFを設計する場合においても、そのような設計方法は本発明における構造座標を使用する限り本発明の範囲である。
また、EGFRの二量体化に関与するアミノ酸残基に、相互作用を困難にするような変異を導入することで、EGFとは結合するが、二量体化を行わない変異EGFRを設計することも可能となる。可溶型変異EGFRとすれば、EGF中和抗体同様に、EGFRアンタゴニスト活性を発揮することで、癌や乾癬などの治療効果を発揮することが期待される。例えばGln252はAla286の主鎖と、Tyr246はCys283の主鎖と、Asn86はThr249の側鎖とそれぞれ水素結合をして二量体を安定化させているので、これらのアミノ酸残基側鎖を水素結合を形成できないアミノ酸に置換することで、二量体化を行わずにEGFをトラップする能力を有する分子を構築することも可能となる。
「変異体」とは、もとの蛋白質のアミノ酸配列のアミノ酸が少なくとも1つ以上、例えば1個または数個(1〜10個)が置換、付加もしくは欠失、または修飾されたアミノ酸配列を有する蛋白質をいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、アシル化(例えば、アセチル化)などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。「天然のアミノ酸」とは、天然のアミノ酸のL−異性体を意味する。天然のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチオニン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、γ−カルボキシグルタミン酸、アルギニン、オルニチン、およびリジンである。特に示されない限り、本明細書でいう全てのアミノ酸はL体である。「非天然アミノ酸」とは、蛋白質中で通常は天然に見出されないアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸の例として、ノルロイシン、パラ−ニトロフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、パラ−フルオロフェニルアラニン、3−アミノ−2−ベンジルプロピオン酸、ホモアルギニンのD体またはL体およびD−フェニルアラニンが挙げられる。「アミノ酸アナログ」とは、アミノ酸ではないが、アミノ酸の物性および/または機能に類似する分子をいう。アミノ酸アナログとしては、例えば、エチオニン、カナバニン、2−メチルグルタミンなどが挙げられる。
本発明の変異体設計方法に用いる構造座標は、表1または表2に示される構造座標、また、これを元にしてコンピューターを用いた計算などにより新たに作成した構造ホモログの構造座標でもよいし、更にはこれらの座標より、一部を抜き出したものでもよい。人に用いる医薬品として設計する場合においては、ヒト由来の蛋白質の構造座標を用いる方がより望ましい。
本発明により設計された変異体は、多くの方法によって調製され得る。例えば本発明を元にして、変異が有効であると同定された部位において、対応するアミノ酸残基をコードしている該オリゴヌクレオチドの部位を、変異体に相当するオリゴヌクレオチドを化学的に合成して、配列に特異的なオリゴヌクレオチド切断酵素(制限酵素)を用いて天然型のオリゴヌクレオチドの部分と入れ替えることで、本発明を元にして設計された該変異体をコードするDNAを得ることができる。得られた変異体DNAを適当な発現ベクターに組み込み、適当な宿主に導入し、組換え蛋白質として生産させることで前述のような変異体を得ることができる。
さらに、本発明の設計方法により設計され、調製された変異体について、生化学的アッセイにより所望の活性を有するかどうかを確認することが好ましい。用い得るアッセイ系に特に限定はないが、既述(3−5)の生化学的アッセイ例を使用することが可能である。すなわち、本発明の構造座標を利用して変異を導入すべきアミノ酸残基を決定し、遺伝子工学的手法を用いて変異蛋白質を作成し、該変異蛋白質を生化学的アッセイに供し、所望の活性を有するかどうかについて評価をすればよい。所望の活性の具体的な例としては、EGFついては、EGFR結合能および/またはEGFR二量体化誘導能を増強あるいは減弱させること、EGFRについては、EGF結合能および/または二量体化能を増強あるいは減弱させることが挙げられる。
以上のように、今まで3次元構造上の理論的な支持がない状態で試行錯誤で行われていた変異体の作製を、本発明の構造座標の使用により、3次元空間内の理論的な解析に基づいて行うことが可能になる。
本発明のEGF/EGFR複合体の構造座標を用いたEGF変異体またはEGFR変異体の設計方法において、構造座標としては、「2.EGF/EGFR複合体の構造座標」の項で説明された構造座標を用いることが可能である。また、後述するホモロジーモデリング法や分子置換法によりEGF/EGFR複合体の構造座標を用いて取得したリガンド/受容体複合体の構造座標を用いることにより、該リガンドの変異体または該受容体の変異体の設計を同様の方法で行うことが可能である。
本発明は、上述のEGF変異体またはEGFR変異体の設計・製造方法により得られる変異体を提供する。
さらに本発明は、具体的な変異体の例として、以下の(A)〜(D)に示す変異体を提供する:
(A)EGFR二量体化部位にアミノ酸変異を有するEGFR変異体;
(B)EGF/EGFR結合部位にアミノ酸変異を有するEGFR変異体;
(C)EGFR二量体化部位およびEGF/EGFR結合部位にアミノ酸変異を有するEGFR変異体;
(D)EGF/EGFR結合部位にアミノ酸変異を有するEGF変異体。
(A)の好ましい態様としては以下の(A−1)〜(A−3)が挙げられる:
(A−1)EGFR二量体化部位を構成するアミノ酸残基の少なくとも一つのアミノ酸残基に変異を有するEGFR変異体;
(A−2)EGFR二量体化部位を構成するアミノ酸残基の少なくとも一つのアミノ酸残基に変異を有し、EGFR二量体化能が減弱した活性を有するEGFR変異体;
(A−3)EGFR二量体化部位を構成するアミノ酸残基の少なくとも一つのアミノ酸残基に変異を有し、EGFR二量体化能が増強した活性を有するEGFR変異体。
(B)の好ましい態様としては以下の(B−1)〜(B−3)が挙げられる:
(B−1)EGF/EGFR結合部位を構成するアミノ酸残基の少なくとも一つのアミノ酸残基に変異を有するEGFR変異体;
(B−2)EGF/EGFR結合部位を構成するアミノ酸残基の少なくとも一つのアミノ酸残基に変異を有し、EGF結合能が減弱した活性を有するEGFR変異体;
(B−3)EGF/EGFR結合部位を構成するアミノ酸残基の少なくとも一つのアミノ酸残基に変異を有し、EGF結合能が増強した活性を有するEGFR変異体。
(C)の好ましい態様としては以下の(C−1)〜(C−2)が挙げられる:
(C−1)EGFR二量体化部位を構成するアミノ酸残基の少なくとも一つのアミノ酸残基およびEGF/EGFR結合部位を構成するアミノ酸残基の少なくとも一つのアミノ酸残基に変異を有するEGFR変異体;
(C−2)EGFR二量体化部位を構成するアミノ酸残基の少なくとも一つのアミノ酸残基およびEGF/EGFR結合部位を構成するアミノ酸残基の少なくとも一つのアミノ酸残基に変異を有し、EGF結合能が増強しかつEGFR二量体化能が減弱した活性を有するEGFR変異体。
実施例9に示されるように、EGFとEGFRはいわゆる「induced fit」によりEGF/EGFR結合とEGFR二量体化を行うものと考えられる。よって、EGFR二量体化部位に変異を有する変異体がEGF結合能に変化を生じる可能性があり、EGF/EGFR結合部位に変異を有するEGFR変異体がEGFR二量体化能に変化を生じる可能性もある。よって、EGFR変異体については、上述のほかに、EGF結合能が増強した活性、EGF結合能が減弱した活性、EGFR二量体化能が増強した活性、EGFR二量体化能が減弱した活性、EGF結合能が増強しかつEGFR二量体化能が増強した活性、EGF結合能が減弱しかつEGFR二量体化能が減弱した活性、EGF結合能が増強しかつEGFR二量体化能が減弱した活性、EGF結合能が減弱しかつEGFR二量体化能が増強した活性、のいずれかより所望の活性を有するEGFR変異体とすることが可能である。
(D)の好ましい態様としては以下の(D−1)〜(D−3)が挙げられる:
(D−1)EGF/EGFR結合部位を構成するアミノ酸残基の少なくとも一つのアミノ酸残基に変異を有するEGF変異体;
(D−2)EGF/EGFR結合部位を構成するアミノ酸残基の少なくとも一つのアミノ酸残基に変異を有し、EGFR結合能が減弱した活性を有するEGF変異体;
(D−3)EGF/EGFR結合部位を構成するアミノ酸残基の少なくとも一つのアミノ酸残基に変異を有し、EGFR結合能が増強した活性を有するEGF変異体。
本項の変異体のEGFR二量体化部位を構成するアミノ酸残基・EGF/EGFR結合部位を構成するアミノ酸残基の定義は、「2.EFG/EGFR複合体の構造座標」の項の説明に準ずる。二量体化部位を構成するとは、二量体化において重要な相互作用を形成していると換言できる。EGF/EGFR結合部位についても同様である。
「減弱した活性」とは、変異を有さない天然のアミノ酸配列の蛋白質の活性に対して、変異を有する蛋白質の活性が、例えば0.8倍以下、好ましくは0.5倍以下、更に好ましくは0.3倍以下であることを意味する。「増強した活性」とは、変異を有さない天然のアミノ酸配列の蛋白質の活性に対して、変異を有する蛋白質の活性が、例えば1.2倍以上、好ましくは1.5倍以上、更に好ましくは2.0倍以上であることを意味する。蛋白質の活性は、当業者が通常使用し得る方法を用いて測定可能であり、例としては「3.構造座標を用いたスクリーニングまたは設計方法」の項の「3−5」の項で説明した生化学的アッセイ、実施例7〜9に記載の方法が挙げられる。
5.EGF/EGFR複合体構造座標を用いた分子置換法
本発明は、EFG/EGFR複合体の構造座標を用い、分子置換法により未知の構造の蛋白質または蛋白質複合体についての構造座標を取得する方法を提供する。より詳細には、未知の構造の蛋白質または蛋白質複合体を結晶化する工程;該結晶化された未知の構造の蛋白質または蛋白質複合体からX線回折像を生成する工程;および、表1または表2に記載の構造座標の少なくとも一部をX線回折像に適用して、その構造が未知である未知の構造の蛋白質または蛋白質複合体の少なくとも一部の3次元電子密度マップを生成する工程を含み得る。分子置換法は、X線結晶構造解析において位相問題を解決するための手段であり、構造未知の蛋白質または蛋白質複合体のネイティブ結晶(重金属原子を含有しない結晶)のX線回折像が得られているとき、既に構造が決定されている蛋白質または蛋白質複合体の構造情報を利用することで、重原子同型置換法を用いることなく迅速に構造未知蛋白質または蛋白質複合体の構造座標を決定し得る方法である(Blundell,T.L.およびJohnson,L.N.,(1976).PROTEIN CRYSTALLOGRAPHY,第443−464頁,Academic Press,NewYork.)。
本発明による、EGF/EGFR複合体の構造座標またはその一部は、EGFおよびEGFRの全部または一部を含んでいる結晶、EGFもしくはEGFRと有意な相同性を持つアミノ酸配列を持つ他の蛋白質から得られた結晶、またはEGFもしくはEGFRと構造上類似性を有すると予想される他の蛋白質から得られた結晶などのX線結晶構造解析において使用されうる。分子置換法を行う際には、例えばCNX(アクセルリス社)やAMORE(CCP4(Collaborative Computational Project,Number4.Acta Crystallogr.D50,670−673(1994))のプログラム群の1つ)などのプログラムを利用できるが、その他のプログラムを用いてもよい。
本発明のEGFとEGFRの複合体の構造座標を用いて分子置換法を適用するべき結晶としては、EGFとEGFRの全部または一部を含んでいる結晶、EGFまたはEGFRと有意な相同性を有するアミノ酸配列を持つ他の蛋白質の結晶、EGFまたはEGFRと構造上類似性を有すると予想される他の蛋白質の結晶、EGFRと結合する化合物(例えばアゴニストやアンタゴニスト)とEGFRとの複合体の結晶、EGFと結合する化合物(例えばアンタゴニスト)とEGFとの複合体の結晶、EGFとアミノ酸残基において有意な相同性を有する蛋白質の結晶、EGFRとアミノ酸残基において有意な相同性を有する蛋白質の結晶が挙げられ、EGFの変異体の結晶、EGFRの変異体の結晶、また更にそれらの複合体(リガンド−受容体複合体、蛋白質−化合物複合体を含む)の結晶にも適応しうる。ここで有意な相同性とは、一般に、比較するアミノ酸配列間において20%以上、好ましくは30%以上のアミノ酸が一致している場合をさす。分子置換法の適用については、実際に目的の結晶のX線回折像から計算された構造因子に分子置換法を適用し、有意な解が得られることにより、判断されうる。すなわち、上記以外の未知物質の結晶においても、本発明によるEGF/EGFR複合体の構造座標の全部または一部を用いて分子置換法により構造解析する方法は、有意な解が得られる場合においては本発明の範囲に含まれる。
本発明のEGF/EGFR複合体の構造座標を用いた分子置換法において、構造座標としては、「2.EGF/EGFR複合体の構造座標」の項で説明された構造座標を用いることが可能である。また、後述するホモロジーモデリング法によりEGF/EGFR複合体の構造座標を用いて取得した蛋白質または蛋白質複合体の構造座標を用いることも可能である。
本発明の分子置換法により新たに得られた蛋白質または蛋白質複合体の構造座標も本発明の範囲内のものである。
6.EGF/EGFR複合体構造座標を用いたホモロジーモデリング法
本発明は、EGF/EGFR複合体の構造座標を用いてホモロジーモデリング法により未知の構造の蛋白質または蛋白質複合体についての構造座標を取得する方法を提供する。
ホモロジーモデリングとは、構造未知の蛋白質(ターゲット)の構造を、類似の配列をもつ構造既知の蛋白質(テンプレート)をもとに予測する手法をいう。ホモロジーモデリングでは、まず、構造データベースから類似の配列を探し、アラインメントを確定する。次に、アラインメントしたテンプレートの配列から、対応する部分の構造を選び出して予測構造を構築する。
ホモロジーモデリングには、フラグメントに基づく方法と制約条件に基づく方法の2つがある。フラグメントに基づく方法は、構造既知の蛋白質から得られるフラグメントを集めてモデリングするもので、フラグメントの平均構造を利用し、構造が保存していない部分では、ループモデリングなど他の手法を用いる。制約条件に基づく方法は、構造上の特徴を制約条件(α炭素間の距離、主鎖・側鎖の二面角など)で表し、これを満たすようモデリングするというものである。制約条件を評価関数で表し、最小化を行う。使用されるプログラムとしてはRockfeller大学SaliのMODELLERが代表的であるがこれに限定されるものではない。
ホモロジーモデリングは、既知の蛋白質と20%程度、より好ましくは30%以上のホモロジーがないと適用できないという制約があるが、他のアプローチに比べ、大きな蛋白質にも適用することができ、また、データベースの内容を直接的に利用するので、構造データベースが充実すればするほど、予測精度が向上する、という利点がある。テンプレートの選択とアラインメントは、構造予測の精度に大きな影響を及ぼす。
本発明に係るEGF/EGFR複合体構造座標を用いたホモロジーモデリング法は、モデリングをしたい構造未知の蛋白質のアミノ酸配列とモデリングのテンプレートとなる蛋白質のアミノ酸配列を用意する工程;双方のアミノ酸配列のアライメントを行う工程;テンプレート蛋白質の構造情報を鋳型としてターゲット蛋白質を座標化する工程;および得られたモデル構造に理論上の問題がないかを検証する工程のうち一部または全部を含む。
産業応用可能な精度を有するEGF/EGFR複合体構造が明らかとなり、この情報を解析してドラッグデザインすることが可能となれば、非常に有用であるが、EGF/EGFRの複合体結晶構造は、EGFRアゴニストやアンタゴニストのドラッグデザインに有用なだけではない。複合体の結晶構造を利用することで、EGFRとの相同性から、その立体構造フォールドが同じであると推測されるすべてのレセプター、例えばインシュリンレセプター、インシュリン様増殖因子−1レセプター、ErbB2,3,4等のリガンド結合状態におけるレセプターのコンフォメーションを高い精度で立体構造予測することを可能とすることをも意味する。本発明によって、EGF/EGFRの共結晶構造が得られたことで、EGFRはリガンド結合によってダイナミックなコンフォメーション変化をおこしていることが判明し、先行技術を大きく上回って、EGF/EGFR様のフォールドを有する蛋白質の構造予測に有用な情報を得ることが可能となった。例えば、EGFRの構造を用いて、一般的なホモロジーモデリングを実施することによりインシュリンレセプターのインシュリン結合時の活性コンフォメーションを精度高く予測することが可能となるし、インシュリンとの結合部位を特定し、それに相補的な分子を設計することで、低分子のインシュリン様活性を有する低分子化合物を提示することも可能である。経口投与可能なインシュリン様化合物は切望されており、この技術を用いることで、試行錯誤を行って探索するよりもはるかに合理的な情報を提供可能となる。同様に、EGFR様フォールドを有する蛋白質すべてにおいて、その活性コンフォメーションの予測が可能となるため、有用な学術的解析や、医薬品創製(抗がん剤など)を目的とした解析が本発明によって可能となる。
上述したターゲット蛋白質アミノ酸配列とテンプレート蛋白質のアミノ酸配列情報とを比較する段階、ドメインを構成する部分配列を特定する段階、テンプレート蛋白質の構造情報を鋳型としてターゲット蛋白質を座標化する段階、得られたモデル構造に理論上の問題がないかを検証する段階、および相互作用部位を構成しているアミノ酸残基を特定する段階のそれぞれに必要とされる情報やプログラムは、一般に開放されているデータベースあるいは市販化されている各種プログラムを用いて得ることができる。ドメインの特定に必要な公知の蛋白質情報は、Genbank蛋白質データベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、PDBデータベース(H.M.Berman,et.al.,Nucleic Acids Research,Vol.28,pp.235−242(2000),http://www.rcsb.org/pdb/)など、公開データベースから入手可能である。また、アミノ酸配列比較には、BLAST(Altschul SF.,J Mol Evol.,36,pp.290−300(1993);Altschul SF et al.,J.Mol.Biol.,215,pp.403−10(1990))、マルチプルアライメントプログラムClustalW(Thompson JD,Higgins DG,Gibson TJ.,Nucleic Acids Res.,22,pp.4673−4680(1994))、その他入手可能ないずれのプログラムを用いてもよい。ドメイン検索には、モチーフデータベースであるPROSITEデータベース(http://www.expasy.ch/prosite/)、またはPfam(http://www.sanger.ac.uk/Pfam/;E.L.L.Sonnhammer,S.R.Eddy,and R.Durbin.,Proteins.,28,pp.405−420(1997))などが利用可能であり、検索プログラムとしては、隠れマルコフモデルを用いた相同性検索プログラムであるHMMER(R.Durbin,S.Eddy,A.Krogh,G.Mitchison.,Cambridge University Press.,重み行列を用いた膜貫通予測プログラムtmap(Persson B,Argos P.,J Mol Biol.,237,pp.182−92(1994))等が挙げられる。また、蛋白質モデリングプログラムとしては、FAMS(Ogata,K.et.al.,J.Mol.Graph.Model.,Vol.18,pp.258−272(2000))、Modeler(Accelrys Inc.,Sandiego,CA)、Homology(Accelrys Inc.,Sandiego,CA)、蛋白質構造評価プログラムとしては、Profiles−3D(Accelrys Inc.,Sandiego,CA)、グラフィックス表示プログラムとしては、InsightII(Accelrys Inc.,Sandiego,CA)、Sybyl(Tripos,Inc.St.Louis,MO)等を使用することが可能である。これらのデータベースまたはプログラムはその性質上内容が改良され、あるいは将来的に新たなプログラム等が開発されることもあり得るが、本発明の実施に必要な機能を有している限り利用可能であり、上記の例に限定されるものではない。
本発明のEGF/EGFR複合体の構造座標を用いたホモロジーモデリング法において、構造座標としては、「2.EGF/EGFR複合体の構造座標」の項で説明された構造座標を用いることが可能である。また、前述の分子置換法によりEGF/EGFR複合体の構造座標を用いて取得した蛋白質または蛋白質複合体の構造座標を用いることも可能である。
本発明のホモロジーモデリング法により新たに得られた蛋白質または蛋白質複合体の構造座標も本発明の範囲内に含まれる。
以下にEGF/EGFR複合体構造座標を用いたホモロジーモデリングの具体的方法を説明する。ヒトインシュリンレセプター、インシュリン様増殖因子−1レセプター、ErbB2,3,4等のEGFRと同じフォールドを有するレセプターのアミノ酸配列を既存のアミノ酸配列DBから抽出する。この配列を、EGFRとアミノ酸配列で配列アライメントを行う。配列アライメントプログラムまたはマルチプルアライメントプログラムとしてはFASTA,BLAST,Clustalwなどを使用できる。次に、本発明で規定されたEGF/EGFR共結晶構造やその部分構造を鋳型として、既存のパッケージソフトウエア(アクセルリス社Homology,北里大学FAMS等)を用いることによって常法に従い、ホモロジーモデリングを行うことが可能である。初期構造に対してDiscoverやCharm,Amberなどの力場を用いて分子最適化計算を行い、極小化後、リガンド結合時のインシュリンレセプター、インシュリン様増殖因子−1レセプター、ErbB2,3,4等のEGFRと同じフォールドを有するレセプターの極めて精度高いと考えられる予測構造を構築することに成功した。例としてヒトErbB2のモデリング構造を図12に示す。得られた各蛋白質のモデリング構造からリガンドとの結合に重要なアミノ酸残基を決定したので、これを図11に提示する。この構造は、アゴニストやアンタゴニストのファルマコフォア抽出、コンピュータスクリーニング、アゴニストやアンタゴニストの分子設計(活性上昇、選択性付与など)、産業上有用な改変体の設計、中和抗体・アゴニスト抗体の作製、分子置換法による新規結晶構造解析、その他変異体の解析などに有用である。これによって規定されるファルマコフォアによって、医薬品のスクリーニングや、開発に利用できる。
また、スクリーニングでヒットした化合物や、その誘導体の結合モデルを構築することで、得られた化合物の誘導最適化に活用することも可能となる。
7.EGF/EGFR複合体構造座標を用いたエピトープの設計方法と抗体の作製
本発明のEGF/EGFR複合体構造座標を用いることにより、抗体のエピトープの設計が合理的に行える。これにより中和抗体やアゴニスト抗体を合理的に効率よく作製することが可能となる。例えば、本発明の複合体構造を観察した結果、EGFのCys33−Trp49(CVVGYIGERCQYRDLKW:配列番号10)は、ヒトEGF中和抗体を作製する上で非常に有用な配列であるし、EGFRのドメインI領域におけるSer11−Asn32(SNKLTQLGTFEDHFLSLQRMFN:配列番号11)、ドメインII領域におけるPro241−Thr266(PPLMLYNPTTYQMDVNPEGKYSFGAT:配列番号12)またはドメインIII領域におけるLeu345−Leu363(LHILPVAFRGDSFTHTPPL:配列番号13)は中和抗体またはアゴニスト抗体を作製する上で非常に有用であることが明らかとなった。
EGF/EGFR複合体構造座標を用いることを特徴とする、エピトープの設計方法は、以下の工程を含み得る:EGF/EGFR複合体の構造座標をコンピュータに入力する段階;およびEGF/EGFR複合体構造の解析によりエピトープとなり得る部分を特定する段階。さらに、コンピュータ上でEGF/EGFR複合体の3次元構造を視覚的に表示させる段階を含んでもよい。EGF/EGFR複合体構造の解析によりエピトープとなり得る部分を特定する段階は、目視および/またはコンピュータプログラムによる解析により実現され得る。また、当該設計方法を用いた抗EGFR抗体または抗EGF抗体の製造方法は、以下の工程を含み得る:EGF/EGFR複合体構造座標を用いてエピトープを設計する段階;および設計したエピトープを含む抗原を調製する段階;設計したエピトープを認識する抗体を調製する段階。
エピトープを設計するにあたっては、本発明のEGF/EGFR複合体構造座標を、分子の3次元構造をグラフィカルに表示可能なコンピュータプログラムに導入する。EGF/EGFR複合体の3次元構造を視覚的に観察し、または適当なコンピュータプログラムを用いて、エピトープとなりうる部分を特定する。エピトープとなりうる部分としては、分子の表面に露出されている部分、または溶媒(例えば水分子)と接触可能な部分が好ましい。また、複合体形成時には蛋白−蛋白相互作用部位を形成しているが、単量体時には分子の表面に露出されている部分または溶媒(例えば水分子)と接触可能な部分をエピトープとすれば、複合体形成を妨げるような中和抗体を設計することが可能である。一方で、リガンド−受容体結合部位を架橋するような抗体または二量体形成部位を架橋するような抗体は、アゴニスト抗体として機能するものと予想される。さらに、アゴニスト活性や中和活性を有さない抗体を設計するために、EGFとEGFRの結合および二量体化に影響を与えないエピトープを設計することも可能である。
エピトープとなりうる部分を特定した後は、該エピトープのアミノ酸配列を有するペプチドを合成し、該ペプチドを抗原として定法に従い抗体を作製する。あるいは、蛋白質の全部または一部を抗原として抗体を作製したのち、所望のエピトープを認識する抗体を選別することにより取得してもよい。
抗体は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよいが、特異性が高い点でモノクローナル抗体が好ましい。
上記モノクローナル抗体は、抗原で免疫した動物から得られる抗体産生細胞と、ミエローマ細胞との細胞融合によりハイブリドーマを調製し、得られるハイブリドーマから所望のエピトープを特異的に認識する抗体を産生するクローンを選択することにより調製することができる。
動物の免疫に抗原として用いるペプチドとしては、組換えDNA法または化学合成により調製したペプチドが好ましい。モノクローナル抗体の作製は、当分野では周知である。簡単に説明すると、抗原用ペプチドをアジュバントとともに哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウマ、サル、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどの哺乳動物に投与して免疫する。免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔で免疫する。最終免疫後、抗体産生細胞(脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等)を採集する。次に、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させる。抗体産生細胞と融合させるミエローマ(骨髄腫)細胞として、マウス、ラット、ヒトなど種々の動物に由来し、当業者が一般に入手可能な株化細胞を使用する。使用する細胞株としては、薬剤抵抗性を有し、未融合の状態では選択培地(例えばHAT培地)で生存できず、融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが用いられる。ミエローマ細胞は、既に公知の種々の細胞株、例えば、P3(P3x63Ag8.653)、P3x63Ag8U.1等が好適に使用される。
細胞融合は、MEM、DMEM、RPMI−1640培地などの動物細胞培養用培地中で、ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを、混合比1:1〜1:10で融合促進剤の存在下に接触させることによって行われる。細胞融合を促進させるためには、平均分子量1,000〜6,000のポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール等を使用することができる。また、電気刺激を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、選択培地における細胞の選択的増殖を利用する方法等が挙げられる。
すなわち、細胞懸濁液を適切な培地で希釈後、マイクロタイタープレート上にまき、各ウェルに選択培地(HAT培地など)を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。ハイブリドーマのスクリーニングは、限界希釈法、蛍光励起セルソーター法等により行い、最終的にモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを取得する。抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜に選択して、またはこれらを組み合わせることにより精製する。
抗体の評価にあたっては、所望のエピトープを特異的に認識するかどうかに加えて、中和活性またはアゴニスト活性を有するかどうかを生化学的アッセイにより評価することが好ましい。用いる生化学的アッセイに制限はないが、例えば前述の生化学的アッセイ例を用いることが可能である。
本発明のエピトープの設計方法は、EGFおよびEGFRのほか、EGF/EGFR複合体の構造座標を用いたホモロジーモデリング法により構造決定された蛋白質または蛋白質複合体、EGF/EGFR複合体の構造座標を用いた分子置換法により構造決定された蛋白質または蛋白質複合体についても適用できる。また、本発明のエピトープの設計方法を利用して作製された抗体についても本発明の範囲内のものである。
8.ペプチド断片
本発明は、EGFR二量体化部位を形成する領域の全部または一部のアミノ酸残基を含むペプチド(ポリペプチド)またはその塩を提供する。複合体のEGFR同士が結合して二量体を形成する領域(EGFR二量体化部位)は、例えば、EGFRのアミノ酸配列(配列番号1に示すアミノ酸配列)のうち第240番目〜第267番目(配列番号14)からなる領域であり、この領域の全部または一部のアミノ酸残基を含む。
さらに、本発明は、EGFとEGFRとの結合部位を形成する領域の全部または一部のアミノ酸残基を含むペプチドまたはその塩も提供する。
EGFのCys33−Trp49(配列番号10)は、ヒトEGF中和抗体を作製する上で非常に有用な配列であり、EGFRのドメインI領域におけるSer11−Asn32(配列番号11)、ドメインII領域におけるPro241−Thr266(配列番号12)またはドメインIII領域におけるLeu345−Leu363(配列番号13)なども、本発明のペプチドに含まれる。
本発明のペプチドの化学合成を行う場合は、ペプチドの合成の常法手段によって合成することができる。例えば、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、DCC法、活性エステル法、カルボイミダゾール法、酸化還元法等が挙げられる。また、その合成は、固相合成法および液相合成法のいずれをも適用することができる。
すなわち、本発明のペプチドを構成し得るアミノ酸同士を縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とするペプチドが合成される。縮合方法や保護基の脱離としては、公知のいずれの手法を用いてもよい(例えば泉屋信夫他,ペプチド合成の基礎と実験,丸善(1975)等)。反応後は、通常の精製法、例えば溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶などを組み合わせて本発明のペプチドを精製することができる。但し、本発明においては、市販の自動ペプチド合成装置(例えば株式会社島津製作所の多種品同時固相法自動ペプチド合成装置PSSM−8)を使用して合成することもできる。
本発明のペプチドの塩は、生理学的に許容される酸付加塩または塩基性塩が好ましい。酸付加塩としては、例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸などの無機酸との塩、あるいは酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸などの有機酸との塩が挙げられる。塩基性塩としては、例えば、酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化マグネシウムなどの無機塩基との塩、あるいはカフェイン、ピペリジン、トリメチルアミン、リジンなどの有機塩基との塩が挙げられる。塩は、塩酸などの適切な酸、または水酸化ナトリウムなどの適切な塩基を用いて調製することができる。
また、本発明のペプチドは、C末端が通常カルボキシル(−COOH)基またはカルボキシレート(−COO−)であるが、C末端がアミド(−CONH2)またはエステル(−COOR)であってもよい。ここで、エステルにおけるRとしては、炭素数1〜12のアルキル基、炭素数3〜10のシクロアルキル基、炭素6〜12のアリール基、炭素数7〜12のアラルキル基などが挙げられる。
さらに、本発明のペプチドには、N末端のアラニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合した糖ペプチドなどの複合ペプチド等も含まれる。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
〔実施例1〕EGFおよびEGFRの発現
(1)EGFRの発現
以下のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて、標準的PCRプロトコルにより発現プラスミドpcDNA−sEGFR(配列番号1のアミノ酸1−619)を作製した。
フォワードプライマー(制限酵素切断部位およびATG開始コドンを含む)
リバースプライマー(トロンビン切断部位、FLAGエピトープ、TAGストップコドン、制限酵素部位を含む)
PCRは、鋳型として全長ヒトEGFRをコードするDNAを含有するpcDNA−EGFRとPwoDNAポリメラーゼ(Roche社)を用い、(94℃で30秒、55℃で15秒、75℃で1分)×25サイクルの反応を行った。
増幅させたDNAを哺乳動物発現プラスミドpcDNA3.1/Zeo(+)(Invitrogen)にクローニングし、pcDNA−sEGFRを作製した。キット(Gibco−BRL)の説明書に従ってリポフェクトアミン法によりベクタープラスミドをLec8細胞(ATCC CRL−1737)にトランスフェクトした。なお、Lec8細胞は、末端シアル酸およびガラクトース残基欠損型N−結合オリゴ糖を有する蛋白質を産生する細胞である。0.1mg/mlの濃度のゼオシン(Invitrogen)で安定なトランスフェクタントを選別し、独立したコロニーを単離した。そして、抗FLAG M2抗体(Sigma)を用いて得られた細胞がEGFRを発現することを確認した。
(2)EGFRの精製
10%ウシ血清(Gibco−BRL)、100units/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシンおよび20mg/lプロリンを添加したダルベッコ改変イーグル培地/Ham′s F−12培地(1:1)(DMEM/F12)を用いてLec8トランスフェクタントを維持した(37℃、5%CO2インキュベーター)。EGFRを大量生産するために、1%ウシ血清、100units/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシンおよび20mg/lプロリンを添加したDMEM/F12中にLec8トランスフェクタントをまき、さらに3〜4日増殖させた。その後、培養上清を回収して1500rpmで15分遠心した。残りのフラスコから細胞を掻きとって回収し、別のフラスコに移して拡大培養を行った。全体のプロセスは、細胞を3箇月維持する間繰り返した。培養上清を回収し、EDTAおよびPMSFをそれぞれ終濃度0.4mMになるように加え、4℃で硫酸アンモニウム沈殿により血清グロブリンを除いたのち(培地1000mLあたり硫酸アンモニウム280g添加)、更に培地1000mLあたり硫酸アンモニウム280gを添加することでEGFRを沈殿させた。ペレットを0.02Mリン酸バッファー(pH7.1)(バッファーA)中に溶解して透析した。得られたEGFR含有サンプルは、−80℃で保存し、次のステップは4℃で行った。次に、DEAE−Toyopearl650S(東ソー)、CM−Toyopearl650S(東ソー)およびAffi−Gel Blue Gel(Bio−Rad)を直列に連結し、バッファーAで平衡化したカラムにサンプルをロードした。切り離したAffi−Gel Blueカラムから、バッファーA中の0.02−0.6M NaCl直線グラジエントにより蛋白質を溶出させた。溶出物を、0.15M NaCl添加のバッファーAで平衡化した抗FLAG M2アフィニティーゲル(Sigma)カラムに一晩循環させることにより通した。カラムに結合した蛋白質を0.1Mグリシン−HClバッファー(pH3.5)で回収し、すぐに中和した。得られたサンプルをUK−10メンブレン(東ソー)で濃縮し、0.02M Tris−HCl(pH8.0)および0.02M NaCl(バッファーB)で透析した後、バッファーBで平衡化したMono−Qカラム(Pharmacia)にロードした。蛋白質は、バッファーB中0.02−0.2M NaClの直線グラジエントで溶出した。得られたEGFRは、Centricon−10(Amicon)で濃縮し、以下のようにして酵素的に脱グリコシル化した。0.1M酢酸ナトリウムバッファー(pH5.3)中の0.4unit/mlのエンドグリコシダーゼD(生化学工業)および1unit/mlのエンドグリコシダーゼH(Roche)を用いて、280nmでの消光係数(0.65)で決定した2mg/ml EGFRをインキュベートした(窒素またはアルゴンガス雰囲気中、37℃で50時間)。反応混合物をバッファーBで10倍に希釈した後、脱グリコシル化EGFR(dEGFR)を、Mono−Qカラムにより精製した(前記Mono−Qカラムの操作と同様に行った)。
メチオニンの代わりにセレノメチオニンを有するEGFRを発現させるため、50mlのメチオニンの代わりの新鮮なセレノメチオニン、1%透析済仔ウシ血清、100units/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシンおよび40mg/lプロリンを含有するDMEM/F12(SeMet培地)を調製した。セレノメチオニン化EGFRを産生させるため、上述と同様に細胞を集密的濃度になるまで増殖させ、続いて培地をSeMet培地に交換した。12〜24時間のプレインキュベーション後、細胞を新鮮なSeMet培地中で2〜3日間培養し、その後培地を回収した。上述した天然dEGFRの精製と同じ方法でセレノメチオニン化dEGFRを精製した。
(3)結果
EGFRの細胞外ドメインは、既に、A431癌細胞系、EGFRを発現する組換え昆虫細胞系、またはEGFRを発現する組換えチャイニーズハムスター卵巣細胞から調整培地で精製されている。結晶化のために、本発明者は、組換えLec8細胞から産生されたEGFRの細胞外ドメインを単離するための精製方法を開発した。
まず、硫酸アンモニウム分画により血清蛋白質等の混入物質の大部分を取り除いた。次に、FLAGタグのアフィニティークロマトグラフィーにより残りの混入物質を取り除き、アニオン交換クロマトグラフィーによりサンプルの不均質性を低減させた。脱グリコシル化していない精製蛋白質を用いて小さな結晶を成長させたが、X線回折像は得られなかった。さらに分子表面の非均質性を低減させるために、精製蛋白質を、エンドグリコシダーゼHおよびDを用いて強力に脱グリコシル化し、続いてアニオン交換クロマトグラフィーを行って酵素と消化されたグリカンを除去した。その結果、脱グリコシル化蛋白質は、SDS−PAGEで判断したところ、予想通り約74kDaのサイズにシフトした(図6)。FLAGタグはトロンビンを用いて消化することができないため、FLAGタグを付したdEGFRを結晶化および他の実験に使用した。dEGFRの収量は、回収した培地3.51あたり約1mgであった。
〔実施例2〕EGF/EGFR複合体の二量体の結晶化
(1)結晶化
結晶化用のdEGFR−EGF複合体を以下の通り調製した。精製dEGFR溶液を、Centricon−10を使用して、280nmにおける吸光係数(0.79)を用いて測定した濃度が10mg/mlとなるまで濃縮した。等モル量の組換えhEGF(Pepro−Tech)を逆相HPLCで精製し、凍結乾燥し、dEGFR溶液に溶解した。結晶化は、ハンギングドロップ蒸気拡散法を用いて、3μlの11mg/ml複合体および3μlのリザーバ緩衝液(15% PEG4000、1% PEG6000、0.075M Tris−HCl(pH8.4)、0.075M酢酸ナトリウム、および0.2M塩化ナトリウム)で開始して、3週間かけて20℃で成長させた。マクロシーディング法を利用することで、結晶を1×0.2×0.2mmまたはそれ以上に再現良く成長させた。本発明者は、XAFSスペクトル測定および回折データセットの収集を大型放射光施設SPring−8のBL41XUで行った。なお、測定は、抗凍結剤(18% PEG4000、1.2% PEG6000、0.09M Tris−HCl(pH8.4)、0.09M酢酸ナトリウム、0.24M塩化ナトリウム、16%トレハロースおよび11% PEG400)存在下、100Kで行った。
(2)化学的架橋実験
野生型EGFRと同様に、EGF誘導型dEGFR二量体化に関して試験するため、本発明者は化学的架橋により分析を行った(図6)。
0.8mg/ml dEGFRを、0.05M Hepes−NaOH(pH7.5)に溶解した0.07mg/ml hEGFおよび1mMビス(スルホスクシンイミジル)基質(BS3,Pierce Chemical)架橋剤と共にインキュベートした。反応混合物を60分間放置した後、0.01mMグリシンを用いて架橋反応をクエンチした。架橋生成物をSDS−PAGEで分析した。
その結果、EGFの存在下において、単一の高分子量種(二量体サイズ150kDに相当する)が形成された。EGFの不在下では、上記のような高分子量種は検出されなかった。この結果は、dEGFRがEGFに応答して二量体を形成したことを示している。
(3)結果(ネイティブ結晶の結晶化およびデータ収集)
結晶化条件をスクリーニングするためにスパースマトリクス法を適用した。ハンギングドロップ蒸気拡散法により、11mg/mlの等モル量のhEGFと複合体化させた受容体を用いて20℃にてCrystal Screen Kit IおよびII(Hampton Research社)を使用した。その結果、最も有望な条件(Screen Kit IのNo.22)を、回折能を有する結晶を成長させるための条件として改善した。結晶化条件の精密化の結果、この結晶は通常は約4週間で最終的なサイズに成長した(図7)。結晶は、1°という高いモザイク度で約3.5Åまで回折した。結晶の質を改善するため、結晶を抗凍結剤に浸漬し、段階的に0℃まで冷却して氷上で静置したところ、モザイク度が約0.5°まで低減した。ネイティブ結晶は、溶媒含量が75%であり、a=b=220.2Åおよびc=113.1Åで空間群P3l21に属するものである。
〔実施例3〕EGF/EGFR複合体の二量体の構造解析
(1)方法
天然およびセレノメチオニン化結晶は、それぞれa=b=220.2Åおよびc=113.1Åならびにa=b=221.2Åおよびc=114.2Åで空間群P3l21に属するものである。非対称単位には、75%の溶媒含量で1つの2:2複合体を含有する。結晶を、回収用緩衝液(リザーバ緩衝液の1.2倍の濃度)から、回収用緩衝液に16%トレハロースおよび11%PEG400を添加した抗凍結剤に移す際には注意深く段階的に移し替えた。液体窒素による凍結保存の前に、結晶を徐々に4℃に冷却し、2日間氷上に静置した。この処理によって結晶のモザイク度が減少した。回折データセットは、凍結保存結晶からSPring−8を用いてビームラインBL41XUで100Kにて収集した。データ処理にはプログラムHKLを使用した。
尺度補正を行ったピーク波長におけるセレノメチオニン化結晶のデータセットを用いて、プログラムDREARで正規化構造因子を計算し、プログラムSnBをセレニウム原子の位置決定に使用した。これにより、非対称単位において予測される20個の原子のうち13個の一致するピークを選択した。重原子位置の精密化および初期位相の計算にはプログラムMLPHAREを使用し、溶媒平滑化にはプログラムRESOLVEを使用した。さらに、プログラムDMによって非結晶学的な平均化およびさらなる溶媒平滑化を行った。本発明者はこの時点で、4.0Å分解能で得られた電子密度を用いて主鎖をトレースした。モデル構築にはプログラム0を使用した。続いて、3.5Åまで位相拡張を行い、MAD法で決定したモデルを探索モデルとしてプログラムAMOREを用いた分子置換解析法を行い、3.5Åまでのデータを用いて、ネイティブ結晶構造を決定した。当該構造を表1に示す。さらに、3.3Åまでのデータを用いることで、3.3Åの分解能でもネイティブ結晶構造を決定した。当該構造を表2に示す。上記モデルは、電子密度から構築し、プログラムCNS(http://www.scl.kyoto−u.ac.jp/scl/appli/appli_manual/cns_manual/main/text.html)を用いて、剛体精密化、エネルギー最小化、制限付き温度因子精密化、およびシミュレーテッドアニーリング法による構造精密化を行った。さらにプログラムSIGMAAおよびプログラムRESOLVEを用いて、モデルバイアスが少なくなるように電子密度の修正を行った。電子密度図の質は、反復的なモデル構築およびデンシティーモディフィケーションによって改善された。最終的な構造精密化の後に、プログラムPROCHECKによるラマチャンドランプロット解析では、表1に示される結晶構造における95.9%、表2に示される結晶構造における95.5%の残基が、最も好ましい領域とそれに加えて許容される領域に存在することを示した。プログラムSIGMAAおよびPROCHECKは、CCP4(http://bio.nagaokaut.ac.jp/〜sakamoto/ccp4)によりサポートされている。
表1に示される結晶構造においては、二量体における一方の受容体分子のアミノ酸残基1−2および513〜C末端、ならびにもう一方の受容体分子のアミノ酸残基1−4および513〜C末端は不規則であり、この領域は電子密度図ではほとんど特定されなかった。両方のリガンド分子における残基1−4および50−53の電子密度は分散している。表1の結晶構造は、1108個のアミノ酸と11個の炭化水素残基を含有する。表2に示される結晶構造においては、二量体における一方の受容体分子のアミノ酸残基1、158−162、169−170、179−180、302−308および513〜C末端、ならびにもう一方の受容体分子のアミノ酸残基1−2、158−160、179、305−309および513〜C末端は不規則であった。両方のリガンド分子における残基1−4および50−53の電子密度は分散している。表2の結晶構造は、996個のアミノ酸、10個の炭化水素残基および79個の水分子を含有する。
(2)結果(セレノメチオニン化dEGFR)
浸漬法によるネイティブ結晶から重原子誘導体のスクリーニングおよび、メチオニンの代わりにセレノメチオニンを有するdEGFRの発現、精製、結晶化の双方を検討した。本発明者は、浸漬法により可能性のある重原子誘導体は同定できなかったが、セレノメチオニン化結晶をネイティブ結晶と同じ方法で得た。セレノメチオニン化結晶は、溶媒含量が75%で、a=b=221.2Åおよびc=114.2Åで空間群P3l21に属するものであり、4.0Åまで回折した。
〔実施例4〕EGF/EGFR複合体構造座標を用いたホモロジーモデリング
(1)モデル構造の作成
SWISS−PROTに登録されているErbB2(EBR2 HUMAN)のアミノ配列情報を元に、全自動モデリングシステムFAMS(Ogata,K.et.al.,J.Mol.Graph.Model.,Vol.18,pp.258−272(2000))を用いて、ErbB2のモデル構造を構造座標として構築した。このとき、FAMSが主鎖構造の構築に用いる立体構造座標として、EGF/EGFR複合体結晶構造解析によって得られた構造座標を使用した。また、側鎖構造の構築に用いるデータベースは、FAMSオリジナルのものを使用した。この結果、配列番号5に示すアミノ酸配列の24〜541番目のアミノ酸残基部分の構造座標を得た。
モデル構造の構造座標を決定した後、さらに分子設計支援ソフトウエアパッケージInsightII(Accelrys Inc.,Sandiego,CA)のモジュールであるProfiles−3D等の蛋白質立体構造評価プログラムを用いて、構築された座標に理論上の問題がないことを検証した。このモデル構造を図12に示す。
ErbB3(配列番号6)、ErbB4(配列番号7)、インシュリン様増殖因子−1受容体(配列番号3)、インシュリン受容体(配列番号4)についても同様の手法でモデリングを行い、モデル構造を得た。
(2)リガンド結合部位の予測
モデリング構造とEGFR立体構造を、構造保存領域(SCR:Structure conserved region)でスーパーインポーズし、初期構造構築に使用したアライメント表と対比しながら、EGFRにおけるEGFと相互作用するアミノ酸と、立体的座標としてほぼ同じ位置に存在するモデリング構造中のアミノ酸残基を抽出した。これを、相互作用するアミノ酸残基とした。結果を図11に示す。
〔実施例5〕ファルマコフォアの作成
複合体情報から抽出したアミノ酸残基の情報を利用すれば、ファルマコフォアの1例は次のように規定できる。ファルマコフォア形成に特に有用であると考えられる相互作用として以下の相互作用を例示する(表4)。
この相互作用部位は、極めて隣接している上に、3点の相互作用部位を有し、しかも、ドメインIとドメインIIIの両ドメインと相互作用可能な部位である。従って、EGFRアンタゴニストを探索できるだけでなく、アゴニストをも探索可能なファルマコフォアとして規定できる可能性が高い。具体的なファルマコフォアの例としては、Arg45、Asp46、Leu47のトリペプタイドが、EGFR結合時に取っている活性コンフォメーションによって規定される。
次に、EGFの構造をCatalystなどの市販のバーチャルスクリーニング用のソフトパッケージに読み込み、相互作用している原子もしくは官能基を、Catalystのファンクションマッピング機能を用いて、以下の表5に示すような、適切な特性球に変換しファルマコフォアを発生させた。
当該ファルマコフォアは、以下の3つの特性球の座標により規定される。
特性球1;X座標−5.623、Y座標6.259、Z座標0.853に中心を有する半径1.5Åの陰イオン性領域、
特性球2;X座標−12.656、Y座標3.363、Z座標−2.934に中心を有する半径1.5Åの疎水性領域、
特性球3;X座標−11.576、Y座標9.546、Z座標−2.135に中心を有する半径1.5Åの水素結合供与体領域R(ルート)を開始点とし、X座標−13.86、Y座標8.532、Z座標−3.792に中心を有する半径2.0Åの水素結合供与体領域T(ターミナル)を終点とするベクトルにより定義される水素結合供与体領域。
当該ファルマコフォアを図13に示す。
〔実施例6〕EGF/EGFR複合体の構造座標・ファルマコフォアを用いたスクリーニング方法
(1)DOCKを利用したvirtual screening
(1−1)検索サイトの特定
EGF/EGFR共結晶構造解析結果から得られた表1の構造座標を、ソフトウエアInsightII(Accelrys社)を用いて三次元構造を視覚的に表示させた。EGF(リガンド)、EGFR(受容体)のconolly surface図を図14に示す。
図14を観察した結果、EGF上で凸状に突出している残基のうち、図中丸印で示す残基は、EGFR上のポケットに対応していることが分かった。この部分は、有力なリガンド結合サイト候補と考えられる。
そこで、上記情報を元に、EGFR上の3つの部位(サイト1,サイト2,サイト3)をリガンド結合サイトと仮定し、各サイトと相互作用すると考えられるEGFアミノ酸残基上の主要な原子位置にDOCK SPHEREを設定した。ドッキングスタディに用いたサイトを表6に示す。
(1−2)化合物データベースの構築
検索対象となる化合物データベースは、ACD(Available Chemicals Directory;MDL Information Systems,Inc.)に登録されている化合物情報を用いた。まず、ACD化合物情報をsdファイル形式でexportし、塩の除去、CORINA(Molecular Networks GmbH)による化合物構造の3次元化、DOCK付属のアクセサリーによるmol2ファイルへの変換および電荷割付け等の処理を施し、DOCK用化合物データベースを作成した(170,855化合物)。更に、上記手法により構築した化合物データベースを酸性官能基を含む化合物群(acd_a:19,270化合物)と含まない化合物群(acd_b:151,585化合物)に分割し、それぞれ独立に解析を実施することにした。 (注:DOCKはしばしば、酸性官能基のスコアリングを不当に高く見積もる傾向があるため、今回の検討では上記のような処理を行い、独立して解析を行った。)
(1−3)ドッキングスタディ実施
各サイトに関して、(1−2)で作成した化合物データベースに対しDOCK4.0.1を実行した。ドッキングはリガンド配座を計算時に発生させる方式(flexible docking)で行った。
得られた結果をドッキングスコア(リガンド−蛋白の結合エネルギーを評価するための関数、ドッキングスコアが低いほど蛋白質と良くフィットしている)の低い順にソートし、上位5000化合物を抽出した。このうち、重要残基に近接した立体配座を有する化合物を自作スクリプト(EGFRの重要残基−リガンド間の距離を計算するスクリプト)により抽出の後(表7中▲1▼)、目視によって、各重要残基と適切な相互作用が起こり得る立体配座を有する化合物を選出した(表7中▲2▼)。更に、医薬品として相応しくない構造を有する化合物や、活性測定時に擬陽性を示す可能性が高い化合物(色素類など)を除去し、最終的なヒット化合物を得た(表7中▲3▼)(a)はacd_a、(b)はacd_bを意味する。
(1−4)ドッキングスタディヒット化合物のクラスター解析
(1−3)により選出したヒット化合物には、互いに構造(骨格)が類似している化合物群が含まれている。これらの化合物群は、互いにドッキングスコアやドッキングモードまで類似している可能性が高く、単純にドッキングスコアの上位順からアッセイ候補化合物を選択すると、構造多様性に乏しいセットとなる恐れが高い。
構造多様性が乏しいと、安全性・ADME(吸収・分布・代謝・排泄)プロファイルまで類似してしまう可能性が高いが、現状の技術では安全性・ADMEプロファイルのin silico予測は困難であり、このようなセットをアッセイ候補化合物とした場合、医薬品開発時にしばしば発生する、予期せぬ副作用によるドロップアウトのリスクに対応できない可能性が高い。
そこで、(1−3)のヒット化合物それぞれに対して、構造類似性に着目したクラスター解析を実施し、幾つかの構造類似グループに分類することで、構造多様性を確保することが可能となる(下表8,9参照)。生化学的アッセイには各グループの代表化合物を1化合物選出して供すればよい。
なお、各ヒットにおける、最適分割グループ数の決定には、optclus(Barnard Chemical Information Ltd.)を用い、クラスター解析にはDaylight Clustering Package(Daylight Inc.)を用いた。
(2)DOCK、AUTODOCKを利用したvirtual screening
(2−1)低分子化合物ライブラリ
低分子化合物データベースACDから、1エントリ複数分子を含むものは1分子ごとに分割した上で重複を除いたライブラリを作成した(計307481分子)。次いで、「Lipinski’s Rule of 5」に基づいた絞込みを行った。ここで用いた絞込み条件は以下のとおりである。
1)分子量 100以上、500以下
2)計算LOGP値(o/w)(XLOGP−1アルゴリズム使用)5以下
3)アクセプター原子数(化合物中に含まれるNの数とOの数) 10以下
4)ドナー原子数(化合物中に含まれるNHの数とOHの数)5以下
更にドッキング計算を適切に行うために以下のような分子を除外した。
1)回転可能な単結合数が21以上のもの
2)ラジカルを含むもの
3)H,C,N,O,F,S,P,Cl,Br,I以外の元素を含むもの
この絞込み操作の結果、222096分子からなる低分子化合物セットを得た。
(2−2)結合部位予測
(2−2−1)ドメイン定義
EGFRのチェーンAを3つのドメイン(ドメインI:Glu2□Lys165、ドメインII:Cys166□Val312、ドメインIII:Cys313□Val512)に分割した。ドメインIおよびIIIにはEGFとEGFRとの相互作用面が、ドメインIIにはEGFRを2量体化するための相互作用面が含まれる。
(2−2−2)サイト定義
EGFとEGFRは3つのサイトで分子間相互作用を形成している。EGFRのLeu14、Gln16、Gly18、Tyr45、Leu69、Glu90、Leu98とEGFのMet21、Ile23、Leu26、Lys28、Cys31、Asn32、Cys33によって形成される相互作用面をサイト1、EGFRのVal350、Asp355、Phe357、EGFのTyr13、Leu15、Arg41によって形成される相互作用面をサイト2、EGFRのLeu382、Gln384、Phe412、Ile438、EGFのGln43、Arg45、Leu47によって形成される相互作用面をサイト3と定義する。サイト1はドメインIに、サイト2および3はドメインIIIに含まれる。ここでは、それぞれのサイトについてその分子間相互作用を阻害する低分子化合物をin silicoスクリーニングにより探索する。
(2−2−3)結合部位予測
ドッキングプログラムスイートDockに含まれるプログラムSphgenを用いて、上記3つのサイトそれぞれについて結合部位予測を行った。
Sphgenは、分子表面にその幾何学的形状に応じた半径を持つ球体(スフィア)を生成する。複数の重なり合うスフィアは1つのクラスタにまとめられ、最終的には相互に独立した複数のクラスタが生成される。これらクラスタによって占められる領域が予測された結合部位となる。この計算はSphgenのデフォルトの設定値を用いて行った。
サイト1については、このサイト近傍のクラスタのうち、EGFRのLeu14、Tyr45、Leu69、Leu98およびEGFのMet21、Ile23、Leu26から構成される疎水性環境、ならびにEGFR側残基Glu90とEGF側残基Lys28を繋ぐソルトブリッジに近接するものを選択した。このクラスタに含まれるスフィアのうち、疎水性ポケットおよびその周辺部に配置されたもの以外を削除するような整形を行ったものをサイト1の予測結合部位として選択した。
サイト2については近傍のクラスタに含まれるスフィアのうち、分子間相互作用を形成しているEGFRのVal350、Asp355、Phe357、EGFのTyr13、Leu15、Arg41からスフィアの中心までの距離が4Å以内にあるものを選択した。
サイト3についても同様に、近傍のクラスタに含まれるスフィアのうち、分子間相互作用を形成しているEGFRのGln384、Phe412、Ile438、EGFのGln43、Arg45、Leu47からスフィアの中心までの距離が4.4Å以内にあるものを選択した。
(2−3)ドッキングシミュレーション条件
ソフトウェアDock4.0を用いて、(2−2)で定義した結合部位それぞれに対して、(2−1)で作成したライブラリに含まれる222096分子の低分子化合物すべてについてドッキングシミュレーションを行った(1次スクリーニング)。計算精度を高めるため、Dock設定パラメータのうち、以下のパラメータをデフォルト値から変更した。
configurations_per_cycle=30(デフォルト25)
maximum_orientations=1000(デフォルト500)
サイト1については上位10347分子、サイト2については上位16929分子、サイト3については上位10500分子について、AutoDock3.0.5を用いてより詳細なドッキングを行った(2次スクリーニング)。ここでも、計算精度を高めるため、以下のパラメータを変更した。
ga_num_evals=1500000(デフォルト250000)
(2−4)ドッキングシミュレーション結果
AutoDockによる2次スクリーニングの結果得られた低分子化合物のドッキング構造について、サイト1についてはEGFのIle23、Leu26、Lys28、サイト2についてはEGFのTyr13、Leu15、Arg41、サイト3についてはEGFのGln43、Arg45、Leu47、およびそれぞれのサイトにおいて1次スクリーニングで用いたスフィアの中心からの距離を計算した。最短距離が4Å以上離れている化合物は、注目している結合サイトからはずれた位置に結合することが予想されるため除外した。次いで、低分子化合物を、AutoDockのスコアの順にソートし、サイト1については上位2500分子、サイト2については上位808分子、サイト3については上位879分子を蛋白質と結合するリガンド候補化合物とした。次いで、これらの化合物を、蛋白質との相互作用様式に基づいて分類した。ここでは、蛋白質と化合物の重原子(水素以外の原子)間の距離を計算し、化合物と4Å以内で接している残基のうち、静電相互作用している残基を「重要相互作用残基」、それ以外の残基を「相互作用残基」とし、蛋白質の1次配列上で、「相互作用残基」および「重要相互作用残基」の出現パターンが類似している化合物を1つのクラスタに分類した。EGFと相互作用しているEGFRの残基と相互作用する化合物の方が阻害活性が高いと期待される。従って、サイト1についてはクラスタ2(319化合物)、サイト2についてはクラスタ2(188化合物)、サイト3については、クラスタ5、6、12を除くクラスタ(871化合物)に含まれる化合物は阻害活性が高いと考えられた。
(2−5)ドッキングスタディヒット化合物のクラスター解析
(1−4)に準じた方法によって、(2−4)におけるヒット化合物に対してクラスター解析を行った。結果を表10に示す。
(3)Catalystを利用したvirtual screening
(3−1)検索サイトの特定(Catalyst Hypothesisの作成)
共結晶構造解析結果から得られた表1の構造座標を、ソフトウエアInsightII(Accelrys社)を用いて三次元構造を視覚的に表示させ、EGF/EGFR相互作用部位を目視により観察した結果から、重要と考えられる薬理作用団パターンを、リガンドであるEGFから抽出した。以下に抽出し、検索に利用した薬理作用団仮説を示す。なお、形状を考慮に入れたCatalyst仮説は最低3点の薬理作用団が要求されるため、「疎水性ポケットに配置し、かつ、もう2点以上の相互作用部位を有する」薬理作用団パターンから仮説を作成した。特性球の設定は、抽出した部分構造をCatalystなどの市販のバーチャルスクリーニング用のソフトパッケージに読み込み、相互作用している原子もしくは官能基を、Catalystのファンクションマッピング機能を用いて、適切な特性球に変換しファルマコフォアを発生させた。さらに、抽出した薬理作用団抽出に利用したEGFの部分構造を、対応する薬理作用団にフィットさせ、Catalystの「Convert Molecule to Shape」機能によってこのEGF部分構造を分子形状仮説(Shape)に変換し、この仮説を元の薬理作用団と結合することによって、3次元分子形状の類似性が加味された薬理作用団仮説を構築した。
なお、分子形状の発生は、デフォルトの方法で実施した。また、残基同士が一次構造上大きく離れている場合(Leu15とArg41など)は、それぞれの残基の最も近い部分で擬似的に結合を発生させた後に形状構築を行った。
(a)Leu26,Asp27,Lys28(site1)
特性球1(Leu26側鎖);X座標−5.669、Y座標−1.630、Z座標−1.200に中心を有する半径1.5Åの疎水性領域、
特性球2(Asp27側鎖のカルボキシル基);X座標−4.547、Y座標6.304、Z座標4.060に中心を有する半径1.5Åの陰イオン性領域、
特性球3(Lys28側鎖のアミノ基);X座標−0.842、Y座標2.938、Z座標0.169に中心を有する半径1.5Åの陽イオン性領域。
(b)Ile38,Gly39,Glu40,Arg41(site2)
特性球1(Arg41側鎖のグアニジル基);X座標4.527、Y座標6.119、Z座標−0.725に中心を有する半径1.5Åの陽イオン性領域、
特性球2(Glu40側鎖のカルボキシル基);X座標0.459、Y座標−1.861、Z座標1.410に中心を有する半径1.5Åの陰イオン性領域、
特性球3(Gly39主鎖のNH基);X座標−6.534、Y座標3.496、Z座標−0.247に中心を有する半径1.5Åの水素結合供与体領域R(ルート)を開始点とし、X座標−8.045、Y座標1.617、Z座標1.538に中心を有する半径1.7Åの水素結合供与体領域T(ターミナル)を終点とするベクトルにより定義される水素結合供与体領域、
特性球4(Ile38側鎖);X座標−11.024、Y座標2.667、Z座標0.128に中心を有する半径1.5Åの疎水性領域。
(c)Leu15,Arg41,Tyr44(site2)
特性球1(Tyr44側鎖);X座標−5.416、Y座標7.542、Z座標−2.184に中心を有する半径1.5Åの芳香族性領域R(ルート)を開始点とし、X座標−8.185、Y座標6.587、Z座標−2.827に中心を有する半径1.5Åの芳香族性領域T(ターミナル)を終点とするベクトルにより定義される芳香族性領域、
特性球2(Arg41側鎖のグアニジル基);X座標−16.119、Y座標9.326、Z座標−0.341に中心を有する半径1.5Åの陽イオン性領域、
特性球3(Leu15側鎖);X座標−14.846、Y座標5.806、Z座標−1.676に中心を有する半径1.5Åの疎水性領域。
(d)Tyr44,Arg45,Leu47(site3)
特性球1(Tyr44側鎖);X座標6.595、Y座標−0.996、Z座標−1.663に中心を有する半径1.5Åの芳香族性領域R(ルート)を開始点とし、X座標7.625、Y座標1.482、Z座標−0.322に中心を有する半径1.5Åの芳香族性領域T(ターミナル)を終点とするベクトルにより定義される芳香族性領域、
特性球2(Arg45主鎖のNH);X座標1.858、Y座標1.046、Z座標1.370に中心を有する半径1.5Åの水素結合供与体領域R(ルート)を開始点とし、X座標2.051、Y座標2.626、Z座標−1.172に中心を有する半径1.7Åの水素結合供与体領域T(ターミナル)を終点とするベクトルにより定義される水素結合供与体領域、
特性球3(Leu47側鎖);X座標−1.936、Y座標0.021、Z座標−3.278に中心を有する半径1.5Åの疎水性領域。
ここで、ルートはベクトルの開始点と、ターミナルはベクトルの終点とそれぞれ定義される。芳香属性領域における環の平面は、RからTへのベクトルを垂線としてもつ平面として定義される。(a)〜(d)に示される特性球の配置をグラフィクス化したものを、それぞれ図15〜図18に示す。
(3−2)化合物データベースの構築
検索対象となる化合物データベースは、ACD(Available Chemicals Directory;MDL Information Systems,Inc.)に登録されている化合物情報を用いた。まず、ACD化合物情報をsdファイル形式でexportし、専用のデータベース形式に変換する(catDBモジュール,Accelrys Inc.)ことにより、Catalyst用データベース(231,777化合物)の構築を行った。
(3−3)Catalyst実行
(3−2)で構築した化合物データベースに対し、(3−1)で示した4個(a〜d)のファルマコフォア(薬理作用団)および実施例5で作成したファルマコフォア(eと呼ぶ)に合致する化合物を、Catalyst4.6(Accelrys Inc.)を用いて検索した(表11中▲1▼)。検索の結果、それぞれの薬理作用団に含まれる全ての仮説球にマッチする化合物が選出された。更に、医薬品として相応しくない構造を有する化合物や、活性測定時に擬陽性を示す可能性が高い化合物(色素類など)を除去し、最終的なヒット化合物を得た(表11中▲2▼)
〔実施例7〕EGF/EGFR結合阻害アッセイ
(1)Europiumラベルリガンドの作製
EGF/EGFRの複合体結晶構造を解析したところ、リガンド(EGF)のN末端部位であるAsnがEGFRとの直接的相互作用には大きく関与していないと判断されたため、N末端をユーロピウム(Europium)キレート化合物(DELFIA Eu−N1,PerkinElmer life sciences)で化学修飾する事とした。ユーロピウム標識EGFは、PerkinElmer life sciencesに合成委託し、50mmol/L Tris−HCl bufferd saline(pH7.8)に48μmol/Lの濃度で溶解したユーロピウム標識EGF(以下、Eu−EGFと表記)を1.5mg得た。
(2)A431細胞を用いたEGF結合試験および抗体による結合阻害
A431細胞(ヒト扁平上皮癌細胞,ATCCより購入)は、DMEM(Sigma)に非働化FBS(JRH)、Penicillin−streptmycin(GIBCO)およびAmphotelicinB(Sigma)をそれぞれ最終濃度10vol%、50U/mL−50μg/mL、1μg/mLとなるように添加した培地(以下培地と表記)を用いて継代培養したものを使用した。培地に懸濁したA431細胞を10,000cells/100μL/wellとなるように96穴マイクロタイタープレート(黒色、COSTAR)に播種した後、これをCO2インキュベーター(37℃,5%CO2)で一晩前培養した。ウェル内の培地を完全に除去した後、138mmol/L NaCl、5mmol/L KCl、1.2mmol/L MgSO4、1.2mmol/L CaCl2、75μmol/L EDTAおよび0.2vol%BSAを含む50mmol/L HEPES−HCl(pH7.8、以下Bufferと表記)で1回洗浄し、Bufferを49μL/wellで添加した。次いでDMSOを1μL/wellで添加し、Bufferにて各種濃度に希釈したEu−EGFを50μL/wellで添加した。室温で1時間インキュベートし、氷冷したBufferを用いて200μL/wellで5回洗浄し、DELFIA増強試薬(PerkinElmer life sciences)を100μL/wellで添加した。室温でさらに30分間インキュベートした後、プレートリーダー(ARVO−sx,PerkinElmer life sciences)を用いて時間分解蛍光を測定した。励起波長および測定波長はそれぞれ340nm、615nmを使用した。
実験の結果、Eu−EGFの濃度依存的に蛍光の増加が認められ、最終濃度30nmol/L以上においてほぼ結合の飽和が認められた(図19)。なお、非特異結合はEu−EGFの添加前に非標識EGFを最終濃度50μmol/Lとなるよう加えたウェルにおける蛍光値で示され、特異結合は各リガンド濃度において測定値から非特異結合の測定値を差し引く事により算出した。なお、遊離リガンド濃度および特異結合の値をもとにScatchard plotを作成したところ、近似直線の傾きからKd=2.2nmol/Lと算出された。また上記試験系において各種濃度に調製した抗EGFRモノクローナル抗体(Ab−3,Oncogene)を添加し、Eu−EGFを最終濃度10nmol/Lとなるように添加したところ、抗体濃度依存的に蛍光が減少し、抗体によるEGF結合阻害が確認された(図20)。以上の結果から、本アッセイ系を用いてEGF/EGFR結合阻害物質のスクリーニングが可能であると考えられた。
(3)コンピュータースクリーングによって選抜した化合物群のスクリーニング 実施例6の2)のサイト1のグループの代表化合物、実施例6の2)のサイト2のグループの代表化合物および実施例6の1)のサイト3のグループの代表化合物を本アッセイに供した。培地に懸濁したA431細胞を10,000cells/100μL/wellとなるよう96穴マイクロタイタープレート(黒色、COSTAR)に播種した後、これをCO2インキュベーター(37℃,5%CO2)で一晩前培養した。ウェル内の培地を完全に除去した後、Bufferで1回洗浄し、次いでBufferを49μL/wellで添加した。検体(被験化合物)は3−8mgを秤量し、これにDMSOを添加し、検体濃度が10mg/mLとなるように調製した。検体を1μL/wellで添加し、室温で5分間インキュベートした後にBufferにて最終濃度5nmol/Lとなるように希釈したEu−EGFを50μL/wellで添加した。室温で1時間インキュベートし、氷冷したBufferを用いて200μL/wellで5回洗浄後、DELFIA増強試薬(PerkinElmer life sciences)を100μL/wellで添加した。室温で30分間インキュベートした後、プレートリーダー(ARVO−sx,PerkinElmer life sciences)を用いて時間分解蛍光を測定した。励起波長および測定波長はそれぞれ340nm、615nmを使用した。アッセイは二連にて行ない、測定値の平均を用いてデータ処理した。なおデータ処理はDMSOおよびスクリーニング検体添加群の測定値から非特異結合の測定値を差し引き、DMSO添加群の特異的リガンド結合を100%、非特異結合を0%とした時の検体添加群における特異的リガンド結合率(%)を算出し、これを100から減ずることにより阻害活性(%)を算出した。さらに、以下の方法により擬陽性検体を除いた。すなわちBufferでDMSOおよび各検体を希釈し、A431細胞と室温で1時間インキュベートした後に5回洗浄を行い、Eu−EGFおよびDELFIA増強試薬(PerkinElmer life sciences)を添加、室温で30分間インキュベートした後、プレートリーダー(ARVO−sx,PerkinElmer life sciences)を用いて時間分解蛍光を測定した。DMSO添加群の測定値と比較して明らかに蛍光が減少している化合物群を擬陽性検体として除き、それ以外の化合物群を活性検体とした。活性検体については検体最終濃度1,3,10,30μg/mLとなるように添加し、阻害活性を算出した後に非線形最小二乗法によりIC50値を算出した。
(4)結果
サイト1の代表化合物からは、IC50=8.0μg/mLを示す化合物10−[3−(4−メチル−ピペラジン−1−イル)−プロピル]−2−トリフルオロメチル−10H−フェノチアジン二塩酸塩(SIGMAより購入、カタログ番号T8516)が得られた。サイト2の代表化合物からは、IC50=13.0μg/mLを示す化合物8−ヘキシルスルファニル−3−メチル−7−プロピル−3,7−ジヒドロ−プリン−2,6−ジオン(SALORより購入、カタログ番号R33,683−1)が得られた。サイト3の代表化合物からは、IC50=23.8μg/mLを示す化合物2−[2−(3−エチル−5,5,8,8−テトラメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−ナフタレン−2−イル)−2−オキソ−エチルスルファニル]−ニコチン酸(MAYBRIDGEより購入、カタログ番号RH00866)が得られた。
〔実施例8〕EGFRリン酸化を指標としたEGFRアゴニスト活性/アンタゴニスト活性の評価
EGFRはリガンドが結合し活性化すると、細胞内領域がリン酸化される。このリン酸化はリン酸化受容体特異的抗体により検出可能である。A431細胞を10%のウシ胎児血清(JRHバイオサイエンス社製)を含むダルベッコ改変イーグル培地(シグマ社製)を用いて5%CO2,37℃の環境下にて1日間培養(BNR−110M,エスペック社製)した後、血清を除いた培地にてさらに1日間培養した。アゴニスト活性測定を行う場合は、検体を10μg/mLの濃度で含んだ培地を添加して10分間放置した。また、アンタゴニスト活性測定を行う場合は検体を10または100μg/mLの濃度で含んだ培地を添加して20分間放置した後、終濃度が100ng/mLとなるようにEGF(Pepro Tech社製)を添加し、さらに10分間放置した。また、コントロールとしてEGF処理のみを行った細胞および未処理の細胞を用意した。培地を除去し、冷却したリン酸緩衝生理食塩液(PBS,Sigma社製)にて細胞を洗浄した後、熱した細胞溶解バッファー(20%グリセロール(和光純薬製),2%SDS(シグマ社製),5% 2−Mercaptoethanol(シグマ社製),0.025mg/mL Bromo Phenol Blue(シグマ社製)を含む125mmol/Lトリス(和光純薬製)−塩酸(和光純薬製)緩衝液(pH6.8))を添加して細胞溶解液を得た。得られた細胞溶解液を7.5%のポリアクリルアミドゲル(e−パジェル、アトー社製)にアプライし、トリス/グリシン/SDS緩衝液(バイオ・ラッド社製)を用いてゲル1枚あたり30mAの条件で電気泳動により分離(AE−6400、アトー社製)した後,セミドライ式ブロッティング装置(AE−6675、アトー社製)を用いてポリビニリデンジフルオリド(PVDF)膜(クリアブロットメンブレン−P、アトー社製)に200mA、1時間の条件で転写した。PVDF膜を5%のスキムミルク(和光純薬製)を含むPBSで室温、1時間の条件でブロッキングした後、0.1%のTween−20(バイオ・ラッド社製)を含むPBSにて1000倍希釈した活性化EGF受容体に対する一次抗体(抗ヒト活性化EGFR抗体・マウスIgG1:BDトランスダクション・ラボラトリーズ社製)および西洋わさび過酸化酵素によって標識された二次抗体(抗マウス イムノグロブリン・ウサギポリクローナル抗体/パーオキシダーゼ標識:ダコ社製)と37℃で1時間ずつ反応させ、化学発光法(ECLウエスタンブロッティング検出システム、アマシャムバイオサイエンス社製)を用いてEGFの作用によって活性化されたEGF受容体を発光・蛍光撮影出力装置(AE−6962N、ATTO社製)を利用して検出した。10μg/mLの10−[3−(4−メチル−ピペラジン−1−イル)−プロピル]−2−トリフルオロメチル−10H−フェノチアジン二塩酸塩、10μg/mLの8−ヘキシルスルファニル−3−メチル−7−プロピル−3,7−ジヒドロ−プリン−2,6−ジオンおよび100μg/mLの2−[2−(3−エチル−5,5,8,8−テトラメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−ナフタレン−2−イル)−2−オキソ−エチルスルファニル]−ニコチン酸はEGFによるA431細胞のEGF受容体活性化を阻害した(図21)。
〔実施例9〕EGFR変異体の作製
(1)方法
QuickChange登録商標部位特異的突然変異誘発キットを製造業者(Stratagene)の指示に従って用いることにより、部位特異的突然変異誘発法を行った。EGFR配列中の突然変異は、DNA配列解析により確認した。CHO細胞は、10%仔ウシ血清を添加した最少必須培地α中で培養し、FuGENE6法を製造業者(Roche)の推奨に従って用いて、野生型又は変異型受容体を含む発現ベクターでトランスフェクトした。続いて、一過性にトランスフェクトしたCHO細胞を24時間にわたり培養し、このCHO細胞は、特記しない限り、24時間にわたり飢餓状態に付すか飢餓状態にしないで次の分析に用い、続いてヒトEGFで5分間刺激した。
一過性トランスフェクトしたCHO細胞におけるEGFRの発現及び下流のERKの活性化は、Kimら(Kim,J.−H.et al.,Eur.J.Biochem.269:2323−2329,2002)に従って測定した。また、抗EGFRポリクローナル抗体(Upstate Biotechnology)、抗リン−p44/42 MAPキナーゼE10モノクローナル抗体、及び抗MAPキナーゼポリクローナル抗体(Cell Signaling Technology)を用いてイムノブロット分析を行った。
続いて、野生型及びERK活性化欠損突然変異体について、一過性トランスフェクトCHO細胞の表面上におけるEGFRの発現を、以下に記載する2つの異なる方法により確認した。第1の方法では、細胞表層タンパク質をビオチン化し、Muthuswamyら(Muthuswamy,S.K.et al.,Mol Cell Biol.19:6845−6857,1999)に記載の方法に従ってビオチン化EGFRを検出した。第2の方法では、一過性トランスフェクトCHO細胞の細胞表層EGFRを抗EGFR 528モノクローナル抗体(Santa Cruz)で標識し、続いてFACS Vantage SE(Becton Dickinson)を製造業者の指示に従って用いて分析した。
EGFにより誘導された自己リン酸化(autophosphorylation)を検出するために、一過性トランスフェクト細胞を12時間培養し、血清不含培地中で3時間にわたり飢餓状態にした。EGFR自己リン酸化は、既に報告されているSatoらの方法により調べた(Sato,C.et al.,J.Biochem(Tokyo)127:65−72,2000)。EGF結合アッセイに関しては、一過性トランスフェクト細胞をフィブロネクチン被覆24ウエルプレート中で24時間維持し、その後血清不含培地中で24時間にわたり飢餓状態にした。この細胞を、1mg/ml BSAを含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で2nM 125I標識EGFと共に1時間インキュベートした。1mg/ml BSAを含む氷冷PBSを用いて3回洗浄することにより遊離125I標識EGFを除去した。続いて細胞を0.5mlの0.5M NaOH中に溶解し、放射活性をγカウンターを用いて測定した。
(2)結果
EGFRの相互作用領域残基(interface residue)に突然変異誘発を行い、全長EGFRの活性化に対する作用を検討した。最初に、CHO細胞において発現されたEGFRの下流シグナル伝達経路を調べるために、細胞外シグナル調節プロテインキナーゼ(extracellular signal−regulated protein kinases;ERK)のEGF依存性リン酸化をアッセイした(図22A)。疎水性受容体の二量体化相互作用領域は、一方の受容体のTyr251が、もう一方の受容体のArg285と水素結合しており、またPhe263と疎水性相互作用している。Arg285をThrで置換する(R285Y)ことによってほとんど影響はないが、Arg285をSerで置換した(R285S)場合には、生物活性が低減した(図22A)。
Tyr251またはPhe263のAlaへの置換は活性にほとんど影響を与えないが、R285S突然変異とY251AまたはF263Aとを組み合わせた場合にはほぼ完全な活性の消失を引き起こした。R285S突然変異とY251AまたはF263Aとを組み合わせた変異体は、ビオチン化分析(図22B)及びFACS解析(データは示さない)のいずれの分析においても、野生型EGFRとほぼ同程度に細胞表面上に発現されることが確認された。これらの非シグナル伝達形態はまた、EGFR自己リン酸化能を示さない(図22C)。結果として、結晶構造において見出された受容体二量体化相互作用領域を突然変異誘発法により確証することができた。2つの二量体化相互作用領域の突然変異体は、[125I]EGF結合アッセイにおいてEGFに対して非常に低いアフィニティーを示している(図22D)。このことは、高いアフィニティーによるEGFの結合がEGFRの二量体化と関連していることを示唆している。
さらに、EGFRのドメインIIとドメインIIIとの間の細胞内相互作用もまた突然変異誘発法を利用して試験した。このドメイン間相互作用領域においては、ドメインIIのGlu293とドメインIIIのArg405とが互いに塩橋を形成している。Arg405のGluによる置換によって、EGF依存性ERKリン酸化、自己リン酸化、及び高アフィニティーによるEGF結合が破壊されていることが示された(図22)。従って、ドメイン間相互作用は、受容体の活性化に重要である。
産業上の利用可能性
本発明により、EGF/EGFR複合体の二量体の結晶構造およびその立体構造が提供される。本発明の複合体共結晶構造が与える構造座標は、EGFRアゴニストやアンタゴニストのファルマコフォア抽出、複合体構造座標の全部または一部を用いたコンピュータスクリーニング、EGFRアゴニストやアンタゴニストの分子設計(活性上昇、選択性付与など)、産業上有用なEGFまたはEGFR変異体設計、EGF中和抗体・アゴニスト抗体の作製、EGF/EGFR結晶構造を利用した分子置換法、インシュリンレセプター等EGFRと同様のフォールドを有すると考えられる蛋白質のモデリングとその構造の活用(コンピュータスクリーニング、分子設計、抗体設計、改変体設計、分子置換法など)などにおいて有用である。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図1a〜cは、EGFR−EGF複合体の二量体の結晶構造および3.5□分解能で作成した電子密度図の一部を示す図である。図1aは、二回垂直軸方向に向けられたリボンダイアグラムである。ドメインIVの大部分は不規則である。図1bは、図1aの上面図である。二回軸を中心に示す。図1cは、ドメインIの一部分の2Fo−Fc電子密度図の立体図である。
図2aおよびbは、EGFRとEGFとの相互作用を示す図である。図2aは、EGFRおよびEGFのリボン図上に種々の相互作用部位をマッピングした。相互作用領域における3つの結合部位を示す。図2bは、部位1における相互作用領域の立体図である。相互作用する残基の側鎖のみを示す。波線は水素結合または塩橋を表す。
図3aおよびbは、EGFRとEGFとの相互作用を示す図である(図2aおよびbの続き)。図3aは、部位2における相互作用領域の立体図である。図3bは、部位3における相互作用領域の立体図である。
図4a〜cは、二量体の相互作用領域における各受容体間の相互作用を示す。図4aは、相互作用領域における結合領域の概要である。相互作用する残基の側鎖のみを示す。図4bは、相互作用領域の立体図である。波線は水素結合または塩橋を表す。図4cは、図4aにおいて矢印で示す、異なる方向から見た相互作用領域の立体図である。
図5a〜cは、EGF誘導型受容体二量体化の可能性のあるモデルを示す。図5aは、リガンド付加EGFRのドメインI、IIおよびIIIと、非リガンド付加IGF−1RのL1、S1およびL2ドメインとの全体的な折りたたみの比較である。図5bは、非リガンド付加EGFRの単量体の推定構造である。リガンド誘導型活性化に関与する可能性のある残基の側鎖のみを示す。図5cは、二量体EGFR−EGF複合体の構造を示す。図5bで示す側鎖のみを示す。
図6は、脱グリコシル化EGFRのSDS−PAGEおよび化学的架橋によるEGF−誘導型二量体化の分析を示す写真である。
A:精製dEGFR(2mg/ml)を、0.1M酢酸ナトリウムバッファー(pH5.8)中でエンドグリコシダーゼH(1U/ml)およびD(0.4U/ml)と共に37℃にてインキュベートした。消化の0時間後(レーン1)、24時間後(レーン2)、48時間後(レーン3)、96時間後(レーン4)および120時間後(レーン5)に採取し、8%SDS−PAGEで消化産物を分析した。また、エンドグリコシダーゼ未添加(レーン6)またはdEGFR未添加の反応混合物を120時間インキュベートした。
B:精製dEGFR(0.8mg/ml)を0.05M Hepes−NaOHバッファー(pH7.5)中でEGFを添加して(レーン1)または添加しないで(レーン2)インキュベートし、続いて化学架橋剤BS3(1mM)と共にインキュベートした。
図7は、dEGFR−EGF複合体結晶の顕微鏡写真を示す。結晶の寸法は約1.0×0.2×0.2mmである。
図8は、ヒトインシュリン様増殖因子−1受容体単量体(PDB−ID:1IGR)の立体構造とEGF結合時のEGFRの立体構造の比較の図である。
図9は、ファルマコフォアの構築に利用可能なEGFとEGFRの結合部位のアミノ酸残基の例を表す図である。
図10は、ファルマコフォアの構築に利用可能なEGFR二量体化部位のアミノ酸残基の例を表す図である。
図11は、EGF/EGFR複合体の構造座標を用いてホモロジーモデリング法により作成したErbBファミリー、インシュリン受容体(IR)インシュリン様増殖因子−1受容体(IGF−1R)のモデル構造より推定したリガンド結合部位を示す図である。
図12は、EGF/EGFR複合体の構造座標を用いてホモロジーモデリング法により作成したヒトErbB2のモデリング構造を示す図である。濃いグレーの部分は、推定リガンド結合部を表す。
図13は、EGF/EGFR複合体の構造座標を用いて構築したファルマコフォアの一例を表す図である。
図14は、EGFおよびEGFR(受容体)のconolly surface図を表す写真である。
図15は、EGF/EGFR複合体の構造座標を用いて構築したファルマコフォアの一例(仮説a)を表す図である。
図16は、EGF/EGFR複合体の構造座標を用いて構築したファルマコフォアの一例(仮説b)を表す図である。
図17は、EGF/EGFR複合体の構造座標を用いて構築したファルマコフォアの一例(仮説c)を表す図である。
図18は、EGF/EGFR複合体の構造座標を用いて構築したファルマコフォアの一例(仮説d)を表す図である。
図19は、A431細胞上のEGFRに対するユーロピウム標識EGFの結合の飽和曲線を表す図である。
図20は、EGFR(A431細胞)/ユーロピウム標識EGF(10nM)結合に対する、EGFR抗体(Ab−3)による結合阻害を表す図である。
図21は、被験化合物のEGFRリン酸化阻害活性を表す写真である。レーン1は分子量マーカーである。レーン2はEGF非添加のサンプル、レーン3はEGF添加のサンプル、レーン4はEGFおよび2−[2−(3−エチル−5,5,8,8−テトラメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−ナフタレン−2−イル)−2−オキソ−エチルスルファニル]−ニコチン酸(100μg/mL)添加のサンプル、レーン5はEGFおよび10−[3−(4−メチル−ピペラジン−1−イル)−プロピル]−2−トリフルオロメチル−10H−フェノチアジン二塩酸塩(10μg/mL)添加のサンプル、レーン6はEGFおよび8−ヘキシルスルファニル−3−メチル−7−プロピル−3,7−ジヒドロ−プリン−2,6−ジオン(10μg/mL)添加のサンプルを泳動したものである。
図22は、変異型EGFRを発現するCHO細胞におけるEGF誘導性EGFR活性化を示す写真である。
A:EGF誘導性ERKリン酸化を示す。
B:変異型EGFRの細胞表面発現を示す。
C:EGFRのEGF誘導性自己リン酸化を示す。
D:変異型EGFRを発現する細胞に対する125I標識ヒトEGF(2nM)の結合を示す。SD(n=3)は誤差のバー(error bar)として示す。
Claims (41)
- EGF/EGFR複合体の結晶であり、EGF/EGFR複合体が以下の(A)および(B)の特徴を有する結晶。
(A)EGFとEGFRが1:1で結合している;
(B)EGF結合EGFRが二量体を形成している - EGF/EGFR複合体の結晶であって、単位格子定数がa=220.2±1.5Å、b=220.2±1.5Åおよびc=113.1±1.5Åであることを特徴とする結晶。
- 結晶化可能なEGFRの製造方法であり、以下の工程:
(A)Lec8細胞を用いてEGFRを産生する工程;および
(B)グリコシダーゼを用いてEGFRを脱グリコシル化する工程;
を含むことを特徴とする方法。 - 請求項3に記載の方法により製造される結晶化可能なEGFR。
- EGFRとEGFR活性調節物質の複合体の結晶の製造方法であり、以下の工程:
(A)結晶化可能なEGFRを製造する工程;および
(B)EGFRとEGFR活性調節物質を接触させる工程;
を含むことを特徴とする方法。 - EGFR活性調節物質がEGFである、請求項5に記載の方法。
- EGFRとEGFR活性調節物質の複合体の構造座標を決定する方法であり、以下の工程:
(A)EGFRとEGFR活性調節物質の複合体の結晶を製造する工程;および
(B)(A)により得られた結晶を用いたX線結晶構造解析によりEGFRとEGFR活性調節物質の複合体の構造座標を取得する工程;
を含むことを特徴とする方法。 - EGFR活性調節物質がEGFである、請求項7に記載の方法。
- 請求項1に記載の結晶を用いたX線結晶構造解析により得られるEGF/EGFR複合体の構造座標。
- EGF/EGFR複合体の構造座標を用いることを特徴とする、EGFR活性調節物質のスクリーニング方法。
- EGFR活性調節物質をスクリーニングする方法であって、以下の段階:
(1)被験物質の立体構造を構造座標化する段階;ならびに
(2)(1)の構造座標および以下の(A)〜(H)のいずれかに記載のEGF/EGFR結合部位の構造座標を同一座標系上で重ね合わせて、両者の適合状態を評価する段階;
を含むことを特徴とする方法。
(A)以下の(A−1)または(A−2)のいずれかから選ばれる第一のEGF/EGFR結合部位の構造座標;
(A−1)少なくともEGFのLeu26およびLys28、ならびにEGFRのLeu69およびLeu98に相当するアミノ酸残基の原子座標を含んでなるEGF/EGFR結合部位の構造座標;
(A−2)少なくともEGFのLeu26およびLys28、ならびにEGFRのLeu69およびLeu98に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつEGFのMet21、Ile23、Ala25、Cys31、Asn32およびCys33、ならびにEGFRのLeu14、Gln16、Gly18、Glu35、Tyr45、Ala68、Glu90およびTyr101に相当するアミノ酸残基から選ばれる1つ以上のアミノ酸残基の原子座標を含んでなるEGF/EGFR結合部位の構造座標;
(B)以下の(B−1)または(B−2)のいずれかから選ばれる第二のEGF/EGFR結合部位の構造座標;
(B−1)少なくともEGFのLeu15およびArg41、ならびにEGFRのVal350およびAsp355に相当するアミノ酸残基の原子座標を含んでなるEGF/EGFR結合部位の構造座標;
(B−2)少なくともEGFのLeu15およびArg41、ならびにEGFRのVal350およびAsp355に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつEGFのHis10、Asp11、Tyr13、His16、Cys31、Asn32、Cys33、Ile38、Gly39およびGlu40、ならびにEGFRのThr10、Asn12、Lys13、Gln16、Leu17、Gly18、Leu27、Leu325、Ser356、Phe357、Gln384およびHis409に相当するアミノ酸残基から選ばれる1つ以上のアミノ酸残基の原子座標を含んでなるEGF/EGFR結合部位の構造座標;
(C)以下の(C−1)または(C−2)のいずれかから選ばれる第三のEGF/EGFR結合部位の構造座標;
(C−1)少なくともEGFのArg45およびLeu47、ならびにEGFRのLeu382、Gln384、Phe412およびIle438に相当するアミノ酸残基の原子座標を含んでなるEGF/EGFR結合部位の構造座標;
(C−2)少なくともEGFのArg45およびLeu47、ならびにEGFRのLeu382、Gln384、Phe412およびIle438に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつEGFのGln43、Tyr44、Asp46およびLys48、ならびにEGFRのArg29、Leu325、His346、Gln408、Gln411、Ala415およびVal417に相当するアミノ酸残基から選ばれる1つ以上のアミノ酸残基の原子座標を含んでなるEGF/EGFR結合部位の構造座標;
(D)(A)に記載の第一のEGF/EGFR結合部位および(B)に記載の第二のEGF/EGFR結合部位を含んでなるEGF/EGFR結合部位の構造座標;
(E)(B)に記載の第二のEGF/EGFR結合部位および(C)に記載の第三のEGF/EGFR結合部位を含んでなるEGF/EGFR結合部位の構造座標;
(F)(A)に記載の第一のEGF/EGFR結合部位および(C)に記載の第三のEGF/EGFR結合部位を含んでなるEGF/EGFR結合部位の構造座標;
(G)(A)に記載の第一のEGF/EGFR結合部位、(B)に記載の第二のEGF/EGFR結合部位および(C)に記載の第三のEGF/EGFR結合部位を含んでなるEGF/EGFR結合部位の構造座標;
(H)以下の(H−1)〜(H−3)のいずれかから選ばれるEGF/EGFR結合部位の構造座標;
(H−1)少なくともEGFのTyr13、Glu40、Arg41、Asp46およびLeu47、ならびにEGFRのPhe357、Lys13、Asp355、Arg29、Leu382、Ala415およびVal417に相当するアミノ酸残基の原子座標を含んでなるEGF/EGFR結合部位の構造座標;
(H−2)EGFのHis10、Asp11、Tyr13、Leu15、His16、Met21、Ile23、Ala25、Leu26、Lys28、Ala30、Cys31、Asn32、Cys33、Val35、Tyr37、Ile38、Gly39、Glu40、Arg41、Gln43、Tyr44、Arg45、Asp46、Leu47、Lys48およびTrp49、ならびにEGFRのAsn12、Lys13、Leu14、Thr15、Gln16、Leu17、Gly18、Asp22、Arg29、Tyr45、Ala68、Leu69、Tyr89、Glu90、Leu98、Ser99、Tyr101、Leu325、His346、Leu348、Pro349、Val350、Asp355、Ser356、Phe357、Thr358、Leu382、Gln384、Gln408、His409、Gln411、Phe412、Ala415、Val417、Ile438およびLys465に相当するアミノ酸残基の原子座標からなる構造座標;
(H−3)EGFのHis10、Asp11、Tyr13、Leu15、His16、Met21、Ile23、Ala25、Leu26、Lys28、Ala30、Cys31、Asn32、Cys33、Val35、Tyr37、Ile38、Gly39、Glu40、Arg41、Gln43、Tyr44、Arg45、Asp46、Leu47、Lys48およびTrp49、ならびにEGFRのAsn12、Lys13、Leu14、Thr15、Gln16、Leu17、Gly18、Asp22、Arg29、Tyr45、Ala68、Leu69、Tyr89、Glu90、Leu98、Ser99、Tyr101、Leu325、His346、Leu348、Pro349、Val350、Asp355、Ser356、Phe357、Thr358、Leu382、Gln384、Gln408、His409、Gln411、Phe412、Ala415、Val417、Ile438およびLys465に相当するアミノ酸残基およびその近傍のアミノ酸残基の原子座標からなる構造座標。 - EGFR活性調節物質をスクリーニングする方法であって、以下の段階:
(1)被験物質の立体構造を構造座標化する段階;ならびに
(2)(1)の構造座標および以下の(A)〜(E)のいずれかに記載のEGFR二量体化部位の構造座標を同一座標系上で重ね合わせて、両者の適合状態を評価する段階;
を含むことを特徴とする方法;
(A)少なくとも二量体を形成している第一のEGFRのThr249、Tyr246およびGln252、ならびに第二のEGFRのAsn86、Cys283およびAla286に相当するアミノ酸残基の原子座標を含んでなるEGFR二量体化部位の構造座標;
(B)少なくとも二量体を形成している第一のEGFRのThr249、Tyr246およびGln252、ならびに第二のEGFRのAsn86、Cys283およびAla286に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつ両方のEGFRのAsn86、Gln194、Pro204、Ser205、Lys229、Phe230、Thr239、Pro242、Tyr246、Pro248、Thr249、Tyr251、Gln252、Met253、Ser262、Phe263、Gly264、Ala265、Tyr275、His280、Ser282、Cys283、Val284、Arg285、Ala286およびLys303に相当するアミノ酸残基から選ばれる1つ以上のアミノ酸残基の原子座標を含んでなるEGFR二量体化部位の構造座標;
(C)二量体を形成している両方のEGFRのAsn86、Gln194、Pro204、Ser205、Lys229、Phe230、Thr239、Pro242、Tyr246、Pro248、Thr249、Tyr251、Gln252、Met253、Ser262、Phe263、Gly264、Ala265、Tyr275、His280、Ser282、Cys283、Val284、Arg285、Ala286およびLys303に相当するアミノ酸残基の原子座標からなるEGFR二量体化部位の構造座標;
(D)二量体を形成している両方のEGFRのAsn86、Gln194、Pro204、Ser205、Lys229、Phe230、Thr239、Pro242、Tyr246、Pro248、Thr249、Tyr25L Gln252、Met253、Ser262、Phe263、Gly264、Ala265、Tyr275、His280、Ser282、Cys283、Val284、Arg285、Ala286およびLys303に相当するアミノ酸残基ならびにその近傍のアミノ酸残基の原子座標からなる構造座標;
(E)少なくともEGFRのArg405およびGlu293に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつEGFRのArg285、Arg273、Asp254およびGly458に相当するアミノ酸残基から選ばれる1つ以上のアミノ酸残基の原子座標を含んでなるEGFR二量体化部位の構造座標。 - EGF/EGFR複合体におけるEGF/EGFR結合部位またはEGFR二量体化部位を同定する方法であって、以下の段階:
(1)EGF/EGFR複合体の構造座標をコンピュータに入力する段階;および
(2)EGF/EGFR複合体構造の解析によりEGF/EGFR結合部位またはEGFR二量体化部位を構成するアミノ酸残基を特定する段階;
を含むことを特徴とする方法。 - EGFR活性調節物質をスクリーニングする方法であって、以下の段階:
(1)EGF/EGFR複合体の構造座標を用いてEGF/EGFR結合部位またはEGFR二量体化部位を同定する段階;
(2)(1)により同定されたEGF/EGFR結合部位またはEGFR二量体化部位の構造座標を用いてEGFR活性調節物質をスクリーニングする段階;および
(3)(2)により得られたEGFR活性調節物質を生化学的アッセイに供し、EGFR活性調節作用について評価する段階;
を含むことを特徴とする方法。 - EGFR活性調節物質のスクリーニング方法であって、以下の段階:
(1)被験物質の立体構造を構造座標化する段階;および
(2)(1)の構造座標と以下の(A)〜(E)のいずれかに記載のファルマコフォアを同一座標系上で重ね合わせて、両者の適合状態を評価する段階;
を含むことを特徴とする方法。
(A)以下の3つの特性球により定義されるファルマコフォア;
特性球1:X座標−5.623、Y座標6.259、Z座標0.853に中心を有する半径1.5Åの陰イオン性領域;
特性球2:X座標−12.656、Y座標3.363、Z座標−2.934に中心を有する半径1.5Åの疎水性領域;
特性球3:X座標−11.576、Y座標9.546、Z座標−2.135に中心を有する半径1.5Åの水素結合供与体領域R(ルート)を開始点とし、X座標−13.86、Y座標8.532、Z座標−3.792に中心を有する半径2.0Åの水素結合供与体領域T(ターミナル)を終点とするベクトルにより定義される水素結合供与体領域;
(B)以下の3つの特性球により定義されるファルマコフォア;
特性球1:X座標−5.669、Y座標−1.630、Z座標−1.200に中心を有する半径1.5Åの疎水性領域;
特性球2:X座標−4.547、Y座標6.304、Z座標4.060に中心を有する半径1.5Åの陰イオン性領域;
特性球3:X座標−0.842、Y座標2.938、Z座標0.169に中心を有する半径1.5Åの陽イオン性領域;
(C)以下の4つの特性球により定義されるファルマコフォア;
特性球1:X座標4.527、Y座標6.119、Z座標−0.725に中心を有する半径1.5Åの陽イオン性領域;
特性球2:X座標0.459、Y座標−1.861、Z座標1.410に中心を有する半径1.5Åの陰イオン性領域;
特性球3:X座標−6.534、Y座標3.496、Z座標−0.247に中心を有する半径1.5Åの水素結合供与体領域R(ルート)を開始点とし、X座標−8.045、Y座標1.617、Z座標1.538に中心を有する半径1.7Åの水素結合供与体領域T(ターミナル)を終点とするベクトルにより定義される水素結合供与体領域;
特性球4:X座標−11.024、Y座標2.667、Z座標0.128に中心を有する半径1.5Åの疎水性領域;
(D)以下の3つの特性球により定義されるファルマコフォア;
特性球1:X座標−5.416、Y座標7.542、Z座標−2.184に中心を有する半径1.5Åの芳香族性領域R(ルート)を開始点とし、X座標−8.185、Y座標6.587、Z座標−2.827に中心を有する半径1.5Åの芳香族性領域T(ターミナル)を終点とするベクトルにより定義される芳香族性領域;
特性球2:X座標−16.119、Y座標9.326、Z座標−0.341に中心を有する半径1.5Åの陽イオン性領域;
特性球3:X座標−14.846、Y座標5.806、Z座標−1.676に中心を有する半径1.5Åの疎水性領域;
(E)以下の3つの特性球により定義されるファルマコフォア;
特性球1:X座標6.595、Y座標−0.996、Z座標−1.663に中心を有する半径1.5Åの芳香族性領域R(ルート)を開始点とし、X座標7.625、Y座標1.482、Z座標−0.322に中心を有する半径1.5Åの芳香族性領域T(ターミナル)を終点とするベクトルにより定義される芳香族性領域;
特性球2:X座標1.858、Y座標1.046、Z座標1.370に中心を有する半径1.5Åの水素結合供与体領域R(ルート)を開始点とし、X座標2.051、Y座標2.626、Z座標−1.172に中心を有する半径1.7Åの水素結合供与体領域T(ターミナル)を終点とするベクトルにより定義される水素結合供与体領域;
特性球3:X座標−1.936、Y座標0.021、Z座標−3.278に中心を有する半径1.5Åの疎水性領域 - EGFR活性調節物質の設計方法であって、以下の段階:
(1)以下の(A)〜(E)のいずれかに記載のファルマコフォアの各特性球に対応する官能基を有する各フラグメント群を作成する段階;および
(2)(1)で作成した各フラグメント群より一つずつ選択された各フラグメントを結合させて、化合物を設計する段階;
を含むことを特徴とする方法。
(A)以下の3つの特性球により定義されるファルマコフォア;
特性球1:X座標−5.623、Y座標6.259、Z座標0.853に中心を有する半径1.5Åの陰イオン性領域;
特性球2:X座標−12.656、Y座標3.363、Z座標−2.934に中心を有する半径1.5Åの疎水性領域;
特性球3:X座標−11.576、Y座標9.546、Z座標−2.135に中心を有する半径1.5Åの水素結合供与体領域R(ルート)を開始点とし、X座標−13.86、Y座標8.532、Z座標−3.792に中心を有する半径2.0Åの水素結合供与体領域T(ターミナル)を終点とするベクトルにより定義される水素結合供与体領域;
(B)以下の3つの特性球により定義されるファルマコフォア;
特性球1:X座標−5.669、Y座標−1.630、Z座標−1.200に中心を有する半径1.5Åの疎水性領域;
特性球2:X座標−4.547、Y座標6.304、Z座標4.060に中心を有する半径1.5Åの陰イオン性領域;
特性球3:X座標−0.842、Y座標2.938、Z座標0.169に中心を有する半径1.5Åの陽イオン性領域;
(C)以下の4つの特性球により定義されるファルマコフォア;
特性球1:X座標4.527、Y座標6.119、Z座標−0.725に中心を有する半径1.5Åの陽イオン性領域;
特性球2:X座標0.459、Y座標−1.861、Z座標1.410に中心を有する半径1.5Åの陰イオン性領域;
特性球3:X座標−6.534、Y座標3.496、Z座標−0.247に中心を有する半径1.5Åの水素結合供与体領域R(ルート)を開始点とし、X座標−8.045、Y座標1.617、Z座標1.538に中心を有する半径1.7Åの水素結合供与体領域T(ターミナル)を終点とするベクトルにより定義される水素結合供与体領域;
特性球4:X座標−11.024、Y座標2.667、Z座標0.128に中心を有する半径1.5Åの疎水性領域;
(D)以下の3つの特性球により定義されるファルマコフォア;
特性球1:X座標−5.416、Y座標7.542、Z座標−2.184に中心を有する半径1.5Åの芳香族性領域R(ルート)を開始点とし、X座標−8.185、Y座標6.587、Z座標−2.827に中心を有する半径1.5Åの芳香族性領域T(ターミナル)を終点とするベクトルにより定義される芳香族性領域;
特性球2:X座標−16.119、Y座標9.326、Z座標−0.341に中心を有する半径1.5Åの陽イオン性領域;
特性球3:X座標−14.846、Y座標5.806、Z座標−1.676に中心を有する半径1.5Åの疎水性領域;
(E)以下の3つの特性球により定義されるファルマコフォア;
特性球1:X座標6.595、Y座標−0.996、Z座標−1.663に中心を有する半径1.5Åの芳香族性領域R(ルート)を開始点とし、X座標7.625、Y座標1.482、Z座標−0.322に中心を有する半径1.5Åの芳香族性領域T(ターミナル)を終点とするベクトルにより定義される芳香族性領域;
特性球2:X座標1.858、Y座標1.046、Z座標1.370に中心を有する半径1.5Åの水素結合供与体領域R(ルート)を開始点とし、X座標2.051、Y座標2.626、Z座標−1.172に中心を有する半径1.7Åの水素結合供与体領域T(ターミナル)を終点とするベクトルにより定義される水素結合供与体領域;
特性球3:X座標−1.936、Y座標0.021、Z座標−3.278に中心を有する半径1.5Åの疎水性領域 - EGFR活性調節物質のファルマコフォアの設計方法であって、以下の段階:
(1)EGF/EGFR結合部位またはEGFR二量体化部位の3次元構造を解析し、EGFR活性調節物質のファルマコフォアとして使用し得る部分構造を特定する段階;および
(2)該部分構造を特性球に変換し、ファルマコフォアを発生させる段階;
を含むことを特徴とする方法。 - EGFR活性調節物質のスクリーニング方法であって、以下の段階:
(1)EGF/EGFR複合体の構造座標を用いてEGF/EGFR結合部位またはEGFR二量体化部位を同定する段階;
(2)(1)により同定されたEGF/EGFR結合部位またはEGFR二量体化部位の構造座標を用いてEGFR活性調節物質のファルマコフォアを設計する段階;
(3)(2)により得られたファルマコフォアを用いてEGFR活性調節物質をスクリーニングする段階;および
(4)(3)により得られたEGFR活性調節物質を生化学的アッセイに供し、EGFR活性調節作用について評価する段階;
を含むことを特徴とする方法。 - EGFR活性調節物質の設計方法であって、以下の段階:
(1)EGF/EGFR複合体の構造座標を用いてEGF/EGFR結合部位またはEGFR二量体化部位を同定する段階;
(2)(1)により同定されたEGF/EGFR結合部位またはEGFR二量体化部位の構造座標を用いてEGFR活性調節物質のファルマコフォアを設計する段階;
(3)(2)により得られたファルマコフォアを用いて化合物を設計する段階;および
(4)(3)により得られた化合物を生化学的アッセイに供し、EGFR活性調節作用について評価する段階;
を含むことを特徴とする方法。 - 以下の(A)〜(E)のいずれかに記載のファルマコフォアに適合する構造を有するEGFRアンタゴニスト。
(A)以下の3つの特性球により定義されるファルマコフォア;
特性球1:X座標−5.623、Y座標6.259、Z座標0.853に中心を有する半径1.5Åの陰イオン性領域;
特性球2:X座標−12.656、Y座標3.363、Z座標−2.934に中心を有する半径1.5Åの疎水性領域;
特性球3:X座標−11.576、Y座標9.546、Z座標−2.135に中心を有する半径1.5Åの水素結合供与体領域R(ルート)を開始点とし、X座標−13.86、Y座標8.532、Z座標−3.792に中心を有する半径2.0Åの水素結合供与体領域T(ターミナル)を終点とするベクトルにより定義される水素結合供与体領域;
(B)以下の3つの特性球により定義されるファルマコフォア;
特性球1:X座標−5.669、Y座標−1.630、Z座標−1.200に中心を有する半径1.5Åの疎水性領域;
特性球2:X座標−4.547、Y座標6.304、Z座標4.060に中心を有する半径1.5Åの陰イオン性領域;
特性球3:X座標−0.842、Y座標2.938、Z座標0.169に中心を有する半径1.5Åの陽イオン性領域;
(C)以下の4つの特性球により定義されるファルマコフォア;
特性球1:X座標4.527、Y座標6.119、Z座標−0.725に中心を有する半径1.5Åの陽イオン性領域;
特性球2:X座標0.459、Y座標−1.861、Z座標1.410に中心を有する半径1.5Åの陰イオン性領域;
特性球3:X座標−6.534、Y座標3.496、Z座標−0.247に中心を有する半径1.5Åの水素結合供与体領域R(ルート)を開始点とし、X座標−8.045、Y座標1.617、Z座標1.538に中心を有する半径1.7Åの水素結合供与体領域T(ターミナル)を終点とするベクトルにより定義される水素結合供与体領域;
特性球4:X座標−11.024、Y座標2.667、Z座標0.128に中心を有する半径1.5Åの疎水性領域;
(D)以下の3つの特性球により定義されるファルマコフォア;
特性球1:X座標−5.416、Y座標7.542、Z座標−2.184に中心を有する半径1.5Åの芳香族性領域R(ルート)を開始点とし、X座標−8.185、Y座標6.587、Z座標−2.827に中心を有する半径1.5Åの芳香族性領域T(ターミナル)を終点とするベクトルにより定義される芳香族性領域;
特性球2:X座標−16.119、Y座標9.326、Z座標−0.341に中心を有する半径1.5Åの陽イオン性領域;
特性球3:X座標−14.846、Y座標5.806、Z座標−1.676に中心を有する半径1.5Åの疎水性領域;
(E)以下の3つの特性球により定義されるファルマコフォア;
特性球1:X座標6.595、Y座標−0.996、Z座標−1.663に中心を有する半径1.5Åの芳香族性領域R(ルート)を開始点とし、X座標7.625、Y座標1.482、Z座標−0.322に中心を有する半径1.5Åの芳香族性領域T(ターミナル)を終点とするベクトルにより定義される芳香族性領域;
特性球2:X座標1.858、Y座標1.046、Z座標1.370に中心を有する半径1.5Åの水素結合供与体領域R(ルート)を開始点とし、X座標2.051、Y座標2.626、Z座標−1.172に中心を有する半径1.7Åの水素結合供与体領域T(ターミナル)を終点とするベクトルにより定義される水素結合供与体領域;
特性球3:X座標−1.936、Y座標0.021、Z座標−3.278に中心を有する半径1.5Åの疎水性領域 - EGFRの活性を阻害する方法であって、EGFRと、以下の(A)〜(E)のいずれかに記載のファルマコフォアに適合する構造を有するEGFRアンタゴニストを接触させることを特徴とする方法。
(A)以下の3つの特性球により定義されるファルマコフォア;
特性球1:X座標−5.623、Y座標6.259、Z座標0.853に中心を有する半径1.5Åの陰イオン性領域;
特性球2:X座標−12.656、Y座標3.363、Z座標−2.934に中心を有する半径1.5Åの疎水性領域;
特性球3:X座標−11.576、Y座標9.546、Z座標−2.135に中心を有する半径1.5Åの水素結合供与体領域R(ルート)を開始点とし、X座標−13.86、Y座標8.532、Z座標−3.792に中心を有する半径2.0Åの水素結合供与体領域T(ターミナル)を終点とするベクトルにより定義される水素結合供与体領域;
(B)以下の3つの特性球により定義されるファルマコフォア;
特性球1:X座標−5.669、Y座標−1.630、Z座標−1.200に中心を有する半径1.5Åの疎水性領域;
特性球2:X座標−4.547、Y座標6.304、Z座標4.060に中心を有する半径1.5Åの陰イオン性領域;
特性球3:X座標−0.842、Y座標2.938、Z座標0.169に中心を有する半径1.5Åの陽イオン性領域;
(C)以下の4つの特性球により定義されるファルマコフォア;
特性球1:X座標4.527、Y座標6.119、Z座標−0.725に中心を有する半径1.5Åの陽イオン性領域;
特性球2:X座標0.459、Y座標−1.861、Z座標1.410に中心を有する半径1.5Åの陰イオン性領域;
特性球3:X座標−6.534、Y座標3.496、Z座標−0.247に中心を有する半径1.5Åの水素結合供与体領域R(ルート)を開始点とし、X座標−8.045、Y座標1.617、Z座標1.538に中心を有する半径1.7Åの水素結合供与体領域T(ターミナル)を終点とするベクトルにより定義される水素結合供与体領域;
特性球4:X座標−11.024、Y座標2.667、Z座標0.128に中心を有する半径1.5Åの疎水性領域;
(D)以下の3つの特性球により定義されるファルマコフォア;
特性球1:X座標−5.416、Y座標7.542、Z座標−2.184に中心を有する半径1.5Åの芳香族性領域R(ルート)を開始点とし、X座標−8.185、Y座標6.587、Z座標−2.827に中心を有する半径1.5Åの芳香族性領域T(ターミナル)を終点とするベクトルにより定義される芳香族性領域;
特性球2:X座標−16.119、Y座標9.326、Z座標−0.341に中心を有する半径1.5Åの陽イオン性領域;
特性球3:X座標−14.846、Y座標5.806、Z座標−1.676に中心を有する半径1.5Åの疎水性領域;
(E)以下の3つの特性球により定義されるファルマコフォア;
特性球1:X座標6.595、Y座標−0.996、Z座標−1.663に中心を有する半径1.5Åの芳香族性領域R(ルート)を開始点とし、X座標7.625、Y座標1.482、Z座標−0.322に中心を有する半径1.5Åの芳香族性領域T(ターミナル)を終点とするベクトルにより定義される芳香族性領域;
特性球2:X座標1.858、Y座標1.046、Z座標1.370に中心を有する半径1.5Åの水素結合供与体領域R(ルート)を開始点とし、X座標2.051、Y座標2.626、Z座標−1.172に中心を有する半径1.7Åの水素結合供与体領域T(ターミナル)を終点とするベクトルにより定義される水素結合供与体領域;
特性球3:X座標−1.936、Y座標0.021、Z座標−3.278に中心を有する半径1.5Åの疎水性領域 - EGFR変異体を設計する方法であって、以下の段階:
(1)EGF/EGFR複合体の構造座標をコンピュータに入力する段階;
(2)EGF/EGFR複合体構造の解析によりEGF/EGFR結合部位またはEGFR二量体化部位を構成するアミノ酸残基を特定する段階;および
(3)変異を導入するアミノ酸残基を特定する段階;
を含むことを特徴とする方法。 - EGFR変異体を製造する方法であって、以下の段階:
(1)EGF/EGFR複合体構造座標を用いてEGFR変異体を設計する段階;
(2)変異蛋白質を調製する段階;および
(3)変異蛋白質を生化学的アッセイに供し所望の活性を有することを確認する段階;
を含むことを特徴とする方法。 - 請求項23に記載の製造方法により得られるEGFR変異体。
- EGFR二量体化部位にアミノ酸変異を有するEGFR変異体。
- EGF/EGFR相互作用部位にアミノ酸変異を有するEGFR変異体。
- EGFR二量体化部位およびEGF/EGFR相互作用部位にアミノ酸変異を有するEGFR変異体。
- EGF変異体を設計する方法であって、以下の段階:
(1)EGF/EGFR複合体の構造座標をコンピュータに入力する段階;
(2)EGF/EGFR複合体構造の解析によりEGF/EGFR結合部位を構成するアミノ酸残基を特定する段階;および
(3)変異を導入するアミノ酸残基を特定する段階;
を含むことを特徴とする方法。 - EGF変異体を製造する方法であって、以下の段階:
(1)EGF/EGFR複合体構造座標を用いてEGF変異体を設計する段階;
(2)変異蛋白質を調製する段階;および
(3)変異蛋白質を生化学的アッセイに供し所望の活性を有することを確認する段階;
を含むことを特徴とする方法。 - 請求項29に記載の製造方法により得られるEGF変異体。
- EGF/EGFR相互作用部位にアミノ酸変異を有するEGF変異体。
- EGF/EGFR複合体の構造座標を用いて、分子置換法により未知の構造の蛋白質または蛋白質複合体についての構造座標を取得する方法。
- EGF/EGFR複合体の構造座標を用いて、ホモロジーモデリング法により未知の構造の蛋白質または蛋白質複合体についての構造座標を取得する方法。
- 請求項32または請求項33に記載の方法により得られる蛋白質または蛋白質複合体の構造座標。
- EGF/EGFR複合体の構造座標を用いてエピトープを設計する方法であって、以下の段階:
(1)EGF/EGFR複合体の構造座標をコンピュータに入力する段階;および
(2)EGF/EGFR複合体構造の解析によりエピトープとなり得る部分を特定する段階;
を含むことを特徴とする方法。 - 抗EGFR抗体の製造方法であって、以下の段階:
(1)EGF/EGFR複合体構造座標を用いてエピトープを設計する段階;
(2)設計したエピトープを含む抗原を調製する段階;および
(3)設計したエピトープを認識する抗体を調製する段階;
を含むことを特徴とする方法。 - 請求項36に記載の製造方法により得られる抗EGFR抗体。
- 抗EGF抗体の製造方法であって、以下の段階:
(1)EGF/EGFR複合体構造座標を用いてエピトープを設計する段階;
(2)設計したエピトープを含む抗原を調製する段階;および
(3)設計したエピトープを認識する抗体を調製する段階;
を含むことを特徴とする方法。 - 請求項38に記載の製造方法により得られる抗EGF抗体。
- EGFR二量体化部位を形成する領域の全部または一部のアミノ酸残基を含むポリペプチドまたはその塩。
- EGFR二量体化部位を形成する領域が、配列番号1に示すアミノ酸配列のうち第240番目〜第267番目からなる領域の全部または一部である請求項40記載のポリペプチドまたはその塩。
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