JPWO2003031652A1 - Ｉ型糖尿病の検査方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ＩＫＢＬ１遺伝子プロモーター領域に見られる多型を検出することによるＩ型糖尿病の検査方法、並びに多型ハプロタイプを識別するための実用的なタイピング法を提供する。
Description
技術分野
本発明は、塩基配列多型を検出することを特徴とするＩ型糖尿病の検査方法、該検査方法に使用されるプライマー及びプローブ、並びに該プライマー及び／またはプローブを含むＩ型糖尿病の検査試薬または検査キットに関する。
本発明は更に、二本鎖ＤＮＡ多型検出法（ＤＳＣＡ）を用いることを特徴とするハプロタイプの検出方法に関する。
背景技術
Ｉ型糖尿病（インスリン依存性糖尿病）は膵臓β細胞を標的とする自己免疫疾患であり、その発症には遺伝的な要因すなわち何らかの遺伝子変異が関与すると考えられている。この遺伝的な要因を同定する目的で以前よりＨＬＡの解析が行われており、本疾患への感受性および抵抗性を規定する遺伝子がＨＬＡ領域内に存在することが示され、特にＨＬＡ−ＤＲ／ＤＱ領域内のＤＲＢ１遺伝子とＤＱＢ１遺伝子の関与が明らかとなっている。しかしながら、ＨＬＡに連鎖した本疾患への感受性・抵抗性は、必ずしもＤＲＢ１とＤＱＢ１遺伝子のみでは説明出来ない。さらに最近の欧米人における詳細な家系解析では、最も関連の強い領域はＤＲ／ＤＱ領域であるが、それとは別にＴＮＦ領域近傍にも強い関連を示す領域があり、そこには本疾患への感受性および抵抗性をコントロールする遺伝子が存在すると推定される（Ｚａｖａｔｔａｒｉ Ｐら，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ（２０００）２０：２９６７−２９７２）。
本発明者らは日本人本症患者を対象としたＨＬＡ領域内遺伝子群の解析を行っており、本症への感受性・抵抗性がＤＲＢ１とＤＱＢ１の相互作用によってコントロールされること（Ｙａｓｕｎａｇａ Ｓら，Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ（１９９６）４７：３７−４８）、本症への感受性にＨＬＡ−Ｂが関与すること（Ｈａｍａｇｕｃｈｉ Ｋら，Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ（２０００）５５：１０−１５）を報告して来た。
発明の開示
本発明者らはＨＬＡ領域内の多数のマイクロサテライトマーカーの多型解析を行い、本症への感受性・抵抗性と強く関連する領域として、ＤＲ／ＤＱ領域およびＨＬＡ−Ｂ領域の２領域以外に、もうひとつＴＮＦ近傍領域を発見した。さらに、このＴＮＦ近傍領域内に存在するＩＫＢＬ１遺伝子に着目した解析を行い、本遺伝子のプロモーター領域の４箇所に多型（Ａｌｌｃｏｃｋ ＲＪＮら，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（２００１）５２：２８９−２９３）が存在することを確認した。また、ＩＫＢＬ１遺伝子のプロモーター多型は、それぞれが異なる転写因子の結合配列に類似した配列部位に認められることから、これらのプロモーター多型、ないしプロモーター多型ハプロタイプはＩＫＢＬ１遺伝子の転写制御における個体差と関連することが示唆される。
しかしながら、これらの多型とＩ型糖尿病との直接の関連については知られておらず、また特定のハプロタイプとの関連については全く報告されていない。
本発明者らはＩ型糖尿病とＩＫＢＬ１遺伝子との関連を直接解明することを目的として、このプロモーター多型を個別に識別・検出する方法に加え、個々の多型を一括した多型ハプロタイプとして識別するための実用的なタイピング法を開発した。開発したタイピング法は二本鎖ＤＮＡ構造多型解析法（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ，ＤＳＣＡ）（Ａｒｇｕｅｌｌｏ ＪＲら，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ（１９９８）１８：１９２−１９４；Ｆｕｋｕｄａ Ｙら，Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ（１９９５）４５：４９−５６）を基本原理とするが、タイピングに用いるレファレンスに挿入、欠失または置換変異を人為的に導入することで、タイピング精度を飛躍的に向上させたものである。
従って、本発明はＩｋＢＬ１遺伝子のプロモーター領域の多型を検出することを特徴とするＩ型糖尿病の検査方法に関する。又、本発明は多型、特にハプロタイプの検出方法に関する。さらに、本発明はＩｋＢＬ１阻害物質を有効成分とするＩ型糖尿病治療薬に関する。
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１１）を提供する。
（１） 以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかの塩基の多型を検出することを特徴とする、Ｉ型糖尿病の検査方法。
（ａ）配列番号１７で表される塩基配列上の第６７〜７４番目の塩基またはその相補鎖上の対応する塩基
（ｂ）配列番号１７で表される塩基配列上の第１７１番目の塩基またはその相補鎖上の対応する塩基
（ｃ）配列番号１７で表される塩基配列上の第２３３番目の塩基またはその相補鎖上の対応する塩基
（ｄ）配列番号１７で表される塩基配列上の第４３３番目の塩基またはその相補鎖上の対応する塩基
（２） 上記（ａ）から（ｄ）の塩基の多型のハプロタイプを検出することを特徴とする、上記（１）に記載のＩ型糖尿病の検査方法。
（３） Ｉ型糖尿病の検査に用いるための、以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のプライマー。
（ａ）配列番号１７で表される塩基配列からなるＤＮＡまたはその相補鎖にハイブリダイズし、かつ配列番号１７で表される塩基配列上の第６７〜７４番目の塩基またはその相補鎖の対応する塩基を挟み込むように設計されたＤＮＡプライマー
（ｂ）配列番号１７で表される塩基配列からなるＤＮＡまたはその相補鎖にハイブリダイズし、かつ配列番号１７で表される塩基配列上の第１７１番目の塩基またはその相補鎖の対応する塩基を挟み込むように設計されたＤＮＡプライマー
（ｃ）配列番号１７で表される塩基配列からなるＤＮＡまたはその相補鎖にハイブリダイズし、かつ配列番号１７で表される塩基配列上の第２３３番目の塩基またはその相補鎖の対応する塩基を挟み込むように設計されたＤＮＡプライマー
（ｄ）配列番号１７で表される塩基配列からなるＤＮＡまたはその相補鎖にハイブリダイズし、かつ配列番号１７で表される塩基配列上の第４３３番目の塩基またはその相補鎖の対応する塩基を挟み込むように設計されたＤＮＡプライマー
（４） 以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかの塩基を含む領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
（ａ）配列番号１７で表される塩基配列または該塩基配列上の第６７〜７４番目の塩基中に１塩基が挿入された塩基配列からなるＤＮＡの第６７〜７４番目及び挿入された１塩基を含む塩基
（ｂ）配列番号１７で表される塩基配列または該塩基配列上の第１７１番目の塩基が他の塩基に置換された塩基配列からなるＤＮＡの第１７１番目の塩基
（ｃ）配列番号１７で表される塩基配列または該塩基配列上の第２３３番目の塩基が他の塩基に置換された塩基配列からなるＤＮＡの第２３３番目の塩基
（ｄ）配列番号１７で表される塩基配列または該塩基配列上の第４３３番目の塩基が他の塩基に置換された塩基配列からなるＤＮＡの第４３３番目の塩基
（５） Ｉ型糖尿病の検査のために用いるプローブである、上記（４）に記載のオリゴヌクレオチド。
（６） 上記（３）に記載のプライマー及び／または上記（５）に記載のプローブを含む、Ｉ型糖尿病の検査試薬。
（７） 上記（３）に記載のプライマー及び／または上記（５）に記載のプローブを含む、Ｉ型糖尿病の検査キット。
（８） Ｉ型糖尿病の検査に用いるための、以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号１７で表される塩基配列または該塩基配列上の第６７〜７４番目の塩基中に一塩基が挿入された塩基配列からなるＤＮＡにおいて、第６７〜７４番目の塩基を含む塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１７で表される塩基配列または該塩基配列上の第１７１番目の塩基が他の塩基に置換された塩基配列からなるＤＮＡにおいて、第１７１番目の塩基を含む塩基配列からなるＤＮＡ
（ｃ）配列番号１７で表される塩基配列または該塩基配列上の第２３３番目の塩基が他の塩基に置換された塩基配列からなるＤＮＡにおいて、第２３３番目の塩基を含む塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号１７で表される塩基配列または該塩基配列上の第４３３番目の塩基が他の塩基に置換された塩基配列からなるＤＮＡにおいて、第４３３番目の塩基を含む塩基配列からなるＤＮＡ
（９） 二本鎖ＤＮＡ多型検出法（ＤＳＣＡ）を用いることを特徴とするハプロタイプの検出方法。
（１０） ＤＳＣＡに用いるレファレンスが非天然型のレファレンスであることを特徴とする上記（９）に記載の検出方法。
（１１） 多型部位の近傍領域に１〜数塩基の欠失、挿入または置換を行うことにより非天然型のレファレンスを作製することを含む、上記（１０）に記載の検出方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００１−３０６８６８号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
発明を実施するための最良の形態
遺伝的多型の一つである一塩基多型（ＳＮＰ）とは、集団内で１％以上の頻度で出現する、塩基配列上の単一塩基の置換、挿入、または欠失による多型をいう。ＳＮＰは、ゲノム上に広く高密度に分布し、疾患の有無、人種及び個人により異なるため、疾患感受性、人種及び個人差を検出する為の有益なマーカーとなり得る。
本発明において、ＩｋＢＬ１遺伝子のプロモーター領域に存在する多型（図１に示す４箇所の多型）が、Ｉ型糖尿病の発症と相関があることが見出された。すなわち、遺伝子の転写開始点（配列番号１７で表される、後述するアリル（ａｌｌｅｌｅ）０１の塩基配列上の第４９６番目の塩基）を１とし、その上流に向かって−１からさかのぼって−４２２位に相当する塩基の上流にＴが８個（Ｔ８）（配列番号１７の第６７〜７４番目）または９個（Ｔ９）（配列番号１７の第６７〜７４番目の塩基に対して１塩基挿入）の多型、−３２５位（配列番号１７の第１７１番目）がＣまたはＧの多型、−２６３位（配列番号１７の第２３３番目）がＡまたはＧの多型、および−６３（配列番号１７の第４３３番目）がＴまたはＡの多型である（図１）。さらに、アリル０１（配列番号１７）（−４２２位（第６７〜７４番目）がＴ８、−３２５位（第１７１番目）の塩基がＣ、−２６３位（第２３３番目）の塩基がＡ、−６３位（第４３３番目）の塩基がＴ）を有している場合には、Ｉ型糖尿病を発症する確率が高いことが判明した。又、アリル０３（配列番号１９）（−４２２位がＴ８、−３２５位がＣ、−２６３位がＧ、−６３位がＴ）を有している場合にはＩ型糖尿病を発症する確率が低いことが判明した。
従って、これらの各位置の多型又は相補鎖上の対応する多型を指標として、Ｉ型糖尿病の検査を行うことができる。
本発明のＩ型糖尿病の検査は−４２２位、−３２５番目、−２６３番目、−６３番目の塩基の多型の中から１又は複数の多型を選択して個々の多型を検出することにより行うことも可能であるが、それら４つの多型のハプロタイプとして検出することにより行うことが好ましい。
なお、本発明におけるＩ型糖尿病の検査方法には、既にＩ型糖尿病の症状を発症している患者の検査及び、未だ症状を発症していない被験者がＩ型糖尿病にかかりやすいか否かを判断する為に行う検査などが含まれる。本発明の検査では、被験者から検出した多型が、Ｉ型糖尿病患者において有意に頻度の高い多型である場合、被験者はＩ型糖尿病に羅患する危険性が高いと判断され、そうでない場合には、被験者はＩ型糖尿病に羅患する可能性が低いと判断される。
本発明のＩ型糖尿病の検査には、前記遺伝的多型を検出するために、プライマー及び／またはプローブが使用され得る。本発明の検査方法に用いられるプライマーとしては、配列番号１７に表される塩基配列からなるＤＮＡまたはその相補鎖にハイブリダイズし、かつ、標的多型部位（配列番号１７に表される塩基配列における第６７〜７４番、第１７１番、第２３３番、または第４３３番の塩基）を挟み込むように設計されたプライマーであることが必要である。ここで，「挟み込む」とは、フォワードプライマー及びリバースプライマーからなるプライマー対によって増幅されるＤＮＡ断片の塩基配列中に（標的多型部位を）含むことをいう。本発明の検査に用いるプライマーは、通常、１０ｍｅｒ〜１００ｍｅｒであり、好ましくは１５ｍｅｒ〜４０ｍｅｒ、更に好ましくは１８ｍｅｒ〜３０ｍｅｒである。また、当該プライマーによって増幅されるＤＮＡ領域の長さは、５０ｂｐ〜５，０００ｂｐ、好ましくは１００ｂｐ〜１，５００ｂｐ、更に好ましくは２００ｂｐ〜７００ｂｐである。尚、プライマーの鋳型ＤＮＡへのハイブリダイゼーションは、当分野において通常用いられる条件下で行うことができる。プライマーは、相補的な塩基対結合を形成できること、そしてその３’末端において相補鎖合成の起点となる−ＯＨ基を与えることの２つの条件を満たしている限り、プライマーを構成する主鎖はホスホジエステル結合によるもの（例えばＤＮＡ）に限定されない。例えばリン（Ｐ）ではなく硫黄（Ｓ）をバックボーンとしたホスホチオエート体や、ペプチド結合に基づくペプチド核酸からなるものであることもできる。また、塩基は、相補的な塩基対結合を可能とするものであれば良い。天然においては、アデニン、グアニン、シトシン、チミン及びウラシルの５種類により構成されるが、例えばブロモデオキシウリジン等の類似体であることもできる。
本発明はまた、上記多型部位を含む領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを提供する。このようなオリゴヌクレオチドは、好ましくは、上記本発明のＤＮＡの多型部位を含む領域にハイブリダイズするものである。ここで、「特異的」とは、上記本発明のＤＮＡの多型部位を含む領域にハイブリダイズし、他の領域にハイブリダイズしないことを意味する。このようなハイブリダイゼーションの条件は、当業者であれば適宜選択することができる。ハイブリダイゼーションの条件として、例えば低ストリンジェントな条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば４２℃、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件であり、好ましくは５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件である。より好ましいハイブリダイゼーションの条件としては、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳである。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては、温度や塩濃度等の複数の要素があり、当業者はこれらの要素を適宜選択することで、同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。本発明のオリゴヌクレオチドは、上記多型部位を含むＤＮＡ領域にハイブリダイズする限り、その鎖長に特に制限はないが、好ましくは１０ｍｅｒ〜２００ｍｅｒであり、より好ましくは１５ｍｅｒ〜１００ｍｅｒであり、更に好ましくは１５ｍｅｒ〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである。本発明のオリゴヌクレオチドは、前記多型を検出するためのプローブとして、前記多型を含むＤＮＡを精製するための吸着リガンドとして、さらにはＩ型糖尿病検査のためのＤＮＡチップ用プローブとして利用することができる。
尚、上記プライマー及びプローブは、当該技術分野で公知の方法によって製造することができ、例えば、ＤＮＡプライマー及びＤＮＡプローブは、ホスホトリエチル法、ホスホジエステル法またはこれらの自動化された方法等を利用して、簡便にはＤＮＡ自動合成機等を利用して本発明で開示する塩基配列に従って合成することができる。
本発明はまた、Ｉ型糖尿病の検査に用いるための、多型を含むＤＮＡを提供する。
本発明のＤＮＡには、
（ａ）配列番号１７で表される塩基配列または該塩基配列上の第６７〜７４番目の塩基中に一塩基が挿入された塩基配列からなるＤＮＡにおいて、第６７〜７４番目の塩基を含む塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号４７で表される塩基配列または該塩基配列上の第１７１番目の塩基が他の塩基に置換された塩基配列からなるＤＮＡにおいて、第１７１番目の塩基を含む塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｃ）配列番号１７で表される塩基配列または該塩基配列上の第２３３番目の塩基が他の塩基に置換された塩基配列からなるＤＮＡにおいて、第２３３番目の塩基を含む塩基配列からなるＤＮＡ、及び
（ｄ）配列番号１７で表される塩基配列または該塩基配列上の第４３３番目の塩基が他の塩基に置換された塩基配列からなるＤＮＡにおいて、第４３３番目の塩基を含む塩基配列からなるＤＮＡ、
が含まれる。
本発明のＤＮＡは、上記多型部位を含む限りその鎖長に制限はないが、好ましくは上記多型部位を含む１０ｂｐ〜２００ｂｐのＤＮＡであり、より好ましくは１５ｂｐ〜１００ｂｐのＤＮＡであり、更に好ましくは１５ｂｐ〜３０ｂｐである。
本発明のＤＮＡは、被験者由来のゲノムＤＮＡの制限酵素処理や、該ゲノムＤＮＡを鋳型にし、上記本発明のプライマーＤＮＡを利用したポリメラーゼ連鎖反応により得ることができ、Ｉ型糖尿病の検査において上記多型を検出するための試料（遺伝子診断のための試料）となる。また、Ｉ型糖尿病の検査のためのＤＮＡチップに利用することも可能である。
上記のプライマー及び／またはプローブは、Ｉ型糖尿病の検査試薬として使用することができる。更に、これらの試薬をパッケージングし、キットとして供給することも可能である。より具体的には、例えば以下の構成要素（Ａ）または（Ｂ）を含むものが挙げられる。
（Ａ） 以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のプライマー。
（ａ）配列番号１７で表される塩基配列からなるＤＮＡまたはその相補鎖にハイブリダイズし、かつ配列番号１７で表される塩基配列上の第６７〜７４番目の塩基またはその相補鎖の対応する塩基を挟み込むように設計されたＤＮＡプライマー
（ｂ）配列番号１７で表される塩基配列からなるＤＮＡまたはその相補鎖にハイブリダイズし、かつ配列番号１７で表される塩基配列上の第１７１番目の塩基またはその相補鎖の対応する塩基を挟み込むように設計されたＤＮＡプライマー
（ｃ）配列番号１７で表される塩基配列からなるＤＮＡまたはその相補鎖にハイブリダイズし、かつ配列番号１７で表される塩基配列上の第２３３番目の塩基またはその相補鎖の対応する塩基を挟み込むように設計されたＤＮＡプライマー
（ｄ）配列番号１７で表される塩基配列からなるＤＮＡまたはその相補鎖にハイブリダイズし、かつ配列番号１７で表される塩基配列上の第４３３番目の塩基またはその相補鎖の対応する塩基を挟み込むように設計されたＤＮＡプライマー
（Ｂ） 以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかの塩基を含む領域にハイブリダイズするＤＮＡプローブ。
（ａ）配列番号１７で表される塩基配列または該塩基配列上の第６７〜７４番目の８個の塩基中に１塩基が挿入された塩基配列からなるＤＮＡの第６７〜７４番目の塩基
（ｂ）配列番号１７で表される塩基配列または該塩基配列上の第１７１番目の塩基が他の塩基に置換された塩基配列からなるＤＮＡの第１７１番目の塩基
（ｃ）配列番号１７で表される塩基配列または該塩基配列上の第２３３番目の塩基が他の塩基に置換された塩基配列からなるＤＮＡの第２３３番目の塩基
（ｄ）配列番号１７で表される塩基配列または該塩基配列上の第４３３番目の塩基が他の塩基に置換された塩基配列からなるＤＮＡの第４３３番目の塩基
上記キットには、必要に応じて、更に酵素反応に好適な条件を与える緩衝液、合成反応生成物の検出のために必要な試薬類等を加えることが可能である。
尚、本発明において、ある塩基配列からなるＤＮＡと記載されている場合には、その塩基配列からなる一本鎖ＤＮＡ、該一本鎖ＤＮＡの相補鎖からなる一本鎖ＤＮＡ、それら２つの一本鎖ＤＮＡからなる二本鎖ＤＮＡなどを含む。
本発明のＩ型糖尿病の検査方法においては、多型の検出は公知の方法により行うことができる。多型の検出方法としては、例えば、二本鎖ＤＮＡ多型検出法（ＤＳＣＡ：Ｄｏｕｂｌｅ Ｓｔｒａｎｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）（Ａｒｇｕｅｌｌｏ ＪＲら，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ（１９９８）１８：１９２−１９４；Ｆｕｋｕｄａ Ｙら，Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ（１９９５）４５：４９−５６）、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、一本鎖高次構造多型）法（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．（１９９２），Ｊａｎ １，１２（１），１３９−１４６，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．（１９９１），Ａｕｇ １，６（８），１３１３−１３１８，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．（１９９５），Ａｐｒ １，４（５），２７５−２８２）、ＤＮＡチップを用いた方法（ポストゲノム時代の実験講座１ゲノム機能研究プロトコール，１４０−１４３，羊土社，Ｗａｎｇ，Ｄ．Ｇ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８０，１０７７−１０８２，（１９９８））、質量分析を用いた方法（Ｐｈｉｌｉｐ Ｒｏｓｓら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６，１３４７−１３５１，（１９９８））、塩基配列を直接決定する方法、などの方法を用いることができ、限定されるものではない。
本発明の検査方法の一つの態様は、被験者の標的多型部位を含む遺伝子領域の塩基配列を直接決定する方法である。具体的には、被験者からＤＮＡ試料を調製する工程、本発明のプライマーＤＮＡを用いて被験者由来のＤＮＡを増幅する工程、及び増幅したＤＮＡの塩基配列を決定する工程、を含む方法である。ＤＮＡの調製は、例えば被験者から採取した末梢血白血球からＱＩＡｍｐＤＮＡ ｂｌｏｏｄ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて行うことが可能である。次いで、標的多型部位を増幅し得る本発明のプライマーを設計し、これを用いて、調製したＤＮＡ試料を鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、得られたＰＣＲ産物の塩基配列を決定する。塩基配列の決定は、上記ＰＣＲに用いたプライマー対のうちいずれか一方をシークエンシングプライマーとして利用して行うと好適である。塩基配列の決定の結果検出された多型がＩ型糖尿病の患者型であれば、被験者はＩ型糖尿病の危険があると判定される。
多型部位を含むＤＮＡ試料の物理化学的性質の差を利用する検査方法として、被験者からＤＮＡ試料を調製する工程、本発明のプライマーＤＮＡを用いて被験者由来のＤＮＡを増幅する工程、及び増幅したＤＮＡを一本鎖に解離させる工程、解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離する工程、分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度を健常者の対照と比較する工程、を含むＰＣＲ−ＳＳＣＰ法が挙げられる。この方法は操作が比較的簡便であり、また試料の量も少なくてすむ等の利点を有している。
具体的には、まず、標的部位を含む領域を、本発明のプライマーを用いたＰＣＲ法等によって増幅する。増幅される範囲としては、１００〜６００ｂｐ程度の長さが好ましい。ＰＣＲ反応の条件は、当該分野において通常行われる範囲で行うことができる。ＰＣＲによる遺伝子断片増幅の際、標識したプライマーを用いるか、あるいはＰＣＲ反応液に標識した基質塩基を加えて反応させることによって、合成されるＤＮＡ断片を標識する。標識には３２Ｐ等の放射性同位体、蛍光色素、ビオチン等を用いることができる。こうして得られた標識されたＤＮＡ断片を、加熱等によって変性させ、尿素等の変性剤を含まないポリアクリルアミドゲルによって電気泳動を行う。この際、ゲルに適量（５から１０％程度）のグリセロールを添加することにより、ＤＮＡ断片の分離条件を改善することができる。電気泳動は通常室温（２０から２５℃）で行うが、好ましい分離が得られないときには４℃〜３０℃までの温度で行っても良い。電気泳動後、ＤＮＡ断片の移動度を、Ｘ線フィルムを用いたオートラジオグラフィーや、蛍光を検出するスキャナー等で検出し、解析する。標識したＤＮＡを用いない場合においても、電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイドや銀等によって染色することによって、バンドを検出することができる。
本発明のプローブを用いた検査方法として、ＤＮＡチップ等のＤＮＡマイクロアレイを用いた検査方法が挙げられる。本方法は、具体的には、例えば被験者からＤＮＡ試料を調製する工程、及び得られたＤＮＡ試料をＤＮＡチップ上に固定した本発明のプローブとハイブリダイズさせる工程、を含む。
この方法においては、上記と同様にしてＤＮＡ試料を調製し、場合によってＰＣＲ反応を行ってＤＮＡを増幅する。その後、ＤＮＡ試料またはＰＣＲ産物を蛍光物質やビオチン等で標識し、ＤＮＡチップ上に固定したオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせる。目的の多型を検出する際のＤＮＡチップ上のプローブとしては、１ＳＮＰ（２パターン）について、ＳＮＰ部位をプローブの中心にもつ配列、ＳＮＰの前後４個目の塩基を中心にもつ配列、ＳＮＰの前後１個目の塩基を中心にもつ配列、これらの各プローブに対して中央にミスマッチをもつネガティブコントロールのプローブ等を用いることができる。最後に、非特異的な結合を洗浄により除去した後、ハイブリダイズした遺伝子を同定し、多型を検出することができる。
本発明で使用できる検査方法の他の態様として、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）質量分析を用いた方法である。本方法は、具体的には、被験者からＤＮＡ試料を調製する工程、本発明のプライマーＤＮＡを用いて被験者由来のＤＮＡを増幅する工程、及び増幅したＤＮＡをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により測定する工程、を含む。
まず、上記と同様にしてＤＮＡ試料を調製し、ＰＣＲ反応によりＤＮＡを増幅した後、ＰＣＲ産物をマトリックス支援のもとにレーザー脱離イオン化し、飛行時間型質量分析計で測定することにより、多型を検出できる。更に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法に、プライマー伸長反応法を組み合わせた方法を用いても良い（ポストゲノム時代の実験講座１ゲノム機能研究プロトコール，１４４−１４９，羊土社，Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ａ．Ｈｏｆｆら，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７，３７８−３８８（１９９７），Ｔａｎｇ，Ｋ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：１００１６−１００２０（１９９０））。
更に本発明の検査方法の他の態様は、被験者からＤＮＡ試料を調製する工程、本発明のプライマーＤＮＡを用いて被験者由来のＤＮＡを増幅する工程、及び増幅したＤＮＡを、ＤＮＡ変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する工程、分離したＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する工程、を含む方法である。このような方法としては、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＤＧＧＥ）が挙げられる（Ｅｒｌｉｃｈ編，ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２），Ｃｈａｐｔｅｒ ７）。
本方法は、上記と同様にしてＤＮＡ試料を調製し、ＰＣＲ反応によりＤＮＡを増幅した後、これを尿素等の変性剤の濃度が移動するに従って徐々に高くなっているポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し、健常者と比較する。変異が存在する場合には、より低い変性剤濃度位置でＤＮＡ断片が一本鎖になり、極端に移動速度が遅くなるため、この移動度の差を検出することにより多型の存在を検出することができる。
本発明のＩ型糖尿病の検査方法において用いる多型の検出方法として、特に好ましいのはＤＳＣＡ法である。特に被験者のハプロタイプ解析の場合には、ＤＳＣＡ法が有用である。
ＤＳＣＡ法の原理は、標識した標準試料（レファレンス）と測定対象サンプルＤＮＡとの間のヘテロデュプレックスをアクリルアミドゲル中で電気泳動すると、測定対象サンプルの塩基配列の違い（ヘテロデュプレックス構成時のミスマッチ位置の違い）に応じて、その移動度が異なることを利用するものである。一般に、ヘテロデュプレックスの移動度はホモデュプレックスより遅れるが、この際にヘテロデュプレックスを形成する配列間の違いがより大きい程、移動度の遅れが生じると考えられており、このことを利用したＨＬＡタイピング法が開発されている（Ａｒｇｕｅｌｌｏ ＪＲら，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ（１９９８）１８：１９２−１９４；Ｆｕｋｕｄａ Ｙら，Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ（１９９５）４５：４９−５６；Ｈｉｇｕｃｈｉ Ｒ，ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｅｒｌｉｃｈ ＨＡ編）（１９８９）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ６１−７０；Ｒａｍｏｎ ＤＳら，Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９８）５９：７３４−７４７）。
ＤＳＣＡ法による多型検出の原法では、健常者集団に本来存在するアリル（ａｌｌｅｌｅ）をレファレンスとして、目的とする領域の多型を検出しようとする。しかしながら、本来存在するアリルをレファレンスとして用いた場合には、その移動度に明確な差がでず、テストしているサンプルのアリル型を明瞭に区別出来ないことがある。
そこで本発明者らは、一般に単塩基置換の場合より、塩基挿入／欠失の場合の方がヘテロデュプレックスの移動度が遅れやすい現象（Ｆｕｋｕｄａ Ｙら，Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ（１９９５）４５：４９−５６；Ｔｕｒｎｅｒ ＤＭら，Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ（１９９９）５４：４００−４０４）に着目し、人為的に１〜数塩基の挿入、欠失または置換等の変異を導入してレファレンスを作成することにより、サンプルのアリル型を明瞭に区別できることを見出した。つまり、人為的に欠失、挿入または置換を行うことにより、本来、天然には存在していない配列を持った人工的なレファレンスを作成したのである。
本発明でいう人工的な（非天然の）レファレンスとは、本来、天然には存在していない塩基配列を有しているレファレンスをいう。人工的なレファレンスを作成する際には、天然に存在する塩基配列を基にして、その多型部位の近傍領域に１〜数塩基の欠失、挿入または置換を行うことが好ましい。ここで、１〜数塩基とは、特に限定されるものではないが、好ましくは１〜１０塩基、さらに好ましくは１〜５塩基、最も好ましくは１〜２塩基である。本発明でいう多型部位の近傍領域とは、好ましくは多型部位から１０塩基以内、さらに好ましくは５塩基以内、最も好ましくは３塩基以内を指す。
又、塩基配列の中に複数の多型部位が存在する場合には、その複数の多型部位の中から１又は数個の多型部位を選択し、選択した多型部位の近傍領域に１〜数塩基の欠失、挿入または置換を行ってもよいが、塩基配列中に含まれる全ての多型部位について近傍領域に１〜数塩基の欠失、挿入または置換を行ってもよい
本発明のレファレンスを用いたハプロタイプ検出方法は、ハプロタイプのタイピング精度が飛躍的に向上しており、高精度かつ高効率でハプロタイプの検出が可能である。
尚、上記したいずれの検査方法においても、測定対象であるＤＮＡ試料はヒト由来のサンプルであり、これを含むものであれば特に限定なく、例えば血液、骨髄液、精液、腹腔液、尿等の体液、肝臓等の組織細胞、毛髪等の体毛等を利用できる。ゲノムＤＮＡは、これらのサンプルより常法に従い抽出、精製し、調製することができる。
本発明により見出されたＩ型糖尿病と相関のある多型はＩｋＢＬ１遺伝子のプロモーター領域に存在しており、この多型はＩｋＢＬ１遺伝子の転写に影響を与えることが見出された。つまり、Ｉ型糖尿病感受性と関連するアリルではＩｋＢＬ１遺伝子の転写活性が高く、ＩｋＢＬ１の発現が多いことが考えられる為、ＩｋＢＬ１遺伝子はＩ型糖尿病の発症に何らかの関与をしている可能性が示唆される。
従って、このＩｋＢＬ１を阻害することにより、Ｉ型糖尿病を治療若しくは抑制することが可能と考えられ、ＩｋＢＬ１抑制物質はＩ型糖尿病治療薬又は抑制薬になると考えられる。
ＩｋＢＬ１抑制物質には、ＩｋＢＬ１に結合してＩｋＢＬ１の活性を阻害する物質や、ＩｋＢＬ１遺伝子の転写を抑制する物質などが含まれる。
ＩｋＢＬ１遺伝子の転写を抑制する物質としては、ＩｋＢＬ１遺伝子に対するアンチセンスが挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、例えば、ＩｋＢＬ１をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡのいずれかの箇所にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくはＩｋＢＬ１のＤＮＡまたはｍＲＮＡ中の連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。さらに好ましくは、連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチドがプロモーター領域若しくは翻訳開始コドンを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、それらの誘導体や修飾体を使用することができ、例えば、メチルホスホネート型やエチルホスホネート型のような低級アルキルホスホネート修飾体、ホスホロチオエート修飾体又はホスホロアミデート修飾体等が挙げられる。
ＩｋＢＬ１に結合してＩｋＢＬ１の活性を阻害する物質としては、例えばＩｋＢＬ１に対する抗体が考えられる。ＩｋＢＬ１に対する抗体はＩｋＢＬ１を抗原として公知の方法により作成することができる。
本発明の抗体は、抗原と結合する限り特に制限はなく、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体、キメラ抗体、ヒト型化抗体、ヒト抗体等を適宜用いることができる。抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、均質な抗体を安定に生産できる点でモノクローナル抗体が好ましい。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は当業者に周知の方法により作製することができる。
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、所望の抗原や所望の抗原を発現する細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞（ハイブリドーマ）をスクリーニングすることによって作製できる。ハイブリドーマの作製は、たとえば、ミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３：３−４６）等に準じて行うことができる。抗原の免疫原性が低い場合には、アルブミン等の免疫原性を有する巨大分子と結合させ、免疫を行えばよい。
また、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた遺伝子組換え型抗体を用いることも（例えば、Ｃａｒｌ，Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｊａｍｅｓ，Ｗ．Ｌａｒｒｉｃｋ，ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ ｂｙ ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ ＬＴＤ，１９９０参照）。具体的には、ハイブリドーマのｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域（Ｖ領域）のｃＤＮＡを合成する。目的とする抗体のＶ領域をコードするＤＮＡが得られれば、これを所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。または、抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、抗体Ｃ領域のＤＮＡを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。
本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体、ヒト型化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体などを使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードするＤＮＡをヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。
ヒト型化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡをヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ ２３９４００、国際特許出願公開番号ＷＯ ９６／０２５７６参照）。ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９３）５３，８５１−８５６）。
また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（国際特許出願公開番号ＷＯ ９３／１２２２７，ＷＯ ９２／０３９１８，ＷＯ ９４／０２６０２，ＷＯ ９４／２５５８５，ＷＯ ９６／３４０９６，ＷＯ ９６／３３７３５参照）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に衆知であり、ＷＯ ９２／０１０４７，ＷＯ ９２／２０７９１，ＷＯ ９３／０６２１３，ＷＯ ９３／１１２３６，ＷＯ ９３／１９１７２，ＷＯ ９５／０１４３８，ＷＯ ９５／１５３８８を参考にすることができる。
抗体遺伝子を一旦単離し、適当な宿主に導入して抗体を作製する場合には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を用いることができる。動物細胞としては、（１）哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ，ＣＯＳ，ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ ｈａｍｓｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ），ＨｅＬａ，Ｖｅｒｏ，（２）両生類細胞、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞、あるいは（３）昆虫細胞、例えば、ｓｆ９，ｓｆ２１，Ｔｎ５などが知られている。植物細胞としては、ニコティアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）属、例えばニコティアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞が知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、例えばアスペスギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）などが知られている。原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌が知られている。これらの細胞に、目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することにより抗体が得られる。
また、抗体はＰｅｔＴに結合し、ＩｋＢＬ１の機能を阻害するかぎり、抗体の断片又はその修飾物であってもよい。例えば、抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、またはＨ鎖若しくはＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えばパパイン、ペプシンなどで処理し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６、Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．及びＨｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．及びＳｋｅｒｒａ，Ａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１２１，６６３−６６９、Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ら，ＴＩＢＴＥＣＨ（１９９１）９，１３２−１３７参照）。ｓｃＦｖは、抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域とを連結することにより得られる。このｓｃＦｖにおいて、Ｈ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域は、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ（１９８８）８５，５８７９−５８８３）。ｓｃＦｖにおけるＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域は、本明細書に抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。Ｖ領域を連結するペプチドリンカーとしては、例えば１２−１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体のＨ鎖またはＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ、およびＬ鎖またはＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡのうち、それらの配列のうちの全部又は所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、およびその両端が各々Ｈ鎖、Ｌ鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合わせて増幅することにより得られる。また、一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従ってｓｃＦｖを得ることができる。これらの抗体断片は、前記と同様にして遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。本発明における「抗体」にはこれらの抗体も包含される。
前記のように発現、産生された抗体は、通常のタンパク質の精製で使用されている公知の方法により精製することができる。例えば、プロテインＡカラムなどのアフィニティーカラム、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）。
抗体の抗原結合活性（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）の測定には公知の手段を使用することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）あるいは蛍光免疫法などを用いることができる。
本発明の治療薬、抑制薬は、Ｉ型糖尿病の治療または予防に使われる。
本発明の治療薬は、経口、非経口投与のいずれでも可能であるが、好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。投与量としては、例えば、一回につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり０．００１〜１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲で投与量を選ぶことができる。しかしながら、本発明の治療薬はこれらの投与量に制限されるものではない。また、発明の治療薬は、常法に従って製剤化することができ（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｌａｔｅｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｒｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ）、医薬的に許容される担体や添加物を供に含むものであってもよい。
以下、本発明を実施例を挙げて更に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
［実施例１］ ＩＫＢＬ１遺伝子多型の検索
ＤＮＡ試料としては、ヒト末梢血の白血球より抽出したゲノムＤＮＡを用いた。ゲノムＤＮＡ抽出は標準的なプロテアーゼＫ／ＳＤＳ／フェノール／クロロホルム法（Ｋｉｍｕｒａ Ａ及びＳａｓａｚｕｋｉ Ｔ，ＨＬＡ１９９１ ｖｏｌ．１（Ｔｓｕｊｉ Ｋら編）（１９９２），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ｐｐ３９７−４１９）によった。
ＩＫＢＬ１遺伝子（Ｓｈｉｉｎａ Ｔら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（１９９８）４７：３７２−３８２）の全ゲノム構造は既に明らかになっているため、データベース配列（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＰ０００５０５）を参考にして、ＩＫＢＬ１遺伝子プロモーター領域及び第１エクソンならびに第２、第３、第４エクソンとその周辺のイントロンをＰＣＲ法で増幅するためのプライマーセット（表１、配列番号１〜１６）を作製した。
ついで、９６名の健常日本人由来の白血球ＤＮＡから、これらのプライマーセットを用いて当該ＤＮＡ領城をＰＣＲ法で増幅し、一本鎖ＤＮＡ構造多型法（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＳＣＰ）（Ｈｏｓｈｉｎｏ Ｓら，Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９２）３３：９８−１０７）を用いて、各ＰＣＲ産物内の多型を検索した。個体によって異なるＳＳＣＰパターン（１本鎖ＤＮＡのポリアクリルアミドゲル電気泳動パターン）が認められた場合には、当該ＰＣＲ産物をクローニングし、ダイターミネーター法によって塩基配列を決定することで、ＩＫＢＬ１遺伝子プロモーター内の少なくとも４箇所に多型を確認した（図１）。
具体的には、表１に示したプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅したＩＫＢＬ１遺伝子各領域の多型を、一本鎖構造多型検出法でスクリーニングした。９６名の日本人集団の解析では、明らかな多型ＳＳＣＰパターンは、Ｐ１Ｆ（配列番号５）とＰ１Ｒ（配列番号６）でのＰＣＲ産物及びＥ１Ｆ（配列番号７）とＥ１Ｒ（配列番号８）でのＰＣＲ産物を用いた場合にのみ認められた。そこで、多型パターンを示す個人について、各々のＤＮＡからＰ１ＦとＰ１Ｒ、Ｅ１ＦとＥ１Ｒ、またはＰ１ＦとＥ１Ｒの組み合わせでＰＣＲを行い、そのＰＣＲ産物をクローニング後、塩基配列を決定した。その結果、図１に示す４箇所に多型が認められた。すなわち−４２２の上流にＴが８個（Ｔ８）または９個（Ｔ９）の多型、−３２５位がＣまたはＧの多型、−２６３位がＡまたはＧの多型、および−６３がＴまたはＡの多型である。これらのうち、特に−２６３位はＲｅｌ／Ｅ２Ｆ、−６３位はｂＨＬＨの各々の転写因子結合配列と極めて高い相同性を示す配列内に存在する多型である。またＳＳＣＰパターンからヘテロ接合と推定される個体を含めて、複数のサンプルについてクローニングして塩基配列を決定した結果から、日本人集団におけるＩＫＢＬ１多型の組み合わせ（ハプロタイプ）として、図２に示すアリル０１（配列番号１７）、０２（配列番号１８）、０３（配列番号１９）、０４（配列番号２０）、０５（配列番号２１）の少なくとも５種が存在することが判明した。なおアリル０６（配列番号２２）は、二本鎖ＤＮＡ多型検出法によるハプロタイプ解析の指標として人為的に作製したものであり、日本人集団中には存在しなかった。
［実施例２］ ＩＫＢＬ１遺伝子検査領域の増幅
実施例１で確認したＩＫＢＬ１遺伝子プロモーター内の４箇所の多型を検出するため、これらの組み合わせ（プロモーター多型ハプロタイプ）を識別・検出する方法論を開発した。まず検査対象とするヒト血液ＤＮＡから、ＩＫＢＬ１プロモーター領域及び第１エクソン（配列番号１７の第４９６〜６２１番）を含むＤＮＡ領域（図１）を、プライマーＰ１Ｆ（配列番号５）とＥ１Ｒ（配列番号８）のセットを用いてＰＣＲ法で増幅した。ＰＣＲ条件は、９５℃５分間の熱変性に続いて、９５℃３０秒／５６℃３０秒／７２℃３０秒のサイクルを３０回くり返した後に、７２℃１０分間の伸長反応を行うものであり、ＡＢＩ社のＰＣＲ９７００またはＰＣＲ９６００を用いた。得られたＰＣＲ産物の一部をクローニングし、塩基配列を決定することで、図２に示すように、少なくとも５種のアリル（プロモーターハプロタイプ）の存在を日本人集団に確認した。また、このようにして得られたＰＣＲ産物は下記実施例４でサンプルＰＣＲ産物として、ＩＫＢＬ１アリルの測定に用いた。
［実施例３］ 標識した標準試料（レファレンス１及び２）の作製
ＤＳＣＡ法による多型検出の原法では、健常者集団に本来存在するアリルをレファレンスとして、目的とする領域の多型を検出しようとするものである。そこで、本発明者らはまず、ＩＫＢＬ１プロモーターアリル０１〜０５（配列番号１７〜２１）（図２）の各々をレファレンスとして、個々のＩＫＢＬ１アリルとのヘテロデュプレックスの移動度を検討した。その結果、アリル間の配列がより違う場合ほど移動度がより遅れる現象を確認したが、その移動度の違いは、テストしているサンプルのアリル型を明瞭に区別出来るものではなかった。
このため、一般に単塩基置換の場合より、塩基挿入／欠失の場合の方がヘテロデュプレックスの移動度が遅れやすい現象（Ｆｕｋｕｄａ Ｙら，Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ（１９９５）４５：４９−５６；Ｔｕｒｎｅｒ ＤＭら，Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ（１９９９）５４：４００−４０４）に着目し、人為的に１〜２塩基の挿入または欠失を導入したものをレファレンスとする着想に至った。そこで変異プライマー法を用いてアリル０３（配列番号１９）の−４２２位に１塩基欠失（Ｔ８→Ｔ７）及び−２６２位に１塩基置換（Ｇ→Ａ）を導入したレファレンス１を作製した。図３にレファレンス１（配列番号２３）及びレファレンス２（配列番号２４）の塩基配列を示す。これらのレファレンスは、上記のＩＫＢＬ１遺伝子プロモーターハプロタイプ配列決定の過程で得られたアリル０３（配列番号１９）およびアリル０４（配列番号２０）の各々のＤＮＡを基にして、２箇所ずつに挿入、欠失または置換変異を導入したものである。変異の導入は変異プライマーを用いたＰＣＲ法（Ｈｏｓｈｉｎｏ Ｓら，Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９２）３３：９８−１０７）により行い、得られた変異ＰＣＲ産物をクローニングし、塩基配列を確認したものをレファレンス１および２とした。このクローン化されたレファレンス１およびレファレンス２をテンプレートとして、Ｃｙ−５で５’端を標識したＥ１Ｒ（配列番号８）と未標識のＰ１Ｆ（配列番号５）を用いて、前記実施例２の条件下でＰＣＲを行い、標識レファレンスを作製した。
［実施例４］ 二本鎖ＤＮＡ形成と構造多型検出のための電気泳動
上記実施例３で作製した標識レファレンス（１μｌ）と前記実施例２で作製したサンプルＰＣＲ産物（３μｌ）を混合し、９５℃で４分間の変性後、５５℃で１５分間、ついで１５℃で５分間のアニーリングを行った。その後１．０μｌのフィコールローディングバッファー（１５％フィコール、０．２５％ブロモフェノールブルー）を加え、６％ポリアクリルアミドゲル（２１ｃｍ長、０．５ｍｍ厚、Ｌｏｎｇ ＲａｎｇｅｒＴＭ Ｇｅｌ）中で電気泳動した。電気泳動はＡＬＦ ｅｘｐｒｅｓｓシーケンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用い、３０Ｗ定電圧、４０℃の条件下で行った。また、移動度測定値を補正するための内部標準として、Ｃｙ−５で標識したボトムマーカー（５１９ｂｐ）及びトップマーカー（８７０ｂｐ）をサンプルと同時に泳動した。螢光標識された２本鎖ＤＮＡの移動度をＦｒａｇｍｅｎｔ ＭａｎａｇｅｒＴＭソフトウェア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で解析し、ＩＫＢＬ１プロモーター配列の違いを電気泳動度の違いとして検出した。これらの泳動条件は、二本鎖ＤＮＡ構造解析による変異検出法（ＤＳＣＡ）に関する論文に示された原法（Ａｒｇｕｅｌｌｏ ＪＲら，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ（１９９８）１８：１９２−１９４）に従うものであるが、解析するＤＮＡの長さが約７００塩基対であるため、泳動時間を４時間に変更した。なお、従来の方法では健常者集団に存在する配列そのものをレファレンスとしているが、本発明者らは、レファレンスに人為的に変異を導入することで、多型ないし多型ハプロタイプをより高精度かつ効率良く検出することを可能とした。
このレファレンス１を用いると、アリル０３をレファレンスとした場合（図４左）に比較して、特にアリル０２及び０４の移動度の遅れが顕著となった（図４右）。一方、変異プライマー法を用いてアリル０３の−４２２位に一塩基欠失を導入したものではアリル０３をレファレンスにした場合に比べてアリル０２の遅れが顕著になるが、アリル０３は移動度がほとんど遅れていない（図４中）。すなわち、本来１塩基置換でしか区別出来ないアリルをより効率的に区別するためには、その違いの存在する部位の直近に１〜数塩基程度の短い挿入、欠失または置換変異を１個または複数個導入することが有効であることが発見された。
このように、作製した非天然のレファレンス１およびレファレンス２を用いることで、日本人集団に認められたＩＫＢＬ１アリル０１〜０５（配列番号１７〜２１）の５種、および人為的に作製したアリル０６（図２、配列番号２２）の全てを明瞭に区別することが可能となった（図５）。ここで特記すべきことは、アリル０１と０４のヘテロ接合体（０１／０４）と、０５と０６のヘテロ接合体（０５／０６）は、個々の位置の多型についてみると、いずれの場合とも−４２２位がＴ８／Ｔ８、−３２６位がＣ／Ｇ、−２６３位がＡ／Ａ、−６３位がＴ／Ａである。このため、個々の多型部位のみを検討する限りでは０１／０４と０５／０６のどちらのアリルの組み合わせであるかを区別できないが、本発明者らが開発した測定法を用いると、これらは明瞭に区別可能となった（図５）。すなわち、この測定法はＩＫＢＬ１プロモーターの多型の組み合わせ（ハプロタイプ）を直接検出することを可能とする。また、この測定法を用いて、種々のハプロタイプのヘテロ接合について、ＩＫＢＬ１アリルを決定可能であることが確認された（図６）。
［実施例５］ ＩＫＢＬ１プロモーターハプロタイプとＩ型糖尿病との関連
日本人健常者２１３名を前記実施例４に従って解析し、各人のＩＫＢＬ１プロモーターハプロタイプ型を決定した。また同様に日本人Ｉ型糖尿病患者１３８名を対象とした解析を行った。ついで各プロモーターハプロタイプ（ＩＫＢＬ１アリル）の陽性率（表２）及びプロモーター多型陽性率（表３）を患者集団と健常者集団で比較した。関連の強さは２×２表を用いて相対危険率で示し、その統計学的有意性はカイ２乗法によって検定した。またＰ値に検出したアリルの数を乗じることで補正Ｐ（Ｐｃ）値を算出し、Ｐｃ値が０．０５未満の場合を有意な関連と判定した。
その結果、表２に示すように、ＩＫＢＬ１アリル０１陽性者は、患者群８１．９％、健常者群５９．２％であり、患者群に有意に多く存在した（相対危険率３．１２、Ｐｃ値＝０．００００４）。一方、ＩＫＢＬ１アリル０３陽性者は、患者群１３．０％、健常者群３５．２％であり、患者群に有意に少ないこと（相対危険率０．３８、Ｐｃ値＝０．００００２）が判明した。このことから、アリル０１は本症への感受性、アリル０３は抵抗性と強く関連する遺伝マーカーであることが示される。
これに対して、プロモーターの各多型とＩ型糖尿病との関連を検討すると、表３に示す結果を得た。すなわち、各多型を指標とした場合には、−２６３Ｇ陽性者が患者群に有意に少ない（患者１３．０％ｖｓ健常者３５．２％、相対危険率０．２８、Ｐｃ値＝０．０００００９）ことが観察された。これは、検討した日本人集団において−２６３Ｇとアリル０３とが完全に１：１対応をしていることによるものである。一方、アリル０１とのみ１：１対応する多型は存在しない（図２に示すように、アリル０１を構成する多型は、いずれも０１以外の複数のアリルと共通である）ため、患者群に高い頻度で認める多型はあるものの、いずれも相対危険率は比較的低く、かつその頻度差は統計学的に有意ではなかった。すなわち、ＩＫＢＬ１プロモーター多型を個々に判定することでは、感受性との弱い関連としか診断出来ない。しかしながら、ＩＫＢＬ１プロモーターでみられる多型をハプロタイプとして一括して判定することで、Ｉ型糖尿病への感受性因子および抵抗性因子を保持しているか否かを的確に診断可能とするものである。
産業上の利用の可能性
以上詳述したように、本発明によりＩｋＢＬ１遺伝子プロモーター領域に見られる多型を検出することによって、Ｉ型糖尿病の検査方法を提供することができる。また、遺伝子の多型ハプロタイプを識別するための実用的なタイピング方法を提供することができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、解析対象としたＩＫＢＬ１遺伝子の塩基配列を示す。多型を認める部位（−４２２，−３２５，−２６３，−６３）と多型配列（二重下線）を示す。波線下線はＰ１Ｆに対応する配列、点線下線はＥ１Ｒに対応する配列を示す。第一エクソンは一重下線で示す。
図２は、ＩＫＢＬ１遺伝子プロモーターアリルの模式図を示す。アリルごとに多型部位の塩基を示す。
図３は、レファレンス−１及びレファレンス−２の塩基配列を示す。レファレンス−１及び２は、それぞれアリル０３、０４に２箇所ずつの変異（欠失変異、挿入変異、または塩基置換）を人為的に導入したものである。導入変異部分を二重下線で示す。
図４は、レファレンスの違いによる泳動パターンの相違を示す。テストしたアリル名を左端に示す。左から、アリル０３、アリル０３の−４２２位で１塩基欠失（Ｔ８→Ｔ７）したもの（＃１７）、さらに−２６２位に１塩基置換（Ａ→Ｇ）を導入した配列（レファレンス−１）をレファレンスとして用いた。レファレンスのホモデュプレックスの位置を矢頭で、テストアリルとレファレンスのヘテロデュプレックスの位置を矢印で示す。アリル０３をレファレンスにした場合でもヘテロデュプレックスの移動度は遅れるが、人為的に変異を導入したものをレファレンスにすると、変異導入が多いほど移動度の遅れは顕著になる。
図５は、ＤＳＣＡ法によるＩＫＢＬ１プロモーターアリルの決定法を示す。左端にテストしたアリル名とその多型配列構成を示す。左はレファレンス−１を用いた場合、右はレファレンス−２を用いた場合の、それぞれのアリルの電気泳動パターンを示す。レファレンスのホモデュプレックスの位置を矢頭で、テストアリルとレファレンスのヘテロデュプレックスの位置を矢印で示す。下２段は０１／０４と０５／０６のヘテロ接合体の泳動パターンを示すが、それぞれのヘテロデュプレックスの位置はそれぞれを構成するアリルによるヘテロデュプレックスの位置に対応している。
図６は、ＤＳＣＡ法によるＩＫＢＬ１遺伝子タイピングの実際例を示す。最上段はレファレンスのみを泳動したもの、続く６段は個々のアリルのホモ接合パターン、その下には種々のアリルのホモおよびヘテロ接合パターンを示す。左にサンプル番号と、ＩＫＢＬ１タイピングの結果を（ ）内に示す。
本発明は、塩基配列多型を検出することを特徴とするＩ型糖尿病の検査方法、該検査方法に使用されるプライマー及びプローブ、並びに該プライマー及び／またはプローブを含むＩ型糖尿病の検査試薬または検査キットに関する。
本発明は更に、二本鎖ＤＮＡ多型検出法（ＤＳＣＡ）を用いることを特徴とするハプロタイプの検出方法に関する。
背景技術
Ｉ型糖尿病（インスリン依存性糖尿病）は膵臓β細胞を標的とする自己免疫疾患であり、その発症には遺伝的な要因すなわち何らかの遺伝子変異が関与すると考えられている。この遺伝的な要因を同定する目的で以前よりＨＬＡの解析が行われており、本疾患への感受性および抵抗性を規定する遺伝子がＨＬＡ領域内に存在することが示され、特にＨＬＡ−ＤＲ／ＤＱ領域内のＤＲＢ１遺伝子とＤＱＢ１遺伝子の関与が明らかとなっている。しかしながら、ＨＬＡに連鎖した本疾患への感受性・抵抗性は、必ずしもＤＲＢ１とＤＱＢ１遺伝子のみでは説明出来ない。さらに最近の欧米人における詳細な家系解析では、最も関連の強い領域はＤＲ／ＤＱ領域であるが、それとは別にＴＮＦ領域近傍にも強い関連を示す領域があり、そこには本疾患への感受性および抵抗性をコントロールする遺伝子が存在すると推定される（Ｚａｖａｔｔａｒｉ Ｐら，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ（２０００）２０：２９６７−２９７２）。
本発明者らは日本人本症患者を対象としたＨＬＡ領域内遺伝子群の解析を行っており、本症への感受性・抵抗性がＤＲＢ１とＤＱＢ１の相互作用によってコントロールされること（Ｙａｓｕｎａｇａ Ｓら，Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ（１９９６）４７：３７−４８）、本症への感受性にＨＬＡ−Ｂが関与すること（Ｈａｍａｇｕｃｈｉ Ｋら，Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ（２０００）５５：１０−１５）を報告して来た。
発明の開示
本発明者らはＨＬＡ領域内の多数のマイクロサテライトマーカーの多型解析を行い、本症への感受性・抵抗性と強く関連する領域として、ＤＲ／ＤＱ領域およびＨＬＡ−Ｂ領域の２領域以外に、もうひとつＴＮＦ近傍領域を発見した。さらに、このＴＮＦ近傍領域内に存在するＩＫＢＬ１遺伝子に着目した解析を行い、本遺伝子のプロモーター領域の４箇所に多型（Ａｌｌｃｏｃｋ ＲＪＮら，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（２００１）５２：２８９−２９３）が存在することを確認した。また、ＩＫＢＬ１遺伝子のプロモーター多型は、それぞれが異なる転写因子の結合配列に類似した配列部位に認められることから、これらのプロモーター多型、ないしプロモーター多型ハプロタイプはＩＫＢＬ１遺伝子の転写制御における個体差と関連することが示唆される。
しかしながら、これらの多型とＩ型糖尿病との直接の関連については知られておらず、また特定のハプロタイプとの関連については全く報告されていない。
本発明者らはＩ型糖尿病とＩＫＢＬ１遺伝子との関連を直接解明することを目的として、このプロモーター多型を個別に識別・検出する方法に加え、個々の多型を一括した多型ハプロタイプとして識別するための実用的なタイピング法を開発した。開発したタイピング法は二本鎖ＤＮＡ構造多型解析法（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ，ＤＳＣＡ）（Ａｒｇｕｅｌｌｏ ＪＲら，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ（１９９８）１８：１９２−１９４；Ｆｕｋｕｄａ Ｙら，Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ（１９９５）４５：４９−５６）を基本原理とするが、タイピングに用いるレファレンスに挿入、欠失または置換変異を人為的に導入することで、タイピング精度を飛躍的に向上させたものである。
従って、本発明はＩｋＢＬ１遺伝子のプロモーター領域の多型を検出することを特徴とするＩ型糖尿病の検査方法に関する。又、本発明は多型、特にハプロタイプの検出方法に関する。さらに、本発明はＩｋＢＬ１阻害物質を有効成分とするＩ型糖尿病治療薬に関する。
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１１）を提供する。
（１） 以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかの塩基の多型を検出することを特徴とする、Ｉ型糖尿病の検査方法。
（ａ）配列番号１７で表される塩基配列上の第６７〜７４番目の塩基またはその相補鎖上の対応する塩基
（ｂ）配列番号１７で表される塩基配列上の第１７１番目の塩基またはその相補鎖上の対応する塩基
（ｃ）配列番号１７で表される塩基配列上の第２３３番目の塩基またはその相補鎖上の対応する塩基
（ｄ）配列番号１７で表される塩基配列上の第４３３番目の塩基またはその相補鎖上の対応する塩基
（２） 上記（ａ）から（ｄ）の塩基の多型のハプロタイプを検出することを特徴とする、上記（１）に記載のＩ型糖尿病の検査方法。
（３） Ｉ型糖尿病の検査に用いるための、以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のプライマー。
（ａ）配列番号１７で表される塩基配列からなるＤＮＡまたはその相補鎖にハイブリダイズし、かつ配列番号１７で表される塩基配列上の第６７〜７４番目の塩基またはその相補鎖の対応する塩基を挟み込むように設計されたＤＮＡプライマー
（ｂ）配列番号１７で表される塩基配列からなるＤＮＡまたはその相補鎖にハイブリダイズし、かつ配列番号１７で表される塩基配列上の第１７１番目の塩基またはその相補鎖の対応する塩基を挟み込むように設計されたＤＮＡプライマー
（ｃ）配列番号１７で表される塩基配列からなるＤＮＡまたはその相補鎖にハイブリダイズし、かつ配列番号１７で表される塩基配列上の第２３３番目の塩基またはその相補鎖の対応する塩基を挟み込むように設計されたＤＮＡプライマー
（ｄ）配列番号１７で表される塩基配列からなるＤＮＡまたはその相補鎖にハイブリダイズし、かつ配列番号１７で表される塩基配列上の第４３３番目の塩基またはその相補鎖の対応する塩基を挟み込むように設計されたＤＮＡプライマー
（４） 以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかの塩基を含む領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
（ａ）配列番号１７で表される塩基配列または該塩基配列上の第６７〜７４番目の塩基中に１塩基が挿入された塩基配列からなるＤＮＡの第６７〜７４番目及び挿入された１塩基を含む塩基
（ｂ）配列番号１７で表される塩基配列または該塩基配列上の第１７１番目の塩基が他の塩基に置換された塩基配列からなるＤＮＡの第１７１番目の塩基
（ｃ）配列番号１７で表される塩基配列または該塩基配列上の第２３３番目の塩基が他の塩基に置換された塩基配列からなるＤＮＡの第２３３番目の塩基
（ｄ）配列番号１７で表される塩基配列または該塩基配列上の第４３３番目の塩基が他の塩基に置換された塩基配列からなるＤＮＡの第４３３番目の塩基
（５） Ｉ型糖尿病の検査のために用いるプローブである、上記（４）に記載のオリゴヌクレオチド。
（６） 上記（３）に記載のプライマー及び／または上記（５）に記載のプローブを含む、Ｉ型糖尿病の検査試薬。
（７） 上記（３）に記載のプライマー及び／または上記（５）に記載のプローブを含む、Ｉ型糖尿病の検査キット。
（８） Ｉ型糖尿病の検査に用いるための、以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号１７で表される塩基配列または該塩基配列上の第６７〜７４番目の塩基中に一塩基が挿入された塩基配列からなるＤＮＡにおいて、第６７〜７４番目の塩基を含む塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１７で表される塩基配列または該塩基配列上の第１７１番目の塩基が他の塩基に置換された塩基配列からなるＤＮＡにおいて、第１７１番目の塩基を含む塩基配列からなるＤＮＡ
（ｃ）配列番号１７で表される塩基配列または該塩基配列上の第２３３番目の塩基が他の塩基に置換された塩基配列からなるＤＮＡにおいて、第２３３番目の塩基を含む塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号１７で表される塩基配列または該塩基配列上の第４３３番目の塩基が他の塩基に置換された塩基配列からなるＤＮＡにおいて、第４３３番目の塩基を含む塩基配列からなるＤＮＡ
（９） 二本鎖ＤＮＡ多型検出法（ＤＳＣＡ）を用いることを特徴とするハプロタイプの検出方法。
（１０） ＤＳＣＡに用いるレファレンスが非天然型のレファレンスであることを特徴とする上記（９）に記載の検出方法。
（１１） 多型部位の近傍領域に１〜数塩基の欠失、挿入または置換を行うことにより非天然型のレファレンスを作製することを含む、上記（１０）に記載の検出方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００１−３０６８６８号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
発明を実施するための最良の形態
遺伝的多型の一つである一塩基多型（ＳＮＰ）とは、集団内で１％以上の頻度で出現する、塩基配列上の単一塩基の置換、挿入、または欠失による多型をいう。ＳＮＰは、ゲノム上に広く高密度に分布し、疾患の有無、人種及び個人により異なるため、疾患感受性、人種及び個人差を検出する為の有益なマーカーとなり得る。
本発明において、ＩｋＢＬ１遺伝子のプロモーター領域に存在する多型（図１に示す４箇所の多型）が、Ｉ型糖尿病の発症と相関があることが見出された。すなわち、遺伝子の転写開始点（配列番号１７で表される、後述するアリル（ａｌｌｅｌｅ）０１の塩基配列上の第４９６番目の塩基）を１とし、その上流に向かって−１からさかのぼって−４２２位に相当する塩基の上流にＴが８個（Ｔ８）（配列番号１７の第６７〜７４番目）または９個（Ｔ９）（配列番号１７の第６７〜７４番目の塩基に対して１塩基挿入）の多型、−３２５位（配列番号１７の第１７１番目）がＣまたはＧの多型、−２６３位（配列番号１７の第２３３番目）がＡまたはＧの多型、および−６３（配列番号１７の第４３３番目）がＴまたはＡの多型である（図１）。さらに、アリル０１（配列番号１７）（−４２２位（第６７〜７４番目）がＴ８、−３２５位（第１７１番目）の塩基がＣ、−２６３位（第２３３番目）の塩基がＡ、−６３位（第４３３番目）の塩基がＴ）を有している場合には、Ｉ型糖尿病を発症する確率が高いことが判明した。又、アリル０３（配列番号１９）（−４２２位がＴ８、−３２５位がＣ、−２６３位がＧ、−６３位がＴ）を有している場合にはＩ型糖尿病を発症する確率が低いことが判明した。
従って、これらの各位置の多型又は相補鎖上の対応する多型を指標として、Ｉ型糖尿病の検査を行うことができる。
本発明のＩ型糖尿病の検査は−４２２位、−３２５番目、−２６３番目、−６３番目の塩基の多型の中から１又は複数の多型を選択して個々の多型を検出することにより行うことも可能であるが、それら４つの多型のハプロタイプとして検出することにより行うことが好ましい。
なお、本発明におけるＩ型糖尿病の検査方法には、既にＩ型糖尿病の症状を発症している患者の検査及び、未だ症状を発症していない被験者がＩ型糖尿病にかかりやすいか否かを判断する為に行う検査などが含まれる。本発明の検査では、被験者から検出した多型が、Ｉ型糖尿病患者において有意に頻度の高い多型である場合、被験者はＩ型糖尿病に羅患する危険性が高いと判断され、そうでない場合には、被験者はＩ型糖尿病に羅患する可能性が低いと判断される。
本発明のＩ型糖尿病の検査には、前記遺伝的多型を検出するために、プライマー及び／またはプローブが使用され得る。本発明の検査方法に用いられるプライマーとしては、配列番号１７に表される塩基配列からなるＤＮＡまたはその相補鎖にハイブリダイズし、かつ、標的多型部位（配列番号１７に表される塩基配列における第６７〜７４番、第１７１番、第２３３番、または第４３３番の塩基）を挟み込むように設計されたプライマーであることが必要である。ここで，「挟み込む」とは、フォワードプライマー及びリバースプライマーからなるプライマー対によって増幅されるＤＮＡ断片の塩基配列中に（標的多型部位を）含むことをいう。本発明の検査に用いるプライマーは、通常、１０ｍｅｒ〜１００ｍｅｒであり、好ましくは１５ｍｅｒ〜４０ｍｅｒ、更に好ましくは１８ｍｅｒ〜３０ｍｅｒである。また、当該プライマーによって増幅されるＤＮＡ領域の長さは、５０ｂｐ〜５，０００ｂｐ、好ましくは１００ｂｐ〜１，５００ｂｐ、更に好ましくは２００ｂｐ〜７００ｂｐである。尚、プライマーの鋳型ＤＮＡへのハイブリダイゼーションは、当分野において通常用いられる条件下で行うことができる。プライマーは、相補的な塩基対結合を形成できること、そしてその３’末端において相補鎖合成の起点となる−ＯＨ基を与えることの２つの条件を満たしている限り、プライマーを構成する主鎖はホスホジエステル結合によるもの（例えばＤＮＡ）に限定されない。例えばリン（Ｐ）ではなく硫黄（Ｓ）をバックボーンとしたホスホチオエート体や、ペプチド結合に基づくペプチド核酸からなるものであることもできる。また、塩基は、相補的な塩基対結合を可能とするものであれば良い。天然においては、アデニン、グアニン、シトシン、チミン及びウラシルの５種類により構成されるが、例えばブロモデオキシウリジン等の類似体であることもできる。
本発明はまた、上記多型部位を含む領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを提供する。このようなオリゴヌクレオチドは、好ましくは、上記本発明のＤＮＡの多型部位を含む領域にハイブリダイズするものである。ここで、「特異的」とは、上記本発明のＤＮＡの多型部位を含む領域にハイブリダイズし、他の領域にハイブリダイズしないことを意味する。このようなハイブリダイゼーションの条件は、当業者であれば適宜選択することができる。ハイブリダイゼーションの条件として、例えば低ストリンジェントな条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば４２℃、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件であり、好ましくは５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件である。より好ましいハイブリダイゼーションの条件としては、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳである。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては、温度や塩濃度等の複数の要素があり、当業者はこれらの要素を適宜選択することで、同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。本発明のオリゴヌクレオチドは、上記多型部位を含むＤＮＡ領域にハイブリダイズする限り、その鎖長に特に制限はないが、好ましくは１０ｍｅｒ〜２００ｍｅｒであり、より好ましくは１５ｍｅｒ〜１００ｍｅｒであり、更に好ましくは１５ｍｅｒ〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである。本発明のオリゴヌクレオチドは、前記多型を検出するためのプローブとして、前記多型を含むＤＮＡを精製するための吸着リガンドとして、さらにはＩ型糖尿病検査のためのＤＮＡチップ用プローブとして利用することができる。
尚、上記プライマー及びプローブは、当該技術分野で公知の方法によって製造することができ、例えば、ＤＮＡプライマー及びＤＮＡプローブは、ホスホトリエチル法、ホスホジエステル法またはこれらの自動化された方法等を利用して、簡便にはＤＮＡ自動合成機等を利用して本発明で開示する塩基配列に従って合成することができる。
本発明はまた、Ｉ型糖尿病の検査に用いるための、多型を含むＤＮＡを提供する。
本発明のＤＮＡには、
（ａ）配列番号１７で表される塩基配列または該塩基配列上の第６７〜７４番目の塩基中に一塩基が挿入された塩基配列からなるＤＮＡにおいて、第６７〜７４番目の塩基を含む塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号４７で表される塩基配列または該塩基配列上の第１７１番目の塩基が他の塩基に置換された塩基配列からなるＤＮＡにおいて、第１７１番目の塩基を含む塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｃ）配列番号１７で表される塩基配列または該塩基配列上の第２３３番目の塩基が他の塩基に置換された塩基配列からなるＤＮＡにおいて、第２３３番目の塩基を含む塩基配列からなるＤＮＡ、及び
（ｄ）配列番号１７で表される塩基配列または該塩基配列上の第４３３番目の塩基が他の塩基に置換された塩基配列からなるＤＮＡにおいて、第４３３番目の塩基を含む塩基配列からなるＤＮＡ、
が含まれる。
本発明のＤＮＡは、上記多型部位を含む限りその鎖長に制限はないが、好ましくは上記多型部位を含む１０ｂｐ〜２００ｂｐのＤＮＡであり、より好ましくは１５ｂｐ〜１００ｂｐのＤＮＡであり、更に好ましくは１５ｂｐ〜３０ｂｐである。
本発明のＤＮＡは、被験者由来のゲノムＤＮＡの制限酵素処理や、該ゲノムＤＮＡを鋳型にし、上記本発明のプライマーＤＮＡを利用したポリメラーゼ連鎖反応により得ることができ、Ｉ型糖尿病の検査において上記多型を検出するための試料（遺伝子診断のための試料）となる。また、Ｉ型糖尿病の検査のためのＤＮＡチップに利用することも可能である。
上記のプライマー及び／またはプローブは、Ｉ型糖尿病の検査試薬として使用することができる。更に、これらの試薬をパッケージングし、キットとして供給することも可能である。より具体的には、例えば以下の構成要素（Ａ）または（Ｂ）を含むものが挙げられる。
（Ａ） 以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のプライマー。
（ａ）配列番号１７で表される塩基配列からなるＤＮＡまたはその相補鎖にハイブリダイズし、かつ配列番号１７で表される塩基配列上の第６７〜７４番目の塩基またはその相補鎖の対応する塩基を挟み込むように設計されたＤＮＡプライマー
（ｂ）配列番号１７で表される塩基配列からなるＤＮＡまたはその相補鎖にハイブリダイズし、かつ配列番号１７で表される塩基配列上の第１７１番目の塩基またはその相補鎖の対応する塩基を挟み込むように設計されたＤＮＡプライマー
（ｃ）配列番号１７で表される塩基配列からなるＤＮＡまたはその相補鎖にハイブリダイズし、かつ配列番号１７で表される塩基配列上の第２３３番目の塩基またはその相補鎖の対応する塩基を挟み込むように設計されたＤＮＡプライマー
（ｄ）配列番号１７で表される塩基配列からなるＤＮＡまたはその相補鎖にハイブリダイズし、かつ配列番号１７で表される塩基配列上の第４３３番目の塩基またはその相補鎖の対応する塩基を挟み込むように設計されたＤＮＡプライマー
（Ｂ） 以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかの塩基を含む領域にハイブリダイズするＤＮＡプローブ。
（ａ）配列番号１７で表される塩基配列または該塩基配列上の第６７〜７４番目の８個の塩基中に１塩基が挿入された塩基配列からなるＤＮＡの第６７〜７４番目の塩基
（ｂ）配列番号１７で表される塩基配列または該塩基配列上の第１７１番目の塩基が他の塩基に置換された塩基配列からなるＤＮＡの第１７１番目の塩基
（ｃ）配列番号１７で表される塩基配列または該塩基配列上の第２３３番目の塩基が他の塩基に置換された塩基配列からなるＤＮＡの第２３３番目の塩基
（ｄ）配列番号１７で表される塩基配列または該塩基配列上の第４３３番目の塩基が他の塩基に置換された塩基配列からなるＤＮＡの第４３３番目の塩基
上記キットには、必要に応じて、更に酵素反応に好適な条件を与える緩衝液、合成反応生成物の検出のために必要な試薬類等を加えることが可能である。
尚、本発明において、ある塩基配列からなるＤＮＡと記載されている場合には、その塩基配列からなる一本鎖ＤＮＡ、該一本鎖ＤＮＡの相補鎖からなる一本鎖ＤＮＡ、それら２つの一本鎖ＤＮＡからなる二本鎖ＤＮＡなどを含む。
本発明のＩ型糖尿病の検査方法においては、多型の検出は公知の方法により行うことができる。多型の検出方法としては、例えば、二本鎖ＤＮＡ多型検出法（ＤＳＣＡ：Ｄｏｕｂｌｅ Ｓｔｒａｎｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）（Ａｒｇｕｅｌｌｏ ＪＲら，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ（１９９８）１８：１９２−１９４；Ｆｕｋｕｄａ Ｙら，Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ（１９９５）４５：４９−５６）、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、一本鎖高次構造多型）法（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．（１９９２），Ｊａｎ １，１２（１），１３９−１４６，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．（１９９１），Ａｕｇ １，６（８），１３１３−１３１８，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．（１９９５），Ａｐｒ １，４（５），２７５−２８２）、ＤＮＡチップを用いた方法（ポストゲノム時代の実験講座１ゲノム機能研究プロトコール，１４０−１４３，羊土社，Ｗａｎｇ，Ｄ．Ｇ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８０，１０７７−１０８２，（１９９８））、質量分析を用いた方法（Ｐｈｉｌｉｐ Ｒｏｓｓら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６，１３４７−１３５１，（１９９８））、塩基配列を直接決定する方法、などの方法を用いることができ、限定されるものではない。
本発明の検査方法の一つの態様は、被験者の標的多型部位を含む遺伝子領域の塩基配列を直接決定する方法である。具体的には、被験者からＤＮＡ試料を調製する工程、本発明のプライマーＤＮＡを用いて被験者由来のＤＮＡを増幅する工程、及び増幅したＤＮＡの塩基配列を決定する工程、を含む方法である。ＤＮＡの調製は、例えば被験者から採取した末梢血白血球からＱＩＡｍｐＤＮＡ ｂｌｏｏｄ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて行うことが可能である。次いで、標的多型部位を増幅し得る本発明のプライマーを設計し、これを用いて、調製したＤＮＡ試料を鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、得られたＰＣＲ産物の塩基配列を決定する。塩基配列の決定は、上記ＰＣＲに用いたプライマー対のうちいずれか一方をシークエンシングプライマーとして利用して行うと好適である。塩基配列の決定の結果検出された多型がＩ型糖尿病の患者型であれば、被験者はＩ型糖尿病の危険があると判定される。
多型部位を含むＤＮＡ試料の物理化学的性質の差を利用する検査方法として、被験者からＤＮＡ試料を調製する工程、本発明のプライマーＤＮＡを用いて被験者由来のＤＮＡを増幅する工程、及び増幅したＤＮＡを一本鎖に解離させる工程、解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離する工程、分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度を健常者の対照と比較する工程、を含むＰＣＲ−ＳＳＣＰ法が挙げられる。この方法は操作が比較的簡便であり、また試料の量も少なくてすむ等の利点を有している。
具体的には、まず、標的部位を含む領域を、本発明のプライマーを用いたＰＣＲ法等によって増幅する。増幅される範囲としては、１００〜６００ｂｐ程度の長さが好ましい。ＰＣＲ反応の条件は、当該分野において通常行われる範囲で行うことができる。ＰＣＲによる遺伝子断片増幅の際、標識したプライマーを用いるか、あるいはＰＣＲ反応液に標識した基質塩基を加えて反応させることによって、合成されるＤＮＡ断片を標識する。標識には３２Ｐ等の放射性同位体、蛍光色素、ビオチン等を用いることができる。こうして得られた標識されたＤＮＡ断片を、加熱等によって変性させ、尿素等の変性剤を含まないポリアクリルアミドゲルによって電気泳動を行う。この際、ゲルに適量（５から１０％程度）のグリセロールを添加することにより、ＤＮＡ断片の分離条件を改善することができる。電気泳動は通常室温（２０から２５℃）で行うが、好ましい分離が得られないときには４℃〜３０℃までの温度で行っても良い。電気泳動後、ＤＮＡ断片の移動度を、Ｘ線フィルムを用いたオートラジオグラフィーや、蛍光を検出するスキャナー等で検出し、解析する。標識したＤＮＡを用いない場合においても、電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイドや銀等によって染色することによって、バンドを検出することができる。
本発明のプローブを用いた検査方法として、ＤＮＡチップ等のＤＮＡマイクロアレイを用いた検査方法が挙げられる。本方法は、具体的には、例えば被験者からＤＮＡ試料を調製する工程、及び得られたＤＮＡ試料をＤＮＡチップ上に固定した本発明のプローブとハイブリダイズさせる工程、を含む。
この方法においては、上記と同様にしてＤＮＡ試料を調製し、場合によってＰＣＲ反応を行ってＤＮＡを増幅する。その後、ＤＮＡ試料またはＰＣＲ産物を蛍光物質やビオチン等で標識し、ＤＮＡチップ上に固定したオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせる。目的の多型を検出する際のＤＮＡチップ上のプローブとしては、１ＳＮＰ（２パターン）について、ＳＮＰ部位をプローブの中心にもつ配列、ＳＮＰの前後４個目の塩基を中心にもつ配列、ＳＮＰの前後１個目の塩基を中心にもつ配列、これらの各プローブに対して中央にミスマッチをもつネガティブコントロールのプローブ等を用いることができる。最後に、非特異的な結合を洗浄により除去した後、ハイブリダイズした遺伝子を同定し、多型を検出することができる。
本発明で使用できる検査方法の他の態様として、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）質量分析を用いた方法である。本方法は、具体的には、被験者からＤＮＡ試料を調製する工程、本発明のプライマーＤＮＡを用いて被験者由来のＤＮＡを増幅する工程、及び増幅したＤＮＡをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により測定する工程、を含む。
まず、上記と同様にしてＤＮＡ試料を調製し、ＰＣＲ反応によりＤＮＡを増幅した後、ＰＣＲ産物をマトリックス支援のもとにレーザー脱離イオン化し、飛行時間型質量分析計で測定することにより、多型を検出できる。更に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法に、プライマー伸長反応法を組み合わせた方法を用いても良い（ポストゲノム時代の実験講座１ゲノム機能研究プロトコール，１４４−１４９，羊土社，Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ａ．Ｈｏｆｆら，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７，３７８−３８８（１９９７），Ｔａｎｇ，Ｋ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：１００１６−１００２０（１９９０））。
更に本発明の検査方法の他の態様は、被験者からＤＮＡ試料を調製する工程、本発明のプライマーＤＮＡを用いて被験者由来のＤＮＡを増幅する工程、及び増幅したＤＮＡを、ＤＮＡ変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する工程、分離したＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する工程、を含む方法である。このような方法としては、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＤＧＧＥ）が挙げられる（Ｅｒｌｉｃｈ編，ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２），Ｃｈａｐｔｅｒ ７）。
本方法は、上記と同様にしてＤＮＡ試料を調製し、ＰＣＲ反応によりＤＮＡを増幅した後、これを尿素等の変性剤の濃度が移動するに従って徐々に高くなっているポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し、健常者と比較する。変異が存在する場合には、より低い変性剤濃度位置でＤＮＡ断片が一本鎖になり、極端に移動速度が遅くなるため、この移動度の差を検出することにより多型の存在を検出することができる。
本発明のＩ型糖尿病の検査方法において用いる多型の検出方法として、特に好ましいのはＤＳＣＡ法である。特に被験者のハプロタイプ解析の場合には、ＤＳＣＡ法が有用である。
ＤＳＣＡ法の原理は、標識した標準試料（レファレンス）と測定対象サンプルＤＮＡとの間のヘテロデュプレックスをアクリルアミドゲル中で電気泳動すると、測定対象サンプルの塩基配列の違い（ヘテロデュプレックス構成時のミスマッチ位置の違い）に応じて、その移動度が異なることを利用するものである。一般に、ヘテロデュプレックスの移動度はホモデュプレックスより遅れるが、この際にヘテロデュプレックスを形成する配列間の違いがより大きい程、移動度の遅れが生じると考えられており、このことを利用したＨＬＡタイピング法が開発されている（Ａｒｇｕｅｌｌｏ ＪＲら，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ（１９９８）１８：１９２−１９４；Ｆｕｋｕｄａ Ｙら，Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ（１９９５）４５：４９−５６；Ｈｉｇｕｃｈｉ Ｒ，ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｅｒｌｉｃｈ ＨＡ編）（１９８９）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ６１−７０；Ｒａｍｏｎ ＤＳら，Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９８）５９：７３４−７４７）。
ＤＳＣＡ法による多型検出の原法では、健常者集団に本来存在するアリル（ａｌｌｅｌｅ）をレファレンスとして、目的とする領域の多型を検出しようとする。しかしながら、本来存在するアリルをレファレンスとして用いた場合には、その移動度に明確な差がでず、テストしているサンプルのアリル型を明瞭に区別出来ないことがある。
そこで本発明者らは、一般に単塩基置換の場合より、塩基挿入／欠失の場合の方がヘテロデュプレックスの移動度が遅れやすい現象（Ｆｕｋｕｄａ Ｙら，Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ（１９９５）４５：４９−５６；Ｔｕｒｎｅｒ ＤＭら，Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ（１９９９）５４：４００−４０４）に着目し、人為的に１〜数塩基の挿入、欠失または置換等の変異を導入してレファレンスを作成することにより、サンプルのアリル型を明瞭に区別できることを見出した。つまり、人為的に欠失、挿入または置換を行うことにより、本来、天然には存在していない配列を持った人工的なレファレンスを作成したのである。
本発明でいう人工的な（非天然の）レファレンスとは、本来、天然には存在していない塩基配列を有しているレファレンスをいう。人工的なレファレンスを作成する際には、天然に存在する塩基配列を基にして、その多型部位の近傍領域に１〜数塩基の欠失、挿入または置換を行うことが好ましい。ここで、１〜数塩基とは、特に限定されるものではないが、好ましくは１〜１０塩基、さらに好ましくは１〜５塩基、最も好ましくは１〜２塩基である。本発明でいう多型部位の近傍領域とは、好ましくは多型部位から１０塩基以内、さらに好ましくは５塩基以内、最も好ましくは３塩基以内を指す。
又、塩基配列の中に複数の多型部位が存在する場合には、その複数の多型部位の中から１又は数個の多型部位を選択し、選択した多型部位の近傍領域に１〜数塩基の欠失、挿入または置換を行ってもよいが、塩基配列中に含まれる全ての多型部位について近傍領域に１〜数塩基の欠失、挿入または置換を行ってもよい
本発明のレファレンスを用いたハプロタイプ検出方法は、ハプロタイプのタイピング精度が飛躍的に向上しており、高精度かつ高効率でハプロタイプの検出が可能である。
尚、上記したいずれの検査方法においても、測定対象であるＤＮＡ試料はヒト由来のサンプルであり、これを含むものであれば特に限定なく、例えば血液、骨髄液、精液、腹腔液、尿等の体液、肝臓等の組織細胞、毛髪等の体毛等を利用できる。ゲノムＤＮＡは、これらのサンプルより常法に従い抽出、精製し、調製することができる。
本発明により見出されたＩ型糖尿病と相関のある多型はＩｋＢＬ１遺伝子のプロモーター領域に存在しており、この多型はＩｋＢＬ１遺伝子の転写に影響を与えることが見出された。つまり、Ｉ型糖尿病感受性と関連するアリルではＩｋＢＬ１遺伝子の転写活性が高く、ＩｋＢＬ１の発現が多いことが考えられる為、ＩｋＢＬ１遺伝子はＩ型糖尿病の発症に何らかの関与をしている可能性が示唆される。
従って、このＩｋＢＬ１を阻害することにより、Ｉ型糖尿病を治療若しくは抑制することが可能と考えられ、ＩｋＢＬ１抑制物質はＩ型糖尿病治療薬又は抑制薬になると考えられる。
ＩｋＢＬ１抑制物質には、ＩｋＢＬ１に結合してＩｋＢＬ１の活性を阻害する物質や、ＩｋＢＬ１遺伝子の転写を抑制する物質などが含まれる。
ＩｋＢＬ１遺伝子の転写を抑制する物質としては、ＩｋＢＬ１遺伝子に対するアンチセンスが挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、例えば、ＩｋＢＬ１をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡのいずれかの箇所にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくはＩｋＢＬ１のＤＮＡまたはｍＲＮＡ中の連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。さらに好ましくは、連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチドがプロモーター領域若しくは翻訳開始コドンを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、それらの誘導体や修飾体を使用することができ、例えば、メチルホスホネート型やエチルホスホネート型のような低級アルキルホスホネート修飾体、ホスホロチオエート修飾体又はホスホロアミデート修飾体等が挙げられる。
ＩｋＢＬ１に結合してＩｋＢＬ１の活性を阻害する物質としては、例えばＩｋＢＬ１に対する抗体が考えられる。ＩｋＢＬ１に対する抗体はＩｋＢＬ１を抗原として公知の方法により作成することができる。
本発明の抗体は、抗原と結合する限り特に制限はなく、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体、キメラ抗体、ヒト型化抗体、ヒト抗体等を適宜用いることができる。抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、均質な抗体を安定に生産できる点でモノクローナル抗体が好ましい。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は当業者に周知の方法により作製することができる。
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、所望の抗原や所望の抗原を発現する細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞（ハイブリドーマ）をスクリーニングすることによって作製できる。ハイブリドーマの作製は、たとえば、ミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３：３−４６）等に準じて行うことができる。抗原の免疫原性が低い場合には、アルブミン等の免疫原性を有する巨大分子と結合させ、免疫を行えばよい。
また、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた遺伝子組換え型抗体を用いることも（例えば、Ｃａｒｌ，Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｊａｍｅｓ，Ｗ．Ｌａｒｒｉｃｋ，ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ ｂｙ ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ ＬＴＤ，１９９０参照）。具体的には、ハイブリドーマのｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域（Ｖ領域）のｃＤＮＡを合成する。目的とする抗体のＶ領域をコードするＤＮＡが得られれば、これを所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。または、抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、抗体Ｃ領域のＤＮＡを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。
本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体、ヒト型化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体などを使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードするＤＮＡをヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。
ヒト型化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡをヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ ２３９４００、国際特許出願公開番号ＷＯ ９６／０２５７６参照）。ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９３）５３，８５１−８５６）。
また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（国際特許出願公開番号ＷＯ ９３／１２２２７，ＷＯ ９２／０３９１８，ＷＯ ９４／０２６０２，ＷＯ ９４／２５５８５，ＷＯ ９６／３４０９６，ＷＯ ９６／３３７３５参照）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に衆知であり、ＷＯ ９２／０１０４７，ＷＯ ９２／２０７９１，ＷＯ ９３／０６２１３，ＷＯ ９３／１１２３６，ＷＯ ９３／１９１７２，ＷＯ ９５／０１４３８，ＷＯ ９５／１５３８８を参考にすることができる。
抗体遺伝子を一旦単離し、適当な宿主に導入して抗体を作製する場合には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を用いることができる。動物細胞としては、（１）哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ，ＣＯＳ，ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ ｈａｍｓｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ），ＨｅＬａ，Ｖｅｒｏ，（２）両生類細胞、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞、あるいは（３）昆虫細胞、例えば、ｓｆ９，ｓｆ２１，Ｔｎ５などが知られている。植物細胞としては、ニコティアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）属、例えばニコティアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞が知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、例えばアスペスギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）などが知られている。原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌が知られている。これらの細胞に、目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することにより抗体が得られる。
また、抗体はＰｅｔＴに結合し、ＩｋＢＬ１の機能を阻害するかぎり、抗体の断片又はその修飾物であってもよい。例えば、抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、またはＨ鎖若しくはＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えばパパイン、ペプシンなどで処理し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６、Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．及びＨｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．及びＳｋｅｒｒａ，Ａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１２１，６６３−６６９、Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ら，ＴＩＢＴＥＣＨ（１９９１）９，１３２−１３７参照）。ｓｃＦｖは、抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域とを連結することにより得られる。このｓｃＦｖにおいて、Ｈ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域は、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ（１９８８）８５，５８７９−５８８３）。ｓｃＦｖにおけるＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域は、本明細書に抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。Ｖ領域を連結するペプチドリンカーとしては、例えば１２−１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体のＨ鎖またはＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ、およびＬ鎖またはＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡのうち、それらの配列のうちの全部又は所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、およびその両端が各々Ｈ鎖、Ｌ鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合わせて増幅することにより得られる。また、一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従ってｓｃＦｖを得ることができる。これらの抗体断片は、前記と同様にして遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。本発明における「抗体」にはこれらの抗体も包含される。
前記のように発現、産生された抗体は、通常のタンパク質の精製で使用されている公知の方法により精製することができる。例えば、プロテインＡカラムなどのアフィニティーカラム、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）。
抗体の抗原結合活性（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）の測定には公知の手段を使用することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）あるいは蛍光免疫法などを用いることができる。
本発明の治療薬、抑制薬は、Ｉ型糖尿病の治療または予防に使われる。
本発明の治療薬は、経口、非経口投与のいずれでも可能であるが、好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。投与量としては、例えば、一回につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり０．００１〜１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲で投与量を選ぶことができる。しかしながら、本発明の治療薬はこれらの投与量に制限されるものではない。また、発明の治療薬は、常法に従って製剤化することができ（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｌａｔｅｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｒｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ）、医薬的に許容される担体や添加物を供に含むものであってもよい。
以下、本発明を実施例を挙げて更に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
［実施例１］ ＩＫＢＬ１遺伝子多型の検索
ＤＮＡ試料としては、ヒト末梢血の白血球より抽出したゲノムＤＮＡを用いた。ゲノムＤＮＡ抽出は標準的なプロテアーゼＫ／ＳＤＳ／フェノール／クロロホルム法（Ｋｉｍｕｒａ Ａ及びＳａｓａｚｕｋｉ Ｔ，ＨＬＡ１９９１ ｖｏｌ．１（Ｔｓｕｊｉ Ｋら編）（１９９２），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ｐｐ３９７−４１９）によった。
ＩＫＢＬ１遺伝子（Ｓｈｉｉｎａ Ｔら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（１９９８）４７：３７２−３８２）の全ゲノム構造は既に明らかになっているため、データベース配列（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＰ０００５０５）を参考にして、ＩＫＢＬ１遺伝子プロモーター領域及び第１エクソンならびに第２、第３、第４エクソンとその周辺のイントロンをＰＣＲ法で増幅するためのプライマーセット（表１、配列番号１〜１６）を作製した。
具体的には、表１に示したプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅したＩＫＢＬ１遺伝子各領域の多型を、一本鎖構造多型検出法でスクリーニングした。９６名の日本人集団の解析では、明らかな多型ＳＳＣＰパターンは、Ｐ１Ｆ（配列番号５）とＰ１Ｒ（配列番号６）でのＰＣＲ産物及びＥ１Ｆ（配列番号７）とＥ１Ｒ（配列番号８）でのＰＣＲ産物を用いた場合にのみ認められた。そこで、多型パターンを示す個人について、各々のＤＮＡからＰ１ＦとＰ１Ｒ、Ｅ１ＦとＥ１Ｒ、またはＰ１ＦとＥ１Ｒの組み合わせでＰＣＲを行い、そのＰＣＲ産物をクローニング後、塩基配列を決定した。その結果、図１に示す４箇所に多型が認められた。すなわち−４２２の上流にＴが８個（Ｔ８）または９個（Ｔ９）の多型、−３２５位がＣまたはＧの多型、−２６３位がＡまたはＧの多型、および−６３がＴまたはＡの多型である。これらのうち、特に−２６３位はＲｅｌ／Ｅ２Ｆ、−６３位はｂＨＬＨの各々の転写因子結合配列と極めて高い相同性を示す配列内に存在する多型である。またＳＳＣＰパターンからヘテロ接合と推定される個体を含めて、複数のサンプルについてクローニングして塩基配列を決定した結果から、日本人集団におけるＩＫＢＬ１多型の組み合わせ（ハプロタイプ）として、図２に示すアリル０１（配列番号１７）、０２（配列番号１８）、０３（配列番号１９）、０４（配列番号２０）、０５（配列番号２１）の少なくとも５種が存在することが判明した。なおアリル０６（配列番号２２）は、二本鎖ＤＮＡ多型検出法によるハプロタイプ解析の指標として人為的に作製したものであり、日本人集団中には存在しなかった。
［実施例２］ ＩＫＢＬ１遺伝子検査領域の増幅
実施例１で確認したＩＫＢＬ１遺伝子プロモーター内の４箇所の多型を検出するため、これらの組み合わせ（プロモーター多型ハプロタイプ）を識別・検出する方法論を開発した。まず検査対象とするヒト血液ＤＮＡから、ＩＫＢＬ１プロモーター領域及び第１エクソン（配列番号１７の第４９６〜６２１番）を含むＤＮＡ領域（図１）を、プライマーＰ１Ｆ（配列番号５）とＥ１Ｒ（配列番号８）のセットを用いてＰＣＲ法で増幅した。ＰＣＲ条件は、９５℃５分間の熱変性に続いて、９５℃３０秒／５６℃３０秒／７２℃３０秒のサイクルを３０回くり返した後に、７２℃１０分間の伸長反応を行うものであり、ＡＢＩ社のＰＣＲ９７００またはＰＣＲ９６００を用いた。得られたＰＣＲ産物の一部をクローニングし、塩基配列を決定することで、図２に示すように、少なくとも５種のアリル（プロモーターハプロタイプ）の存在を日本人集団に確認した。また、このようにして得られたＰＣＲ産物は下記実施例４でサンプルＰＣＲ産物として、ＩＫＢＬ１アリルの測定に用いた。
［実施例３］ 標識した標準試料（レファレンス１及び２）の作製
ＤＳＣＡ法による多型検出の原法では、健常者集団に本来存在するアリルをレファレンスとして、目的とする領域の多型を検出しようとするものである。そこで、本発明者らはまず、ＩＫＢＬ１プロモーターアリル０１〜０５（配列番号１７〜２１）（図２）の各々をレファレンスとして、個々のＩＫＢＬ１アリルとのヘテロデュプレックスの移動度を検討した。その結果、アリル間の配列がより違う場合ほど移動度がより遅れる現象を確認したが、その移動度の違いは、テストしているサンプルのアリル型を明瞭に区別出来るものではなかった。
このため、一般に単塩基置換の場合より、塩基挿入／欠失の場合の方がヘテロデュプレックスの移動度が遅れやすい現象（Ｆｕｋｕｄａ Ｙら，Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ（１９９５）４５：４９−５６；Ｔｕｒｎｅｒ ＤＭら，Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ（１９９９）５４：４００−４０４）に着目し、人為的に１〜２塩基の挿入または欠失を導入したものをレファレンスとする着想に至った。そこで変異プライマー法を用いてアリル０３（配列番号１９）の−４２２位に１塩基欠失（Ｔ８→Ｔ７）及び−２６２位に１塩基置換（Ｇ→Ａ）を導入したレファレンス１を作製した。図３にレファレンス１（配列番号２３）及びレファレンス２（配列番号２４）の塩基配列を示す。これらのレファレンスは、上記のＩＫＢＬ１遺伝子プロモーターハプロタイプ配列決定の過程で得られたアリル０３（配列番号１９）およびアリル０４（配列番号２０）の各々のＤＮＡを基にして、２箇所ずつに挿入、欠失または置換変異を導入したものである。変異の導入は変異プライマーを用いたＰＣＲ法（Ｈｏｓｈｉｎｏ Ｓら，Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９２）３３：９８−１０７）により行い、得られた変異ＰＣＲ産物をクローニングし、塩基配列を確認したものをレファレンス１および２とした。このクローン化されたレファレンス１およびレファレンス２をテンプレートとして、Ｃｙ−５で５’端を標識したＥ１Ｒ（配列番号８）と未標識のＰ１Ｆ（配列番号５）を用いて、前記実施例２の条件下でＰＣＲを行い、標識レファレンスを作製した。
［実施例４］ 二本鎖ＤＮＡ形成と構造多型検出のための電気泳動
上記実施例３で作製した標識レファレンス（１μｌ）と前記実施例２で作製したサンプルＰＣＲ産物（３μｌ）を混合し、９５℃で４分間の変性後、５５℃で１５分間、ついで１５℃で５分間のアニーリングを行った。その後１．０μｌのフィコールローディングバッファー（１５％フィコール、０．２５％ブロモフェノールブルー）を加え、６％ポリアクリルアミドゲル（２１ｃｍ長、０．５ｍｍ厚、Ｌｏｎｇ ＲａｎｇｅｒＴＭ Ｇｅｌ）中で電気泳動した。電気泳動はＡＬＦ ｅｘｐｒｅｓｓシーケンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用い、３０Ｗ定電圧、４０℃の条件下で行った。また、移動度測定値を補正するための内部標準として、Ｃｙ−５で標識したボトムマーカー（５１９ｂｐ）及びトップマーカー（８７０ｂｐ）をサンプルと同時に泳動した。螢光標識された２本鎖ＤＮＡの移動度をＦｒａｇｍｅｎｔ ＭａｎａｇｅｒＴＭソフトウェア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で解析し、ＩＫＢＬ１プロモーター配列の違いを電気泳動度の違いとして検出した。これらの泳動条件は、二本鎖ＤＮＡ構造解析による変異検出法（ＤＳＣＡ）に関する論文に示された原法（Ａｒｇｕｅｌｌｏ ＪＲら，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ（１９９８）１８：１９２−１９４）に従うものであるが、解析するＤＮＡの長さが約７００塩基対であるため、泳動時間を４時間に変更した。なお、従来の方法では健常者集団に存在する配列そのものをレファレンスとしているが、本発明者らは、レファレンスに人為的に変異を導入することで、多型ないし多型ハプロタイプをより高精度かつ効率良く検出することを可能とした。
このレファレンス１を用いると、アリル０３をレファレンスとした場合（図４左）に比較して、特にアリル０２及び０４の移動度の遅れが顕著となった（図４右）。一方、変異プライマー法を用いてアリル０３の−４２２位に一塩基欠失を導入したものではアリル０３をレファレンスにした場合に比べてアリル０２の遅れが顕著になるが、アリル０３は移動度がほとんど遅れていない（図４中）。すなわち、本来１塩基置換でしか区別出来ないアリルをより効率的に区別するためには、その違いの存在する部位の直近に１〜数塩基程度の短い挿入、欠失または置換変異を１個または複数個導入することが有効であることが発見された。
このように、作製した非天然のレファレンス１およびレファレンス２を用いることで、日本人集団に認められたＩＫＢＬ１アリル０１〜０５（配列番号１７〜２１）の５種、および人為的に作製したアリル０６（図２、配列番号２２）の全てを明瞭に区別することが可能となった（図５）。ここで特記すべきことは、アリル０１と０４のヘテロ接合体（０１／０４）と、０５と０６のヘテロ接合体（０５／０６）は、個々の位置の多型についてみると、いずれの場合とも−４２２位がＴ８／Ｔ８、−３２６位がＣ／Ｇ、−２６３位がＡ／Ａ、−６３位がＴ／Ａである。このため、個々の多型部位のみを検討する限りでは０１／０４と０５／０６のどちらのアリルの組み合わせであるかを区別できないが、本発明者らが開発した測定法を用いると、これらは明瞭に区別可能となった（図５）。すなわち、この測定法はＩＫＢＬ１プロモーターの多型の組み合わせ（ハプロタイプ）を直接検出することを可能とする。また、この測定法を用いて、種々のハプロタイプのヘテロ接合について、ＩＫＢＬ１アリルを決定可能であることが確認された（図６）。
［実施例５］ ＩＫＢＬ１プロモーターハプロタイプとＩ型糖尿病との関連
日本人健常者２１３名を前記実施例４に従って解析し、各人のＩＫＢＬ１プロモーターハプロタイプ型を決定した。また同様に日本人Ｉ型糖尿病患者１３８名を対象とした解析を行った。ついで各プロモーターハプロタイプ（ＩＫＢＬ１アリル）の陽性率（表２）及びプロモーター多型陽性率（表３）を患者集団と健常者集団で比較した。関連の強さは２×２表を用いて相対危険率で示し、その統計学的有意性はカイ２乗法によって検定した。またＰ値に検出したアリルの数を乗じることで補正Ｐ（Ｐｃ）値を算出し、Ｐｃ値が０．０５未満の場合を有意な関連と判定した。
これに対して、プロモーターの各多型とＩ型糖尿病との関連を検討すると、表３に示す結果を得た。すなわち、各多型を指標とした場合には、−２６３Ｇ陽性者が患者群に有意に少ない（患者１３．０％ｖｓ健常者３５．２％、相対危険率０．２８、Ｐｃ値＝０．０００００９）ことが観察された。これは、検討した日本人集団において−２６３Ｇとアリル０３とが完全に１：１対応をしていることによるものである。一方、アリル０１とのみ１：１対応する多型は存在しない（図２に示すように、アリル０１を構成する多型は、いずれも０１以外の複数のアリルと共通である）ため、患者群に高い頻度で認める多型はあるものの、いずれも相対危険率は比較的低く、かつその頻度差は統計学的に有意ではなかった。すなわち、ＩＫＢＬ１プロモーター多型を個々に判定することでは、感受性との弱い関連としか診断出来ない。しかしながら、ＩＫＢＬ１プロモーターでみられる多型をハプロタイプとして一括して判定することで、Ｉ型糖尿病への感受性因子および抵抗性因子を保持しているか否かを的確に診断可能とするものである。
産業上の利用の可能性
以上詳述したように、本発明によりＩｋＢＬ１遺伝子プロモーター領域に見られる多型を検出することによって、Ｉ型糖尿病の検査方法を提供することができる。また、遺伝子の多型ハプロタイプを識別するための実用的なタイピング方法を提供することができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、解析対象としたＩＫＢＬ１遺伝子の塩基配列を示す。多型を認める部位（−４２２，−３２５，−２６３，−６３）と多型配列（二重下線）を示す。波線下線はＰ１Ｆに対応する配列、点線下線はＥ１Ｒに対応する配列を示す。第一エクソンは一重下線で示す。
図２は、ＩＫＢＬ１遺伝子プロモーターアリルの模式図を示す。アリルごとに多型部位の塩基を示す。
図３は、レファレンス−１及びレファレンス−２の塩基配列を示す。レファレンス−１及び２は、それぞれアリル０３、０４に２箇所ずつの変異（欠失変異、挿入変異、または塩基置換）を人為的に導入したものである。導入変異部分を二重下線で示す。
図４は、レファレンスの違いによる泳動パターンの相違を示す。テストしたアリル名を左端に示す。左から、アリル０３、アリル０３の−４２２位で１塩基欠失（Ｔ８→Ｔ７）したもの（＃１７）、さらに−２６２位に１塩基置換（Ａ→Ｇ）を導入した配列（レファレンス−１）をレファレンスとして用いた。レファレンスのホモデュプレックスの位置を矢頭で、テストアリルとレファレンスのヘテロデュプレックスの位置を矢印で示す。アリル０３をレファレンスにした場合でもヘテロデュプレックスの移動度は遅れるが、人為的に変異を導入したものをレファレンスにすると、変異導入が多いほど移動度の遅れは顕著になる。
図５は、ＤＳＣＡ法によるＩＫＢＬ１プロモーターアリルの決定法を示す。左端にテストしたアリル名とその多型配列構成を示す。左はレファレンス−１を用いた場合、右はレファレンス−２を用いた場合の、それぞれのアリルの電気泳動パターンを示す。レファレンスのホモデュプレックスの位置を矢頭で、テストアリルとレファレンスのヘテロデュプレックスの位置を矢印で示す。下２段は０１／０４と０５／０６のヘテロ接合体の泳動パターンを示すが、それぞれのヘテロデュプレックスの位置はそれぞれを構成するアリルによるヘテロデュプレックスの位置に対応している。
図６は、ＤＳＣＡ法によるＩＫＢＬ１遺伝子タイピングの実際例を示す。最上段はレファレンスのみを泳動したもの、続く６段は個々のアリルのホモ接合パターン、その下には種々のアリルのホモおよびヘテロ接合パターンを示す。左にサンプル番号と、ＩＫＢＬ１タイピングの結果を（ ）内に示す。
Claims (11)
- 以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかの塩基の多型を検出することを特徴とする、Ｉ型糖尿病の検査方法。
（ａ）配列番号１７で表される塩基配列上の第６７〜７４番目の塩基またはその相補鎖上の対応する塩基
（ｂ）配列番号１７で表される塩基配列上の第１７１番目の塩基またはその相補鎖上の対応する塩基
（ｃ）配列番号１７で表される塩基配列上の第２３３番目の塩基またはその相補鎖上の対応する塩基
（ｄ）配列番号１７で表される塩基配列上の第４３３番目の塩基またはその相補鎖上の対応する塩基 - 上記（ａ）から（ｄ）の塩基の多型のハプロタイプを検出することを特徴とする、請求項１に記載のＩ型糖尿病の検査方法。
- Ｉ型糖尿病の検査に用いるための、以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のプライマー。
（ａ）配列番号１７で表される塩基配列からなるＤＮＡまたはその相補鎖にハイブリダイズし、かつ配列番号１７で表される塩基配列上の第６７〜７４番目の塩基またはその相補鎖の対応する塩基を挟み込むように設計されたＤＮＡプライマー
（ｂ）配列番号１７で表される塩基配列からなるＤＮＡまたはその相補鎖にハイブリダイズし、かつ配列番号１７で表される塩基配列上の第１７１番目の塩基またはその相補鎖の対応する塩基を挟み込むように設計されたＤＮＡプライマー
（ｃ）配列番号１７で表される塩基配列からなるＤＮＡまたはその相補鎖にハイブリダイズし、かつ配列番号１７で表される塩基配列上の第２３３番目の塩基またはその相補鎖の対応する塩基を挟み込むように設計されたＤＮＡプライマー
（ｄ）配列番号１７で表される塩基配列からなるＤＮＡまたはその相補鎖にハイブリダイズし、かつ配列番号１７で表される塩基配列上の第４３３番目の塩基またはその相補鎖の対応する塩基を挟み込むように設計されたＤＮＡプライマー - 以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかの塩基を含む領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
（ａ）配列番号１７で表される塩基配列または該塩基配列上の第６７〜７４番目の塩基中に１塩基が挿入された塩基配列からなるＤＮＡの第６７〜７４番目及び挿入された１塩基を含む塩基
（ｂ）配列番号１７で表される塩基配列または該塩基配列上の第１７１番目の塩基が他の塩基に置換された塩基配列からなるＤＮＡの第１７１番目の塩基
（ｃ）配列番号１７で表される塩基配列または該塩基配列上の第２３３番目の塩基が他の塩基に置換された塩基配列からなるＤＮＡの第２３３番目の塩基
（ｄ）配列番号１７で表される塩基配列または該塩基配列上の第４３３番目の塩基が他の塩基に置換された塩基配列からなるＤＮＡの第４３３番目の塩基 - Ｉ型糖尿病の検査のために用いるプローブである、請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
- 請求項３に記載のプライマー及び／または請求項５に記載のプローブを含む、Ｉ型糖尿病の検査試薬。
- 請求項３に記載のプライマー及び／または請求項５に記載のプローブを含む、Ｉ型糖尿病の検査キット。
- Ｉ型糖尿病の検査に用いるための、以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号１７で表される塩基配列または該塩基配列上の第６７〜７４番目の塩基中に一塩基が挿入された塩基配列からなるＤＮＡにおいて、第６７〜７４番目の塩基を含む塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１７で表される塩基配列または該塩基配列上の第１７１番目の塩基が他の塩基に置換された塩基配列からなるＤＮＡにおいて、第１７１番目の塩基を含む塩基配列からなるＤＮＡ
（ｃ）配列番号１７で表される塩基配列または該塩基配列上の第２３３番目の塩基が他の塩基に置換された塩基配列からなるＤＮＡにおいて、第２３３番目の塩基を含む塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号１７で表される塩基配列または該塩基配列上の第４３３番目の塩基が他の塩基に置換された塩基配列からなるＤＮＡにおいて、第４３３番目の塩基を含む塩基配列からなるＤＮＡ - 二本鎖ＤＮＡ多型検出法（ＤＳＣＡ）を用いることを特徴とするハプロタイプの検出方法。
- ＤＳＣＡに用いるレファレンスが非天然型のレファレンスであることを特徴とする請求項９に記載の検出方法。
- 多型部位の近傍領域に１〜数塩基の欠失、挿入または置換を行うことにより非天然型のレファレンスを作製することを含む、請求項１０に記載の検出方法。
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