JPWO2003004640A1 - 抗癌剤感受性測定用ｄｎａアレイ - Google Patents
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Abstract
核酸代謝関連酵素遺伝子群、遺伝子修復関連酵素遺伝子群、薬剤耐性関連因子遺伝子群及びハウスキーピング遺伝子群の各群からの少なくとも２種以上を含む少なくとも１３種以上の標的遺伝子の断片であって、次のステップ１）及び２）、１）データベースを利用したホモロジー検索により、標的遺伝子に特異性の高い断片を選択するステップ、２）１）のステップで選択された断片をプローブとして腫瘍細胞から得られたＲＮＡに対してノーザンハイブリダイゼーションを行い、標的遺伝子に対する特異性を確認するステップ、を行うことにより選択された断片を、基板上に固定化してなることを特徴とする代謝拮抗剤系抗癌剤又は当該抗癌剤と他の抗癌剤との併用に対する感受性の測定用ＤＮＡアレイ。検体中の数十〜数百種の遺伝子発現を、一度だけの簡便なアッセイで定量性よく測定できる。
Description
技術分野
本発明は抗癌剤感受性の測定用ＤＮＡアレイ及び当該ＤＮＡアレイを用いた抗癌剤感受性測定法に関する。
背景技術
一般的に、癌患者に対する抗癌剤の治療効果は必ずしも高いとは言えず、その一方で副作用は比較的高頻度に発現する。近年、抗癌剤の適正使用あるいは患者個人個人に応じたオーダーメイド医療が望まれている。すなわち、抗癌剤を投与する前に、患者から採取した組織検体等を測定対象試料とし、その抗癌剤の感受性に関連している遺伝子の発現量を測定することで、効果が期待できそうなまたは副作用が少なそうな患者を絞り込んで投与するというものである。
汎用されている抗癌剤のなかでも、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）系薬剤等の代謝拮抗剤の分野では適正使用を目指した臨床研究が盛んである。測定対象となる遺伝子としては、代謝拮抗剤の感受性に関連しているとされているチミジル酸シンターゼ（ｔｈｙｍｉｄｙｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ；ＥＣ２．１．１．４５，以下、ＴＳと称する）、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ（ｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；ＥＣ１．３．１．２，以下、ＤＰＤと称する）、チミジンホスホリラーゼ（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ；ＥＣ２．４．２．４，以下、ＴＰと称する）が代表的なものであり、それらの発現パターンは生化学的酵素活性測定法（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５，８８３−８８９，１９９９）、抗体を用いた免疫学的測定法（癌と化学療法，２４（６）：７０５−７１２，１９９７）ノーザンハイブリダイゼーションやＲＴ−ＰＣＲ法によるｍＲＮＡ測定法（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６，１３２２−１３２７，２０００）で解析され、適正使用の指標とされている。また、シスプラチンを用いた癌の化学療法においてはＥＲＣＣ１等のＤＮＡ修復酵素も効果を予測する因子として有用であることが示唆されている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１６，３０９−３１６，１９９８）。
一方、近年、数百〜数万という多種の遺伝子のｍＲＮＡ発現を同時に解析できる技術として、ＤＮＡマイクロアレイ法が汎用されるようになってきた。この手法は遺伝子を網羅的に解析するのに適しており、将来汎用抗癌剤の適正使用に応用されることが期待されている。
５−フルオロウラシル等の代謝拮抗剤は生体内で種々の過程を経て代謝されるため、代謝拮抗剤の感受性を予測するには、上記３種（ＴＳ，ＤＰＤ及びＴＰ）の遺伝子発現の解析だけでは十分とは言えない。更に広範囲の遺伝子発現を解析できれば感受性の予測率も高まると予想される。また実際の癌化学療法においては数種の抗癌剤を組み合わせた併用療法が施行されることが多いため、各薬剤の感受性に関与する遺伝子発現を包括的に解析できれば個々の患者に適した併用化学療法をデザインできる可能性がある。
生化学的酵素活性測定法、抗体を用いた免疫学的測定法、ノーザンハイブリダイゼーションやＲＴ−ＰＣＲ法によるｍＲＮＡ測定法はいずれも定量性は高いものの、原則として１遺伝子につき１回のアッセイが必要なので、多種の遺伝子発現様式を同時に解析するには作業上適していない技術である。
一方、ＤＮＡマイクロアレイ法は多種の遺伝子発現解析に適しているものの、定量性はノーザンハイブリダイゼーションやＲＴ−ＰＣＲ法に比べ格段に劣る。その原因の主たるものとして、ノーザンハイブリダイゼーションやＲＴ−ＰＣＲ法は目的とする遺伝子に対する特異性をＲＮＡやＰＣＲ産物のサイズにより分別することができるが、ＤＮＡマイクロアレイ法は分子サイズが表現されないドットブロットであるため特異性を分別できず、目的とする遺伝子発現以外の非特異的なシグナルを検出してしまう（いわゆるクロスハイブリダイゼーション）ことが挙げられる。目的とする遺伝子に対する特異性は、アレイ化する個々のＤＮＡ断片（以下、ターゲット断片と呼ぶ）の設定法、すなわち遺伝子（全長ｃＤＮＡ）のどの部分（リージョン）をターゲット断片として選択するかによって左右される。通常のＤＮＡマイクロアレイ法の場合、設計支援ソフトなどを利用して計算上特異性が高いと予想されるリージョン（データベース上に公開されている他の遺伝子と塩基配列の重複が少ないリージョン）を選択してターゲット断片としているものの、その特異性が実証されているわけではない。また、ターゲット断片はＰＣＲで増幅して調製されるが、その際に用いられる個々の遺伝子に特異的なプライマーがターゲット断片溶液に混入して一緒にアレイ化される結果、不均一なバックグラウンドの原因になることがある。これらの要因により、同一検体（生体由来試料）中のある特定遺伝子の発現量をＤＮＡマイクロアレイ法で解析した結果とノーザンハイブリダイゼーションやＲＴ−ＰＣＲ法で解析した結果が食い違うことはしばしば起こるので、ＤＮＡマイクロアレイ法の結果のみで遺伝子発現に差があると断定することはできない。実験手順としては、第一次スクリーニングとして発現量に差がありそうな遺伝子をＤＮＡマイクロアレイ法でおおまかに絞り込み、第二次スクリーニングとしてノーザンハイブリダイゼーションやＲＴ−ＰＣＲ法により発現量の差が確かであることを証明するのが一般的で、結局のところ少なくとも２種の測定法が必要となる。
従って、本発明の目的は代謝拮抗剤系抗癌剤及びこれと他の抗癌剤との併用療法に対する感受性を、一度だけの簡便なアッセイで、しかも高感度に定量性よく測定するための手段を提供することにある。
発明の開示
かかる実状において本発明者らは、汎用されているＤＮＡマイクロアレイ法により一度で抗癌剤の感受性が測定できるか否かを検討した。しかし、次のような欠点があることが判明した。
すなわち、汎用されているＤＮＡマイクロアレイ法の場合、対象とする遺伝子の種類が数百から数万と多いために、現状で使用可能な抗癌剤の作用機序から推察して薬剤感受性には関連がないと思われる遺伝子を多数含んでいる。その結果、解析に余計な労力を必要としたり、抗癌剤の作用機序に密接した遺伝子を軽視することがあるといった短所が生ずる。
更に、汎用されているＤＮＡマイクロアレイ法の場合、支持担体（ナイロンメンブレンやガラスプレートなど）にスポットするＤＮＡ量（濃度）は一定である場合が多く、抗癌剤の感受性に密接に関連している遺伝子であるにも関わらず発現量が極めて少ないために定量できないものがある。
そこで、本発明者らは、現存するＤＮＡマイクロアレイ法を改良すべく検討した。まず、標的遺伝子を代謝拮抗剤系抗癌剤及びこれと併用する他の抗癌剤の作用機序に関連していると考えられる遺伝子を中心に数十から数百に絞り込んだ。次にデータベースを利用したホモロジー検索により計算上で設計しただけでなく、実際にノーザンハイブリダイゼーションにより特異性を確認したものをターゲット断片とした。かくして選択された断片を基板上に固定化することにより得られたＤＮＡアレイは、代謝拮抗剤系抗癌剤又は当該抗癌剤と他の抗癌剤との併用に対する感受性を、一度の試験で高感度に判定できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、核酸代謝関連酵素遺伝子群、遺伝子修復関連酵素遺伝子群、薬剤耐性関連因子遺伝子群及びハウスキーピング遺伝子群の各群からの少なくとも２種以上を含む少なくとも１３種以上の標的遺伝子の断片であって、
次のステップ１）及び２）、
１）データベースを利用したホモロジー検索により、標的遺伝子に特異性の高い断片を選択するステップ、
２）１）のステップで選択された断片をプローブとして腫瘍細胞から得られたＲＮＡに対してノーザンハイブリダイゼーションを行い、標的遺伝子に対する特異性を確認するステップ、
を行うことにより選択された断片を、基板上に固定化してなることを特徴とする代謝拮抗剤系抗癌剤又は当該抗癌剤と他の抗癌剤との併用に対する感受性の測定用ＤＮＡアレイを提供するものである。
また、本発明は、このＤＮＡアレイに、癌患者由来の体液検体又は組織検体から得られたｍＲＮＡを鋳型として合成した標識ｃＤＮＡプローブをハイブリダイズさせることを特徴とする当該体液検体又は組織検体の代謝拮抗剤系抗癌剤又は当該抗癌剤と他の抗癌剤との併用に対する感受性の測定方法を提供するものである。
発明を実施するための最良の形態
本発明のＤＮＡアレイは、代謝拮抗剤系抗癌剤又は当該抗癌剤と他の抗癌剤との併用に対する感受性の測定に用いるものである。ここで、代謝拮抗剤系抗癌剤としては、テガフール、５−フルオロウラシル、テガフール・ウラシル、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム、カルモフール、カペシタビン、フルツロン等の５−フルオロウラシル系抗癌剤；６−メルカプトプリン、メルカプトプリンリポジド等のメルカプトプリン系抗癌剤；シタラビン、エノシタビン、ゲムシタビン等のシトシン系抗癌剤；メトトレキサート等が挙げられ、このうち５−フルオロウラシル系抗癌剤が特に好ましい。また、代謝拮抗剤と併用する他の抗癌剤としては、シスプラチン等の白金錯体系抗癌剤；ＣＰＴ−１１、ＶＰ−１６等のトポイソメラーゼ阻害剤；ドセタキセル、パクリタキセル等のタキサン系抗癌剤等が挙げられる。
本発明における感受性の測定には、患者に対する抗癌剤の有効性及び副作用のバランスの判定、適切な併用療法の決定、適切な投与法（投与量、投与スケジュール）の判定等が含まれる。
本発明における標的遺伝子は、感受性に関連していると考えられる遺伝子であり、核酸代謝関連酵素遺伝子群、遺伝子修復関連酵素遺伝子群、薬剤耐性関連因子遺伝子群及びハウスキーピング遺伝子群の各群からの少なくとも２種以上を含む少なくとも１３種以上の遺伝子である。
ここで、核酸代謝関連酵素としては、チミジル酸シンターゼ（ｔｈｙｍｉｄｙｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ：ＴＳ）、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ（ｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：ＤＰＤ）、オロテートホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｏｒｏｔａｔｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：ＯＰＲＴ（ウリジンモノホスフェートシンセターゼ（ｕｒｉｄｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ：ＵＭＰＳ）））、チミジンホスホリラーゼ（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ：ＴＰ）、チミジンキナーゼ１（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ １：ＴＫ１）、リボヌクレオシド−ジホスフェートリダクターゼＭ１サブユニット（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ−ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ Ｍ１ ｓｕｂｕｎｉｔ：ＲＲＭ１）、リボヌクレオシド−ジホスフェートリダクターゼＭ２サブユニット（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ−ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ Ｍ２ ｓｕｂｕｎｉｔ：ＲＲＭ２）、ウリジンシチジンキナーゼ２（ｕｒｉｄｉｎｅ ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ２：ＵＣＫ２）、ウリジンホスホリラーゼ（ｕｒｉｄｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ：ＵＰ）、シチジンデアミナーゼ（ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ：ＣＤＡ）、５′ヌクレオチダーゼ（５′ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ：ＮＴ５）、ＩＭＰデヒドロゲナーゼ１（ＩＭＰ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ １：ＩＭＰＤ）、メチレンテトラヒドロフォレートデヒドロゲナーゼ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：ＭＴＨＦＤ１）、ＲＮＡポリメラーゼ２（ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ２：ＲＰ２）、ウリジンモノホスフェートキナーゼ（ｕｒｉｄｉｎｅｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｋｉｎａｓｅ：ＵＭＰＫ）、ＣＴＰシンターゼ（ＣＴＰ ｓｙｎｔｈａｓｅ：ＣＴＰＳ）、デオキシシチジレートデアミナーゼ（ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｙｌａｔｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ：ＤＣＤ）、デオキシシチジンキナーゼ（ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ：ＤＣＫ）、ホスホリボシルピロホスフェートシンセターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ：ＰＲＰＳ）、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １：ＨＰＲＴ１）、フォリルポリグルタメートシンセターゼ（ｆｏｌｙｌｐｏｌｙｇｌｕｔａｍａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ：ＦＰＧＳ）、ヌクレオシドジホスフェートキナーゼＡ（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｋｉｎａｓｅ Ａ：ＮＤＫＡ）、ヌクレオシドジホスフェートキナーゼＢ（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｋｉｎａｓｅ Ｂ：ＮＤＫＢ）、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ａｄｅｎｉｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：ＡＰＲＴ）、アデノシンキナーゼ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅ：ＡＫ）等が挙げられる。これらの酵素遺伝子のうち、少なくともＴＳ、ＤＰＤ、ＯＲＲＴ、ＴＰ及びＴＫ１の遺伝子を含むのが特に好ましい。
遺伝子修復関連酵素としては、ＤＮＡ切除修復蛋白ＥＲＣＣ１（ＤＮＡ ｅｘｃｉｓｉｏｎｒｅｐａｉｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ＥＲＣＣ１：ＥＲＣＣ１）、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ｕｒａｃｉｌ−ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ：ＵＤＧ）、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：ＰＡＲＰ）、ＤＮＡリガーゼＩ（ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ Ｉ：ＬＩＧ１）、ＤＮＡリガーゼＩＩＩ（ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ ＩＩＩ：ＬＩＧ３）、ＤＮＡリガーゼＩＶ（ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ ＩＶ：ＬＩＧ４）、ＤＮＡポリメラーゼβ（ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ β：ＰＯＬＢ）、ＤＮＡポリメラーゼδ（ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ δ：ＰＯＬＤ）、ＤＮＡ−修復蛋白ＸＲＣＣ１（ＤＮＡ−ｒｅｐａｉｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ＸＲＣＣ１：ＸＲＣＣ１）等が挙げられる。これらの酵素遺伝子のうち、少なくともＥＲＣＣ１及びＵＤＧを含むのが好ましい。
薬剤耐性関連因子としては、トポイソメラーゼ１（ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ １：ＴＯＰ１）、Ｐ−グリコプロテイン（Ｐ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ：ＭＤＲ１）、平衡ヌクレオシドトランスポーター１（ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｖｅ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ １：ＥＮＴ１）、多剤耐性関連蛋白１（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １：ＭＲＰ１）、トポイソメラーゼ２α（ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ ２α：ＴＯＰ２Ａ）、トポイソメラーゼ２β（ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ ２β：ＴＯＰＢ）、熱ショック蛋白２７（ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ ２７：Ｈｓｐ２７）、平衡ヌクレオシドトランスポーター２（ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｖｅ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ２：ＥＮＴ２）等が挙げられる。これらの因子遺伝子のうち少なくともＴＯＰ１、ＭＤＲ１、ＥＮＴ１及びＭＲＰ１の遺伝子を含むのが好ましい。
ハウスキーピング遺伝子としては、グリセロアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：ＧＡＰＤＨ）、βアクチン（β−ａｃｔｉｎ：ＡＣＴＢ）及び４０Ｓリボソーマル蛋白Ｓ９（４０Ｓｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ９：ＲＳＰ９）等が挙げられる。ＧＡＰＤＨ、ＡＣＴＢ、ＲＳＰ９から選ばれる２種以上を含むのが好ましい。これらの遺伝子は、内部標準として使用されるものである。
その他の遺伝子としては、Ｅ２Ｆ１、ｐ５３、ＶＥＧＦβ（ＶＥＧＦ β）、インテグリンα３（ｉｎｔｅｇｒｉｎ α３）、Ｍｎ ＳＯＤ、Ｃｕ／Ｚｎ ＳＯＤ、増殖細胞核抗原（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｔｉｇｅｎ：ＰＣＮＡ）等が挙げられる。
これらの標的遺伝子の断片をすべて固定化するのが望ましいが、特に、ＴＳ、ＤＰＤ、ＯＰＲＴ、ＴＰ、ＴＫ１、ＥＲＣＣ１、ＵＤＧ、ＴＯＰ１、ＭＤＲ１、ＥＮＴ１及びＭＲＰ１の１１種の遺伝子と、ＧＡＰＤＨ、ＡＣＴＢ及びＲＳＰ９のうちの２種以上との合計の１３種以上の遺伝子の断片を固定化すると前記感受性のより効率的な測定が可能であり好ましい。
これらの標的遺伝子の配列について、まずデータベースを利用したホモロジー検索により、各標的遺伝子に特異性の高い断片を選択する（ステップ１）。
このホモロジー検索は、例えばＢｌａｓｔ Ｓｅａｒｃｈ等により行うことができる。断片の設計条件としては、例えばＧＣ含量が４０〜６０％で重複配列が少なく、Ｔｍ値が７５〜８５℃、サイズ２００〜６００ｂｐ等が挙げられる。
次にステップ１で設計された断片をプローブとして腫瘍細胞から得られたＲＮＡに対してノーザンハイブリダイゼーションを行うことにより、特異性を確認する（ステップ２）。ステップ１で設計された断片は、計算上は標的遺伝子に対する特異性が高いはずであるが、実際にはクロスハイブリダイゼーションが高い確率で起こる。実際、ステップ１で第１選択された断片が、ステップ２で特異的であることが確認できたものは１０〜２０％にすぎない。
ステップ２は、まず、ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲ法にて増幅することによりＤＮＡ断片を得る。次に、このＤＮＡ断片を鋳型として放射性プローブを酵素的に合成し、種々の腫瘍細胞から調製した全ＲＮＡをブロットしたメンブレンを用いてノーザンハイブリダイゼーションを実施し、特異性を確認する。すなわち特定遺伝子から転写されるｍＲＮＡのサイズ（文献情報やデータベースサーチにて調査できる）に対応したシグナルが検出され、しかも他のサイズのシグナルがほとんど検出されない（クロスハイブリダイゼーションがほとんどない）ことが特異性の条件となる。
特異性が充分でないＤＮＡ断片については、対応する遺伝子の他のリージョンからＤＮＡ断片を設計し直し、再度ノーザンハイブリダイゼーションを実施する。このような作業を特異性が充分になるまで繰り返すことで、アレイ化するＤＮＡ断片のリージョンを最適化し、ターゲット断片を得る。ターゲット断片は、プラスミド（ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ）にクローニングする。
なお、ターゲット断片をＰＣＲで増幅する時に用いるプライマーとして、クローニングベクターのマルチプルクローニングサイトの配列を元にユニバーサルプライマーを設計し、すべてのターゲット断片が一組のユニバーサルプライマーで増幅できるようにする。当該ユニバーサルプライマーとしては、配列番号１及び２に示される塩基配列を有するプライマーが特に好ましい。また、スポッティング溶液に混入するプライマー量ができるだけ少なくなるようにユニバーサルプライマーの量を最適化する。その結果、すべてのターゲット断片のスポットにおけるバックグラウンドが低く抑えられ、ばらつきが少なくなる。
かくして選択された各標的遺伝子のターゲット断片を基板（支持担体）上に固定化すれば、本発明のＤＮＡアレイが得られる。ここで使用される基板としては、通常公知のものが挙げられ、例えば、ガラスプレート、プラスチックプレート、メンブレン（ナイロン製等）、ビーズ等が挙げられ、好ましくはガラスプレートである。また、当該アレイへの断片の固定化は、通常公知のスポッティング手段が利用でき、例えば、特表平１０−５０３８４１号公報記載のようなターゲットＤＮＡを含む溶液に先の割れたピンを浸して支持体の上に圧着することにより移していく表面接着方式（ｓｔａｎｆｏｒｄ方式）、ターゲットＤＮＡを含む溶液をインクジェットプリンタと同様の原理で支持体に吹き付けるインクジェット・圧電放出方式、光リソグラフの技術を利用して、ターゲットＤＮＡを直接支持体の上で合成する光リソグラフ方式等により行われ、好ましくはｓｔａｎｆｏｒｄ方式である。
ノーザンハイブリダイゼーションによる解析で得られた個々の遺伝子の発現量に基づいて、発現量の多い遺伝子については基板（支持担体）に固定化するターゲット断片の量を少なく、発現量の少ない遺伝子については多くすることにより、すべての標的遺伝子のｍＲＮＡを定量できるようにするのが好ましい。
得られた本発明のＤＮＡアレイを用いて前記抗癌剤の感受性を測定するには、当該ＤＮＡアレイに、癌患者由来の体液検体又は組織検体から得られたｍＲＮＡを鋳型として合成した標識ｃＤＮＡプローブをハイブリダイズさせることにより実施できる。
ここで癌患者由来の体液としては、血液、尿等が挙げられる。また組織としては、癌組織が挙げられる。検体からｍＲＮＡの採取は常法により行われ、ｍＲＮＡは全ＲＮＡに含まれたままでも、全ＲＮＡから単離したもののいずれでもよい。また標識ｃＤＮＡは、ｍＲＮＡを鋳型として逆転写酵素反応を利用して標識する。ここで、標識としては、蛍光標識、放射性同位体による標識が挙げられるが、蛍光標識が特に好ましい。
ハイブリダイゼーションの条件は、常法により行うことができる。ハイブリダイズの定量は標識プローブ量、例えば蛍光量を定量することにより行われる。
本発明ＤＮＡアレイの定量性のバリデーションを取るために、５２種の遺伝子発現の測定値をノーザンハイブリダイゼーション法で得られた測定値と比較したところ、食い違うことがほとんどなかった。また、特徴のある発現様式を示す（平均的な発現量よりも２倍以上差のある）遺伝子を判別することも、ノーザンハイブリダイゼーションと同程度の精度で可能であった。
実施例
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの範囲に限定されるものではない。
実施例１
（１）ターゲット断片の調製
Ａ．ＤＮＡ断片の選択と設計
後記表２及び３に示すように、核酸代謝関連遺伝子を中心に、５−ＦＵの感受性に関連していると考えられる遺伝子を５２種類選択した。ＤＮＡ断片の設計は、原則としてＧＣ含量が４０〜６０％で重複配列が少なくＴｍ値が７５〜８５℃、サイズが２００〜６００ｂｐであることを条件とし、クロスハイブリダイゼーションをできるだけ回避するために他の遺伝子と重複する配列がほとんどないことをデータベースを利用したホモロジー検索（Ｂｌａｓｔ Ｓｅａｒｃｈ）により確認した。ＰＣＲで増幅する時に用いる個々の遺伝子に特異的なプライマー（ｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｉｍｅｒ［ｆｏｒｗａｒｄ／ｒｅｖｅｒｓｅ］）はＴｍ値が５９〜６１℃となるように設計支援ソフト（Ｐｒｉｍｅｒ ＥｘｐｒｅｓｓＴＭ、ＰＥバイオシステムズ）を用いて設定した。
Ｂ．ＤＮＡ断片の合成と精製
ＤＮＡ断片は、ヒト由来のｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、特異的プライマーとＥｘＴａｑＴＭ（ＴａＫａＲａ）を用いてＰＣＲ反応（熱変性を９４℃で１分，アニーリングを６０℃で１分，伸長反応を７２℃で１分を１サイクルとして、計３０サイクル）により増幅した。ＰＣＲ産物溶液をスピンカラム（ミニプレップスピンカラム、Ａｅｔｎａ）により精製し、蒸留水で溶出した。
（２）ノーザンハイブリダイゼーション
Ａ．全ＲＮＡの調製と精製
表１記載の１４種のヒト腫瘍細胞からＲＮｅａｓｙ ｍｉｄｉ ｋｉｔＴＭ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて全ＲＮＡを抽出し、蒸留水で溶出した。溶液中に混在している可能性のあるＤＮＡをＤＮａｓｅを用いて分解し（３７℃、３０分）、フェノール・クロロホルムを用いて除タンパクし、エタノール沈殿により精製・濃縮し、蒸留水に溶解して全ＲＮＡ溶液を得た。
Ｂ．ノーザンブロット
前記の１４種のヒト腫瘍細胞から調製した全ＲＮＡ（各５μｇ）を１重量％変性アガロースゲルにて電気泳動した。臭化エチジウムにより染色し、紫外線下で写真撮影してＲＮＡが分解していないことを確認した。ゲル中のＲＮＡをキャピラリ法によりナイロンメンブレンにブロットし、紫外線によりメンブレンに固定（クロスリンク）した。
Ｃ．プローブの調製
上記（１）で調製したＤＮＡ断片を鋳型として、ランダムプライム法（ｒｅｄｉｐｒｉｍｅＴＭＩＩ、アマシャムファルマシア）により［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰにてラベルしたプローブを合成した。プローブ中に取り込まれなかった［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰをゲル濾過法（ＰｒｏｂｅＱｕａｎｔＴＭ Ｇ−５０マイクロスピンカラム、アマシャムファルマシア）により取り除いた。
Ｄ．ノーザンハイブリダイゼーション
上記（２）Ｂと（２）Ｃで調製されたブロットとプローブを用いてノーザンハイブリダイゼーションを実施した。ブロットをハイブリダイゼーションバッファー（ラピッドハイブリバッファー、アマシャムファルマシア）中にて６５℃、３０分プレハイブリダイズし、そこに熱変性させたプローブを添加して、６５℃で２時間ハイブリダイズした。次にブロットを洗浄し（０．１重量％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ（０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ／０．１５ｍｏｌ／Ｌクエン酸３ナトリウム）溶液で２回、０．１重量％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ溶液で１回、０．１重量％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ溶液で２回）、遮光下で一晩イメージングプレート（富士フィルム）に露光した。翌日、イメージングプレートを画像解析装置（ＳＴＯＲＭ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｃ．）でスキャンし、画像データを保存した。
Ｅ．ＤＮＡ断片の評価と再設計
ノーザンハイブリダイゼーションの画像を見て、ＤＮＡ断片の特異性を評価した。すなわち、目的とする遺伝子のｍＲＮＡと同じサイズのシグナルが見られ、それ以外のシグナルがほとんど見られないときには特異性があるものと判断し、対して目的とする遺伝子のｍＲＮＡのサイズにシグナルが認められなかったり、他のシグナルが認められた（クロスハイブリダイセーション）時には特異性に乏しいと評価した。後者の場合、同一遺伝子のｍＲＮＡの他のリージョンから上記（１）Ａに示した条件でＤＮＡ断片を再設計した。以下、ＤＮＡ断片の特異性が確認されるまで、設計、合成及びノーザンハイブリダイゼーションの工程を繰り返し（多いもので６回）、ターゲット断片（本発明のＤＮＡアレイに乗せる遺伝子のリージョン）を決定した。
（３）ＤＮＡアレイの作成とハイブリダイゼーション
一連の工程は、Ｓｔａｎｆｏｒｄ方式を基本としており、一部改変したものである。
Ａ．ターゲット断片のクローニング
ターゲット断片を質・量ともに安定に供給するには、ロットによるばらつきが生じ易いｃＤＮＡライブラリーを鋳型として用いるのは望ましくない。そこで、図１で示すように、個々のターゲット断片（ＰＣＲ産物の状態にある）をＴＡクローニング法によりプラスミド（ｐＣＲ−ＴＯＰＯ ｖｅｃｔｏｒ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングすることにより、すべてのターゲット断片に対応した５２種類のクローンを得た。
Ｂ．ターゲット断片の調製
上記のクローンを鋳型とし、上記（１）に準じた方法でターゲット断片を増幅した。ただし、プライマーとしてユニバーサルプライマーを用いた（配列番号１、２）。得られたＰＣＲ産物をエタノール沈殿法により洗浄した後、蒸留水で溶かした。溶液の一部を取って濃度算出（吸光度測定による）及び純度検定（アガロースゲル電気泳動による）に用いた。ターゲット断片溶液は一度室温真空下で乾固し、Ｍｉｃｒｏ Ｓｐｏｔｔｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＭ）にて０．５−１０ｐｍｏｌ／μＬの濃度になるように溶解した（表２及び３に個々のターゲット断片の濃度を示す）。得られたターゲット断片の塩基配列を配列番号３〜配列番号５４に示した。
Ｃ．スポッティングと後処理
あらかじめポリＬリジンコートしてあるスライドガラスに、スポッター（ＯｍｎｉＧｒｉｄ，ＧＥＮＥＭＡＣＨＩＮＥＳ）を用いて９５℃で３分熱変性したターゲット断片をスポッティングした。その後、紫外線にてターゲット断片をスライドガラスにクロスリンクし、ブロッキング溶液（８重量％Ｂｌｏｃｋ Ａ ｉｎ ＰＢＳ）の入ったラックに入れて３０分振盪したのちＴＥバッファーで洗浄して乾燥させた。スライドガラスは使用するまでデシケーターに入れて遮光下で保存した。このようにして本発明ＤＮＡアレイを得た。
Ｄ．蛍光ＤＮＡプローブの調製
腫瘍細胞から調整した全ＲＮＡ（上記（２）と同一の方法による）を鋳型に、個々の遺伝子のｍＲＮＡに特異的なプライマーを用いて、逆転写酵素反応を利用して蛍光標識した。標識反応に必要な試薬は以下の通りである。
・逆転写酵素ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）
・（反応バッファー、ＤＴＴ）
・プライマー混合液（５２種の遺伝子に特異的なリバースプライマーを混合したもの。リバースプライマーは参考例１にて用いた特異的プライマーのうちの片方）
・ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ（アマシャムファルマシア）
・Ｃｙ３−ｄＵＴＰ（アマシャムファルマシア）
・Ｃｙ５−ｄＵＴＰ（アマシャムファルマシア）
・０．５Ｍ ＥＤＴＡ
・１Ｎ ＮａＯＨ
・１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
・ＴＥバッファー
全ＲＮＡ（３０μｇ）、プライマー混合液（５０ｐｍｏｌ ｅａｃｈ）と蒸留水を混合し、９μＬに調整したものを６５℃で２分間熱変性して氷上で急冷した。反応バッファー（１×）、ＤＴＴ（１０ｍＭ）、ｄＴＴＰ（０．２ｍＭ）、ｄＡＴＰ（０．５ｍＭ）、ｄＧＴＰ（０．５ｍＭ）、ｄＣＴＰ（０．５ｍＭ）、Ｃｙ３−ｄＵＴＰ又はＣｙ５−ｄＵＴＰ（０．１ｍＭ）、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（１０Ｕ／μＬ）を添加し、蒸留水にて全量を２０μＬとした（括弧内は終濃度を示す）。４２℃で６０分反応させた後蒸留水２０μＬ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ５μＬ、１Ｎ ＮａＯＨ５μＬを添加して６５℃で６０分インキュベートすることによりＲＮＡを分解し、２５μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを加えて中和した。２００−４００μＬのＴＥバッファーを加え、反応液を限外濾過法（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ−３０、ミリポア）により脱塩・濃縮し（この工程で、プローブに取り込まれなかったＣｙ３−ｄＵＴＰ又はＣｙ５−ｄＵＴＰや、リバースプライマーも除去される）、最終的に約１０μＬのプローブ溶液を得た。
Ｅ．ハイブリダイゼーション
上記蛍光ＤＮＡプローブ溶液に２０×ＳＳＣを３μＬと蒸留水を加え、２０μＬとし（終濃度３×ＳＳＣ）、９５℃で３分間熱変性させ、室温で放置して冷却させた。そこに１０重量％ＳＤＳを２μＬと蒸留水を加えて４０μＬとし（終濃度０．５重量％）、Ａ〜Ｃの工程で作製したＤＮＡアレイに滴下して、カバーグラスを上からかぶせて覆った（気泡が入らないように静かに乗せた）。ＤＮＡアレイをハイブリダイゼーションチャンバーにセットし、６５℃で１０〜２０時間インキュベートした後、０．２重量％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ溶液中に入れてカバーグラスを静かに外し、そのまま５分間洗浄した。更に、０．２重量％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ溶液中で１回、０．２重量％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ溶液中で２回の洗浄の工程を繰り返し、最後に０．２×ＳＳＣで２回リンスした（洗浄の工程はすべて室温で行った）。ＤＮＡアレイをラックに入れ、６００ｒｐｍで２０秒間遠心して水分を飛ばし、室温で乾燥させてから、ＤＮＡマイクロアレイ用蛍光スキャナー（ＧｅｎｅＰｉｘ，Ａｘｏｎ）で蛍光シグナルを測定した。
試験１：ＤＮＡ断片の特異性
ノーザンハイブリダイゼーションにおいて、プローブ合成の鋳型として用いたＤＮＡ断片の特異性は、同一遺伝子であっても設計されたリージョンによって様々だった。実例として、ＸＲＣＣ１とＥ２Ｆ１を図２に示す。ＸＲＣＣ１では８９８−１２６５ｎｔのリージョンは良好（目的とする遺伝子のｍＲＮＡと同じ長さのサイズに強いシグナルが見られた）だったが、１８７−４９４ｎｔはクロスハイブリダイゼーションが多く不適と判断された。同様に、Ｅ２Ｆ１では１０１４−１３０９ｎｔのリージョンは良好だったが、７８８−１０８７ｎｔは不適であった。他の遺伝子についても程度の差はあるものの特異性は多様だった。最終的に、対象遺伝子において最も特異性の良好だったＤＮＡ断片を選択してターゲット断片とした。
試験２：ノーザンハイブリダイゼーションの定量性
ＤＮＡアレイの定量性は、ノーザンハイブリダイゼーションと比較することにより確認できる。そこで、本発明者らが採用したノーザンハイブリダイゼーションの測定系（実施例１（２））の定量性を改めて確認するために、ＲＮＡ量と測定値（シグナル強度）との相関関係を調べた。
前記の１４種のヒト腫瘍細胞由来の全ＲＮＡを変性アガロースゲルで電気泳動後、ナイロンメンブレンにブロットし、ＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅｓ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）のターゲットＤＮＡから合成したプローブを用いてノーザンハイブリダイゼーションを実施した（方法の詳細は実施例１（２）と同じ）。結果を画像解析用ソフト（ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｃ）で解析し、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡと対応するシグナル強度を定量した。
泳動した全ＲＮＡ量とノーザンハイブリダイゼーションの測定値との関係を図３に示す。全ＲＮＡ量とシグナル強度の間の直線関係は明らかであり（ｒ＝０．９５、ｐ＜０．０１）、定量性が高いことが示された。
試験３：ユニバーサルプライマーのバックグラウンドに及ぼす影響
図１に示すように、ユニバーサルプライマー（ｆｏｒｗａｒｄ（ｐＣＲ−Ｆ）／ｒｅｖｅｒｓｅ（ｐＣＲ−Ｒ））をベクターのマルチクローニングサイトの配列を元に設計した。ユニバーサルプライマーを用いることで、５２種すべてのターゲット断片を一定の効率で増幅できるようになったため、特異的プライマーと比較してターゲット断片の安定供給が容易になった。
ターゲット断片をスポッティングするときに混入してくるプライマーのバックグラウンドに及ぼす影響を調べるために、ユニバーサルプライマー（５スポット）と特異的プライマー（表２及び表３に記載の５種のターゲットＤＮＡ断片［ＴＳ，ＤＰＤ，ＯＰＲＴ，ＬＩＧ４，ＧＡＰＤＨ］の両端約２０ｂｐの配列に対応するプライマーをそれぞれ１スポットずつ）を等量ずつスライドガラスにスポットし、実施例１（３）で示した手順によりハイブリダイゼーションを行い、それぞれのシグナル強度を測定した。
ユニバーサルプライマー（５スポット）のシグナル強度の平均値は２７．３、標準偏差（ＳＤ）は６．５、変動係数（ＣＶ）は２４．０％であったのに対し、特異的プライマー（５スポット）のシグナル強度の平均値は２２．９、標準偏差（ＳＤ）は１２．０、変動係数（ＣＶ）は５２．４％であった。シグナル強度はほぼ同等であったものの、ユニバーサルプライマーの方がＳＤ、ＣＶともに小さいことより、ユニバーサルプライマーの方がスポット間におけるバックグラウンドのばらつきに及ぼす影響が比較的小さいことが示された。
更に、バックグラウンドを極力抑えるために、ターゲット断片を増幅するときに用いるユニバーサルプライマーの必要最少量を検討した。ｆｏｒｗａｒｄ／ｒｅｖｅｒｓｅプライマーをそれぞれ１０，２０，３０，４０，５０ｐｍｏｌ用いてＰＣＲにかけ、産物をアガロースゲル泳動したところ、２０ｐｍｏｌ以下では産物量が減少することが確認できたので、ユニバーサルプライマーの必要最少量を３０ｐｍｏｌと決定した。
実施例２ ヒト腫瘍細胞中の種々の遺伝子発現量の測定
（１）ノーザンハイブリダイゼーション法による測定
ＤＮＡアレイに乗せるターゲット断片を決定する過程で、前記の１４種のヒト腫瘍細胞における５２種の遺伝子のノーザンハイブリダイゼーションの結果を元に（実施例１（２）参照）、それぞれの遺伝子の発現量を画像解析した。なお、発現量は、３種のハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ，ＡＣＴＢ，ＲＳＰ９）の発現量の平均値に対する相対値として表わした。
（２）ＤＮＡアレイによる測定
５２種の遺伝子ターゲット断片を乗せたＤＮＡアレイを作製し、ノーザンハイブリダイゼーションで用いた１４種の細胞から抽出した全ＲＮＡを元に調製した蛍光ＤＮＡプローブを用いてハイブリダイゼーションを実施し、それぞれの遺伝子の発現量を測定した（方法の詳細は実施例１（３）と同じ）。なお、発現量は、３種のハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ，ＡＣＴＢ，ＲＳＰ９）の発現量の平均値に対する相対値として表わした。
（３）ノーザンハイブリダイゼーション法とＤＮＡアレイの相関
前記の１４種のヒト腫瘍細胞における５２種の遺伝子の発現量について、ノーザンハイブリダイゼーション法とＤＮＡアレイで測定した結果の相関を調べるために回帰分析した（表４）。相関の程度（相関係数）は、遺伝子の種類によってまちまちであったが、２０種の遺伝子については５％未満の危険率において有意な相関が認められた。９種の遺伝子については、有意ではなかったものの、相関する傾向が認められた（ｐ＜０．１）。３種のハウスキーピング遺伝子を含む１２種の遺伝子（ＭＴＨＦＤ１、ＳＯＤ１、ＡＫ、Ｅ２Ｆ１、ＰＯＬＤ、ＬＩＧ３、ＲＳＰ９、ＨＰＲＴ１、ＡＣＴＢ、ＵＤＧ、ＧＡＰＤＨ、ＬＩＧ１）については、発現量のばらつきが細胞間で小さいため正規分布をしているとは言い難く、相関性は低い又は評価不能であった。
（４）ＤＮＡアレイの判定力
実際に医療現場で使用されることを想定した場合、診断（薬剤の適正使用）を使用目的とするこのようなツールは、通常ある閾値を境にして陽性又は陰性であると評価される。例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法で測定したＴＳやＤＰＤのｍＲＮＡレベルを５−ＦＵの適正使用の指標と見なした研究でも、レベルの高低を判断するための閾値が設定されている（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６，１３２２−１３２７，２０００）。本発明のＤＮＡアレイの診断判定力をノーザンハイブリダイゼーションと比較することにより以下の方法で評価した。
前記の１４種のヒト腫瘍細胞を臨床検体に相当するものと見なし、すべての細胞について５２種の遺伝子発現量を本発明のＤＮＡアレイ及びノーザンハイブリダイゼーションにより測定した（それぞれの測定法において、測定ポイントは５２種遺伝子×１４種細胞＝７２８ポイント算出された）。本発明のＤＮＡアレイの測定値をもとに、各遺伝子について１４種の細胞が示す発現量の中央値を求めた。中央値を基準とみなしたときの１４種の細胞における相対的発現量（中央値に対する発現量の比）を算出した。閾値を２倍と設定し、相対的発現量が閾値を越える（２以上または０．５以下）較差が見られた細胞を「陽性」、閾値を越えないものを「陰性」と判定した。またノーザンハイブリダイゼーションによる判定結果を信頼性の高いものとみなし、本発明のＤＮＡアレイによる判定結果が一致すれば「真」、一致しなければ「偽」と評価した。図４に示すように、陽性・陰性の判定結果が「真」であったのは８２．３％と高率であった。また、陽性と判定された７５ポイントのうち、７７．３％（５８／７５）がノーザンハイブリダイゼーションの結果と一致した。また、相反する結果（例えば、両方とも真陽性だがノーザンハイブリダイゼーションによる相対的発現量が０．３で本発明のＤＮＡアレイによる相対的発現量が２．５のようにまったく食い違っているという意味）は１例もなかった。このように、本発明のＤＮＡアレイは、ノーザンハイブリダイゼーションとほぼ同程度の診断判定力があることが示された。
（５）ＤＮＡアレイの検出力
試験４の４）において、判定の対象となった７２８ポイント（５２種遺伝子×１４種細胞）のうち、測定不可能であった６２ポイントについてはノーザンハイブリダイゼーションでも検出されたかった。このことより、本発明のＤＮＡアレイはノーザンハイブリダイゼーションと同等以上の検出力を有していることが示された。
実施例３ 可移植性ヒト腫瘍株中の種々の遺伝子発現量とＴＳ−１に対する感受性との相関
（１）ＴＳ−１に対する感受性試験
本発明のＤＮＡアレイを臨床応用する際、例えば癌組織中に発現している５２種の遺伝子発現量と５−ＦＵ系抗癌剤の抗腫瘍効果との間の相関を解析することにより、感受性規定因子として実際にどの遺伝子が重要であるのかを見極めるために用いることが想定される。
本試験では、抗腫瘍効果を検討する実験モデルとして、１１種の可移植性ヒト腫瘍株（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ。由来は、胃癌４株、大腸癌３株、肺癌２株、乳癌２株）のＴＳ−１に対する感受性試験を実施した（ＴＳ−１は大鵬薬品工業（株）が開発した５−ＦＵ系抗癌剤の１種であり、５−ＦＵのプロドラッグであるテガフール、ＤＰＤ阻害剤であるギメラシル及びｏｒｏｔａｔｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの阻害剤であるオテラシルカリウムをモル比にして１：０．４：１にて含有している配合剤である）。各種ｘｅｎｏｇｒａｆｔをヌードマウスの背部皮下に移植し、１００−２００ｍｍ３の大きさに達したときに対照群（薬剤非投与群）とＴＳ−１投与群に群分けし（１群あたり６匹）、翌日から１日１回、１４日間連日ＴＳ−１を１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ（ＦＴ量として）の用量で経口投与し、投薬終了翌日に腫瘍体積を測定して対照群の腫瘍体積と比較し、腫瘍増殖抑制率（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ，ＩＲ）を求めた。ＩＲは以下の式により算出した。
ＩＲ（％）＝（１−［ＴＳ−１投薬群の相対腫瘍体積］／［対照群の相対腫瘍体積］）×１００
（相対腫瘍体積）＝（判定時の腫瘍体積）／（群分け時の腫瘍体積）
（２）本発明のＤＮＡアレイによる測定
上記の１１種のｘｅｎｏｇｒａｆｔから抽出した全ＲＮＡを材料とし、５２種の遺伝子の発現量を測定した。試験方法は、実施例２に準じて行った。なお、発現量は、３種のハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ，ＡＣＴＢ，ＲＳＰ９）の発現量の平均値に対する相対値として表わした。
（３）１１種のｘｅｎｏｇｒａｆｔ中の遺伝子発現量とＴＳ−１に対する感受性との相関
上記（１）および（２）の検討により得られた１１種のｘｅｎｏｇｒａｆｔ中の５２種の遺伝子発現量とＴＳ−１に対する感受性（ＩＲ，％）との関連を調べるために、総当り（５２通り）で回帰分析を実施した。その結果、相関係数（Ｐ値：Ｐｅａｒｓｏｎの積率相関係数）の絶対値が０．５を上回った遺伝子が４種（ＵＤＧ，ＰＣＮＡ，ＴＳ，ＴＫ１）あった（図５）。Ｐ値は０．０５以上０．１未満であり、統計上有意ではなかったものの、Ｎ数が１１と少なかったこともあり、相関の傾向は回帰直線から見ても十分に判定できた。これら４種の遺伝子にＴＳが含まれていたことは注目に値する。ＴＳは、５−ＦＵ系抗癌剤の感受性規定因子の代表的なものであり、ＴＳ発現量が高いと５−ＦＵ系抗癌剤は奏効しにくいとの知見が基礎・臨床の双方から得られている。本検討でも、ＴＳ発現量とＴＳ−１の抗腫瘍効果の間には負の相関（ｒ＝−０．５３）があった点でこれまでの知見と一致している。さらに、確認試験として測定精度が極めて高いとされているリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により１１種のｘｅｎｏｇｒａｆｔ中のＴＳ発現量（ＧＡＰＤＨに対する相対発現量）を測定し、ＴＳ−１に対する感受性との相関を解析したところ、相関係数は−０．６５で有意な（Ｐ＝０．０３０）相関が認められた（図６）。この結果より、本発明のＤＮＡアレイは５−ＦＵ系抗癌剤の感受性規定因子の候補を５２種の遺伝子から絞り込む上で有用であることが示された。さらにＮ数を増やせば、臨床検体を用いて５−ＦＵ系抗癌剤の感受性規定因子を絞り込むことも可能であろうし、絞り込まれた遺伝子の発現量を解析することで、５−ＦＵ系抗癌剤の適正使用の指標とすることができる。
産業上の利用可能性
本発明によれば、検体中の数十〜数百種の遺伝子発現を、一度だけの簡便なアッセイで定量性よく測定できる。本発明の測定法を用いて被検体（例えば癌患者の末梢血単核球や腫瘍組織から抽出した全ＲＮＡ）中の、代謝拮抗剤系抗癌剤又はこれと他の抗癌剤の併用の作用機序に関連している遺伝子発現様式を解析することで、これらの抗癌剤の適正使用の指標とすることができる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、ユニバーサルプライマーの配列と、ターゲット断片が組み込まれたクローンの構造を示す図である。
図２は、プローブを合成するための鋳型となるＤＮＡフラグメントを遺伝子の異なるリージョンから設定すると、特異性に差異がある場合があることを示すノーザンハイブリダイゼーションの画像の実例を示す図である。
図３は、ノーザンハイブリダイゼーションにおいて全ＲＮＡ量と測定値の間の相関を示す図である。
図４は、本発明の診断判定力をノーザンハイブリダイゼーションと比較することで評価したことを示す図である。
図５は、１１種のｘｅｎｏｇｒａｆｔのＴＳ−１に対する感受性と５２種の遺伝子のうち相関関係の高かった４種の遺伝子発現量との相関を示す図である。
図６は、１１種のｘｅｎｏｇｒａｆｔのＴＳ−１に対する感受性とＴＳ発現量との相関を示す図である。
本発明は抗癌剤感受性の測定用ＤＮＡアレイ及び当該ＤＮＡアレイを用いた抗癌剤感受性測定法に関する。
背景技術
一般的に、癌患者に対する抗癌剤の治療効果は必ずしも高いとは言えず、その一方で副作用は比較的高頻度に発現する。近年、抗癌剤の適正使用あるいは患者個人個人に応じたオーダーメイド医療が望まれている。すなわち、抗癌剤を投与する前に、患者から採取した組織検体等を測定対象試料とし、その抗癌剤の感受性に関連している遺伝子の発現量を測定することで、効果が期待できそうなまたは副作用が少なそうな患者を絞り込んで投与するというものである。
汎用されている抗癌剤のなかでも、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）系薬剤等の代謝拮抗剤の分野では適正使用を目指した臨床研究が盛んである。測定対象となる遺伝子としては、代謝拮抗剤の感受性に関連しているとされているチミジル酸シンターゼ（ｔｈｙｍｉｄｙｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ；ＥＣ２．１．１．４５，以下、ＴＳと称する）、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ（ｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；ＥＣ１．３．１．２，以下、ＤＰＤと称する）、チミジンホスホリラーゼ（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ；ＥＣ２．４．２．４，以下、ＴＰと称する）が代表的なものであり、それらの発現パターンは生化学的酵素活性測定法（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５，８８３−８８９，１９９９）、抗体を用いた免疫学的測定法（癌と化学療法，２４（６）：７０５−７１２，１９９７）ノーザンハイブリダイゼーションやＲＴ−ＰＣＲ法によるｍＲＮＡ測定法（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６，１３２２−１３２７，２０００）で解析され、適正使用の指標とされている。また、シスプラチンを用いた癌の化学療法においてはＥＲＣＣ１等のＤＮＡ修復酵素も効果を予測する因子として有用であることが示唆されている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１６，３０９−３１６，１９９８）。
一方、近年、数百〜数万という多種の遺伝子のｍＲＮＡ発現を同時に解析できる技術として、ＤＮＡマイクロアレイ法が汎用されるようになってきた。この手法は遺伝子を網羅的に解析するのに適しており、将来汎用抗癌剤の適正使用に応用されることが期待されている。
５−フルオロウラシル等の代謝拮抗剤は生体内で種々の過程を経て代謝されるため、代謝拮抗剤の感受性を予測するには、上記３種（ＴＳ，ＤＰＤ及びＴＰ）の遺伝子発現の解析だけでは十分とは言えない。更に広範囲の遺伝子発現を解析できれば感受性の予測率も高まると予想される。また実際の癌化学療法においては数種の抗癌剤を組み合わせた併用療法が施行されることが多いため、各薬剤の感受性に関与する遺伝子発現を包括的に解析できれば個々の患者に適した併用化学療法をデザインできる可能性がある。
生化学的酵素活性測定法、抗体を用いた免疫学的測定法、ノーザンハイブリダイゼーションやＲＴ−ＰＣＲ法によるｍＲＮＡ測定法はいずれも定量性は高いものの、原則として１遺伝子につき１回のアッセイが必要なので、多種の遺伝子発現様式を同時に解析するには作業上適していない技術である。
一方、ＤＮＡマイクロアレイ法は多種の遺伝子発現解析に適しているものの、定量性はノーザンハイブリダイゼーションやＲＴ−ＰＣＲ法に比べ格段に劣る。その原因の主たるものとして、ノーザンハイブリダイゼーションやＲＴ−ＰＣＲ法は目的とする遺伝子に対する特異性をＲＮＡやＰＣＲ産物のサイズにより分別することができるが、ＤＮＡマイクロアレイ法は分子サイズが表現されないドットブロットであるため特異性を分別できず、目的とする遺伝子発現以外の非特異的なシグナルを検出してしまう（いわゆるクロスハイブリダイゼーション）ことが挙げられる。目的とする遺伝子に対する特異性は、アレイ化する個々のＤＮＡ断片（以下、ターゲット断片と呼ぶ）の設定法、すなわち遺伝子（全長ｃＤＮＡ）のどの部分（リージョン）をターゲット断片として選択するかによって左右される。通常のＤＮＡマイクロアレイ法の場合、設計支援ソフトなどを利用して計算上特異性が高いと予想されるリージョン（データベース上に公開されている他の遺伝子と塩基配列の重複が少ないリージョン）を選択してターゲット断片としているものの、その特異性が実証されているわけではない。また、ターゲット断片はＰＣＲで増幅して調製されるが、その際に用いられる個々の遺伝子に特異的なプライマーがターゲット断片溶液に混入して一緒にアレイ化される結果、不均一なバックグラウンドの原因になることがある。これらの要因により、同一検体（生体由来試料）中のある特定遺伝子の発現量をＤＮＡマイクロアレイ法で解析した結果とノーザンハイブリダイゼーションやＲＴ−ＰＣＲ法で解析した結果が食い違うことはしばしば起こるので、ＤＮＡマイクロアレイ法の結果のみで遺伝子発現に差があると断定することはできない。実験手順としては、第一次スクリーニングとして発現量に差がありそうな遺伝子をＤＮＡマイクロアレイ法でおおまかに絞り込み、第二次スクリーニングとしてノーザンハイブリダイゼーションやＲＴ−ＰＣＲ法により発現量の差が確かであることを証明するのが一般的で、結局のところ少なくとも２種の測定法が必要となる。
従って、本発明の目的は代謝拮抗剤系抗癌剤及びこれと他の抗癌剤との併用療法に対する感受性を、一度だけの簡便なアッセイで、しかも高感度に定量性よく測定するための手段を提供することにある。
発明の開示
かかる実状において本発明者らは、汎用されているＤＮＡマイクロアレイ法により一度で抗癌剤の感受性が測定できるか否かを検討した。しかし、次のような欠点があることが判明した。
すなわち、汎用されているＤＮＡマイクロアレイ法の場合、対象とする遺伝子の種類が数百から数万と多いために、現状で使用可能な抗癌剤の作用機序から推察して薬剤感受性には関連がないと思われる遺伝子を多数含んでいる。その結果、解析に余計な労力を必要としたり、抗癌剤の作用機序に密接した遺伝子を軽視することがあるといった短所が生ずる。
更に、汎用されているＤＮＡマイクロアレイ法の場合、支持担体（ナイロンメンブレンやガラスプレートなど）にスポットするＤＮＡ量（濃度）は一定である場合が多く、抗癌剤の感受性に密接に関連している遺伝子であるにも関わらず発現量が極めて少ないために定量できないものがある。
そこで、本発明者らは、現存するＤＮＡマイクロアレイ法を改良すべく検討した。まず、標的遺伝子を代謝拮抗剤系抗癌剤及びこれと併用する他の抗癌剤の作用機序に関連していると考えられる遺伝子を中心に数十から数百に絞り込んだ。次にデータベースを利用したホモロジー検索により計算上で設計しただけでなく、実際にノーザンハイブリダイゼーションにより特異性を確認したものをターゲット断片とした。かくして選択された断片を基板上に固定化することにより得られたＤＮＡアレイは、代謝拮抗剤系抗癌剤又は当該抗癌剤と他の抗癌剤との併用に対する感受性を、一度の試験で高感度に判定できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、核酸代謝関連酵素遺伝子群、遺伝子修復関連酵素遺伝子群、薬剤耐性関連因子遺伝子群及びハウスキーピング遺伝子群の各群からの少なくとも２種以上を含む少なくとも１３種以上の標的遺伝子の断片であって、
次のステップ１）及び２）、
１）データベースを利用したホモロジー検索により、標的遺伝子に特異性の高い断片を選択するステップ、
２）１）のステップで選択された断片をプローブとして腫瘍細胞から得られたＲＮＡに対してノーザンハイブリダイゼーションを行い、標的遺伝子に対する特異性を確認するステップ、
を行うことにより選択された断片を、基板上に固定化してなることを特徴とする代謝拮抗剤系抗癌剤又は当該抗癌剤と他の抗癌剤との併用に対する感受性の測定用ＤＮＡアレイを提供するものである。
また、本発明は、このＤＮＡアレイに、癌患者由来の体液検体又は組織検体から得られたｍＲＮＡを鋳型として合成した標識ｃＤＮＡプローブをハイブリダイズさせることを特徴とする当該体液検体又は組織検体の代謝拮抗剤系抗癌剤又は当該抗癌剤と他の抗癌剤との併用に対する感受性の測定方法を提供するものである。
発明を実施するための最良の形態
本発明のＤＮＡアレイは、代謝拮抗剤系抗癌剤又は当該抗癌剤と他の抗癌剤との併用に対する感受性の測定に用いるものである。ここで、代謝拮抗剤系抗癌剤としては、テガフール、５−フルオロウラシル、テガフール・ウラシル、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム、カルモフール、カペシタビン、フルツロン等の５−フルオロウラシル系抗癌剤；６−メルカプトプリン、メルカプトプリンリポジド等のメルカプトプリン系抗癌剤；シタラビン、エノシタビン、ゲムシタビン等のシトシン系抗癌剤；メトトレキサート等が挙げられ、このうち５−フルオロウラシル系抗癌剤が特に好ましい。また、代謝拮抗剤と併用する他の抗癌剤としては、シスプラチン等の白金錯体系抗癌剤；ＣＰＴ−１１、ＶＰ−１６等のトポイソメラーゼ阻害剤；ドセタキセル、パクリタキセル等のタキサン系抗癌剤等が挙げられる。
本発明における感受性の測定には、患者に対する抗癌剤の有効性及び副作用のバランスの判定、適切な併用療法の決定、適切な投与法（投与量、投与スケジュール）の判定等が含まれる。
本発明における標的遺伝子は、感受性に関連していると考えられる遺伝子であり、核酸代謝関連酵素遺伝子群、遺伝子修復関連酵素遺伝子群、薬剤耐性関連因子遺伝子群及びハウスキーピング遺伝子群の各群からの少なくとも２種以上を含む少なくとも１３種以上の遺伝子である。
ここで、核酸代謝関連酵素としては、チミジル酸シンターゼ（ｔｈｙｍｉｄｙｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ：ＴＳ）、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ（ｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：ＤＰＤ）、オロテートホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｏｒｏｔａｔｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：ＯＰＲＴ（ウリジンモノホスフェートシンセターゼ（ｕｒｉｄｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ：ＵＭＰＳ）））、チミジンホスホリラーゼ（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ：ＴＰ）、チミジンキナーゼ１（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ １：ＴＫ１）、リボヌクレオシド−ジホスフェートリダクターゼＭ１サブユニット（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ−ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ Ｍ１ ｓｕｂｕｎｉｔ：ＲＲＭ１）、リボヌクレオシド−ジホスフェートリダクターゼＭ２サブユニット（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ−ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ Ｍ２ ｓｕｂｕｎｉｔ：ＲＲＭ２）、ウリジンシチジンキナーゼ２（ｕｒｉｄｉｎｅ ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ２：ＵＣＫ２）、ウリジンホスホリラーゼ（ｕｒｉｄｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ：ＵＰ）、シチジンデアミナーゼ（ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ：ＣＤＡ）、５′ヌクレオチダーゼ（５′ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ：ＮＴ５）、ＩＭＰデヒドロゲナーゼ１（ＩＭＰ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ １：ＩＭＰＤ）、メチレンテトラヒドロフォレートデヒドロゲナーゼ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：ＭＴＨＦＤ１）、ＲＮＡポリメラーゼ２（ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ２：ＲＰ２）、ウリジンモノホスフェートキナーゼ（ｕｒｉｄｉｎｅｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｋｉｎａｓｅ：ＵＭＰＫ）、ＣＴＰシンターゼ（ＣＴＰ ｓｙｎｔｈａｓｅ：ＣＴＰＳ）、デオキシシチジレートデアミナーゼ（ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｙｌａｔｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ：ＤＣＤ）、デオキシシチジンキナーゼ（ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ：ＤＣＫ）、ホスホリボシルピロホスフェートシンセターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ：ＰＲＰＳ）、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １：ＨＰＲＴ１）、フォリルポリグルタメートシンセターゼ（ｆｏｌｙｌｐｏｌｙｇｌｕｔａｍａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ：ＦＰＧＳ）、ヌクレオシドジホスフェートキナーゼＡ（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｋｉｎａｓｅ Ａ：ＮＤＫＡ）、ヌクレオシドジホスフェートキナーゼＢ（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｋｉｎａｓｅ Ｂ：ＮＤＫＢ）、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ａｄｅｎｉｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：ＡＰＲＴ）、アデノシンキナーゼ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅ：ＡＫ）等が挙げられる。これらの酵素遺伝子のうち、少なくともＴＳ、ＤＰＤ、ＯＲＲＴ、ＴＰ及びＴＫ１の遺伝子を含むのが特に好ましい。
遺伝子修復関連酵素としては、ＤＮＡ切除修復蛋白ＥＲＣＣ１（ＤＮＡ ｅｘｃｉｓｉｏｎｒｅｐａｉｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ＥＲＣＣ１：ＥＲＣＣ１）、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ｕｒａｃｉｌ−ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ：ＵＤＧ）、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：ＰＡＲＰ）、ＤＮＡリガーゼＩ（ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ Ｉ：ＬＩＧ１）、ＤＮＡリガーゼＩＩＩ（ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ ＩＩＩ：ＬＩＧ３）、ＤＮＡリガーゼＩＶ（ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ ＩＶ：ＬＩＧ４）、ＤＮＡポリメラーゼβ（ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ β：ＰＯＬＢ）、ＤＮＡポリメラーゼδ（ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ δ：ＰＯＬＤ）、ＤＮＡ−修復蛋白ＸＲＣＣ１（ＤＮＡ−ｒｅｐａｉｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ＸＲＣＣ１：ＸＲＣＣ１）等が挙げられる。これらの酵素遺伝子のうち、少なくともＥＲＣＣ１及びＵＤＧを含むのが好ましい。
薬剤耐性関連因子としては、トポイソメラーゼ１（ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ １：ＴＯＰ１）、Ｐ−グリコプロテイン（Ｐ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ：ＭＤＲ１）、平衡ヌクレオシドトランスポーター１（ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｖｅ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ １：ＥＮＴ１）、多剤耐性関連蛋白１（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １：ＭＲＰ１）、トポイソメラーゼ２α（ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ ２α：ＴＯＰ２Ａ）、トポイソメラーゼ２β（ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ ２β：ＴＯＰＢ）、熱ショック蛋白２７（ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ ２７：Ｈｓｐ２７）、平衡ヌクレオシドトランスポーター２（ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｖｅ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ２：ＥＮＴ２）等が挙げられる。これらの因子遺伝子のうち少なくともＴＯＰ１、ＭＤＲ１、ＥＮＴ１及びＭＲＰ１の遺伝子を含むのが好ましい。
ハウスキーピング遺伝子としては、グリセロアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：ＧＡＰＤＨ）、βアクチン（β−ａｃｔｉｎ：ＡＣＴＢ）及び４０Ｓリボソーマル蛋白Ｓ９（４０Ｓｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ９：ＲＳＰ９）等が挙げられる。ＧＡＰＤＨ、ＡＣＴＢ、ＲＳＰ９から選ばれる２種以上を含むのが好ましい。これらの遺伝子は、内部標準として使用されるものである。
その他の遺伝子としては、Ｅ２Ｆ１、ｐ５３、ＶＥＧＦβ（ＶＥＧＦ β）、インテグリンα３（ｉｎｔｅｇｒｉｎ α３）、Ｍｎ ＳＯＤ、Ｃｕ／Ｚｎ ＳＯＤ、増殖細胞核抗原（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｔｉｇｅｎ：ＰＣＮＡ）等が挙げられる。
これらの標的遺伝子の断片をすべて固定化するのが望ましいが、特に、ＴＳ、ＤＰＤ、ＯＰＲＴ、ＴＰ、ＴＫ１、ＥＲＣＣ１、ＵＤＧ、ＴＯＰ１、ＭＤＲ１、ＥＮＴ１及びＭＲＰ１の１１種の遺伝子と、ＧＡＰＤＨ、ＡＣＴＢ及びＲＳＰ９のうちの２種以上との合計の１３種以上の遺伝子の断片を固定化すると前記感受性のより効率的な測定が可能であり好ましい。
これらの標的遺伝子の配列について、まずデータベースを利用したホモロジー検索により、各標的遺伝子に特異性の高い断片を選択する（ステップ１）。
このホモロジー検索は、例えばＢｌａｓｔ Ｓｅａｒｃｈ等により行うことができる。断片の設計条件としては、例えばＧＣ含量が４０〜６０％で重複配列が少なく、Ｔｍ値が７５〜８５℃、サイズ２００〜６００ｂｐ等が挙げられる。
次にステップ１で設計された断片をプローブとして腫瘍細胞から得られたＲＮＡに対してノーザンハイブリダイゼーションを行うことにより、特異性を確認する（ステップ２）。ステップ１で設計された断片は、計算上は標的遺伝子に対する特異性が高いはずであるが、実際にはクロスハイブリダイゼーションが高い確率で起こる。実際、ステップ１で第１選択された断片が、ステップ２で特異的であることが確認できたものは１０〜２０％にすぎない。
ステップ２は、まず、ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲ法にて増幅することによりＤＮＡ断片を得る。次に、このＤＮＡ断片を鋳型として放射性プローブを酵素的に合成し、種々の腫瘍細胞から調製した全ＲＮＡをブロットしたメンブレンを用いてノーザンハイブリダイゼーションを実施し、特異性を確認する。すなわち特定遺伝子から転写されるｍＲＮＡのサイズ（文献情報やデータベースサーチにて調査できる）に対応したシグナルが検出され、しかも他のサイズのシグナルがほとんど検出されない（クロスハイブリダイゼーションがほとんどない）ことが特異性の条件となる。
特異性が充分でないＤＮＡ断片については、対応する遺伝子の他のリージョンからＤＮＡ断片を設計し直し、再度ノーザンハイブリダイゼーションを実施する。このような作業を特異性が充分になるまで繰り返すことで、アレイ化するＤＮＡ断片のリージョンを最適化し、ターゲット断片を得る。ターゲット断片は、プラスミド（ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ）にクローニングする。
なお、ターゲット断片をＰＣＲで増幅する時に用いるプライマーとして、クローニングベクターのマルチプルクローニングサイトの配列を元にユニバーサルプライマーを設計し、すべてのターゲット断片が一組のユニバーサルプライマーで増幅できるようにする。当該ユニバーサルプライマーとしては、配列番号１及び２に示される塩基配列を有するプライマーが特に好ましい。また、スポッティング溶液に混入するプライマー量ができるだけ少なくなるようにユニバーサルプライマーの量を最適化する。その結果、すべてのターゲット断片のスポットにおけるバックグラウンドが低く抑えられ、ばらつきが少なくなる。
かくして選択された各標的遺伝子のターゲット断片を基板（支持担体）上に固定化すれば、本発明のＤＮＡアレイが得られる。ここで使用される基板としては、通常公知のものが挙げられ、例えば、ガラスプレート、プラスチックプレート、メンブレン（ナイロン製等）、ビーズ等が挙げられ、好ましくはガラスプレートである。また、当該アレイへの断片の固定化は、通常公知のスポッティング手段が利用でき、例えば、特表平１０−５０３８４１号公報記載のようなターゲットＤＮＡを含む溶液に先の割れたピンを浸して支持体の上に圧着することにより移していく表面接着方式（ｓｔａｎｆｏｒｄ方式）、ターゲットＤＮＡを含む溶液をインクジェットプリンタと同様の原理で支持体に吹き付けるインクジェット・圧電放出方式、光リソグラフの技術を利用して、ターゲットＤＮＡを直接支持体の上で合成する光リソグラフ方式等により行われ、好ましくはｓｔａｎｆｏｒｄ方式である。
ノーザンハイブリダイゼーションによる解析で得られた個々の遺伝子の発現量に基づいて、発現量の多い遺伝子については基板（支持担体）に固定化するターゲット断片の量を少なく、発現量の少ない遺伝子については多くすることにより、すべての標的遺伝子のｍＲＮＡを定量できるようにするのが好ましい。
得られた本発明のＤＮＡアレイを用いて前記抗癌剤の感受性を測定するには、当該ＤＮＡアレイに、癌患者由来の体液検体又は組織検体から得られたｍＲＮＡを鋳型として合成した標識ｃＤＮＡプローブをハイブリダイズさせることにより実施できる。
ここで癌患者由来の体液としては、血液、尿等が挙げられる。また組織としては、癌組織が挙げられる。検体からｍＲＮＡの採取は常法により行われ、ｍＲＮＡは全ＲＮＡに含まれたままでも、全ＲＮＡから単離したもののいずれでもよい。また標識ｃＤＮＡは、ｍＲＮＡを鋳型として逆転写酵素反応を利用して標識する。ここで、標識としては、蛍光標識、放射性同位体による標識が挙げられるが、蛍光標識が特に好ましい。
ハイブリダイゼーションの条件は、常法により行うことができる。ハイブリダイズの定量は標識プローブ量、例えば蛍光量を定量することにより行われる。
本発明ＤＮＡアレイの定量性のバリデーションを取るために、５２種の遺伝子発現の測定値をノーザンハイブリダイゼーション法で得られた測定値と比較したところ、食い違うことがほとんどなかった。また、特徴のある発現様式を示す（平均的な発現量よりも２倍以上差のある）遺伝子を判別することも、ノーザンハイブリダイゼーションと同程度の精度で可能であった。
実施例
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの範囲に限定されるものではない。
実施例１
（１）ターゲット断片の調製
Ａ．ＤＮＡ断片の選択と設計
後記表２及び３に示すように、核酸代謝関連遺伝子を中心に、５−ＦＵの感受性に関連していると考えられる遺伝子を５２種類選択した。ＤＮＡ断片の設計は、原則としてＧＣ含量が４０〜６０％で重複配列が少なくＴｍ値が７５〜８５℃、サイズが２００〜６００ｂｐであることを条件とし、クロスハイブリダイゼーションをできるだけ回避するために他の遺伝子と重複する配列がほとんどないことをデータベースを利用したホモロジー検索（Ｂｌａｓｔ Ｓｅａｒｃｈ）により確認した。ＰＣＲで増幅する時に用いる個々の遺伝子に特異的なプライマー（ｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｉｍｅｒ［ｆｏｒｗａｒｄ／ｒｅｖｅｒｓｅ］）はＴｍ値が５９〜６１℃となるように設計支援ソフト（Ｐｒｉｍｅｒ ＥｘｐｒｅｓｓＴＭ、ＰＥバイオシステムズ）を用いて設定した。
Ｂ．ＤＮＡ断片の合成と精製
ＤＮＡ断片は、ヒト由来のｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、特異的プライマーとＥｘＴａｑＴＭ（ＴａＫａＲａ）を用いてＰＣＲ反応（熱変性を９４℃で１分，アニーリングを６０℃で１分，伸長反応を７２℃で１分を１サイクルとして、計３０サイクル）により増幅した。ＰＣＲ産物溶液をスピンカラム（ミニプレップスピンカラム、Ａｅｔｎａ）により精製し、蒸留水で溶出した。
（２）ノーザンハイブリダイゼーション
Ａ．全ＲＮＡの調製と精製
表１記載の１４種のヒト腫瘍細胞からＲＮｅａｓｙ ｍｉｄｉ ｋｉｔＴＭ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて全ＲＮＡを抽出し、蒸留水で溶出した。溶液中に混在している可能性のあるＤＮＡをＤＮａｓｅを用いて分解し（３７℃、３０分）、フェノール・クロロホルムを用いて除タンパクし、エタノール沈殿により精製・濃縮し、蒸留水に溶解して全ＲＮＡ溶液を得た。
前記の１４種のヒト腫瘍細胞から調製した全ＲＮＡ（各５μｇ）を１重量％変性アガロースゲルにて電気泳動した。臭化エチジウムにより染色し、紫外線下で写真撮影してＲＮＡが分解していないことを確認した。ゲル中のＲＮＡをキャピラリ法によりナイロンメンブレンにブロットし、紫外線によりメンブレンに固定（クロスリンク）した。
Ｃ．プローブの調製
上記（１）で調製したＤＮＡ断片を鋳型として、ランダムプライム法（ｒｅｄｉｐｒｉｍｅＴＭＩＩ、アマシャムファルマシア）により［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰにてラベルしたプローブを合成した。プローブ中に取り込まれなかった［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰをゲル濾過法（ＰｒｏｂｅＱｕａｎｔＴＭ Ｇ−５０マイクロスピンカラム、アマシャムファルマシア）により取り除いた。
Ｄ．ノーザンハイブリダイゼーション
上記（２）Ｂと（２）Ｃで調製されたブロットとプローブを用いてノーザンハイブリダイゼーションを実施した。ブロットをハイブリダイゼーションバッファー（ラピッドハイブリバッファー、アマシャムファルマシア）中にて６５℃、３０分プレハイブリダイズし、そこに熱変性させたプローブを添加して、６５℃で２時間ハイブリダイズした。次にブロットを洗浄し（０．１重量％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ（０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ／０．１５ｍｏｌ／Ｌクエン酸３ナトリウム）溶液で２回、０．１重量％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ溶液で１回、０．１重量％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ溶液で２回）、遮光下で一晩イメージングプレート（富士フィルム）に露光した。翌日、イメージングプレートを画像解析装置（ＳＴＯＲＭ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｃ．）でスキャンし、画像データを保存した。
Ｅ．ＤＮＡ断片の評価と再設計
ノーザンハイブリダイゼーションの画像を見て、ＤＮＡ断片の特異性を評価した。すなわち、目的とする遺伝子のｍＲＮＡと同じサイズのシグナルが見られ、それ以外のシグナルがほとんど見られないときには特異性があるものと判断し、対して目的とする遺伝子のｍＲＮＡのサイズにシグナルが認められなかったり、他のシグナルが認められた（クロスハイブリダイセーション）時には特異性に乏しいと評価した。後者の場合、同一遺伝子のｍＲＮＡの他のリージョンから上記（１）Ａに示した条件でＤＮＡ断片を再設計した。以下、ＤＮＡ断片の特異性が確認されるまで、設計、合成及びノーザンハイブリダイゼーションの工程を繰り返し（多いもので６回）、ターゲット断片（本発明のＤＮＡアレイに乗せる遺伝子のリージョン）を決定した。
（３）ＤＮＡアレイの作成とハイブリダイゼーション
一連の工程は、Ｓｔａｎｆｏｒｄ方式を基本としており、一部改変したものである。
Ａ．ターゲット断片のクローニング
ターゲット断片を質・量ともに安定に供給するには、ロットによるばらつきが生じ易いｃＤＮＡライブラリーを鋳型として用いるのは望ましくない。そこで、図１で示すように、個々のターゲット断片（ＰＣＲ産物の状態にある）をＴＡクローニング法によりプラスミド（ｐＣＲ−ＴＯＰＯ ｖｅｃｔｏｒ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングすることにより、すべてのターゲット断片に対応した５２種類のクローンを得た。
Ｂ．ターゲット断片の調製
上記のクローンを鋳型とし、上記（１）に準じた方法でターゲット断片を増幅した。ただし、プライマーとしてユニバーサルプライマーを用いた（配列番号１、２）。得られたＰＣＲ産物をエタノール沈殿法により洗浄した後、蒸留水で溶かした。溶液の一部を取って濃度算出（吸光度測定による）及び純度検定（アガロースゲル電気泳動による）に用いた。ターゲット断片溶液は一度室温真空下で乾固し、Ｍｉｃｒｏ Ｓｐｏｔｔｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＭ）にて０．５−１０ｐｍｏｌ／μＬの濃度になるように溶解した（表２及び３に個々のターゲット断片の濃度を示す）。得られたターゲット断片の塩基配列を配列番号３〜配列番号５４に示した。
あらかじめポリＬリジンコートしてあるスライドガラスに、スポッター（ＯｍｎｉＧｒｉｄ，ＧＥＮＥＭＡＣＨＩＮＥＳ）を用いて９５℃で３分熱変性したターゲット断片をスポッティングした。その後、紫外線にてターゲット断片をスライドガラスにクロスリンクし、ブロッキング溶液（８重量％Ｂｌｏｃｋ Ａ ｉｎ ＰＢＳ）の入ったラックに入れて３０分振盪したのちＴＥバッファーで洗浄して乾燥させた。スライドガラスは使用するまでデシケーターに入れて遮光下で保存した。このようにして本発明ＤＮＡアレイを得た。
Ｄ．蛍光ＤＮＡプローブの調製
腫瘍細胞から調整した全ＲＮＡ（上記（２）と同一の方法による）を鋳型に、個々の遺伝子のｍＲＮＡに特異的なプライマーを用いて、逆転写酵素反応を利用して蛍光標識した。標識反応に必要な試薬は以下の通りである。
・逆転写酵素ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）
・（反応バッファー、ＤＴＴ）
・プライマー混合液（５２種の遺伝子に特異的なリバースプライマーを混合したもの。リバースプライマーは参考例１にて用いた特異的プライマーのうちの片方）
・ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ（アマシャムファルマシア）
・Ｃｙ３−ｄＵＴＰ（アマシャムファルマシア）
・Ｃｙ５−ｄＵＴＰ（アマシャムファルマシア）
・０．５Ｍ ＥＤＴＡ
・１Ｎ ＮａＯＨ
・１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
・ＴＥバッファー
全ＲＮＡ（３０μｇ）、プライマー混合液（５０ｐｍｏｌ ｅａｃｈ）と蒸留水を混合し、９μＬに調整したものを６５℃で２分間熱変性して氷上で急冷した。反応バッファー（１×）、ＤＴＴ（１０ｍＭ）、ｄＴＴＰ（０．２ｍＭ）、ｄＡＴＰ（０．５ｍＭ）、ｄＧＴＰ（０．５ｍＭ）、ｄＣＴＰ（０．５ｍＭ）、Ｃｙ３−ｄＵＴＰ又はＣｙ５−ｄＵＴＰ（０．１ｍＭ）、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（１０Ｕ／μＬ）を添加し、蒸留水にて全量を２０μＬとした（括弧内は終濃度を示す）。４２℃で６０分反応させた後蒸留水２０μＬ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ５μＬ、１Ｎ ＮａＯＨ５μＬを添加して６５℃で６０分インキュベートすることによりＲＮＡを分解し、２５μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを加えて中和した。２００−４００μＬのＴＥバッファーを加え、反応液を限外濾過法（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ−３０、ミリポア）により脱塩・濃縮し（この工程で、プローブに取り込まれなかったＣｙ３−ｄＵＴＰ又はＣｙ５−ｄＵＴＰや、リバースプライマーも除去される）、最終的に約１０μＬのプローブ溶液を得た。
Ｅ．ハイブリダイゼーション
上記蛍光ＤＮＡプローブ溶液に２０×ＳＳＣを３μＬと蒸留水を加え、２０μＬとし（終濃度３×ＳＳＣ）、９５℃で３分間熱変性させ、室温で放置して冷却させた。そこに１０重量％ＳＤＳを２μＬと蒸留水を加えて４０μＬとし（終濃度０．５重量％）、Ａ〜Ｃの工程で作製したＤＮＡアレイに滴下して、カバーグラスを上からかぶせて覆った（気泡が入らないように静かに乗せた）。ＤＮＡアレイをハイブリダイゼーションチャンバーにセットし、６５℃で１０〜２０時間インキュベートした後、０．２重量％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ溶液中に入れてカバーグラスを静かに外し、そのまま５分間洗浄した。更に、０．２重量％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ溶液中で１回、０．２重量％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ溶液中で２回の洗浄の工程を繰り返し、最後に０．２×ＳＳＣで２回リンスした（洗浄の工程はすべて室温で行った）。ＤＮＡアレイをラックに入れ、６００ｒｐｍで２０秒間遠心して水分を飛ばし、室温で乾燥させてから、ＤＮＡマイクロアレイ用蛍光スキャナー（ＧｅｎｅＰｉｘ，Ａｘｏｎ）で蛍光シグナルを測定した。
試験１：ＤＮＡ断片の特異性
ノーザンハイブリダイゼーションにおいて、プローブ合成の鋳型として用いたＤＮＡ断片の特異性は、同一遺伝子であっても設計されたリージョンによって様々だった。実例として、ＸＲＣＣ１とＥ２Ｆ１を図２に示す。ＸＲＣＣ１では８９８−１２６５ｎｔのリージョンは良好（目的とする遺伝子のｍＲＮＡと同じ長さのサイズに強いシグナルが見られた）だったが、１８７−４９４ｎｔはクロスハイブリダイゼーションが多く不適と判断された。同様に、Ｅ２Ｆ１では１０１４−１３０９ｎｔのリージョンは良好だったが、７８８−１０８７ｎｔは不適であった。他の遺伝子についても程度の差はあるものの特異性は多様だった。最終的に、対象遺伝子において最も特異性の良好だったＤＮＡ断片を選択してターゲット断片とした。
試験２：ノーザンハイブリダイゼーションの定量性
ＤＮＡアレイの定量性は、ノーザンハイブリダイゼーションと比較することにより確認できる。そこで、本発明者らが採用したノーザンハイブリダイゼーションの測定系（実施例１（２））の定量性を改めて確認するために、ＲＮＡ量と測定値（シグナル強度）との相関関係を調べた。
前記の１４種のヒト腫瘍細胞由来の全ＲＮＡを変性アガロースゲルで電気泳動後、ナイロンメンブレンにブロットし、ＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅｓ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）のターゲットＤＮＡから合成したプローブを用いてノーザンハイブリダイゼーションを実施した（方法の詳細は実施例１（２）と同じ）。結果を画像解析用ソフト（ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｃ）で解析し、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡと対応するシグナル強度を定量した。
泳動した全ＲＮＡ量とノーザンハイブリダイゼーションの測定値との関係を図３に示す。全ＲＮＡ量とシグナル強度の間の直線関係は明らかであり（ｒ＝０．９５、ｐ＜０．０１）、定量性が高いことが示された。
試験３：ユニバーサルプライマーのバックグラウンドに及ぼす影響
図１に示すように、ユニバーサルプライマー（ｆｏｒｗａｒｄ（ｐＣＲ−Ｆ）／ｒｅｖｅｒｓｅ（ｐＣＲ−Ｒ））をベクターのマルチクローニングサイトの配列を元に設計した。ユニバーサルプライマーを用いることで、５２種すべてのターゲット断片を一定の効率で増幅できるようになったため、特異的プライマーと比較してターゲット断片の安定供給が容易になった。
ターゲット断片をスポッティングするときに混入してくるプライマーのバックグラウンドに及ぼす影響を調べるために、ユニバーサルプライマー（５スポット）と特異的プライマー（表２及び表３に記載の５種のターゲットＤＮＡ断片［ＴＳ，ＤＰＤ，ＯＰＲＴ，ＬＩＧ４，ＧＡＰＤＨ］の両端約２０ｂｐの配列に対応するプライマーをそれぞれ１スポットずつ）を等量ずつスライドガラスにスポットし、実施例１（３）で示した手順によりハイブリダイゼーションを行い、それぞれのシグナル強度を測定した。
ユニバーサルプライマー（５スポット）のシグナル強度の平均値は２７．３、標準偏差（ＳＤ）は６．５、変動係数（ＣＶ）は２４．０％であったのに対し、特異的プライマー（５スポット）のシグナル強度の平均値は２２．９、標準偏差（ＳＤ）は１２．０、変動係数（ＣＶ）は５２．４％であった。シグナル強度はほぼ同等であったものの、ユニバーサルプライマーの方がＳＤ、ＣＶともに小さいことより、ユニバーサルプライマーの方がスポット間におけるバックグラウンドのばらつきに及ぼす影響が比較的小さいことが示された。
更に、バックグラウンドを極力抑えるために、ターゲット断片を増幅するときに用いるユニバーサルプライマーの必要最少量を検討した。ｆｏｒｗａｒｄ／ｒｅｖｅｒｓｅプライマーをそれぞれ１０，２０，３０，４０，５０ｐｍｏｌ用いてＰＣＲにかけ、産物をアガロースゲル泳動したところ、２０ｐｍｏｌ以下では産物量が減少することが確認できたので、ユニバーサルプライマーの必要最少量を３０ｐｍｏｌと決定した。
実施例２ ヒト腫瘍細胞中の種々の遺伝子発現量の測定
（１）ノーザンハイブリダイゼーション法による測定
ＤＮＡアレイに乗せるターゲット断片を決定する過程で、前記の１４種のヒト腫瘍細胞における５２種の遺伝子のノーザンハイブリダイゼーションの結果を元に（実施例１（２）参照）、それぞれの遺伝子の発現量を画像解析した。なお、発現量は、３種のハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ，ＡＣＴＢ，ＲＳＰ９）の発現量の平均値に対する相対値として表わした。
（２）ＤＮＡアレイによる測定
５２種の遺伝子ターゲット断片を乗せたＤＮＡアレイを作製し、ノーザンハイブリダイゼーションで用いた１４種の細胞から抽出した全ＲＮＡを元に調製した蛍光ＤＮＡプローブを用いてハイブリダイゼーションを実施し、それぞれの遺伝子の発現量を測定した（方法の詳細は実施例１（３）と同じ）。なお、発現量は、３種のハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ，ＡＣＴＢ，ＲＳＰ９）の発現量の平均値に対する相対値として表わした。
（３）ノーザンハイブリダイゼーション法とＤＮＡアレイの相関
前記の１４種のヒト腫瘍細胞における５２種の遺伝子の発現量について、ノーザンハイブリダイゼーション法とＤＮＡアレイで測定した結果の相関を調べるために回帰分析した（表４）。相関の程度（相関係数）は、遺伝子の種類によってまちまちであったが、２０種の遺伝子については５％未満の危険率において有意な相関が認められた。９種の遺伝子については、有意ではなかったものの、相関する傾向が認められた（ｐ＜０．１）。３種のハウスキーピング遺伝子を含む１２種の遺伝子（ＭＴＨＦＤ１、ＳＯＤ１、ＡＫ、Ｅ２Ｆ１、ＰＯＬＤ、ＬＩＧ３、ＲＳＰ９、ＨＰＲＴ１、ＡＣＴＢ、ＵＤＧ、ＧＡＰＤＨ、ＬＩＧ１）については、発現量のばらつきが細胞間で小さいため正規分布をしているとは言い難く、相関性は低い又は評価不能であった。
実際に医療現場で使用されることを想定した場合、診断（薬剤の適正使用）を使用目的とするこのようなツールは、通常ある閾値を境にして陽性又は陰性であると評価される。例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法で測定したＴＳやＤＰＤのｍＲＮＡレベルを５−ＦＵの適正使用の指標と見なした研究でも、レベルの高低を判断するための閾値が設定されている（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６，１３２２−１３２７，２０００）。本発明のＤＮＡアレイの診断判定力をノーザンハイブリダイゼーションと比較することにより以下の方法で評価した。
前記の１４種のヒト腫瘍細胞を臨床検体に相当するものと見なし、すべての細胞について５２種の遺伝子発現量を本発明のＤＮＡアレイ及びノーザンハイブリダイゼーションにより測定した（それぞれの測定法において、測定ポイントは５２種遺伝子×１４種細胞＝７２８ポイント算出された）。本発明のＤＮＡアレイの測定値をもとに、各遺伝子について１４種の細胞が示す発現量の中央値を求めた。中央値を基準とみなしたときの１４種の細胞における相対的発現量（中央値に対する発現量の比）を算出した。閾値を２倍と設定し、相対的発現量が閾値を越える（２以上または０．５以下）較差が見られた細胞を「陽性」、閾値を越えないものを「陰性」と判定した。またノーザンハイブリダイゼーションによる判定結果を信頼性の高いものとみなし、本発明のＤＮＡアレイによる判定結果が一致すれば「真」、一致しなければ「偽」と評価した。図４に示すように、陽性・陰性の判定結果が「真」であったのは８２．３％と高率であった。また、陽性と判定された７５ポイントのうち、７７．３％（５８／７５）がノーザンハイブリダイゼーションの結果と一致した。また、相反する結果（例えば、両方とも真陽性だがノーザンハイブリダイゼーションによる相対的発現量が０．３で本発明のＤＮＡアレイによる相対的発現量が２．５のようにまったく食い違っているという意味）は１例もなかった。このように、本発明のＤＮＡアレイは、ノーザンハイブリダイゼーションとほぼ同程度の診断判定力があることが示された。
（５）ＤＮＡアレイの検出力
試験４の４）において、判定の対象となった７２８ポイント（５２種遺伝子×１４種細胞）のうち、測定不可能であった６２ポイントについてはノーザンハイブリダイゼーションでも検出されたかった。このことより、本発明のＤＮＡアレイはノーザンハイブリダイゼーションと同等以上の検出力を有していることが示された。
実施例３ 可移植性ヒト腫瘍株中の種々の遺伝子発現量とＴＳ−１に対する感受性との相関
（１）ＴＳ−１に対する感受性試験
本発明のＤＮＡアレイを臨床応用する際、例えば癌組織中に発現している５２種の遺伝子発現量と５−ＦＵ系抗癌剤の抗腫瘍効果との間の相関を解析することにより、感受性規定因子として実際にどの遺伝子が重要であるのかを見極めるために用いることが想定される。
本試験では、抗腫瘍効果を検討する実験モデルとして、１１種の可移植性ヒト腫瘍株（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ。由来は、胃癌４株、大腸癌３株、肺癌２株、乳癌２株）のＴＳ−１に対する感受性試験を実施した（ＴＳ−１は大鵬薬品工業（株）が開発した５−ＦＵ系抗癌剤の１種であり、５−ＦＵのプロドラッグであるテガフール、ＤＰＤ阻害剤であるギメラシル及びｏｒｏｔａｔｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの阻害剤であるオテラシルカリウムをモル比にして１：０．４：１にて含有している配合剤である）。各種ｘｅｎｏｇｒａｆｔをヌードマウスの背部皮下に移植し、１００−２００ｍｍ３の大きさに達したときに対照群（薬剤非投与群）とＴＳ−１投与群に群分けし（１群あたり６匹）、翌日から１日１回、１４日間連日ＴＳ−１を１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ（ＦＴ量として）の用量で経口投与し、投薬終了翌日に腫瘍体積を測定して対照群の腫瘍体積と比較し、腫瘍増殖抑制率（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ，ＩＲ）を求めた。ＩＲは以下の式により算出した。
ＩＲ（％）＝（１−［ＴＳ−１投薬群の相対腫瘍体積］／［対照群の相対腫瘍体積］）×１００
（相対腫瘍体積）＝（判定時の腫瘍体積）／（群分け時の腫瘍体積）
（２）本発明のＤＮＡアレイによる測定
上記の１１種のｘｅｎｏｇｒａｆｔから抽出した全ＲＮＡを材料とし、５２種の遺伝子の発現量を測定した。試験方法は、実施例２に準じて行った。なお、発現量は、３種のハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ，ＡＣＴＢ，ＲＳＰ９）の発現量の平均値に対する相対値として表わした。
（３）１１種のｘｅｎｏｇｒａｆｔ中の遺伝子発現量とＴＳ−１に対する感受性との相関
上記（１）および（２）の検討により得られた１１種のｘｅｎｏｇｒａｆｔ中の５２種の遺伝子発現量とＴＳ−１に対する感受性（ＩＲ，％）との関連を調べるために、総当り（５２通り）で回帰分析を実施した。その結果、相関係数（Ｐ値：Ｐｅａｒｓｏｎの積率相関係数）の絶対値が０．５を上回った遺伝子が４種（ＵＤＧ，ＰＣＮＡ，ＴＳ，ＴＫ１）あった（図５）。Ｐ値は０．０５以上０．１未満であり、統計上有意ではなかったものの、Ｎ数が１１と少なかったこともあり、相関の傾向は回帰直線から見ても十分に判定できた。これら４種の遺伝子にＴＳが含まれていたことは注目に値する。ＴＳは、５−ＦＵ系抗癌剤の感受性規定因子の代表的なものであり、ＴＳ発現量が高いと５−ＦＵ系抗癌剤は奏効しにくいとの知見が基礎・臨床の双方から得られている。本検討でも、ＴＳ発現量とＴＳ−１の抗腫瘍効果の間には負の相関（ｒ＝−０．５３）があった点でこれまでの知見と一致している。さらに、確認試験として測定精度が極めて高いとされているリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により１１種のｘｅｎｏｇｒａｆｔ中のＴＳ発現量（ＧＡＰＤＨに対する相対発現量）を測定し、ＴＳ−１に対する感受性との相関を解析したところ、相関係数は−０．６５で有意な（Ｐ＝０．０３０）相関が認められた（図６）。この結果より、本発明のＤＮＡアレイは５−ＦＵ系抗癌剤の感受性規定因子の候補を５２種の遺伝子から絞り込む上で有用であることが示された。さらにＮ数を増やせば、臨床検体を用いて５−ＦＵ系抗癌剤の感受性規定因子を絞り込むことも可能であろうし、絞り込まれた遺伝子の発現量を解析することで、５−ＦＵ系抗癌剤の適正使用の指標とすることができる。
産業上の利用可能性
本発明によれば、検体中の数十〜数百種の遺伝子発現を、一度だけの簡便なアッセイで定量性よく測定できる。本発明の測定法を用いて被検体（例えば癌患者の末梢血単核球や腫瘍組織から抽出した全ＲＮＡ）中の、代謝拮抗剤系抗癌剤又はこれと他の抗癌剤の併用の作用機序に関連している遺伝子発現様式を解析することで、これらの抗癌剤の適正使用の指標とすることができる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、ユニバーサルプライマーの配列と、ターゲット断片が組み込まれたクローンの構造を示す図である。
図２は、プローブを合成するための鋳型となるＤＮＡフラグメントを遺伝子の異なるリージョンから設定すると、特異性に差異がある場合があることを示すノーザンハイブリダイゼーションの画像の実例を示す図である。
図３は、ノーザンハイブリダイゼーションにおいて全ＲＮＡ量と測定値の間の相関を示す図である。
図４は、本発明の診断判定力をノーザンハイブリダイゼーションと比較することで評価したことを示す図である。
図５は、１１種のｘｅｎｏｇｒａｆｔのＴＳ−１に対する感受性と５２種の遺伝子のうち相関関係の高かった４種の遺伝子発現量との相関を示す図である。
図６は、１１種のｘｅｎｏｇｒａｆｔのＴＳ−１に対する感受性とＴＳ発現量との相関を示す図である。
Claims (7)
- 核酸代謝関連酵素遺伝子群、遺伝子修復関連酵素遺伝子群、薬剤耐性関連因子遺伝子群及びハウスキーピング遺伝子群の各群からの少なくとも２種以上を含む少なくとも１３種以上の標的遺伝子の断片であって、
次のステップ１）及び２）、
１）データベースを利用したホモロジー検索により、標的遺伝子に特異性の高い断片を選択するステップ、
２）１）のステップで選択された断片をプローブとして腫瘍細胞から得られたＲＮＡに対してノーザンハイブリダイゼーションを行い、標的遺伝子に対する特異性を確認するステップ、
を行うことにより選択された断片を、基板上に固定化してなることを特徴とする代謝拮抗剤系抗癌剤又は当該抗癌剤と他の抗癌剤との併用に対する感受性の測定用ＤＮＡアレイ。 - 基板上への各断片の固定量が、腫瘍細胞における標的遺伝子の発現量に応じて調節されている請求項１記載のＤＮＡアレイ。
- ステップ２）で選択された断片を、配列番号１及び２で示される塩基配列を有するユニバーサルプライマーを用いるＰＣＲにより取得するものである請求項１又は２記載のＤＮＡアレイ。
- 核酸代謝関連酵素遺伝子群が、少なくともチミジル酸シンターゼ遺伝子、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子、オロテートホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、チミジンホスホリラーゼ遺伝子及びチミジンキナーゼ１遺伝子を含む遺伝子群であり；
遺伝子修復関連酵素遺伝子群が、少なくともＤＮＡ切除修復蛋白ＥＲＣＣ１遺伝子及びウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ遺伝子を含む遺伝子群であり；
薬剤耐性関連遺伝子群が、少なくともトポイソメラーゼ１遺伝子、Ｐ−グリコプロテイン遺伝子、平衡ヌクレオシドトランスポーター１遺伝子及び多剤耐性関連蛋白１遺伝子を含む遺伝子群であり；
ハウスキーピング遺伝子群が、グリセロアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子、β−アクチン遺伝子及び４０Ｓリボソーム蛋白Ｓ９遺伝子から選ばれる２種以上の遺伝子群である請求項１〜３のいずれか１項記載のＤＮＡアレイ。 - 各標的遺伝子断片が、２００〜６００ｂｐである請求項１〜４のいずれか１項記載のＤＮＡアレイ。
- 少なくとも次の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）の断片を、基板上に固定化してなることを特徴とする代謝拮抗剤系抗癌剤又は当該抗癌剤と他の抗癌剤との併用に対する感受性の測定用ＤＮＡアレイ。
（Ａ）配列番号３で示される塩基配列を有するチミジル酸シンターゼ遺伝子断片、配列番号４で示される塩基配列を有するジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子断片、配列番号５で示される塩基配列を有するオロテートホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子断片、配列番号６で示される塩基配列を有するチミジンホスホリラーゼ遺伝子断片及び配列番号７で示される塩基配列を有するチミジンキナーゼ１遺伝子断片を含む核酸代謝関連酵素遺伝子群の断片；
（Ｂ）配列番号２８で示される塩基配列を有するＤＮＡ切除修復蛋白ＥＲＣＣ１遺伝子断片及び配列番号２９で示される塩基配列を有するウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ遺伝子断片を含む遺伝子修復関連遺伝子群の断片；
（Ｃ）配列番号３７で示される塩基配列を有するトポイソメラーゼ１遺伝子断片、配列番号３８で示される塩基配列を有するＰ−グリコプロテイン遺伝子断片、配列番号３９で示される塩基配列を有する平衡ヌクレオシドトランスポーター１遺伝子断片及び配列番号４０で示される塩基配列を有する多剤耐性関連蛋白１遺伝子断片を含む薬剤耐性関連遺伝子群の断片；
（Ｄ）配列番号５２で示される塩基配列を有するグリセロアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子断片、配列番号５３で示される塩基配列を有するβ−アクチン遺伝子断片及び配列番号５４で示される塩基配列を有する４０Ｓリボソーム蛋白Ｓ９遺伝子断片から選ばれる２種以上のハウスキーピング遺伝子群の断片。 - 請求項１〜６のいずれか１項記載のＤＮＡアレイに、癌患者由来の体液検体又は組織検体から得られたｍＲＮＡを鋳型として合成した標識ｃＤＮＡプローブをハイブリダイズさせることを特徴とする当該体液検体又は組織検体の代謝拮抗剤系抗癌剤又は当該抗癌剤と他の抗癌剤との併用に対する感受性の測定方法。
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