JPWO2002038179A1 - 小胞体ストレス関連疾患の予防又は治療剤 - Google Patents
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Abstract
本発明は、小胞体ストレス誘導性のアポトーシスの抑制作用を有し、例えば、ASK1ドミナントネガティブ体、ASK1アンチセンスオリゴヌクレオチド、グルタチオン S−トランスフェラーゼ(Mu1−1等)、ネフ、14−3−3蛋白質、チオレドキシン等のASK1阻害作用を有する化学物質又はそのセンスオリゴヌクレオチド、これらの発現ベクター、当該発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を含む、例えば、ポリグルタミン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、プリオン病、筋萎縮性側索硬化症、FTDP−17に代表される神経変性疾患等の、小胞体ストレスに起因する疾患の予防または治療剤に関するものである。
Description
〔技術分野〕
本発明は、ASK1(Apoptosis Signal−regulating Kinase 1)阻害物質を含む、小胞体ストレスに起因する疾患の予防または治療剤、ASK1阻害物質を有効量使用することを含む、小胞体ストレスに起因する疾患の予防または治療方法、および小胞体ストレスに起因する疾患の予防または治療用の製剤を製造するためのASK1阻害物質の使用に関するものである。
〔背景技術〕
小胞体ストレスとは、異常蛋白質が小胞体内に凝集又は蓄積する現象をいい、小胞体ストレスがポリグルタミン病、アルツハイマー病、プリオン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、FTDP−17(17番染色体にリンクする前側頭葉性痴呆症)等の神経変性疾患に深く関与していることが報告されている。異常蛋白質については、例えば、ポリグルタミン病においては脳内又は神経にポリグルタミンの沈着が認められ、アルツハイマー病においては脳内にβアミロイド(Amyloid β)の沈着が認められている。同様に、プリオン病においては異常型プリオン(PrPSC)、パーキンソン病においてはα−シヌクレイン(α−Synuclein)、筋萎縮性側索硬化症においては変異型SOD1遺伝子産物、FTDP−17においてはタウ(Tau)の沈着がそれぞれ認められている。そして、この小胞体ストレスが過剰な場合あるいは長時間持続した場合、細胞がアポトーシス様の形態変化を起こして死滅し、上記神経変性疾患は小胞体を起源とするアポトーシスであることが指摘されている。このように、小胞体ストレスは、これらの神経変性疾患の発症における由々しき危険因子であると考えられている。(Niwa N.et al.,Cell,Vol.99,pp.691−702(1999);Katayama T.et al.,Nature Cell Biol.,Vol.1,pp.479−702(1999);Nakagawa T.et al.,Nature,Vol.403,pp.98−103(2000);垣塚彰,細胞工学,Vol.18,N0.6,pp.782−788(1999);今泉和則,実験医学,Vol.18,No.13,pp,1781−1786(2000))
小胞体ストレスの伝達経路やその活性化のメカニズムとしては、小胞体内の異常蛋白質を認識するセンサー分子と解されるIRE1が、アダプター蛋白であるTRAF2を介してMAPキナーゼであるJNKを活性化することが明らかになっている。また、システインプロテアーゼであるカスパーゼ12のノックアウトマウスでは小胞体ストレスによるアポトーシスが抑制されたことが報告されている。(Urano F et al.,Science,Vol.287,pp.664−666(2000);松沢厚ら,生体の科学,Vol.51,No.4,pp.266−272(2000))
ASK1はMAPKKキナーゼ(MAPKKK)ファミリーに属するキナーゼの一種であり、例えば、ヒトASK1は1375個のアミノ酸により構成され(WO97/40143号公報記載の配列表配列番号1の蛋白質)、マウスASK1は1379個のアミノ酸から構成されており(口腔病学会雑誌,No.3,pp.45(1998)図1記載の蛋白質)、ヒトASK1とマウスASK1には91.9%の極めて高い相同性が認められることが報告されている。同様に、ヒトASK1のcDNA(WO97/40143号公報記載の配列表配列番号2)やマウスASK1のcDNA(口腔病学会雑誌,No.3,pp.45(1998)図1)が開示されている。MAPKKキナーゼは、ヒトを含む哺乳類から酵母に至るまで保存された細胞内シグナル伝達経路として知られているMAP(Mitogen−activated Protein)キナーゼスーパーファミリーによるシグナル伝達カスケードに属するキナーゼであり、MAPKKキナーゼの下流には、MAPKキナーゼ(MAPKK)およびMAPキナーゼ(MAPK)の2種類のキナーゼが存在する。(Ichijo H.et al.,Science,Vol.275,pp.90−94(1997);WO97/40143号公報;飛梅圭,口腔病学会雑誌,No.3,pp.42−52(1998))
ASK1についてはTNF受容体を介してTNF(腫瘍壊死因子)−αにより活性化され、活性化されたASK1が当該シグナル伝達カスケードを介して細胞のアポトーシス誘導に関与していることが確認されており、ヒトASK1の変異体であるドミナントネガティブ体をJurkat細胞に高発現させた場合、TNF−αにより誘導されるアポトーシスが抑制されたことが報告されている。それ故、ASK1が悪性腫瘍治療剤または悪性腫瘍遺伝子治療剤として有用であることが開示されている。しかしながら、小胞体ストレスにおけるASK1の関与については何ら報告されていない。(Ichijo H.et al.,Science,Vol.275,pp.90−94(1997);WO97/40143号公報)
現在、小胞体ストレスによる神経変性疾患に有用な予防または治療剤は全く知られておらず、目下これらの神経変性疾患の予防または治療剤を早期に開発すべく鋭意研究が行われている。
〔発明の開示〕
本発明は、ASK1阻害物質を含む、小胞体ストレスに起因する疾患の予防または治療剤に関するものである。
また、本発明は、ASK1阻害物質を有効量使用することを含む、小胞体ストレスに起因する疾患の予防または治療方法に関するものである。
更には、本発明は、小胞体ストレスに起因する疾患の予防または治療用の製剤を製造するためのASK1阻害物質の使用に関するものである。
〔発明を実施するための最良の形態〕
本発明者らは、小胞体ストレスに起因する疾患の予防または治療に有用な薬剤を見出すべく鋭意検討した結果、ASK1が小胞体ストレスによるアポトーシスに関与し、ASK1阻害物質が小胞体ストレス関連疾患に有用であるという知見を得、本発明を成すに至った。
詳細に述べれば、本発明者らは、第一にASK1ノックアウトマウスを後述した方法により作製した。作製したASK1ノックアウトマウスより胎児線維芽細胞を採取し、小胞体ストレスを誘導する種々の誘発剤であるタプシガルギン、ツニカマイシンやジチオスレイトールを用いてアポトーシスの発生を観察した。その結果、すべてにおいて、ASK1ノックアウトマウスの胎児線維芽細胞においては野生型(正常)マウスの胎児線維芽細胞の場合と比較して有意にアポトーシスが抑制されていた。この事からASK1は小胞体ストレスによるアポトーシス誘導に密接に関与していることが認められる。
また、ASK1の709番目のリジン残基はATP結合サイトであり、これをアルギニンまたはメチオニンに置換することによってキナーゼ触媒活性を不活化できる。この変異体ASK1(K709R、K709M)はドミナントネガティブ(優性抑制型)体として機能する。ASK1ドミナントネガティブ体は、変異体ASK1(例えば、K709R、K709M)をコードする塩基配列を発現ベクターに組み込み、そのベクターをリポフェクチン法やアデノウイルス感染法などにより細胞にトランスフェクションまたはインフェクションすることで、細胞内に過剰発現させることができる。過剰発現した細胞は、小胞体ストレスによるアポトーシスを顕著に抑制することができる。
即ち、ASK1阻害物質を有効成分として含有させることにより、小胞体ストレスに起因する疾患の予防または治療に有用な薬剤を提供することができる。また、ASK1阻害物質を有効量使用することにより、小胞体ストレスに起因する疾患の予防または治療として有用な方法を提供することができる。
尚、本明細書において、特定の変異体であるドミナントネガティブ体を表す場合には、本来のアミノ酸残基(一文字表記)を最初に、位置番号を二番目に、置換された後のアミノ酸残基(一文字表記)を三番目に示し、「K709R」や「K709M」は709番目のアミノ酸残基であるK(Lys:リジン)がR(Arg:アルギニン)またはM(Met:メチオニン)で置換されていることを表す。
また、本明細書において、「+/+」は、マウスまたはマウス由来細胞において1対の相同染色体それぞれに存在する2ヶ所のASK1遺伝子座が共に正常であること、即ち野生型であることを示し、「−/−」は、1対の相同染色体それぞれに存在する2ヶ所のASK1遺伝子座の両方に変異が導入されており、ASK1蛋白の発現がないホモ接合体、即ちASK1がノックアウトされているマウスまたはマウス由来細胞であることを示す。
本発明において、小胞体ストレスに起因する疾患とは、小胞体ストレスがその病態の発症または進展に関与している疾患をいい、例えば、ポリグルタミン病、アルツハイマー病、プリオン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、FTDP−17等の神経変性疾患を挙げることができる。
本発明において、ASK1阻害物質とは、それ自体ASK1阻害作用を有しているものに限定されるものではなく、生体内または培養系においてASK1阻害作用を有しているものを産生するものを含み、例えば、アミノ酸配列において1以上のアミノ酸を付加、挿入、置換および/または欠損(例えば、960番目のアラニン残基の欠損)させた誘導体を含む(例えば、Wang X S et al.,J.Biol.Chem.,Vol.271,pp.31607−31611(1996))、ヒトASK1に対するドミナントネガティブ体(例えば、K709R、K709M;以下、ASK1ドミナントネガティブ体と称する)、ヒトASK1に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド(以下、ASK1アンチセンスオリゴヌクレオチドと称する)、ASK1阻害作用を有する化学物質(例えば、グルタチオン S−トランスフェラーゼ(Mu1−1等)、ネフ、14−3−3蛋白質、チオレドキシンなど)(例えば、Ssang−Goo Cho et al.,J.Biol.Chem.,Vol.276,No.16,pp.12749−12755(2001);Romas Geleziunas et al.,Nature,Vol.410,pp.834−838(2001);FASEB Journal,Vol.15,No.4,pp.A235(2001);EMBO Journal,Vol.17,No.9,pp.2596−2606(1998))やそのセンスオリゴヌクレオチド(それらの薬理学的に許容される塩を含む)、並びにASK1ドミナントネガティブ体またはASK1アンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする塩基配列を複製し、標的組織または宿主細胞内で当該ドミナントネガティブ体またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現することができる組換えベクター(以下、ASK1ドミナントネガティブ体発現組換えベクターまたはASK1アンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターと称する)、ASK1阻害作用を有する化学物質またはそのセンスオリゴヌクレオチドを標的組織または宿主細胞内で発現することができる組換えベクター(以下、ASK1阻害作用を有する化学物質発現組換えベクターまたはASK1阻害作用を有する化学物質のセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターと称する)、それらの組換えベクターによって形質転換された宿主細胞(以下、場合によりASK1ドミナントネガティブ体発現組換えベクターにより形質転換された宿主細胞、ASK1アンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターにより形質転換された宿主細胞、ASK1阻害作用を有する化学物質発現組換えベクターにより形質転換された宿主細胞、またはASK1阻害作用を有する化学物質のセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターにより形質転換された宿主細胞と称する)等を例示することができる。
本発明のASK1阻害物質の使用方法としては、ASK1ドミナントネガティブ体発現組換えベクター、ASK1アンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクター、ASK1阻害作用を有する化学物質発現組換えベクター、またはASK1阻害作用を有する化学物質のセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターや、それらの組換えベクターによって形質転換された宿主細胞を生体内の標的組織に適当な方法により導入し、所望のASK1ドミナントネガティブ体、ASK1アンチセンスヌクレオチド、ASK1阻害作用を有する化学物質またはそのセンスオリゴヌクレオチドを発現させることによる遺伝子的な予防または治療剤としての使用や、ASK1ドミナントネガティブ体、ASK1アンチセンスオリゴヌクレオチド、ASK1阻害作用を有する化学物質、またはASK1阻害作用を有する化学物質のセンスオリゴヌクレオチドを有効成分とする製剤を経口または非経口的に投与させることによる薬物的な予防または治療剤としての使用を挙げることができる。
ベクターとしては、プラスミドベクター、ウイルスベクター(例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、センダイウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター)、リポソームベクター(例えば、カチオニックリポソームベクター)等を挙げることができる。
組換えベクターにおいては、ASK1ドミナントネガティブ体やASK1アンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする塩基配列の他に、これを実際に標的組織または宿主細胞に導入して所望の当該ドミナントネガティブ体やアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現させるために、その発現を制御する塩基配列(例えば、プロモーター配列、ターミネーター配列、エンハンサー配列)や微生物、昆虫細胞または動物培養細胞等を選択するための遺伝子マーカー(例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子)等を含んでいてもよい。
宿主細胞としては、例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、並びにCHO細胞、COS細胞、ミンク肺上皮細胞(例えば、Mv1Lu)、リンパ球、繊維芽細胞、血液系細胞および腫瘍細胞等の動物細胞を挙げることができる。
組換えベクターの標的組織または宿主細胞への導入方法としては、HVJリポソーム法(金田,実験医学,Vol.12,No.2,p.78(1994);森下等,実験医学,Vol.12,No.15,p.158(1994))、ASK1阻害物質を注射等により直接投与する方法、リン酸カルシウム法、DEAE−デキストラン法、エレクトロポレーション法、遺伝子銃による方法(T.M.Klein et al.,Bio/Technology 10,pp.286−291(1992))、リポフェクション法によって投与する方法(Nabel et al.,Science,Vol.244,p.1285(1990))、ベクター(例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター等)を使う方法等を挙げることができる。
ASK1阻害物質を有効成分とする製剤を実際に小胞体ストレスに起因する疾患の予防または治療において用いる場合、用法に応じ種々の製剤形態のものが使用される。製剤形態としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、細粒剤、トローチ剤、注射剤、直腸投与剤、座剤等を挙げることができ、経口または非経口的に投与される。
ASK1阻害物質を含有するこれらの各種製剤は、上記ASK1阻害物質を有効成分として、通常用いられている賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、希釈剤、緩衝剤、等張化剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解補助剤等の医薬品添加物と適宜混合または希釈若しくは溶解し、常法に従い調剤することにより製造することができる。
ASK1阻害物質の小胞体ストレスに起因する疾患の薬物的な予防または治療における投与量は、用法、患者の年齢、性別、症状の程度や疾患の種類等を考慮して適宜決定されるが、通常成人1日当たり約0.1〜500mg、好ましくは約0.5〜100mg程度とするのがよく、1日一回または数回に分けて投与することができる。また、ASK1阻害物質の小胞体ストレスに起因する疾患の遺伝的な予防または治療における投与量もこれに準じて適宜決定することができる。
本発明によれば、ASK1ドミナントネガティブ体、ASK1アンチセンスオリゴヌクレオチド、ASK1阻害作用を有する化学物質またはそのセンスオリゴヌクレオチドをコードする塩基配列またはこれを含むベクター、またはそのベクターにより形質転換させた宿主細胞を用いて標的組織に導入することにより、神経変性疾患等の小胞体ストレスに起因する疾患の発症または進展を抑制することができる。また、ASK1ドミナントネガティブ体、ASK1アンチセンスオリゴヌクレオチド、ASK1阻害作用を有する化学物質又はそのセンスオリゴヌクレオチドを含む製剤を経口または非経口的に投与することにより、神経変性疾患等の小胞体ストレスに起因する疾患の発症または進展を抑制することができる。
本発明の内容を以下の試験例でさらに詳細に説明するが、本発明はその内容に限定されるものではない。
試験例1
ASK1ノックアウトマウスの作製
129/SvJマウスの染色体(ジェノミック)DNAライブラリー(Strategene社)から、ASK1の第1エクソンを含む幾つかの染色体DNA断片をクローン化した。そのうちの一つのクローンを用いて、第1エクソンより上流10kb及び下流2kbを相同組換え領域とし、第1エクソン及び隣接するイントロン領域を、GFP(green fluorescence protein)とポジティブセレクション用のネオマイシン耐性遺伝子とに置換したターゲッティングベクターを構築した。ターゲッティングベクターには、ネガティブセレクション用のDT−A(ジフテリアトキシンα鎖)を含むpBluescript SK(Strategene社)を用いた。ターゲッティングベクターは、エレクトロポーレーション法によってJ1 ES細胞(embryonic stem cell)に導入した。ネオマイシン耐性のES細胞コロニーを選択した後、更にサザンブロット法により相同組換え細胞の確認を行った。ヘテロ接合変異体ES細胞は、マイクロインジェクション法によりC57BL/6Jの胚盤胞に導入した。生まれてきたキメラマウスとC57BL/6Jマウスとの戻し交配によって、F1(第1世代)ヘテロ接合体マウスが得られた。遺伝子変異が生殖細胞に導入されているか否かをサザンブロット法により確認した後、それらF1ヘテロ接合体マウス同士の掛け合わせから、ASK1のホモ接合体であるASK1ノックアウトマウスを樹立した。
試験例2
小胞体ストレスによるアポトーシス誘導
胎生12.5日目のASK1ノックアウトマウス由来の胎児線維芽細胞(mouse embryonic fibroblasts;MEFs)を用いて、ASK1が小胞体ストレス誘導性のアポトーシスに関与しているか否かについて検討を行った。24ウェルプレートに1×105cells/wellの濃度でMEFsを一晩培養し、刺激前2時間に無血清培地に変換後、2μMのタプシガルギン、2.5μg/mLのツニカマイシン又は10mMのジチオスレイトールを培地に添加することによって小胞体ストレスを誘導した。タプシガルギンは、小胞体へのカルシウム取り込みを阻害し、小胞体内のカルシウムホメオスタシスを乱すことによって小胞体ストレスを誘導する薬剤である。また、ツニカマイシンは、蛋白質糖鎖付加を阻害することにより、ジチオスレイトールは、ジスルフィド結合を阻害することにより、それぞれ小胞体ストレスを誘導する薬剤である。アポトーシスによる細胞死の検出は、TUNEL(ターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ−メディエーティッド dUTPニック・エンド・ラベリング)法およびMTT(3−〔4,5−ジメチルチアゾール−2−イル〕−2,5−ジフェニル−2H−テトラゾリウム ブロマイド)法によって行った。
1)TUNEL法
アポトーシスによる細胞死の大きな特徴の一つは、DNAの断片化であり、TUNEL法は、その断片化されたDNAを特異的に染色できる方法である。タプシガルギン添加2、6時間後、細胞を4%パラホルムアルデヒドによって30分間、室温で固定し、0.1%トライトンX−100で4℃、2分間処理し細胞膜透過性を亢進させた。アポトーシス細胞の染色のために、FITC(fluorescein isothiocyanate)−conjugated TUNEL reaction mixture(ロシュ社)を加え、室温で1時間静置した。全体の細胞数を数えるため、生細胞と死細胞の両者を染色できるHoechst 33258(1μg/mL)とpropidium iodide(10μg/mL)を用いた。全ての溶液の希釈および洗浄は、PBS(phosphate−buffered saline)によって行った。染色後の細胞は、Mowiol(和光純薬工業(株))で包埋し、蛍光顕微鏡観察により死細胞を同定した。アポトーシス細胞の割合(%)は、全体の細胞数として少なくとも3つ以上の視野でそれぞれ100個以上の細胞を数え、そのうちのTUNEL染色陽性の細胞数の割合として算出した。
2)MTT法
MTT法は、methylthiazol tetrazoliumのフォルマザンへの還元による吸光度の変化を指標に、生細胞の割合を検出するアッセイ法である。タプシガルギンを加えて8、16、24時間後に、また、その他の小胞体ストレス誘発剤については8時間後に、それぞれMTTアッセイを行った。MTTアッセイ溶液原液(Dojindo社)を細胞培養液中に10倍希釈で添加し、37℃、1時間静置し、その培養液中の吸光度を450nmにて測定した。無処理の細胞培養液中の吸光度値を100%として、生細胞率(%)を計算した。
第1図は、TUNEL法により、アポトーシス細胞を視覚化したものである。緑色蛍光染色されているものが、アポトーシス細胞である。細胞の全体像は、青色のHoechst 33258及び赤色のpropidium iodideによって染色されている。第1図は刺激6時間後の代表的な視野であり、更に3つ以上の視野で観察した結果をグラフにまとめたものが第2図である。野生型のMEFs(+/+)と比較して、ASK1ノックアウトマウス由来の胎児線維芽細胞MEFs(−/−)は、タプシガルギンによる小胞体ストレス誘導性の細胞死に対して、顕著に耐性を示した。同様の結果は、MTT法によっても確認された(第3図)。また、タプシガルギンとは別なメカニズムで小胞体ストレスを誘発する代表的な化合物であるツニカマイシンやジチオスレイトールによるアポトーシスに対しても同様に、ASK1を欠損したMEFs細胞は耐性を示した(第4図)。
以上の結果は、小胞体ストレス誘導性のアポトーシスはASK1によって実行されることを示している。ASK1の欠損によって、小胞体ストレス誘導性のアポトーシスが消失する事実は、ASK1阻害物質のアポトーシス関連性疾患への有用性を顕著に証明するものである。
試験例3
神経変性蛋白質Amyloid−βによる初代培養神経細胞へのアポトーシス誘導
胎生14.5日目のASK1ノックアウトマウス大脳由来の初代培養神経細胞を用いて、ASK1が神経変性蛋白質Amyloid−βによるアポトーシスに関与しているか否かについて検討を行った。マウス大脳半球を単離し培地中で組織をピペッティングによりほぐした後、ポリ−L−リジンおよびフィブロネクチンをコートした24ウェルプレート上におよそ1×105cells/wellの濃度で播種した。培養1日目および3日目に10ng/mLのbFGF(basic−Fibroblast Grouwth Factor)を培地に添加し、4日間培養したものを初代培養神経細胞として用いた。Amyloid−βはアルツハイマー病患者の脳組織に多量に凝集する変性蛋白質であり、強い神経毒性を有し、アルツハイマー病における神経変性の原因蛋白質である。Amyloid−β(25−35)(Amyloid−β蛋白質のアミノ酸配列で25番目から35番目までのペプチドで、最も神経毒性の強い部分と言われている)を25μMの濃度で培地に加え、3日後の生存率を、試験例2記載のMTT法と同様の方法により、無処理の初代培養神経細胞に対する生細胞率(%)として計算した。
図5は、Amyloid−βによる神経毒性に対する生存率を、野生型マウス由来の神経細胞(+/+)とASK1ノックアウトマウス由来の神経細胞(−/−)とで比較したものである。野生型の神経細胞のほとんどがAmyloid−β誘導性細胞死を起こすのに対して、ASK1ノックアウトマウス由来の神経細胞は、Amyloid−βによって誘導される神経細胞死に対して、顕著に耐性を示した。
神経変性蛋白質であるAmyloid−βは小胞体ストレスを誘導することが分かっていることから、第5図の結果は、実際に小胞体ストレス誘導性の神経細胞アポトーシスはASK1によって実行されることを示している。また、ASK1の欠損によって、Amyloid−β誘導性誘導性のアポトーシスが消失する事実は、ASK1阻害物質の神経変性疾患への効果を顕著に証明するものである。
〔産業上の利用可能性〕
本発明は、ASK1を阻害することによる小胞体ストレス誘導性のアポトーシスの抑制に関するものである。本発明により小胞体ストレスに起因する疾患、特には、ポリグルタミン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、プリオン病、筋萎縮性側索硬化症、FTDP−17などの神経変性疾患の予防または治療剤或いは予防または治療方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
第1図は、TUNEL法を用いて、タプシガルギンによる小胞体ストレスによって誘導されたアポトーシス細胞をASK1ノックアウトマウス由来のMEFs細胞(ASK1−/−)と野生型MEFs細胞(ASK1+/+)につき比較検出した写真である。小胞体ストレス誘導後6時間目の代表的な写真を示した。上段は無刺激のコントロール細胞、下段はタプシガルギン処理細胞である。4枚ずつの写真のうち、左側のHoechst 33258(青色)とpropidium iodide(赤色)での染色は、細胞の全体像を示し、それらのうちアポトーシスを引き起こしている細胞の核は、右側の写真でTUNEL染色法により緑色を呈している。TUNEL染色写真の右下の数字は、アポトーシス細胞の割合(%)である。
第2図は、第1図に示したタプシガルギンによる小胞体ストレス誘導性アポトーシス細胞の割合についてTUNEL法により検出した結果を、ASK1ノックアウトマウスのMEFs細胞(ASK1−/−;黒棒)と野生型MEFs細胞(ASK+/+;白棒)につき比較し、経時的に(0、2及び6時間後)グラフ化したものである。データは、3つ以上の視野で、それぞれ100個以上の細胞数を数えて、そのうちのTUNEL陽性細胞をアポトーシス細胞とし、その割合の平均値を示した。エラー・バーは標準偏差を表す。縦軸はアポトーシス細胞の割合(%)を、横軸は時間(時間)を示す。
第3図は、MTT法を用い、タプシガルギンによる小胞体ストレスによって誘導される細胞死に対する耐性について、ASK1ノックアウトマウスのMEFs(ASK1−/−;黒丸)と野生型MEFs細胞(ASK+/+;白丸)につき比較し、経時的に(0、8、16及び24時間後)それぞれの細胞生存率を示したグラフである。データは、5回以上の独立した実験を行い、その平均値として示した。エラー・バーは標準偏差を表す。縦軸は細胞生存率(%)を、横軸は時間(時間)を示す。
第4図は、MTT法を用い、タプシガルギンの他に、様々な小胞体ストレス誘発剤として、ジチオスレイトールおよびツニカマイシンによって誘導される細胞死に対する耐性について、ASK1ノックアウトマウスのMEFs(ASK1−/−;黒棒)と野生型MEFs細胞(ASK+/+;白棒)につき比較したグラフである。データは、5回以上の独立した実験を行い、小胞体ストレス誘導後8時間目の細胞生存率の平均値として示した。エラー・バーは標準偏差を表す。縦軸は細胞生存率(%)を、横軸は用いた小胞体ストレス誘発剤の名称を示す。
第5図は、MTT法を用い、神経変性蛋白質Amyloid−βによって誘導される神経細胞死に対する耐性について、ASK1ノックアウトマウスの初代培養神経細胞(ASK1−/−;黒棒)と野生型初代培養神経細胞(ASK+/+;白棒)につき比較し、Amyloid−βを添加した当日(0日)、および3日後におけるそれぞれの神経細胞の生存率を示したグラフである。データは、5回以上の独立した実験を行い、その平均値として示した。エラー・バーは標準偏差を表す。縦軸は神経細胞生存率(%)を、横軸は時間(日)を示す。
本発明は、ASK1(Apoptosis Signal−regulating Kinase 1)阻害物質を含む、小胞体ストレスに起因する疾患の予防または治療剤、ASK1阻害物質を有効量使用することを含む、小胞体ストレスに起因する疾患の予防または治療方法、および小胞体ストレスに起因する疾患の予防または治療用の製剤を製造するためのASK1阻害物質の使用に関するものである。
〔背景技術〕
小胞体ストレスとは、異常蛋白質が小胞体内に凝集又は蓄積する現象をいい、小胞体ストレスがポリグルタミン病、アルツハイマー病、プリオン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、FTDP−17(17番染色体にリンクする前側頭葉性痴呆症)等の神経変性疾患に深く関与していることが報告されている。異常蛋白質については、例えば、ポリグルタミン病においては脳内又は神経にポリグルタミンの沈着が認められ、アルツハイマー病においては脳内にβアミロイド(Amyloid β)の沈着が認められている。同様に、プリオン病においては異常型プリオン(PrPSC)、パーキンソン病においてはα−シヌクレイン(α−Synuclein)、筋萎縮性側索硬化症においては変異型SOD1遺伝子産物、FTDP−17においてはタウ(Tau)の沈着がそれぞれ認められている。そして、この小胞体ストレスが過剰な場合あるいは長時間持続した場合、細胞がアポトーシス様の形態変化を起こして死滅し、上記神経変性疾患は小胞体を起源とするアポトーシスであることが指摘されている。このように、小胞体ストレスは、これらの神経変性疾患の発症における由々しき危険因子であると考えられている。(Niwa N.et al.,Cell,Vol.99,pp.691−702(1999);Katayama T.et al.,Nature Cell Biol.,Vol.1,pp.479−702(1999);Nakagawa T.et al.,Nature,Vol.403,pp.98−103(2000);垣塚彰,細胞工学,Vol.18,N0.6,pp.782−788(1999);今泉和則,実験医学,Vol.18,No.13,pp,1781−1786(2000))
小胞体ストレスの伝達経路やその活性化のメカニズムとしては、小胞体内の異常蛋白質を認識するセンサー分子と解されるIRE1が、アダプター蛋白であるTRAF2を介してMAPキナーゼであるJNKを活性化することが明らかになっている。また、システインプロテアーゼであるカスパーゼ12のノックアウトマウスでは小胞体ストレスによるアポトーシスが抑制されたことが報告されている。(Urano F et al.,Science,Vol.287,pp.664−666(2000);松沢厚ら,生体の科学,Vol.51,No.4,pp.266−272(2000))
ASK1はMAPKKキナーゼ(MAPKKK)ファミリーに属するキナーゼの一種であり、例えば、ヒトASK1は1375個のアミノ酸により構成され(WO97/40143号公報記載の配列表配列番号1の蛋白質)、マウスASK1は1379個のアミノ酸から構成されており(口腔病学会雑誌,No.3,pp.45(1998)図1記載の蛋白質)、ヒトASK1とマウスASK1には91.9%の極めて高い相同性が認められることが報告されている。同様に、ヒトASK1のcDNA(WO97/40143号公報記載の配列表配列番号2)やマウスASK1のcDNA(口腔病学会雑誌,No.3,pp.45(1998)図1)が開示されている。MAPKKキナーゼは、ヒトを含む哺乳類から酵母に至るまで保存された細胞内シグナル伝達経路として知られているMAP(Mitogen−activated Protein)キナーゼスーパーファミリーによるシグナル伝達カスケードに属するキナーゼであり、MAPKKキナーゼの下流には、MAPKキナーゼ(MAPKK)およびMAPキナーゼ(MAPK)の2種類のキナーゼが存在する。(Ichijo H.et al.,Science,Vol.275,pp.90−94(1997);WO97/40143号公報;飛梅圭,口腔病学会雑誌,No.3,pp.42−52(1998))
ASK1についてはTNF受容体を介してTNF(腫瘍壊死因子)−αにより活性化され、活性化されたASK1が当該シグナル伝達カスケードを介して細胞のアポトーシス誘導に関与していることが確認されており、ヒトASK1の変異体であるドミナントネガティブ体をJurkat細胞に高発現させた場合、TNF−αにより誘導されるアポトーシスが抑制されたことが報告されている。それ故、ASK1が悪性腫瘍治療剤または悪性腫瘍遺伝子治療剤として有用であることが開示されている。しかしながら、小胞体ストレスにおけるASK1の関与については何ら報告されていない。(Ichijo H.et al.,Science,Vol.275,pp.90−94(1997);WO97/40143号公報)
現在、小胞体ストレスによる神経変性疾患に有用な予防または治療剤は全く知られておらず、目下これらの神経変性疾患の予防または治療剤を早期に開発すべく鋭意研究が行われている。
〔発明の開示〕
本発明は、ASK1阻害物質を含む、小胞体ストレスに起因する疾患の予防または治療剤に関するものである。
また、本発明は、ASK1阻害物質を有効量使用することを含む、小胞体ストレスに起因する疾患の予防または治療方法に関するものである。
更には、本発明は、小胞体ストレスに起因する疾患の予防または治療用の製剤を製造するためのASK1阻害物質の使用に関するものである。
〔発明を実施するための最良の形態〕
本発明者らは、小胞体ストレスに起因する疾患の予防または治療に有用な薬剤を見出すべく鋭意検討した結果、ASK1が小胞体ストレスによるアポトーシスに関与し、ASK1阻害物質が小胞体ストレス関連疾患に有用であるという知見を得、本発明を成すに至った。
詳細に述べれば、本発明者らは、第一にASK1ノックアウトマウスを後述した方法により作製した。作製したASK1ノックアウトマウスより胎児線維芽細胞を採取し、小胞体ストレスを誘導する種々の誘発剤であるタプシガルギン、ツニカマイシンやジチオスレイトールを用いてアポトーシスの発生を観察した。その結果、すべてにおいて、ASK1ノックアウトマウスの胎児線維芽細胞においては野生型(正常)マウスの胎児線維芽細胞の場合と比較して有意にアポトーシスが抑制されていた。この事からASK1は小胞体ストレスによるアポトーシス誘導に密接に関与していることが認められる。
また、ASK1の709番目のリジン残基はATP結合サイトであり、これをアルギニンまたはメチオニンに置換することによってキナーゼ触媒活性を不活化できる。この変異体ASK1(K709R、K709M)はドミナントネガティブ(優性抑制型)体として機能する。ASK1ドミナントネガティブ体は、変異体ASK1(例えば、K709R、K709M)をコードする塩基配列を発現ベクターに組み込み、そのベクターをリポフェクチン法やアデノウイルス感染法などにより細胞にトランスフェクションまたはインフェクションすることで、細胞内に過剰発現させることができる。過剰発現した細胞は、小胞体ストレスによるアポトーシスを顕著に抑制することができる。
即ち、ASK1阻害物質を有効成分として含有させることにより、小胞体ストレスに起因する疾患の予防または治療に有用な薬剤を提供することができる。また、ASK1阻害物質を有効量使用することにより、小胞体ストレスに起因する疾患の予防または治療として有用な方法を提供することができる。
尚、本明細書において、特定の変異体であるドミナントネガティブ体を表す場合には、本来のアミノ酸残基(一文字表記)を最初に、位置番号を二番目に、置換された後のアミノ酸残基(一文字表記)を三番目に示し、「K709R」や「K709M」は709番目のアミノ酸残基であるK(Lys:リジン)がR(Arg:アルギニン)またはM(Met:メチオニン)で置換されていることを表す。
また、本明細書において、「+/+」は、マウスまたはマウス由来細胞において1対の相同染色体それぞれに存在する2ヶ所のASK1遺伝子座が共に正常であること、即ち野生型であることを示し、「−/−」は、1対の相同染色体それぞれに存在する2ヶ所のASK1遺伝子座の両方に変異が導入されており、ASK1蛋白の発現がないホモ接合体、即ちASK1がノックアウトされているマウスまたはマウス由来細胞であることを示す。
本発明において、小胞体ストレスに起因する疾患とは、小胞体ストレスがその病態の発症または進展に関与している疾患をいい、例えば、ポリグルタミン病、アルツハイマー病、プリオン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、FTDP−17等の神経変性疾患を挙げることができる。
本発明において、ASK1阻害物質とは、それ自体ASK1阻害作用を有しているものに限定されるものではなく、生体内または培養系においてASK1阻害作用を有しているものを産生するものを含み、例えば、アミノ酸配列において1以上のアミノ酸を付加、挿入、置換および/または欠損(例えば、960番目のアラニン残基の欠損)させた誘導体を含む(例えば、Wang X S et al.,J.Biol.Chem.,Vol.271,pp.31607−31611(1996))、ヒトASK1に対するドミナントネガティブ体(例えば、K709R、K709M;以下、ASK1ドミナントネガティブ体と称する)、ヒトASK1に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド(以下、ASK1アンチセンスオリゴヌクレオチドと称する)、ASK1阻害作用を有する化学物質(例えば、グルタチオン S−トランスフェラーゼ(Mu1−1等)、ネフ、14−3−3蛋白質、チオレドキシンなど)(例えば、Ssang−Goo Cho et al.,J.Biol.Chem.,Vol.276,No.16,pp.12749−12755(2001);Romas Geleziunas et al.,Nature,Vol.410,pp.834−838(2001);FASEB Journal,Vol.15,No.4,pp.A235(2001);EMBO Journal,Vol.17,No.9,pp.2596−2606(1998))やそのセンスオリゴヌクレオチド(それらの薬理学的に許容される塩を含む)、並びにASK1ドミナントネガティブ体またはASK1アンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする塩基配列を複製し、標的組織または宿主細胞内で当該ドミナントネガティブ体またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現することができる組換えベクター(以下、ASK1ドミナントネガティブ体発現組換えベクターまたはASK1アンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターと称する)、ASK1阻害作用を有する化学物質またはそのセンスオリゴヌクレオチドを標的組織または宿主細胞内で発現することができる組換えベクター(以下、ASK1阻害作用を有する化学物質発現組換えベクターまたはASK1阻害作用を有する化学物質のセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターと称する)、それらの組換えベクターによって形質転換された宿主細胞(以下、場合によりASK1ドミナントネガティブ体発現組換えベクターにより形質転換された宿主細胞、ASK1アンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターにより形質転換された宿主細胞、ASK1阻害作用を有する化学物質発現組換えベクターにより形質転換された宿主細胞、またはASK1阻害作用を有する化学物質のセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターにより形質転換された宿主細胞と称する)等を例示することができる。
本発明のASK1阻害物質の使用方法としては、ASK1ドミナントネガティブ体発現組換えベクター、ASK1アンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクター、ASK1阻害作用を有する化学物質発現組換えベクター、またはASK1阻害作用を有する化学物質のセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターや、それらの組換えベクターによって形質転換された宿主細胞を生体内の標的組織に適当な方法により導入し、所望のASK1ドミナントネガティブ体、ASK1アンチセンスヌクレオチド、ASK1阻害作用を有する化学物質またはそのセンスオリゴヌクレオチドを発現させることによる遺伝子的な予防または治療剤としての使用や、ASK1ドミナントネガティブ体、ASK1アンチセンスオリゴヌクレオチド、ASK1阻害作用を有する化学物質、またはASK1阻害作用を有する化学物質のセンスオリゴヌクレオチドを有効成分とする製剤を経口または非経口的に投与させることによる薬物的な予防または治療剤としての使用を挙げることができる。
ベクターとしては、プラスミドベクター、ウイルスベクター(例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、センダイウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター)、リポソームベクター(例えば、カチオニックリポソームベクター)等を挙げることができる。
組換えベクターにおいては、ASK1ドミナントネガティブ体やASK1アンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする塩基配列の他に、これを実際に標的組織または宿主細胞に導入して所望の当該ドミナントネガティブ体やアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現させるために、その発現を制御する塩基配列(例えば、プロモーター配列、ターミネーター配列、エンハンサー配列)や微生物、昆虫細胞または動物培養細胞等を選択するための遺伝子マーカー(例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子)等を含んでいてもよい。
宿主細胞としては、例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、並びにCHO細胞、COS細胞、ミンク肺上皮細胞(例えば、Mv1Lu)、リンパ球、繊維芽細胞、血液系細胞および腫瘍細胞等の動物細胞を挙げることができる。
組換えベクターの標的組織または宿主細胞への導入方法としては、HVJリポソーム法(金田,実験医学,Vol.12,No.2,p.78(1994);森下等,実験医学,Vol.12,No.15,p.158(1994))、ASK1阻害物質を注射等により直接投与する方法、リン酸カルシウム法、DEAE−デキストラン法、エレクトロポレーション法、遺伝子銃による方法(T.M.Klein et al.,Bio/Technology 10,pp.286−291(1992))、リポフェクション法によって投与する方法(Nabel et al.,Science,Vol.244,p.1285(1990))、ベクター(例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター等)を使う方法等を挙げることができる。
ASK1阻害物質を有効成分とする製剤を実際に小胞体ストレスに起因する疾患の予防または治療において用いる場合、用法に応じ種々の製剤形態のものが使用される。製剤形態としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、細粒剤、トローチ剤、注射剤、直腸投与剤、座剤等を挙げることができ、経口または非経口的に投与される。
ASK1阻害物質を含有するこれらの各種製剤は、上記ASK1阻害物質を有効成分として、通常用いられている賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、希釈剤、緩衝剤、等張化剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解補助剤等の医薬品添加物と適宜混合または希釈若しくは溶解し、常法に従い調剤することにより製造することができる。
ASK1阻害物質の小胞体ストレスに起因する疾患の薬物的な予防または治療における投与量は、用法、患者の年齢、性別、症状の程度や疾患の種類等を考慮して適宜決定されるが、通常成人1日当たり約0.1〜500mg、好ましくは約0.5〜100mg程度とするのがよく、1日一回または数回に分けて投与することができる。また、ASK1阻害物質の小胞体ストレスに起因する疾患の遺伝的な予防または治療における投与量もこれに準じて適宜決定することができる。
本発明によれば、ASK1ドミナントネガティブ体、ASK1アンチセンスオリゴヌクレオチド、ASK1阻害作用を有する化学物質またはそのセンスオリゴヌクレオチドをコードする塩基配列またはこれを含むベクター、またはそのベクターにより形質転換させた宿主細胞を用いて標的組織に導入することにより、神経変性疾患等の小胞体ストレスに起因する疾患の発症または進展を抑制することができる。また、ASK1ドミナントネガティブ体、ASK1アンチセンスオリゴヌクレオチド、ASK1阻害作用を有する化学物質又はそのセンスオリゴヌクレオチドを含む製剤を経口または非経口的に投与することにより、神経変性疾患等の小胞体ストレスに起因する疾患の発症または進展を抑制することができる。
本発明の内容を以下の試験例でさらに詳細に説明するが、本発明はその内容に限定されるものではない。
試験例1
ASK1ノックアウトマウスの作製
129/SvJマウスの染色体(ジェノミック)DNAライブラリー(Strategene社)から、ASK1の第1エクソンを含む幾つかの染色体DNA断片をクローン化した。そのうちの一つのクローンを用いて、第1エクソンより上流10kb及び下流2kbを相同組換え領域とし、第1エクソン及び隣接するイントロン領域を、GFP(green fluorescence protein)とポジティブセレクション用のネオマイシン耐性遺伝子とに置換したターゲッティングベクターを構築した。ターゲッティングベクターには、ネガティブセレクション用のDT−A(ジフテリアトキシンα鎖)を含むpBluescript SK(Strategene社)を用いた。ターゲッティングベクターは、エレクトロポーレーション法によってJ1 ES細胞(embryonic stem cell)に導入した。ネオマイシン耐性のES細胞コロニーを選択した後、更にサザンブロット法により相同組換え細胞の確認を行った。ヘテロ接合変異体ES細胞は、マイクロインジェクション法によりC57BL/6Jの胚盤胞に導入した。生まれてきたキメラマウスとC57BL/6Jマウスとの戻し交配によって、F1(第1世代)ヘテロ接合体マウスが得られた。遺伝子変異が生殖細胞に導入されているか否かをサザンブロット法により確認した後、それらF1ヘテロ接合体マウス同士の掛け合わせから、ASK1のホモ接合体であるASK1ノックアウトマウスを樹立した。
試験例2
小胞体ストレスによるアポトーシス誘導
胎生12.5日目のASK1ノックアウトマウス由来の胎児線維芽細胞(mouse embryonic fibroblasts;MEFs)を用いて、ASK1が小胞体ストレス誘導性のアポトーシスに関与しているか否かについて検討を行った。24ウェルプレートに1×105cells/wellの濃度でMEFsを一晩培養し、刺激前2時間に無血清培地に変換後、2μMのタプシガルギン、2.5μg/mLのツニカマイシン又は10mMのジチオスレイトールを培地に添加することによって小胞体ストレスを誘導した。タプシガルギンは、小胞体へのカルシウム取り込みを阻害し、小胞体内のカルシウムホメオスタシスを乱すことによって小胞体ストレスを誘導する薬剤である。また、ツニカマイシンは、蛋白質糖鎖付加を阻害することにより、ジチオスレイトールは、ジスルフィド結合を阻害することにより、それぞれ小胞体ストレスを誘導する薬剤である。アポトーシスによる細胞死の検出は、TUNEL(ターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ−メディエーティッド dUTPニック・エンド・ラベリング)法およびMTT(3−〔4,5−ジメチルチアゾール−2−イル〕−2,5−ジフェニル−2H−テトラゾリウム ブロマイド)法によって行った。
1)TUNEL法
アポトーシスによる細胞死の大きな特徴の一つは、DNAの断片化であり、TUNEL法は、その断片化されたDNAを特異的に染色できる方法である。タプシガルギン添加2、6時間後、細胞を4%パラホルムアルデヒドによって30分間、室温で固定し、0.1%トライトンX−100で4℃、2分間処理し細胞膜透過性を亢進させた。アポトーシス細胞の染色のために、FITC(fluorescein isothiocyanate)−conjugated TUNEL reaction mixture(ロシュ社)を加え、室温で1時間静置した。全体の細胞数を数えるため、生細胞と死細胞の両者を染色できるHoechst 33258(1μg/mL)とpropidium iodide(10μg/mL)を用いた。全ての溶液の希釈および洗浄は、PBS(phosphate−buffered saline)によって行った。染色後の細胞は、Mowiol(和光純薬工業(株))で包埋し、蛍光顕微鏡観察により死細胞を同定した。アポトーシス細胞の割合(%)は、全体の細胞数として少なくとも3つ以上の視野でそれぞれ100個以上の細胞を数え、そのうちのTUNEL染色陽性の細胞数の割合として算出した。
2)MTT法
MTT法は、methylthiazol tetrazoliumのフォルマザンへの還元による吸光度の変化を指標に、生細胞の割合を検出するアッセイ法である。タプシガルギンを加えて8、16、24時間後に、また、その他の小胞体ストレス誘発剤については8時間後に、それぞれMTTアッセイを行った。MTTアッセイ溶液原液(Dojindo社)を細胞培養液中に10倍希釈で添加し、37℃、1時間静置し、その培養液中の吸光度を450nmにて測定した。無処理の細胞培養液中の吸光度値を100%として、生細胞率(%)を計算した。
第1図は、TUNEL法により、アポトーシス細胞を視覚化したものである。緑色蛍光染色されているものが、アポトーシス細胞である。細胞の全体像は、青色のHoechst 33258及び赤色のpropidium iodideによって染色されている。第1図は刺激6時間後の代表的な視野であり、更に3つ以上の視野で観察した結果をグラフにまとめたものが第2図である。野生型のMEFs(+/+)と比較して、ASK1ノックアウトマウス由来の胎児線維芽細胞MEFs(−/−)は、タプシガルギンによる小胞体ストレス誘導性の細胞死に対して、顕著に耐性を示した。同様の結果は、MTT法によっても確認された(第3図)。また、タプシガルギンとは別なメカニズムで小胞体ストレスを誘発する代表的な化合物であるツニカマイシンやジチオスレイトールによるアポトーシスに対しても同様に、ASK1を欠損したMEFs細胞は耐性を示した(第4図)。
以上の結果は、小胞体ストレス誘導性のアポトーシスはASK1によって実行されることを示している。ASK1の欠損によって、小胞体ストレス誘導性のアポトーシスが消失する事実は、ASK1阻害物質のアポトーシス関連性疾患への有用性を顕著に証明するものである。
試験例3
神経変性蛋白質Amyloid−βによる初代培養神経細胞へのアポトーシス誘導
胎生14.5日目のASK1ノックアウトマウス大脳由来の初代培養神経細胞を用いて、ASK1が神経変性蛋白質Amyloid−βによるアポトーシスに関与しているか否かについて検討を行った。マウス大脳半球を単離し培地中で組織をピペッティングによりほぐした後、ポリ−L−リジンおよびフィブロネクチンをコートした24ウェルプレート上におよそ1×105cells/wellの濃度で播種した。培養1日目および3日目に10ng/mLのbFGF(basic−Fibroblast Grouwth Factor)を培地に添加し、4日間培養したものを初代培養神経細胞として用いた。Amyloid−βはアルツハイマー病患者の脳組織に多量に凝集する変性蛋白質であり、強い神経毒性を有し、アルツハイマー病における神経変性の原因蛋白質である。Amyloid−β(25−35)(Amyloid−β蛋白質のアミノ酸配列で25番目から35番目までのペプチドで、最も神経毒性の強い部分と言われている)を25μMの濃度で培地に加え、3日後の生存率を、試験例2記載のMTT法と同様の方法により、無処理の初代培養神経細胞に対する生細胞率(%)として計算した。
図5は、Amyloid−βによる神経毒性に対する生存率を、野生型マウス由来の神経細胞(+/+)とASK1ノックアウトマウス由来の神経細胞(−/−)とで比較したものである。野生型の神経細胞のほとんどがAmyloid−β誘導性細胞死を起こすのに対して、ASK1ノックアウトマウス由来の神経細胞は、Amyloid−βによって誘導される神経細胞死に対して、顕著に耐性を示した。
神経変性蛋白質であるAmyloid−βは小胞体ストレスを誘導することが分かっていることから、第5図の結果は、実際に小胞体ストレス誘導性の神経細胞アポトーシスはASK1によって実行されることを示している。また、ASK1の欠損によって、Amyloid−β誘導性誘導性のアポトーシスが消失する事実は、ASK1阻害物質の神経変性疾患への効果を顕著に証明するものである。
〔産業上の利用可能性〕
本発明は、ASK1を阻害することによる小胞体ストレス誘導性のアポトーシスの抑制に関するものである。本発明により小胞体ストレスに起因する疾患、特には、ポリグルタミン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、プリオン病、筋萎縮性側索硬化症、FTDP−17などの神経変性疾患の予防または治療剤或いは予防または治療方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
第1図は、TUNEL法を用いて、タプシガルギンによる小胞体ストレスによって誘導されたアポトーシス細胞をASK1ノックアウトマウス由来のMEFs細胞(ASK1−/−)と野生型MEFs細胞(ASK1+/+)につき比較検出した写真である。小胞体ストレス誘導後6時間目の代表的な写真を示した。上段は無刺激のコントロール細胞、下段はタプシガルギン処理細胞である。4枚ずつの写真のうち、左側のHoechst 33258(青色)とpropidium iodide(赤色)での染色は、細胞の全体像を示し、それらのうちアポトーシスを引き起こしている細胞の核は、右側の写真でTUNEL染色法により緑色を呈している。TUNEL染色写真の右下の数字は、アポトーシス細胞の割合(%)である。
第2図は、第1図に示したタプシガルギンによる小胞体ストレス誘導性アポトーシス細胞の割合についてTUNEL法により検出した結果を、ASK1ノックアウトマウスのMEFs細胞(ASK1−/−;黒棒)と野生型MEFs細胞(ASK+/+;白棒)につき比較し、経時的に(0、2及び6時間後)グラフ化したものである。データは、3つ以上の視野で、それぞれ100個以上の細胞数を数えて、そのうちのTUNEL陽性細胞をアポトーシス細胞とし、その割合の平均値を示した。エラー・バーは標準偏差を表す。縦軸はアポトーシス細胞の割合(%)を、横軸は時間(時間)を示す。
第3図は、MTT法を用い、タプシガルギンによる小胞体ストレスによって誘導される細胞死に対する耐性について、ASK1ノックアウトマウスのMEFs(ASK1−/−;黒丸)と野生型MEFs細胞(ASK+/+;白丸)につき比較し、経時的に(0、8、16及び24時間後)それぞれの細胞生存率を示したグラフである。データは、5回以上の独立した実験を行い、その平均値として示した。エラー・バーは標準偏差を表す。縦軸は細胞生存率(%)を、横軸は時間(時間)を示す。
第4図は、MTT法を用い、タプシガルギンの他に、様々な小胞体ストレス誘発剤として、ジチオスレイトールおよびツニカマイシンによって誘導される細胞死に対する耐性について、ASK1ノックアウトマウスのMEFs(ASK1−/−;黒棒)と野生型MEFs細胞(ASK+/+;白棒)につき比較したグラフである。データは、5回以上の独立した実験を行い、小胞体ストレス誘導後8時間目の細胞生存率の平均値として示した。エラー・バーは標準偏差を表す。縦軸は細胞生存率(%)を、横軸は用いた小胞体ストレス誘発剤の名称を示す。
第5図は、MTT法を用い、神経変性蛋白質Amyloid−βによって誘導される神経細胞死に対する耐性について、ASK1ノックアウトマウスの初代培養神経細胞(ASK1−/−;黒棒)と野生型初代培養神経細胞(ASK+/+;白棒)につき比較し、Amyloid−βを添加した当日(0日)、および3日後におけるそれぞれの神経細胞の生存率を示したグラフである。データは、5回以上の独立した実験を行い、その平均値として示した。エラー・バーは標準偏差を表す。縦軸は神経細胞生存率(%)を、横軸は時間(日)を示す。
Claims (36)
- ASK1阻害物質を含む、小胞体ストレスに起因する疾患の予防または治療剤。
- ASK1阻害物質がASK1ドミナントネガティブ体、ASK1ドミナントネガティブ体発現組換えベクターまたはASK1ドミナントネガティブ体発現組換えベクターにより形質転換された宿主細胞である請求項1記載の予防または治療剤。
- ASK1ドミナントネガティブ体がK709RまたはK709Mである請求項2記載の予防または治療剤。
- ASK1阻害物質がASK1アンチセンスオリゴヌクレオチド、ASK1アンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターまたはASK1アンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターにより形質転換された宿主細胞である請求項1記載の予防または治療剤。
- ASK1阻害物質がグルタチオン S−トランスフェラーゼ、ネフ、14−3−3蛋白質およびチオレドキシンから選択されるASK1阻害作用を有する化学物質、そのASK1阻害作用を有する化学物質のセンスオリゴヌクレオチド、そのASK1阻害作用を有する化学物質発現組換えベクター、そのASK1阻害作用を有する化学物質のセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクター、またはそれらの組換えベクターにより形質転換された宿主細胞である請求項1記載の予防または治療剤。
- 小胞体ストレスに起因する疾患が神経変性疾患である請求項1、2、3、4または5記載の予防または治療剤。
- 神経変性疾患がポリグルタミン病である請求項6記載の予防または治療剤。
- 神経変性疾患がアルツハイマー病である請求項6記載の予防または治療剤。
- 神経変性疾患がパーキンソン病である請求項6記載の予防または治療剤。
- 神経変性疾患がプリオン病である請求項6記載の予防または治療剤。
- 神経変性疾患が筋萎縮性側索硬化症である請求項6記載の予防または治療剤。
- 神経変性疾患がFTDP−17である請求項6記載の予防または治療剤。
- ASK1阻害物質を有効量使用することを含む、小胞体ストレスに起因する疾患の予防または治療方法。
- ASK1阻害物質がASK1ドミナントネガティブ体、ASK1ドミナントネガティブ体発現組換えベクターまたはASK1ドミナントネガティブ体発現組換えベクターにより形質転換された宿主細胞である請求項13記載の予防または治療方法。
- ASK1ドミナントネガティブ体がK709RまたはK709Mである請求項14記載の予防または治療方法。
- ASK1阻害物質がASK1アンチセンスオリゴヌクレオチド、ASK1アンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターまたはASK1アンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターにより形質転換された宿主細胞である請求項13記載の予防または治療方法。
- ASK1阻害物質がグルタチオン S−トランスフェラーゼ、ネフ、14−3−3蛋白質およびチオレドキシンから選択されるASK1阻害作用を有する化学物質、そのASK1阻害作用を有する化学物質のセンスオリゴヌクレオチド、そのASK1阻害作用を有する化学物質発現組換えベクター、そのASK1阻害作用を有する化学物質のセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクター、またはそれらの組換えベクターにより形質転換された宿主細胞である請求項13記載の予防または治療方法。
- 小胞体ストレスに起因する疾患が神経変性疾患である請求項13、14、15、16または17記載の予防または治療方法。
- 神経変性疾患がポリグルタミン病である請求項18記載の予防または治療方法。
- 神経変性疾患がアルツハイマー病である請求項18記載の予防または治療方法。
- 神経変性疾患がパーキンソン病である請求項18記載の予防または治療方法。
- 神経変性疾患がプリオン病である請求項18記載の予防または治療方法。
- 神経変性疾患が筋萎縮性側索硬化症である請求項18記載の予防または治療方法。
- 神経変性疾患がFTDP−17である請求項18記載の予防または治療方法。
- 小胞体ストレスに起因する疾患の予防または治療用の製剤を製造するためのASK1阻害物質の使用。
- ASK1阻害物質がASK1ドミナントネガティブ体、ASK1ドミナントネガテイブ体発現組換えベクターまたはASK1ドミナントネガティブ体発現組換えベクターにより形質転換された宿主細胞である請求項25記載の使用。
- ASK1ドミナントネガティブ体がK709RまたはK709Mである請求項26記載の使用。
- ASK1阻害物質がASK1アンチセンスオリゴヌクレオチド、ASK1アンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターまたはASK1アンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターにより形質転換された宿主細胞である請求項25記載の使用。
- ASK1阻害物質がグルタチオン S−トランスフェラーゼ、ネフ、14−3−3蛋白質およびチオレドキシンから選択されるASK1阻害作用を有する化学物質、そのASK1阻害作用を有する化学物質のセンスオリゴヌクレオチド、そのASK1阻害作用を有する化学物質発現組換えベクター、そのASK1阻害作用を有する化学物質のセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクター、またはそれらの組換えベクターにより形質転換された宿主細胞である請求項25記載の使用。
- 小胞体ストレスに起因する疾患が神経変性疾患である請求項25、26、27、28または29記載の使用。
- 神経変性疾患がポリグルタミン病である請求項30記載の使用。
- 神経変性疾患がアルツハイマー病である請求項30記載の使用。
- 神経変性疾患がパーキンソン病である請求項30記載の使用。
- 神経変性疾患がプリオン病である請求項30記載の使用。
- 神経変性疾患が筋萎縮性側索硬化症である請求項30記載の使用。
- 神経変性疾患がFTDP−17である請求項30記載の使用。
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