JPS648306B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、電子器械を用いる基準コントロール
において、複数の血小板パラメーターを測定する
ため、アルデヒドまたは他の固定剤を用いずに人
または動物の血小板を安定化する方法、ならびに
そのための希釈剤に関するものである。最近の技
術的進歩の結果として、臨床診断のため細胞の生
物学的成分の算出用計測システムが増加し、品質
管理製品の改善の必要性が生じた。 血小板基準コントロールを作製するには、血小
板を血液から遠心分離により除去し、緩衝塩で洗
浄し、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、
ピルビンアルデヒド等の薬剤で「固定」する。次
いでアルデヒドと反応した血小板を緩衝液に懸濁
する。 懸濁した血小板は不安定で、環境により凝集す
る場合がある。さらに、アルデヒドと反応した血
小板は次第に形が変わり、古くなると大きさが縮
まる。 アルデヒドと反応した血小板は粒径により影響
される粒子計数装置に用いられる。従つて、理想
的には基準コントロールは、大きさが健康人の血
液中の血小板粒子にできるだけ等しい血小板を含
む必要がある。凝集が基準コンントロールの粒子
の総数および大きさに影響を与えることは明らか
である。また、血小板が新しい人血の血小板と同
じ大きさではないので、縮化または膨潤がコント
ロール値を減らすことも明らかである。 一般に、多くの人血小板基準コントロールが市
販されている。しかし、血小板の平均容量および
粒度の分布幅の測定において、長期安定性に関す
る改良が必要である。 この種の器械システムとして、全血標本の人血
小板の数と容量分布を数え試験するクールター・
カウンターモデルＳ―プラス血液学システムが
ある。同種の機械は他の会社も同じ目的で製造し
ている。電子測定に関する設計はこの種の機械の
オペレーターに対し十分に明らかにされている。
どんな血小板基準コントロールも人の患者標本で
測定される基準をすべて満足しなければならな
い。この基準コントロールは健康な新しい全血標
本の基準コントロールに出来るだけ近似する必要
がある。また、計数法、正しく釣合つた口径、電
流、増幅利得整定、および機能的状況のすべてに
関するシステムの応答性について、しきい値を正
しく合わせるようにしなければならない。 最近、平均血小板容量分布分析が臨床上の応用
に有用な計量法として認められてきた。現在、人
血小板の粒度分布幅を特定の測定パラメーターか
ら計算することができる。各測定パラメーター目
体は人血小板の対数正常分布を検討する場合の改
善に役立つ。また、この方法の変動とシフトは間
違つた計算の原因となる。 計算不一致の共通の原因は凝集である。血小板
の凝集は、信頼性のない品質管理方法の結果、白
血球モードで重複して計算することになる。血小
板が凝集を受ける範囲まで、凝集した血小板細胞
が出現し、自動機器に白血球として計算される。
血小板の数は詳鮮血に含まれる白血球の数の約30
倍であるので、ほんの僅かな量の血小板が凝集し
ても、白血球数に関して、特に通常の固定剤で処
理した後に、信頼性のない結果を生じさせる。 また、血小板の付着物は間違つた計数をもたら
す。「異種」表面への血小板の付着は種々の方法
で測定された。これら試験原理はすべて同じであ
る。標準時間中に血液に「異種」表面を接触させ
る場合に生じる血小板数の減少を測定する。この
減少は、部分的に、異種表面に付着した血小板数
を示し、もとの血小板数の百分率で表されたこの
値は付着度と称される。しかし、血小板の損失の
若干は、また血小板凝集が原因であることが知ら
れている。血小板の付着度は、カルシウムまたは
マグネシウムのいずれかのイオンに依存するが、
このことについては多形核細胞の付着度と同様に
選択的ではない。 血小板は、血管が損傷した位置で凝集体を形成
して初期止血に関与する。結局血小板凝集に関与
する物質は恐らくアデノシンジホスフエート
（ADP）であり、これは損傷した組織および赤血
球に由来するかまたは、特に、コラーゲントロン
ビンおよびエピネフリンによつて血小板自体から
放出される。出血障害を伴つた患者、および薬の
摂取を続けている一般患者において、これらの薬
の１種または２種以上によつて血小板の凝集が損
なわれる。血小板の凝集が損なわれると、患者の
出血時間が長くなる原因となる場合が多い。 血小板数の別の不一致は、コントロールの予想
した満期日まで安定性が不十分なために生じる。
人血小板を安定にする試みは極めて難かしいこと
が明らかになつた。主な問題のひとつは、血小板
膜の壊変である。従来、固定剤が壊変抑制源とし
て用いられた。血小板膜が壊変する場合、残屑を
生じ、これが間違つた計数の原因となる。なまの
データを満たす曲線用に改良したコンピユーター
技術による新しい方法はこれらの問題に悩まされ
ている。 米国特許第4198206号には、凝集せず、しかも
人血小板と同じ大きさを有し少なくとも６ケ月間
この大きさを維持する血小板からコントロールを
調製する方法が開示されている。このコントロー
ルは次に示す溶液： (1) グリシンまたはアラニンのアミノ酸、 (2) グリコール、グリセリンまたはメタノール、 (3) 塩化ナトリウムおよびリン酸ナトリウム、お
よび (4) 固体ポリエチレングリコール（分子量4000〜
20000） で洗浄したアルデヒドと反応した血小板の懸濁液
である。提案されたこの反応の機構は、アミノ酸
のアミノ基がアルデヒド基と反応し、その結果、
血小板の硬化と縮化に導く橋かけを含む反応がこ
れ以上起こることができないことを示している。 本発明は人または動物の血小板の処理法および
グルタルアルデヒドのような固定剤を使用しない
血小板の安定法に関するものであり、これにより
本発明は上記矛盾除くのに役立つものである。意
外なことに、式ICH₂CONH₂のヨードアセトアミ
ド、式H₂NCOCH₂N（CH₂COOH）₂のADAを用
い、アルデヒドで処理した血小板を用いないで、
優れた結果が得られた。長期の細胞安定性は細胞
の粒度分布を変えることなく増加する。 本発明は電子器械を用いる基準コントロールに
おいて複数の血小板パラメーターを測定するた
め、アルデヒドまたは他の固定剤を用いないで人
または動物の血小板を安定化する方法に関するも
のである。さらに特に本発明は、患者の血液標本
の所望の血小板パラメーターをモニタリングする
能力をもつコントロール剤として働くことができ
る血小板を懸濁する新規の安定化組成物を提供す
る。これらのパラメーターは、特にすぐれた調合
剤においては、血小板数、粒度分布幅、平均血小
板容量および信号／ノイズ比（debris残屑）を含
む。 次に、血小板の電解質水溶液に適当量の(1)ヨー
ドアセトアミドおよび(2)イミノジ酢酸およびその
アルカリ金属塩およびアルカリ緩衝塩、並びに相
溶性殺バクテリア剤の組合せを添加し、この溶液
をあらかじめ選択したPHおよび浸透圧モル濃度の
範囲に維持することにより、血小板の安定化をも
たらす。 好ましいイミノジ酢酸はＮ―（２―アセトアミ
ド）イミノジ酢酸（ADA）であり、好ましい殺
バクテリア化合物はペニシリン属、特にペニシリ
ンナトリウムであり、これは血小板に別の安定化
作用をもたらすことができる。 エチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）、その
ナトリウム塩またはカリウム塩、またはヒドロキ
シエチルエチレンジアミントリ酢酸を、製剤に含
むことができる。 本発明は血小板の安定化のために、ヨードアセ
トアミドおよびイミノ酢酸またはその塩、相溶性
殺バクテリア剤との組合せを、あらかじめ選択し
たPHおよび浸透圧モル濃度の範囲に維持する電解
質水溶液に溶解したものを用いる。 ヨードアセトアミドは血小板と多形核細胞の付
着性を減らすかまたは阻止する働きがある。いか
なる作用理論にも制限されることなく、血小板と
多形核細胞は活性なグリコリシス系を有すること
が知られており、データーはヨードアセトアミド
がグリコリシスを妨害して付着性に作用するとい
う仮説と一致する。しかし、データーはまた、ヨ
ードアセトアミドに類似の感度を有する機構によ
るスルフヒドリルへの付着性を与える仮説と一致
する。 また、血小板の付着性は２価のカチオンに依存
するらしいが、血小板に必要な濃度は多形核細胞
に必要な濃度よりもずつと小さいようである。マ
グネシウムイオンおよびカルシウムイオンは付着
性に必要である。カルシウムイオンのみでは、キ
レート樹脂で処理して二価のカチオンを除去した
血液から多形核細胞への付着性を回復することは
できない。 特定のキレート剤としてＮ―（２―アセトアミ
ド）イミノジ酢酸（ADA）とヨードアセトアミ
ドを組合せて使用すると、人血小板を凝集しない
でまたはその完全さを失うことなく安定時間を延
ばすことができる。ヨードアセトアミドのみでは
これらのフアクターを中和しない。また、血小板
の豊富な血漿に懸濁するには緩衝性が十分でな
い。 イミノジ酢酸塩、特にADAとヨードアセトア
ミドとの組合せは、安定性を改善し、凝集を排除
し、ADAの抗凝析性の利点を獲得する。ADAの
緩衝性は人血小板に理想的である。安定化溶液１
につき約0.5ｇ〜約2.0ｇのヨードアセトアミド
を添加する。 適当なイミノジ酢酸化合物は、Ｎ―（２―アセ
トアミド）イミノジ酢酸（ADA）、ADAナトリ
ウム、ADAカリウム、ADAリチウム、トリス―
ADAまたはADAイミダゾールである。血小板の
水性懸濁液１につき、約0.5ｇ〜約2.0ｇのADA
または同量のADAの塩を、例えば血小板の豊富
な血漿に添加する。 相溶性殺バクテリア剤はナトリウムペニシリン
Ｇ、カリウムペニシリンＧ、プロカインペニシリ
ンＧ、ペニシリンＶカリウム、アンピシリンおよ
びカルベニシリンを含む。 好適な製剤 １ ヨードアセトアミド 1.0ｇ ２ Ｎ―（２―アセトアミド）イミノジ酢酸
（ADA） 1.0ｇ ３ 塩化ナトリウム 9.1466ｇ ４ ペニシリンナトリウム 0.155ｇ 蒸留水で１にする。 浸透圧モル濃度＝310 PHをNaOHで7.0±0.1の調整。 上記製剤において、エチレンジアミンテトラ酢
酸（EDTA）またはその塩を、二価イオンに対
するキレート剤として働く随意成分として添加す
ることが望ましい。約0.5ｇ〜約2.0ｇのEDTA、
または同量の塩を、１の血小板の水性懸濁液に
添加する。 調製方法 １ 約500mlの蒸留水を１のフラスコに添加す
る。 ２ ADA １ｇを添加し溶解する。 ３ EDTAジナトリウムを製剤に含む場合、１
ｇを添加し溶解する。 ４ ヨードアセトアミド１ｇを添加し溶解する。 ５ 塩化ナトリウム9.4166ｇを添加し溶解する。 ６ ペニシリンナトリウム0.155ｇを添加し溶解
する。 ７ 蒸留水で１にする。 ８ 水酸化ナトリウムでPHを7.0±0.5に調整し、
塩化ナトリウムで浸透圧モル濃度を330±30に
調整する。 ９ 0.22ミクロンフイルターにより無菌バツグに
過する。 10 室温で６ケ月まで貯蔵する。 米国特許第4116635号には全血を用いるADAと
EDTAの両者の抗凝析性を研究し、明細書の第
１表にその結果を報告している。PH7.5にて仮安
定度定数であるLogK′は、EDTAに対し7.9で
ADAに対し4.0に過ぎない。抗凝析性その他のク
ルーム１によるフアクターに対し血液標本を試験
する方法において、選ばれた抗凝析性は3.4〜約
4.2のLogK′を有し、従つてADAを含むが、
EDTAは除かれる。 意外なことに、本発明では、ADAとEDTAの
両者を殆ど同量で製剤に用いる場合、良い結果が
得られることがわかつた。血小板の水性製剤に添
加するEDTAの分量は、１につき約0.5〜約2.0
ｇである。 以下の実施例は、電子器械により複数の血小板
パラメーターを測定するため固定剤を用いないで
血小板を安定する方法を示すものである。

【表】 上の結果は、安定化溶液を２〜８℃で保存し、
標準クールターカウンター モデルＳ―プラス器
械で試験して得られた。 信号／ノイズ比は時間と共に減少する。即ち、
ノイズは信号に比例して増加する。提示した全パ
ラメーターは時間と共に変化する。７日後、完全
な細胞分裂を示し、その結果、分布分析表には適
合しなかつた。血小板数、平均血小板容量
（MPV）、および粒度分布を器械で測定すること
はできなかつた。 同様に、リン酸塩緩衝食塩溶液に溶解したグル
タルアルデヒド固定血小板の代表的標本は、全期
間を通じて平均血小容量の減少を示す。最近製造
された臨床血液学の器械は、平均血小板粒度分布
の減少に対しシフトを許容することができない。
このシフトは不適合条件となる。 過剰の残屑は粒度分布曲線に不適合を生じる。

【表】 上の結果は、２〜８℃で貯蔵し、標準クールタ
ーカウンター モデルＳ―プラス器械で試験した
場合に得られた。これらの結果は、180日後いず
れのパラメーターもあまり変化がないことを示し
ている。電子装置で測定した品質管理応用に必要
なすべての臨床パラメーターに関して、安定性が
優れている。 信号／ノイズ比は、器械が製造者の設計に従つ
て実施されることをオペレーターに保証するよう
に、最大にならなければならない。血小板残屑お
よびこの種の生成物が生きている間の細胞分裂の
ために、増加するノイズは常に問題となる。これ
らの試料では、信号／ノイズ比は減少を示さず、
器械に品質管理方法のためのパラメーターを臨界
測定することができなくする。電子粒径測定装置
の信号／ノイズ比の減少は、特に血小板を数え粒
度分布を測定する一層低いしきい値において、許
容することができない。 統計データーは、幾つかの臨床血液学研究室に
おける100日以上の全血コントロール調製におい
て上記安定化した人血小板の使用を実証してい
る。 本発明の安定化溶液を用いて人血小板をあらか
じめ調整することにより、電子装置を監視するた
めのコントロールとして、その細胞を人または動
物の赤血球調製物に再懸濁させることができる。
また生体内の治療に応用するため人血小板を安定
化することができる。 血小板をあらかじめ調整するために、約50〜
100mlの安定化希釈剤を直接200±50ｇ単位の血小
板が豊富な血漿（PRP）に添加し、よくかきま
ぜる。次いで安定化したPRPは７日間室温に放
置した後、血小板濃縮処理のために遠心分離す
る。あるいは、安定化希釈剤を添加したPRPを
３ケ月までの間４〜６℃に貯蔵し、その後、血小
板濃縮物を取出すために遠心分離処理する。 PRPは約3800RPM（冷凍遠心機）で５分間遠
心分離し、上澄みを捨てる。PH7.0〜7.2および
320mOs／Kgのリン酸塩緩衝食塩水を添加して混
合し、洗浄工程を２回くり返す。２回洗浄後、血
小板を濃縮し、単一高濃度プールにためる。 血小板濃縮物を希釈剤に所望の濃度で再懸濁
し、この調製物を、全血コントロールとして用い
る安定化した赤血球に添加する。最終調製物を６
ケ月までの間２〜８℃で貯蔵する。 この希釈剤は、一般に用いられる抗凝析剤、例
えばCPD（クエン酸塩―リン酸塩―デキストロー
ス）、ACD（酸―クエン酸塩―デキストロース）
およびEDTA（エチレンジアミンテトラ酢酸）を
用いて処理した血小板の豊富な血漿を好結果で安
定化する。 安定化した血小板は、全血基準コントロールと
同様に、すぐれた血小板コントロールとして用い
られ、良質のコントロール法を確保し、(1)計数、
(2)平均粒度分布、(3)平均血小板容量、および(4)信
号／ノイズ比（残屑）をモニターする。 当該分野では、血液成分に対し自動計数器械の
精度をチエツクするために有効な安定化した血球
製剤を多少変更することは、よく認められること
である。この種の製剤は「血液学」（ウイリアム
ス、ビユトラー、エルスレブ、およびランドル
ス、マクグローヒル・インコーポレーテツド
（1972））の第14頁に簡単に議論されている。 血液学の分野では、「キヤリブレーター」と
「基準コントロール」の語には相違がある。キヤ
リブレーターは一定のキーナンバーに関して自動
器械をセツトするために用いられる血球清剤であ
る。基準コントロールは前もつてキヤブレーター
血球清剤を用いて「キヤブレート」した自動器械
の継続する精密度を時々チエツクするために用い
られる血球製剤である。 本発明の利点は、60日間または60日以上安定で
ある基準コントロールを与える固定剤としてアル
デヒドを使用しないで上記方法により安定化した
血小板を、次いで、特に一定の目的のために、一
層長期にわたつて改良された安定性を有する血小
板製剤を与えるアルデヒドおよび／または界面活
性剤を用いる方法を含む他の方法により処理する
第２の安定化処理に委ねることができることであ
る。 例えば、本発明の好適な製剤によつて安定化し
た血小板を、次いで、次に示す組成を有する固定
剤―安定剤媒体で処理することができる。 NaH₂PO₄・H₂O 0.196ｇ Na₂HPO₄・7H₂O 0.980ｇ NaN₃ 0.098ｇ NaCl 7.9 ｇ グルタルアルデヒド、49％ 8.4 ｇ タージトール 15―Ｓ―12 0.5 ｇ 水q.s. １ リン酸塩でPHを7.3〜7.4に調製し、NaClで浸
透圧モル濃度を290mOsKgに調整する。 タージトール 15―Ｓ―12は異性体線状アルコ
ールのエトキシレート混合物である（米国特許第
3912450号（1975）および米国特許第3968248号
（1976）。この混合物は次式： （式中のポリオキシエチレン鎖は無作為に線状
脂肪族鎖に連結し、ｎ＝９〜13およびｘ＝９〜13
を示す）で表される。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ヨードアセトアミドとイミノジ酢酸、および
   前記酸のアルカリ金属およびアルカリ緩衝塩、並
   びに相溶性殺バクテリア剤から成る水溶液である
   安定化溶液を懸濁流体中の血小板に添加すること
   を特徴とする血小板安定化方法。 ２ 安定化溶液としてアルカリ金属水酸化物およ
   びアルカリ金属塩化物を用いてPHと浸透圧モル濃
   度を予定の範囲に維持した電解質溶液を用いる特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ さらに、血小板に適当な時間および温度で少
   なくとも部分安定化を達成せしめ、 血小板を前記安定化溶液から分離し、 これに適当量のグルタルアルデヒドおよび次
   式： （式中のポリオキシエチレン鎖は無作為に線状
   脂肪族鎖に連結し、ｎ＝９〜13およびｘ＝９〜13
   を示す）で表される異性体線状アルコールのエト
   キシレート混合物である非イオン界面活性剤を添
   加し、 PHと浸透圧モル濃度をあらかじめ選択した範囲
   に調整する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４ 安定化溶液の追加成分として、エチレンジア
   ミンテトラ酢酸、そのナトリウムまたはカリウム
   塩が存在する特許請求の範囲第１項または第２項
   記載の方法。 ５ 前記イミノジ酢酸がＮ―（２―アセトアミ
   ド）イミノジ酢酸である特許請求の範囲第１〜４
   項のいずれか一つの項に記載の方法。 ６ 前記イミノジ酢酸の濃度が0.5ｇ〜2.0ｇ／
   である特許請求の範囲第１項〜第４項のいずれか
   一つの項に記載の方法。 ７ 前記殺バクテリア剤が、ペニシリンＧ、カリ
   ウムペニシリンＧ、プロカインペニシリンＧ、ペ
   ニシリンＶカリウム、アンピシリンおよびカルベ
   ニシリンから成るペニシリン群の一員である特許
   請求の範囲第１〜６項のいずれか一つの項に記載
   の方法。 ８ 前記安定化溶液を血小板の豊富な血漿に添加
   する特許請求の範囲第１〜７項のいずれか一つの
   項に記載の方法。 ９ 前記ヨードアセトアミドの濃度が0.5ｇ〜2.0
   ｇ／である特許請求の範囲第１〜８項のいずれ
   か一つの項に記載の方法。