JPS6394980A - 環状二重鎖ｄｎａ、それを含む微生物、それらを用いる型間組換え体ウイルスの製造法及び得られた型間組換え体ウイルス - Google Patents
環状二重鎖ｄｎａ、それを含む微生物、それらを用いる型間組換え体ウイルスの製造法及び得られた型間組換え体ウイルスInfo
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- JPS6394980A JPS6394980A JP61242694A JP24269486A JPS6394980A JP S6394980 A JPS6394980 A JP S6394980A JP 61242694 A JP61242694 A JP 61242694A JP 24269486 A JP24269486 A JP 24269486A JP S6394980 A JPS6394980 A JP S6394980A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野〕
本発明は、遺伝子組換え技術を利用して急性灰白髄炎（
ポリオ）に対する新しい生ワクチン株を製造する方法及
び、新たに製造された生ワクヂン株ウィルスに関するも
のである。
ポリオ）に対する新しい生ワクチン株を製造する方法及
び、新たに製造された生ワクヂン株ウィルスに関するも
のである。
ポリオウィルスはピコルナウィルス科に属し、自然宿主
である人に感染して急性灰白髄炎をひきおこす。又猿に
も感染が成立して人の場合と同様の症状を呈する。血清
学的に１型、２型、３型の３種類に分類され、現在各型
それぞれに弱毒株が分離され、サル腎等の組織培菩によ
り得られたウィルスがポリオ生ワクチンとして使用され
ている。
である人に感染して急性灰白髄炎をひきおこす。又猿に
も感染が成立して人の場合と同様の症状を呈する。血清
学的に１型、２型、３型の３種類に分類され、現在各型
それぞれに弱毒株が分離され、サル腎等の組織培菩によ
り得られたウィルスがポリオ生ワクチンとして使用され
ている。
それらポリオ生ワクチン株のうちでもｓａｂ ｉ ｎ博
士により分離された５ａｂｉｎ１．２．３型株は広く世
界中で使用されポリオの制圧に非常に大きな成果をおさ
めている（Ｓａｂｉｎ、＾、Ｂ、 、 ：Ｊ。
士により分離された５ａｂｉｎ１．２．３型株は広く世
界中で使用されポリオの制圧に非常に大きな成果をおさ
めている（Ｓａｂｉｎ、＾、Ｂ、 、 ：Ｊ。
［ｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、 ：υ５１．４２０（１９８５
））。
））。
３ａｂｉｎ株はこのように効果的なワクチン株であるが
、３ａｂ ｉ ｎ２．３ａｂ ｉ ｎ３型株はワクチン
投与によって引起こされたと考えられるマヒの原因とな
ることがあり、より安全なワクチン株の開発が望まれて
いる。更に、ポリオウィルス遺伝子のような（＋）−重
鎖ＲＮＡは複製時の変異率が１０−３〜１０−４であり
二本鎖ＤＮＡの変異率１０−８〜１ｏ−１１にくらべて
非常に大きいことが知られている。このことは１度の継
代でかなりの変異株が出現し、３ａｂ ｉ ｎ原株の性
質を保ったまま継代を繰り返すのが困難であることを示
しており、事実ＷＨＯによるＭａｓｔｅｒ ５ｅｅｄ作
製の試みは成功しているとはいい難い状況である。
、３ａｂ ｉ ｎ２．３ａｂ ｉ ｎ３型株はワクチン
投与によって引起こされたと考えられるマヒの原因とな
ることがあり、より安全なワクチン株の開発が望まれて
いる。更に、ポリオウィルス遺伝子のような（＋）−重
鎖ＲＮＡは複製時の変異率が１０−３〜１０−４であり
二本鎖ＤＮＡの変異率１０−８〜１ｏ−１１にくらべて
非常に大きいことが知られている。このことは１度の継
代でかなりの変異株が出現し、３ａｂ ｉ ｎ原株の性
質を保ったまま継代を繰り返すのが困難であることを示
しており、事実ＷＨＯによるＭａｓｔｅｒ ５ｅｅｄ作
製の試みは成功しているとはいい難い状況である。
現在ＷＨＯにより保管されている３ａｂ ｉ ｎ原株の
吊は１型が１３．５ｄ、２型が３．５蛇、３型が２．５
成しがなく、原株の消失が憂慮される事態となっている
。これらのことから現在使用されているＳａｂ ｉ ｎ
株ワクチンより安全で常に一定の性質を示すワクチン株
の出現が望まれている。
吊は１型が１３．５ｄ、２型が３．５蛇、３型が２．５
成しがなく、原株の消失が憂慮される事態となっている
。これらのことから現在使用されているＳａｂ ｉ ｎ
株ワクチンより安全で常に一定の性質を示すワクチン株
の出現が望まれている。
本発明は正にこのようなワクチン株を提供することを主
たる目的とする。
たる目的とする。
本発明者らは、上記した従来技術の問題点を解決するた
めに研究を重ねた結果、ポリオウィルスＲＮＡ遺伝子を
二重鎖ｃＤＮＡに変換し、更にＳａｂ ｉ ｎｌ型株ｃ
ＤＮＡのコート蛋白をコードしている領域をＳａｂ ｉ
ｎ２型株あるいは５ａｂｉｎ３型株のそれで置き換え
た組換え体ＣＤＮＡクローンを描築し、この組換λ体ｃ
ＤＮＡクローンを動物細胞にトランスフェクションする
ならば、現行のワクチン株よりも安定な型間組換え体ウ
ィルスを再現性よく回収し得ることを見出し、本発明を
完成するに至った。
めに研究を重ねた結果、ポリオウィルスＲＮＡ遺伝子を
二重鎖ｃＤＮＡに変換し、更にＳａｂ ｉ ｎｌ型株ｃ
ＤＮＡのコート蛋白をコードしている領域をＳａｂ ｉ
ｎ２型株あるいは５ａｂｉｎ３型株のそれで置き換え
た組換え体ＣＤＮＡクローンを描築し、この組換λ体ｃ
ＤＮＡクローンを動物細胞にトランスフェクションする
ならば、現行のワクチン株よりも安定な型間組換え体ウ
ィルスを再現性よく回収し得ることを見出し、本発明を
完成するに至った。
以下、本発明の詳細な説明する。
本発明の環状二重鎖ＤＮＡは、ポリオウィルス弱毒株５
ａｂｉｎｌ型、Ｓａｂ ｉ ｎ２型あルイハ３ａｂ ｉ
ｎ３型株の遺伝子をコードするＤＮＡ配列のうち（Ｔ
ｏｙｏｄａ、１１．、ｅｔ ａｌ、： Ｊ、Ｈｏ１．Ｂ
ｉｏｌ、＋１７４．５６１（１９８４）） Ｓ ａ ｂ
ｉ ｒｌ ｉ型の次式で示す領域を５ａｂｉｎ２型株
のＢａ１ｌ−ＢａｎＩ領域（塩基番号６３７−３５５０
）あるいは３ａｂ ｉ ｎ３型株のＢａ Ｉ Ｉ −Ｎ
ｄｅ ｒ領域（塩基番９号（６３７−３４０５）で組換
えたのものである。
ａｂｉｎｌ型、Ｓａｂ ｉ ｎ２型あルイハ３ａｂ ｉ
ｎ３型株の遺伝子をコードするＤＮＡ配列のうち（Ｔ
ｏｙｏｄａ、１１．、ｅｔ ａｌ、： Ｊ、Ｈｏ１．Ｂ
ｉｏｌ、＋１７４．５６１（１９８４）） Ｓ ａ ｂ
ｉ ｒｌ ｉ型の次式で示す領域を５ａｂｉｎ２型株
のＢａ１ｌ−ＢａｎＩ領域（塩基番号６３７−３５５０
）あるいは３ａｂ ｉ ｎ３型株のＢａ Ｉ Ｉ −Ｎ
ｄｅ ｒ領域（塩基番９号（６３７−３４０５）で組換
えたのものである。
（式中Ａはアデニル［を、Ｇはグアニル１１を、Ｃはシ
チジル酸基をＵはウリジル酸基を表わす。
チジル酸基をＵはウリジル酸基を表わす。
ＤＮＡの場合はＵをＴ：チミジルＰＩｉｕと読みかえる
。） 本発明の環状二重鎖ＤＮＡは、３ａｂ ｉ ｎｌｌ型上
３ａｂ ＋ ｎ３型株の組換えを例に示せば、次のよう
にして調製スることができる（第１図を参照）。 ＶＳ
（１’）ＩＣ−０（Ｔ）プラスミド（にｏｈａｒａ、
Ｈ，、ｅｔ ａｌ、： Ｖｉｒｏｌｏｇｙ：１５１．
２１（１９８Ｇ））を制限酵素ＡａｔｌＩ、ＢＳｔＥＩ
、Ｂａ１Ｉで消化してＡａｔＩ［−ＢａｌＩ断片を単離
する。
。） 本発明の環状二重鎖ＤＮＡは、３ａｂ ｉ ｎｌｌ型上
３ａｂ ＋ ｎ３型株の組換えを例に示せば、次のよう
にして調製スることができる（第１図を参照）。 ＶＳ
（１’）ＩＣ−０（Ｔ）プラスミド（にｏｈａｒａ、
Ｈ，、ｅｔ ａｌ、： Ｖｉｒｏｌｏｇｙ：１５１．
２１（１９８Ｇ））を制限酵素ＡａｔｌＩ、ＢＳｔＥＩ
、Ｂａ１Ｉで消化してＡａｔＩ［−ＢａｌＩ断片を単離
する。
、ＶＳ （３）２６０３プラスミド（Ｔｏｙｏｄａ、
ｔｌ、 。
ｔｌ、 。
ｅｔ ａｔ、： Ｊ、Ｈｏ１．Ｂｉｏｌ、：１７４．５
６１（１９８４））を制限酵素ト１ｉｎｄｌｌ［、Ｎｄ
ｅＩ、Ｂａ１Ｉおよびｐｓ ｔ Ｉテ消化し、３ａｌＩ
−ＮｄｅＩ、ＮｄｅＩ−ＰｓｔＩ、Ｐ ｓ ｔ Ｉ ’
−Ｎ ｄ ’ｅ ＩＤＮΔ断片を単離する。ｐＶＳ （
１）ＢＢ２プラスミド（Ｎｏｍｏｔｏ、Ａ、、ｅｔａｌ
、： Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。
６１（１９８４））を制限酵素ト１ｉｎｄｌｌ［、Ｎｄ
ｅＩ、Ｂａ１Ｉおよびｐｓ ｔ Ｉテ消化し、３ａｌＩ
−ＮｄｅＩ、ＮｄｅＩ−ＰｓｔＩ、Ｐ ｓ ｔ Ｉ ’
−Ｎ ｄ ’ｅ ＩＤＮΔ断片を単離する。ｐＶＳ （
１）ＢＢ２プラスミド（Ｎｏｍｏｔｏ、Ａ、、ｅｔａｌ
、： Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、ＵＳＡ＋７９．５７９３（１９８２））を制限
酵素ＮｄｅＩ、ＸｂａＩで消化し、ＮｄｅＩ−ＸｂａＩ
ＤＮＡ断片を単離する。。ＵＣｌ３プラスミド（Ｒ
ｏｂｅｒｔｓ、Ｒ，Ｊ、：Ｎｕｃｌｅｉｃ 八ｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ、＋１２．１６７（１９８４））を制限酵
素ＡａｔＩＩ、ＮｄｅＩおよびＰｓｔＩ、ＸｂａＩで消
化し、それぞれ長い方のＡａｔＩＩ−ＮｄｅＩ、Ｐｓｔ
Ｉ−ＸｂａＩＤＮＡ断片を単離する。得られたＤＮＡ断
片のうち、ｐＵＣ１８ＵＣｌ３プラスミドａｔ［−Ｎ
ｄ ｅ Ｉ 、ｐ Ｖ Ｓ （１） Ｉ Ｃ−０（Ｔ
）プラスミドからの ＡａｔＩ［−ＢａｌＩ、 ＶＳ（
３）２６０３からのＢａ ｌ Ｉ−ＮｄｅＩの３つのＤ
ＮＡ断片をＴ４ ＤＮ△リガーゼで結合環化し１、Ａ
ＢＮ／１８プラスミドを得る。
酵素ＮｄｅＩ、ＸｂａＩで消化し、ＮｄｅＩ−ＸｂａＩ
ＤＮＡ断片を単離する。。ＵＣｌ３プラスミド（Ｒ
ｏｂｅｒｔｓ、Ｒ，Ｊ、：Ｎｕｃｌｅｉｃ 八ｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ、＋１２．１６７（１９８４））を制限酵
素ＡａｔＩＩ、ＮｄｅＩおよびＰｓｔＩ、ＸｂａＩで消
化し、それぞれ長い方のＡａｔＩＩ−ＮｄｅＩ、Ｐｓｔ
Ｉ−ＸｂａＩＤＮＡ断片を単離する。得られたＤＮＡ断
片のうち、ｐＵＣ１８ＵＣｌ３プラスミドａｔ［−Ｎ
ｄ ｅ Ｉ 、ｐ Ｖ Ｓ （１） Ｉ Ｃ−０（Ｔ
）プラスミドからの ＡａｔＩ［−ＢａｌＩ、 ＶＳ（
３）２６０３からのＢａ ｌ Ｉ−ＮｄｅＩの３つのＤ
ＮＡ断片をＴ４ ＤＮ△リガーゼで結合環化し１、Ａ
ＢＮ／１８プラスミドを得る。
また１、ｔＪｃｌ ＢプラスミドからのｐｓｔＩ−Ｘｂ
ａＩｌ、ＶＳ （３）２６０３プラスミドからのＰｓｔ
Ｉ−ＮｄｅＩ、、ＶＳ （１）ＢＢ２からのＮｄｅＩ−
ＸｂａＩの３つのＤＮＡ断片も同様にして結合環化し、
ｐＰＮＸ／１８プラスミドを得る。
ａＩｌ、ＶＳ （３）２６０３プラスミドからのＰｓｔ
Ｉ−ＮｄｅＩ、、ＶＳ （１）ＢＢ２からのＮｄｅＩ−
ＸｂａＩの３つのＤＮＡ断片も同様にして結合環化し、
ｐＰＮＸ／１８プラスミドを得る。
得られた環状ＤＮＡをリン酸カルシウム法でニジエリシ
ャーｍｌす（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） Ｊ
Ｍ２Ｏ３株に形質転換し、アンピシリン耐性を指標に
ＡＢＮ／１８および、ＰＮＸ／１８プラスミド含有株
をスクリーニングし、増幅する。得られた形質転換株よ
り、ＡＢＮ／１８および、ＰＮＸ／１８プラスミドを単
離する。
ャーｍｌす（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） Ｊ
Ｍ２Ｏ３株に形質転換し、アンピシリン耐性を指標に
ＡＢＮ／１８および、ＰＮＸ／１８プラスミド含有株
をスクリーニングし、増幅する。得られた形質転換株よ
り、ＡＢＮ／１８および、ＰＮＸ／１８プラスミドを単
離する。
。ΔＢＮ／１８プラスミドを制限酵素Ａａｔ■、Ｎｄｅ
Ｉで消化し、５ａｂｉｎｌ型株オヨヒＳａｂ ｉ ｎ３
型株の遺伝子をもったＤＮＡ断片を単離する。更に、Ｖ
Ｓ （１）ＩＣ−０（Ｔ）プラスミドを制限酵素Ａａｔ
Ｉ［、Ｂ、ａｎＩＩで消化し、長い方のＤＮＡ断片△ａ
ｔｌＩ−ＢａｎＩ［を単離する。
Ｉで消化し、５ａｂｉｎｌ型株オヨヒＳａｂ ｉ ｎ３
型株の遺伝子をもったＤＮＡ断片を単離する。更に、Ｖ
Ｓ （１）ＩＣ−０（Ｔ）プラスミドを制限酵素Ａａｔ
Ｉ［、Ｂ、ａｎＩＩで消化し、長い方のＤＮＡ断片△ａ
ｔｌＩ−ＢａｎＩ［を単離する。
得られたＤＮＡ断片のうち。ＶＳ（１）ＩＣ−０（Ｔ）
プラスミドからのＡａｔＩＩ−ＢａｎＵ、。ＡＢＮ／１
８プラスミドからのＡａｔＩＩ−ＮｄｅＬ、ＶＳ （３
）２６０３プラスミドからのＮｄｅＩ −ＰｓｔＩ、、
ＰＮＸ／１８からのＰｓｔＩ−ＢａｎｌＩの４つのＤＮ
Ａ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで結合環化させ、。ＶＳＳ
（１／３）ＢＮプラスミドを得る。
プラスミドからのＡａｔＩＩ−ＢａｎＵ、。ＡＢＮ／１
８プラスミドからのＡａｔＩＩ−ＮｄｅＬ、ＶＳ （３
）２６０３プラスミドからのＮｄｅＩ −ＰｓｔＩ、、
ＰＮＸ／１８からのＰｓｔＩ−ＢａｎｌＩの４つのＤＮ
Ａ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで結合環化させ、。ＶＳＳ
（１／３）ＢＮプラスミドを得る。
得られた環状ＤＮＡをリン酸カルシウム法でニジエリシ
ャ・コリＨ８１０１株に形質転換し、アンピシリン耐性
を指標にｐＶＳＳ （１／３）ＢＮプラスミド含有株を
スクリーニングし、増幅する。
ャ・コリＨ８１０１株に形質転換し、アンピシリン耐性
を指標にｐＶＳＳ （１／３）ＢＮプラスミド含有株を
スクリーニングし、増幅する。
得られた形質転換株より、ＶＳＳ （１／３） ＢＮ
プラスミドを単離する。このプラスミドが有するポリオ
ウィルスの遺伝子構造は第２図に示しである。
プラスミドを単離する。このプラスミドが有するポリオ
ウィルスの遺伝子構造は第２図に示しである。
以上の操作で各制限酵素による消化、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼによる結合、アンピシリン耐性を用いるスクリーニン
グおよび各プラスミドの増幅などはすべて慣用の方法を
用いることができる。
ゼによる結合、アンピシリン耐性を用いるスクリーニン
グおよび各プラスミドの増幅などはすべて慣用の方法を
用いることができる。
また各ＤＮＡｆｇｉ片およびプラスミドなどの分離精製
には、フェノールによる抽出、エタノールによる沈澱、
アガロースゲル電気泳動およびそれに引続く抽出技術な
どすべて慣用の技術を用いることができる。例えば、Ｈ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ ＣＩｏｎｉｎｃ＋、ＡＬＡＢＯＲＡ
ＴＯＲＹ ＨＡＮＩＪＡＬ：ｅｄ、Ｈａｎｉａｔｉｓ、
Ｔ、、ａｔ ａｌ、：Ｃ，Ｓ。
には、フェノールによる抽出、エタノールによる沈澱、
アガロースゲル電気泳動およびそれに引続く抽出技術な
どすべて慣用の技術を用いることができる。例えば、Ｈ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ ＣＩｏｎｉｎｃ＋、ＡＬＡＢＯＲＡ
ＴＯＲＹ ＨＡＮＩＪＡＬ：ｅｄ、Ｈａｎｉａｔｉｓ、
Ｔ、、ａｔ ａｌ、：Ｃ，Ｓ。
Ｈ，（１９８２）参照（以下、単にＭｏ１ｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇと称ず）。
Ｃｌｏｎｉｎｇと称ず）。
尚、本発明において実際に使用された、あるいは得られ
た、ポリオウィルス遺伝子のｃＤＮＡが組込まれている
プラスミドをもった菌は、Ｐ２レベルに相当するので、
通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に寄託でき
ない。但し、該プラスミドは東京大学医学部細菌学教室
野本明男博士より分与を受けることができる。
た、ポリオウィルス遺伝子のｃＤＮＡが組込まれている
プラスミドをもった菌は、Ｐ２レベルに相当するので、
通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に寄託でき
ない。但し、該プラスミドは東京大学医学部細菌学教室
野本明男博士より分与を受けることができる。
以上のようにして得られた本発明の環状二重鎖ＤＮＡを
ポリオ生ワクチン製造に適しているアフリカミトリＥｆ
ル腎細胞等にトランスフェクションする（Ｏｍａｔａ、
Ｔ、、ｅｔ ａｌ、：Ｇｅｎｅ： ３２，１（１９８４
））。
ポリオ生ワクチン製造に適しているアフリカミトリＥｆ
ル腎細胞等にトランスフェクションする（Ｏｍａｔａ、
Ｔ、、ｅｔ ａｌ、：Ｇｅｎｅ： ３２，１（１９８４
））。
３３．０〜３４．０℃で培養して型間組換え体ウィルス
を回収し、このウィルスをさらに数代１４Ｈｏ：Ｗｈｏ
、 Ｔｅｃｈ、 Ｒａｐ、 Ｓｅｒ、：６８７．１０７
（１９８３）に示されティる条件下で培養してポリオ生
ワクチンとして使用可能な多聞のウィルス液を得る。
を回収し、このウィルスをさらに数代１４Ｈｏ：Ｗｈｏ
、 Ｔｅｃｈ、 Ｒａｐ、 Ｓｅｒ、：６８７．１０７
（１９８３）に示されティる条件下で培養してポリオ生
ワクチンとして使用可能な多聞のウィルス液を得る。
本発明によれば、従来技術では成し得なかった、Ｓａｂ
ｉ ｎ尻上の遺伝情報を二重鎖ＤＮＡとして改変、保
存することができる。また、得られた型間組換え体ｃＤ
ＮＡにより従来の３ａｂ ｉ ｎ２型、Ｓａｂ ｉ ｎ
３型ワクチン株よりも遺伝的に安定な型間組換え体２型
あるいは３型ウイルスを定常的に得ることができ、ポリ
オ生ワクチン％Ｊ Ｂに有用である。
ｉ ｎ尻上の遺伝情報を二重鎖ＤＮＡとして改変、保
存することができる。また、得られた型間組換え体ｃＤ
ＮＡにより従来の３ａｂ ｉ ｎ２型、Ｓａｂ ｉ ｎ
３型ワクチン株よりも遺伝的に安定な型間組換え体２型
あるいは３型ウイルスを定常的に得ることができ、ポリ
オ生ワクチン％Ｊ Ｂに有用である。
次に本発明を実施例によって更に詳細に説明するが、本
発明はその要旨を越えない限りこれらによって限定され
るものではない。
発明はその要旨を越えない限りこれらによって限定され
るものではない。
実施例１
３図参照）
、ＶＳ（１）ＥＰプラスミド（Ｈｏｍｏｔｏ、 Ａ、
、 ａｔａｔ、： Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、へｃａｄ、
ｓｃｉ、ＬｌｓＡニア９．５７９３（１９８２））１０
μ０を５０μｍの反応液（２０ｍＭＴｒ ｉ ５−ＨＣ
Ｉ ｐＨ７，５，５ｍＭｔＶＩｇＣｌ １ｍＭＤ
ＴＴ）中でＢａ１Ｉ １６ｕと３７℃で２時間反応さ
せた。更に１００ｍＭになるようにＮａＣ１を加え、Ｂ
ａｍＨＩ ２０ｕと３７℃で２時間反応させた後に１
．５％アガロースゲル電気泳動にかけ、約４１０塩基対
のＤＮＡ断片（ＢａｍＨＩ −Ｂａ ｌ 工断片） ヲ
１％ ｔｃ。
、 ａｔａｔ、： Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、へｃａｄ、
ｓｃｉ、ＬｌｓＡニア９．５７９３（１９８２））１０
μ０を５０μｍの反応液（２０ｍＭＴｒ ｉ ５−ＨＣ
Ｉ ｐＨ７，５，５ｍＭｔＶＩｇＣｌ １ｍＭＤ
ＴＴ）中でＢａ１Ｉ １６ｕと３７℃で２時間反応さ
せた。更に１００ｍＭになるようにＮａＣ１を加え、Ｂ
ａｍＨＩ ２０ｕと３７℃で２時間反応させた後に１
．５％アガロースゲル電気泳動にかけ、約４１０塩基対
のＤＮＡ断片（ＢａｍＨＩ −Ｂａ ｌ 工断片） ヲ
１％ ｔｃ。
次にｐＶｓ （２＞２５０３プラスミド（Ｔｏｙｏｄａ
、１１．、ｅｔ ａｌ、：Ｊ、ＨＯｌ、 Ｂｉｏｌ
、：１７４ ．５ら１（１９８４）） ２０μＱを１０
０μρの反応液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ７
，５，５ｍＭＭ０Ｃ１１ｍＭＤＴＴ＞中でＫ ｐ ｎ
ｌ４０ｕと３７℃で２時間反応させた。更に５０ｍＭに
なるようにＮ ａ Ｃｌを加え、ＡａｔＩ［４２ｕ、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ ４０ｕと３７℃で２時間反応させた後
に１．２％アガロースゲル電気泳動にかけ、約６１０塩
基対のＤＮＡ断片（ＨｉｎｄＩ［［−ＡａｔＩＩ断片）
及び約１３４０塩基対のＤＮＡ断片（ＡａｔＩＩ−Ｋｐ
ｎＩ断片）を得た。得られた約６１０塩基対のＤＮＡ断
片を１５μｐの反応液＜２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＩＣＩ
Ｄｔ−１７，５，５ｍＭＭｑｃ ｌ ２．１ｍＭｐＴ
Ｔ＞に溶解し、８ＵのＢａ１Ｉを加え３７°Ｃで２時間
反発後１．５％アガロースゲル電気泳動にかけ、約３０
０塩基対のＤＮＡｌｌ１片（Ｂａ Ｉ Ｉ−ＡａｔＩＩ
断片）を分離回収した。
、１１．、ｅｔ ａｌ、：Ｊ、ＨＯｌ、 Ｂｉｏｌ
、：１７４ ．５ら１（１９８４）） ２０μＱを１０
０μρの反応液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ７
，５，５ｍＭＭ０Ｃ１１ｍＭＤＴＴ＞中でＫ ｐ ｎ
ｌ４０ｕと３７℃で２時間反応させた。更に５０ｍＭに
なるようにＮ ａ Ｃｌを加え、ＡａｔＩ［４２ｕ、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ ４０ｕと３７℃で２時間反応させた後
に１．２％アガロースゲル電気泳動にかけ、約６１０塩
基対のＤＮＡ断片（ＨｉｎｄＩ［［−ＡａｔＩＩ断片）
及び約１３４０塩基対のＤＮＡ断片（ＡａｔＩＩ−Ｋｐ
ｎＩ断片）を得た。得られた約６１０塩基対のＤＮＡ断
片を１５μｐの反応液＜２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＩＣＩ
Ｄｔ−１７，５，５ｍＭＭｑｃ ｌ ２．１ｍＭｐＴ
Ｔ＞に溶解し、８ＵのＢａ１Ｉを加え３７°Ｃで２時間
反発後１．５％アガロースゲル電気泳動にかけ、約３０
０塩基対のＤＮＡｌｌ１片（Ｂａ Ｉ Ｉ−ＡａｔＩＩ
断片）を分離回収した。
更に、 Ｖ Ｓ ２ ／ ｇｐｔ （Ｈｕｌｌｉｇａｎ
、Ｒ，Ｃ，、ｅｔａｌ、： Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八
ｃａｄ、Ｓｃ ｉ 、ＵＳ＾ニア８．２０７２（１９８
１））２０μ０を１００μρの反応液（２０ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣＩ ｐＨ７，５，５ｍＭＭｇＣ１１ｍＭＤＴ
Ｔ）中でＫｐｎＩ ２′− ４０ｕと３７℃で２時間反応させた。次いで１００ｍＭ
になるようにＮａＣｌを加え、ＢａｍＨＩ ２０ｕと
３７℃で２時間反応させた後に１．２％アガロースゲル
電気泳動にかけ、約３７１０塩基対のＤＮＡ断片（Ｂａ
ｍＨＩ−Ｋｌ）ｎＩ断片）を得た。
、Ｒ，Ｃ，、ｅｔａｌ、： Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八
ｃａｄ、Ｓｃ ｉ 、ＵＳ＾ニア８．２０７２（１９８
１））２０μ０を１００μρの反応液（２０ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣＩ ｐＨ７，５，５ｍＭＭｇＣ１１ｍＭＤＴ
Ｔ）中でＫｐｎＩ ２′− ４０ｕと３７℃で２時間反応させた。次いで１００ｍＭ
になるようにＮａＣｌを加え、ＢａｍＨＩ ２０ｕと
３７℃で２時間反応させた後に１．２％アガロースゲル
電気泳動にかけ、約３７１０塩基対のＤＮＡ断片（Ｂａ
ｍＨＩ−Ｋｌ）ｎＩ断片）を得た。
以上のようにして得られたＢａｍＨＩ −Ｂａ ＩＩ断
片０．０３μＯ，Ｂａ ｌ Ｉ−ＡａｔＩＩｆｌ１片０
．０２μＱ、ＡａｔＩＩ−ＫｐｎＩ断片０．０９１１（
Ｊ、Ｂａｍ）−ＩＩ−ＫＤｎＩＫ片０．２１ｚｑを２５
１［）反応液（６６ｍＭＴ ｒ ｉ Ｓ −）−ＩＣ１
ｐＨ７，５，６，６ｍＭＭｑＣ＋ ２．１０ｍＭＤＴＴ
、０．５ｍＭＡＴＰ）中でＴ４ ＤＮＡリガーゼ０．
８ｕと１５℃で４２時間反応させた。
片０．０３μＯ，Ｂａ ｌ Ｉ−ＡａｔＩＩｆｌ１片０
．０２μＱ、ＡａｔＩＩ−ＫｐｎＩ断片０．０９１１（
Ｊ、Ｂａｍ）−ＩＩ−ＫＤｎＩＫ片０．２１ｚｑを２５
１［）反応液（６６ｍＭＴ ｒ ｉ Ｓ −）−ＩＣ１
ｐＨ７，５，６，６ｍＭＭｑＣ＋ ２．１０ｍＭＤＴＴ
、０．５ｍＭＡＴＰ）中でＴ４ ＤＮＡリガーゼ０．
８ｕと１５℃で４２時間反応させた。
この反応物を用いてニジエリシャ・コリＨ８１０１株を
形質転換し、アンピシリン耐性株の中から第３図に示さ
れるように、ＢＢＡＫ／ｐＳ■２プラスミドを単離した
。単離の方法は先に示したＭｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇによった。
形質転換し、アンピシリン耐性株の中から第３図に示さ
れるように、ＢＢＡＫ／ｐＳ■２プラスミドを単離した
。単離の方法は先に示したＭｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇによった。
３図参照）
ｐＳＶ （２） ２５０３ （Ｔｏｙｏｄａ、Ｈ，、ｅ
ｔ ａｌ、：Ｊ。
ｔ ａｌ、：Ｊ。
Ｈｏ１．Ｂｉｏｌ、 ：１７４．５６１（１９８４）＞
２０ ｕ Ｑを１００μ」の反応液（２０ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣＩ ｐＨ７，５，５０ｍＭＮａＣＩ 、５ｍ
Ｍ１ｖｌＣｌ ２．１ｍＭＤＴＴ＞中でＨｉｎｄｌｌ［
４０ｕ。
２０ ｕ Ｑを１００μ」の反応液（２０ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣＩ ｐＨ７，５，５０ｍＭＮａＣＩ 、５ｍ
Ｍ１ｖｌＣｌ ２．１ｍＭＤＴＴ＞中でＨｉｎｄｌｌ［
４０ｕ。
ＰｖｕＩＩ ４０ｕと３７℃で２時間反応させた。
更に１００ｍＭになるようにＮａＣｌを加え、ＥｃｏＲ
Ｉ ４０ｕと３７℃で２時間反応させた後に１．５％
アガロースゲル電気泳動にかけ、約１６９０塩基対のＤ
ＮＡ断片（ＥｃｏＲｌ−ＰＶｕ■断片）と約１３０塩基
対のＤＮＡ断片（ＰｖｕＩＩ−ＰｖｕＩＩ断片）を得た
。得られた約１３０塩基対のＤＮＡ断片を１５μρの反
応液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ７，５，５
ｍＭＭａｃｌ １ｍＭＤＴＴ）に溶解し５ｕのＢａ
ｎＩを加え３７℃で２時間反応後１．５％アガロースゲ
ル電気泳動にかけ、約１１０塩基対のＤＮＡ断片（Ｐｖ
ｕＩＩ−ＢａｎＩ断片）を分離回収した。
Ｉ ４０ｕと３７℃で２時間反応させた後に１．５％
アガロースゲル電気泳動にかけ、約１６９０塩基対のＤ
ＮＡ断片（ＥｃｏＲｌ−ＰＶｕ■断片）と約１３０塩基
対のＤＮＡ断片（ＰｖｕＩＩ−ＰｖｕＩＩ断片）を得た
。得られた約１３０塩基対のＤＮＡ断片を１５μρの反
応液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ７，５，５
ｍＭＭａｃｌ １ｍＭＤＴＴ）に溶解し５ｕのＢａ
ｎＩを加え３７℃で２時間反応後１．５％アガロースゲ
ル電気泳動にかけ、約１１０塩基対のＤＮＡ断片（Ｐｖ
ｕＩＩ−ＢａｎＩ断片）を分離回収した。
次に、ＶＳ （１） Ｉ Ｃ−０（Ｔ） （Ｋｏｈａ
ｒａ、Ｈ，。
ｒａ、Ｈ，。
ｅｔ ａｌ、：Ｖｉｒｏｌｏｏｙ：１５１．２１（１９
８６））２０μＱを１００．１の反応液（２０ｍＭＴｒ
＋ Ｓ −ＨＣｌｐＨ７，５，５ｍＭＭ０ＣＩ
１ｍＭＤＴＴ＞中でＫｐｎＩ ４０ＬＪと３７℃で２
時間反応させた後に１．２％アガロースゲル電気泳動に
かけ、約６００塩基対のＤＮＡ断片（ＫｐｎＩ−Ｋｐｎ
ｌ断片）を得た。得られた約６００塩基対のＤＮＡ断片
を１５μｇの反応液 （２０ｍＭＴｒｉｓ−ｔ−ＩＣＩ ｐＨ７，５，５ｍ
Ｍｆｖｌｏｃｌ １ｍＭＤＴＴ＞に溶解し、１０２
・ ＵのＢａｎＩを加え３７℃で２時間反応後１．５％アガ
ロースゲル電気泳動にかけ約１３０塩基対のＤＮＡ１ｇ
１片（ＢａｎＩ−ＫｐｎＩ断片）ヲ得り。
８６））２０μＱを１００．１の反応液（２０ｍＭＴｒ
＋ Ｓ −ＨＣｌｐＨ７，５，５ｍＭＭ０ＣＩ
１ｍＭＤＴＴ＞中でＫｐｎＩ ４０ＬＪと３７℃で２
時間反応させた後に１．２％アガロースゲル電気泳動に
かけ、約６００塩基対のＤＮＡ断片（ＫｐｎＩ−Ｋｐｎ
ｌ断片）を得た。得られた約６００塩基対のＤＮＡ断片
を１５μｇの反応液 （２０ｍＭＴｒｉｓ−ｔ−ＩＣＩ ｐＨ７，５，５ｍ
Ｍｆｖｌｏｃｌ １ｍＭＤＴＴ＞に溶解し、１０２
・ ＵのＢａｎＩを加え３７℃で２時間反応後１．５％アガ
ロースゲル電気泳動にかけ約１３０塩基対のＤＮＡ１ｇ
１片（ＢａｎＩ−ＫｐｎＩ断片）ヲ得り。
更にｐＳ Ｖ ２ ／ Ｑ ｐｔ （Ｈｕｌｌｉｇａｎ
、Ｒ，Ｃ，、ｅｔａｌ、：Ｐｒｏ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ
、Ｓｃｉ、ＵＳ八へア８．２０７２（１９８１））２
０μＱを１００μ」の反応液（２０ｍＭＴｒ ｉ ｓ
−ＨＣｌ ＤＩ−１７，５，５ｍＭＭｏＣ１１ｍＭ
ＤＴＴ）中でＫｐｎＩ ４Ｑｕと３７℃で２時間反応
させた。次いで１００ｍＭになるようにＮａＣｌを加え
、ＥｃｏＲＩ ３０ｕと３７℃で２時間反応させた後
に１．２％アガロースゲル電気泳動にかけ、約２９６０
塩基対のＤＮＡ断片（ＥＣＯＲＩ−Ｋｐｎｒ断片）を得
た。
、Ｒ，Ｃ，、ｅｔａｌ、：Ｐｒｏ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ
、Ｓｃｉ、ＵＳ八へア８．２０７２（１９８１））２
０μＱを１００μ」の反応液（２０ｍＭＴｒ ｉ ｓ
−ＨＣｌ ＤＩ−１７，５，５ｍＭＭｏＣ１１ｍＭ
ＤＴＴ）中でＫｐｎＩ ４Ｑｕと３７℃で２時間反応
させた。次いで１００ｍＭになるようにＮａＣｌを加え
、ＥｃｏＲＩ ３０ｕと３７℃で２時間反応させた後
に１．２％アガロースゲル電気泳動にかけ、約２９６０
塩基対のＤＮＡ断片（ＥＣＯＲＩ−Ｋｐｎｒ断片）を得
た。
以上のようにして得られたＥｃｏＲＩ−Ｐｖｕ■断片０
．１４μＧ、ｐｖｕＩＩ−ＢａｎＩ断片０．０１μＱ、
ＢａｎＩ−ＫｐｎＩ断片０．０１ｕＱ、ＥＣ０ＲＩ−Ｋ
ｌ）ｎＩ断片０．２４μＱを２５μρの反応液（６６ｍ
ＭＴ ｒ ｉ ｓ −）−１０１ｐＨ７，５，６，６ｍ
ＭＭｇＣｌ １０ｍＭＤＴＴ、０．５ｍＭＡＴＰ）
中でＴ４ ＤＮ△リガーゼ０，８ｕと１５℃で４２時
間反応させた。
．１４μＧ、ｐｖｕＩＩ−ＢａｎＩ断片０．０１μＱ、
ＢａｎＩ−ＫｐｎＩ断片０．０１ｕＱ、ＥＣ０ＲＩ−Ｋ
ｌ）ｎＩ断片０．２４μＱを２５μρの反応液（６６ｍ
ＭＴ ｒ ｉ ｓ −）−１０１ｐＨ７，５，６，６ｍ
ＭＭｇＣｌ １０ｍＭＤＴＴ、０．５ｍＭＡＴＰ）
中でＴ４ ＤＮ△リガーゼ０，８ｕと１５℃で４２時
間反応させた。
この反応物を用いてニジエリシャ・コリ！−Ｉ Ｂ１０
１株を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から第３図
に示されるような、ＥＰＢＫ／ｐＳＶ２プラスミドを単
離した。単離の方法はＮｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇによった。
１株を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から第３図
に示されるような、ＥＰＢＫ／ｐＳＶ２プラスミドを単
離した。単離の方法はＮｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇによった。
、ＶＳ （１）ＩＣ−０（Ｔ）（にｏｈａｒａ、 Ｈ，
、ｅｔａｔ、： Ｖｉｒｏｌｏｇｙ：１５１．２１（１
り８６））２０ ＩＩ Ｑを１００μ乃の反応液（２０
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ １）Ｈ７，５，５０ｍ Ｍ
Ｎ ａ ＣＩ 、５ ｍ Ｍ Ｍ ｇＣＩ ２．１ｍＭ
ＤＴＴ）中でＡａｔＩＩ ３０ｕと３７℃で２時間反
応させた後に１．２％アガロースゲル電気泳動にかけ、
約１２００塩基対と約１３２３０塩基対の２つのＤＮＡ
ｌｆＦｉ片を分離した。約１２００塩基対のＤＮＡ断片
を１５μｐの反応液＜２０ｍｔ’ｖｌＪｒｉｓ−１−１
ｃＩ ｐＨ７，５，１００ｍＭ ＮａＣ１，５ｍＭ
ＭａＣＩ２．１ｍＭＤＴＴ）に溶解し、１０ｕのＢ ａ
ｍ ｔ（Ｉを加え３７℃で２時間反応後１．５％アガ
ロースゲル電気泳動にかけ、約３００塩基対のＤＮＡＩ
ｇｉ片（ＡａｔＩＩ−ＢａｍＨＩ断片）を得た。更ニ約
１３２３０塩基対のＤＮＡ断片を１５μρの反応液（２
０ｍＭ Ｔｉｒｓ−ＨＣＩ ｐＨ７，５，５ｍＭ
Ｍａｉｌ １ｍＭＤＴＴ）に溶解し、１２ｕの
ＫｐｎＩを加え３７℃で２時間反応後１．２％アガロー
スゲル電気泳動にかけ、約１０６９０塩基対のＤＮＡ断
片（ＡａｔｌＩ−ＫｐｎＩ断片）を得た。
、ｅｔａｔ、： Ｖｉｒｏｌｏｇｙ：１５１．２１（１
り８６））２０ ＩＩ Ｑを１００μ乃の反応液（２０
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ １）Ｈ７，５，５０ｍ Ｍ
Ｎ ａ ＣＩ 、５ ｍ Ｍ Ｍ ｇＣＩ ２．１ｍＭ
ＤＴＴ）中でＡａｔＩＩ ３０ｕと３７℃で２時間反
応させた後に１．２％アガロースゲル電気泳動にかけ、
約１２００塩基対と約１３２３０塩基対の２つのＤＮＡ
ｌｆＦｉ片を分離した。約１２００塩基対のＤＮＡ断片
を１５μｐの反応液＜２０ｍｔ’ｖｌＪｒｉｓ−１−１
ｃＩ ｐＨ７，５，１００ｍＭ ＮａＣ１，５ｍＭ
ＭａＣＩ２．１ｍＭＤＴＴ）に溶解し、１０ｕのＢ ａ
ｍ ｔ（Ｉを加え３７℃で２時間反応後１．５％アガ
ロースゲル電気泳動にかけ、約３００塩基対のＤＮＡＩ
ｇｉ片（ＡａｔＩＩ−ＢａｍＨＩ断片）を得た。更ニ約
１３２３０塩基対のＤＮＡ断片を１５μρの反応液（２
０ｍＭ Ｔｉｒｓ−ＨＣＩ ｐＨ７，５，５ｍＭ
Ｍａｉｌ １ｍＭＤＴＴ）に溶解し、１２ｕの
ＫｐｎＩを加え３７℃で２時間反応後１．２％アガロー
スゲル電気泳動にかけ、約１０６９０塩基対のＤＮＡ断
片（ＡａｔｌＩ−ＫｐｎＩ断片）を得た。
次に上記Ａで得られた ＢＢＡＫ／、ＳＶ２プラスミド
５μｑを５０μ９の反応液 （２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ７，５，５ｍＭＭ
ｑＣｌ １ｍＭＤＴＴ）中でＫｐｎＩ２ゝ １０ｕと３７℃で２時間反応させた。これに１００ｍＭ
になるようにＮａＣＩを加え３ａｍＨＩ １０ｕと３
７℃で２時間反応後１．２％アガロースゲル電気泳動に
かけ、約２０７０塩基対のＤＮＡ断片（ＢａｍＨＩ−Ｋ
ｐｎＩｆｇｉ片）を得た。
５μｑを５０μ９の反応液 （２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ７，５，５ｍＭＭ
ｑＣｌ １ｍＭＤＴＴ）中でＫｐｎＩ２ゝ １０ｕと３７℃で２時間反応させた。これに１００ｍＭ
になるようにＮａＣＩを加え３ａｍＨＩ １０ｕと３
７℃で２時間反応後１．２％アガロースゲル電気泳動に
かけ、約２０７０塩基対のＤＮＡ断片（ＢａｍＨＩ−Ｋ
ｐｎＩｆｇｉ片）を得た。
更に上記Ｂで得られた ＥＰＢＫ／ｐＳＶ２プラスミド
５μｑを５０μＡの反応液 （２０ｍＭＴｒ ｉ ｓ −ＨＣＩ 、５ｍＭＭｇＣＩ
２．１ｍＭＤＴＴ）中でＫｐｎＩ １０ｕと３７℃
で２時間反応後１．２％アガロースゲル電気泳動にかけ
、約１４００塩基対のＤＮＡ断片（ＫｐｎＩ−ＫｐｎＩ
断片）を得た。
５μｑを５０μＡの反応液 （２０ｍＭＴｒ ｉ ｓ −ＨＣＩ 、５ｍＭＭｇＣＩ
２．１ｍＭＤＴＴ）中でＫｐｎＩ １０ｕと３７℃
で２時間反応後１．２％アガロースゲル電気泳動にかけ
、約１４００塩基対のＤＮＡ断片（ＫｐｎＩ−ＫｐｎＩ
断片）を得た。
以上のようにして得られたＢａｍ）−ＩＩ−Ｋｐｎ■断
片０．０６μＱ、ＫｐｎＩ−ＫｐｎＩ断片０．０４μ０
１ＡａｔＩＩ−ＢａｍＨＩ断片０．００８μＱ１Δａｔ
Ｉ［−ＫｐｎＩ断片０．３μｑを２５１！の反応液（６
６ｍＭＴｒ ｉ ｓ −ＨＣｌ ｐＨ７，５，６，６
ｍＭＭｏＣＩ ２．１０ｍＭＤＴＴ、１ｍＭＡＴＰ）中
でＴ４ＤＮＡリガーゼ０．８ｕと１５℃で２８時間反応
させた。この反応物を用いてニジエリシャ・コリ８８１
０１株を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から第３
図に示されるような、ＶＳＳ （１／２）ＢＢプラスミ
ドをＭｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ニ示されて
いる方法で単離した。このｃＤＮΔの構造は第４図に示
した。
片０．０６μＱ、ＫｐｎＩ−ＫｐｎＩ断片０．０４μ０
１ＡａｔＩＩ−ＢａｍＨＩ断片０．００８μＱ１Δａｔ
Ｉ［−ＫｐｎＩ断片０．３μｑを２５１！の反応液（６
６ｍＭＴｒ ｉ ｓ −ＨＣｌ ｐＨ７，５，６，６
ｍＭＭｏＣＩ ２．１０ｍＭＤＴＴ、１ｍＭＡＴＰ）中
でＴ４ＤＮＡリガーゼ０．８ｕと１５℃で２８時間反応
させた。この反応物を用いてニジエリシャ・コリ８８１
０１株を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から第３
図に示されるような、ＶＳＳ （１／２）ＢＢプラスミ
ドをＭｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ニ示されて
いる方法で単離した。このｃＤＮΔの構造は第４図に示
した。
実施例２
照）
ｐＶＳ （１）ＩＣ−０（Ｔ）プラスミド（ＫＯｈ−ａ
ｒａ、Ｈ，、ｅｔ ａｔ、： Ｖｉｒｏｌｏｇｙ：１５
１ ．２１（１９８６））２０μ９を１００ｉの反応液
（２０ｍＭＴｒ ｉ ｓ −ＨＣｌ ｐＨ７，５，５
ｍＭＭ０ＣＩ ５０Ｓ ｍＭＮａｃＩ、１ｍＭＤＴＴ）中でＡａｔＩ［３０Ｕと
３７℃で１時間反応させた。更に１００ｍＭになるよう
にＮａＣｌを加えＢｓｔＥＩＩ３０Ｕと３７℃で２時間
反応させた後に１．２％アガロースゲル電気泳動にかけ
た。約１１９５塩基対のＤＮＡ断片を回収し、これを２
０μｍの反応 液 （２０ｍＭＴｒ ｉ ５−
ＨＣＩ ｐＨ７，５，５ｍＭＭ０ＣＩ １
ｍＭＤＴＴ）に溶解した。
ｒａ、Ｈ，、ｅｔ ａｔ、： Ｖｉｒｏｌｏｇｙ：１５
１ ．２１（１９８６））２０μ９を１００ｉの反応液
（２０ｍＭＴｒ ｉ ｓ −ＨＣｌ ｐＨ７，５，５
ｍＭＭ０ＣＩ ５０Ｓ ｍＭＮａｃＩ、１ｍＭＤＴＴ）中でＡａｔＩ［３０Ｕと
３７℃で１時間反応させた。更に１００ｍＭになるよう
にＮａＣｌを加えＢｓｔＥＩＩ３０Ｕと３７℃で２時間
反応させた後に１．２％アガロースゲル電気泳動にかけ
た。約１１９５塩基対のＤＮＡ断片を回収し、これを２
０μｍの反応 液 （２０ｍＭＴｒ ｉ ５−
ＨＣＩ ｐＨ７，５，５ｍＭＭ０ＣＩ １
ｍＭＤＴＴ）に溶解した。
２ゝ
これに４．８ｕの３ａｌＩを加え３７℃で２時間反応さ
せた後に１．５％アガロースゲル゛心気泳動にかけ約７
００塩基対のＤＮＡ断片（ΔａｔＩＩ−ＢａｌＩ断片）
を？また。
せた後に１．５％アガロースゲル゛心気泳動にかけ約７
００塩基対のＤＮＡ断片（ΔａｔＩＩ−ＢａｌＩ断片）
を？また。
次に、。ＶＳ （３）２６０３プラスミド（Ｔｏｙ−ｏ
ｄａ、１１．、ｅｔ ａｌ、：Ｊ、Ｈｏ１．Ｂｉｏｌ、
：１７４．５６１（１９８４）） ５μｑを５０．ｉの
反応液（２０ｍＭＴｒ ｉ ｓ −ＨＣｌ ｐＨ７
，５，５ｍＭＭａＣｌ ５０Ｓ ｍＭＮａＣＩ 、１ｍＭＤＴＴ）中でＨｉｎｃｌｍｌｏ
ｕと３７℃で１時間反応させた。更に１５０ｒｒ＋Ｍに
なるようにＮａＣＩを加え、Ｎｄｅ１１２ｕと３７℃で
２時間反応させた後に１．２％アガロースゲル電気泳動
にかけ、約１０７０塩基対と約１７９０塩基対のＤＮＡ
断片を回収した。
ｄａ、１１．、ｅｔ ａｌ、：Ｊ、Ｈｏ１．Ｂｉｏｌ、
：１７４．５６１（１９８４）） ５μｑを５０．ｉの
反応液（２０ｍＭＴｒ ｉ ｓ −ＨＣｌ ｐＨ７
，５，５ｍＭＭａＣｌ ５０Ｓ ｍＭＮａＣＩ 、１ｍＭＤＴＴ）中でＨｉｎｃｌｍｌｏ
ｕと３７℃で１時間反応させた。更に１５０ｒｒ＋Ｍに
なるようにＮａＣＩを加え、Ｎｄｅ１１２ｕと３７℃で
２時間反応させた後に１．２％アガロースゲル電気泳動
にかけ、約１０７０塩基対と約１７９０塩基対のＤＮＡ
断片を回収した。
約１１０７０Ｊ基対のＤＮＡ断片を２０μＱの反応液（
２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ７，５，５ｍＭＭｑ
Ｃ１１ｍＭＤＴＴ）に溶解し、４．８ｕのＢａ１Ｉを加
え３７℃で２時間反応後１．５％アガロースゲル電気泳
動にか【ノ、約９５０塩基対のＤＮＡ断片（Ｂａ Ｉ
Ｉ −ＮｄｅＩ断片）を得た。更に約１７９０塩基対の
ＤＮＡ断片も２０μｍの反応液（２０ｍＭＴｒ ｉ ｓ
−ＨＣｌ ｐＨ７，５，５ｍＭｔ’ｖ４ｑＣＩ
１５０２ゝ ｍＭＮａｃ Ｉ 、１ｍＭＤＴＴ＞に溶解し、１０ｕの
ｐｓｔＩを加え３７℃で２時間反応後１．５％アガロー
スゲル電気泳動にかけ、約１０３０塩基対のＤＮＡ断片
（ＮｄｅＩ−ＰｓｔＩ断片）と約７６０塩基対のＤＮＡ
断片（ＰｓｔＩ−Ｎｄｅ■断片）を得た。
２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ７，５，５ｍＭＭｑ
Ｃ１１ｍＭＤＴＴ）に溶解し、４．８ｕのＢａ１Ｉを加
え３７℃で２時間反応後１．５％アガロースゲル電気泳
動にか【ノ、約９５０塩基対のＤＮＡ断片（Ｂａ Ｉ
Ｉ −ＮｄｅＩ断片）を得た。更に約１７９０塩基対の
ＤＮＡ断片も２０μｍの反応液（２０ｍＭＴｒ ｉ ｓ
−ＨＣｌ ｐＨ７，５，５ｍＭｔ’ｖ４ｑＣＩ
１５０２ゝ ｍＭＮａｃ Ｉ 、１ｍＭＤＴＴ＞に溶解し、１０ｕの
ｐｓｔＩを加え３７℃で２時間反応後１．５％アガロー
スゲル電気泳動にかけ、約１０３０塩基対のＤＮＡ断片
（ＮｄｅＩ−ＰｓｔＩ断片）と約７６０塩基対のＤＮＡ
断片（ＰｓｔＩ−Ｎｄｅ■断片）を得た。
次に、ｐＵｏｌ ８プラスミド（Ｒｏｂｅｒｔｓ、 Ｒ
，Ｊ、 ：Ｎｕｃｌｅｉｃ 八ｃｉｄｓ Ｒｅｓ、
１２．１６７（１９８４）＞ ２ μ ｑ を ２
０ｕｇの反応液（２０ｒｎＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ
７，５，５ｍＭＭ０ＣＩ ５０ｍＭＮａＣ１、Ｓ １ｍＭＤＴＴ＞中ｔ”ＡａｔＩ １１ｕと３７℃で１
時間反応させ、さらに１５０ｍＭになるようにＮａＣＩ
を加えＮｄｅＩ ５ｕと３７℃で２時間反応させた。
，Ｊ、 ：Ｎｕｃｌｅｉｃ 八ｃｉｄｓ Ｒｅｓ、
１２．１６７（１９８４）＞ ２ μ ｑ を ２
０ｕｇの反応液（２０ｒｎＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ
７，５，５ｍＭＭ０ＣＩ ５０ｍＭＮａＣ１、Ｓ １ｍＭＤＴＴ＞中ｔ”ＡａｔＩ １１ｕと３７℃で１
時間反応させ、さらに１５０ｍＭになるようにＮａＣＩ
を加えＮｄｅＩ ５ｕと３７℃で２時間反応させた。
これを１．２％アガロースゲル電気泳動にかけ約２４３
０塩基対のＤＮＡ断片（△ａｔｌｌ−ＮｄｅＩ！Ｉｉ片
）を得た。
０塩基対のＤＮＡ断片（△ａｔｌｌ−ＮｄｅＩ！Ｉｉ片
）を得た。
以上のようにして得られたＡａｔ［−ＢａｌＩ断片０．
０７μＧ、Ｂａ ｌ Ｉ−ＮｄｅＩ断片０、ｏ９μｑ及
びＡａｔＩＩ−ＮｄｅＩ断片０．２４１１０を２５μｇ
の反応液（６６ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ７，５，
６，６ｍＭＭｑＣｌ １０ｍＭＤＴＴ、０．５ｍＭ
ＡＴＰ）Ｓ 中で７４ ＤＮＡリガーゼ０．８ｕと１５℃で９１時
間反応させた。この反応物を用いてニジエリシャ・コリ
ＪＭ１０９株を形質転換し、アンピシリン耐性株の中か
ら第１図に示されるようにｐＡＢＮ／１８プラスミドを
ｔ（ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇに示されている
方法で単離した。
０７μＧ、Ｂａ ｌ Ｉ−ＮｄｅＩ断片０、ｏ９μｑ及
びＡａｔＩＩ−ＮｄｅＩ断片０．２４１１０を２５μｇ
の反応液（６６ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ７，５，
６，６ｍＭＭｑＣｌ １０ｍＭＤＴＴ、０．５ｍＭ
ＡＴＰ）Ｓ 中で７４ ＤＮＡリガーゼ０．８ｕと１５℃で９１時
間反応させた。この反応物を用いてニジエリシャ・コリ
ＪＭ１０９株を形質転換し、アンピシリン耐性株の中か
ら第１図に示されるようにｐＡＢＮ／１８プラスミドを
ｔ（ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇに示されている
方法で単離した。
ｐＶＳ（１）ＢＢ２プラスミド（Ｎｏｍｏｔｏ、 Ａ、
、 ｅｔａｔ、： Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、ＵＳＡニア９．５７９３（１９８２））３μ９
を３０μρの反応液（２０ｍＭＴｒ ｉ ｓ −ＨＣｌ
ｐＨ７，５，５ｍＭｔＶＩＣｌ １５０ｍＭＮ
ａｃＩ、１ｍＭＤＴＴ）中でＮｄｅＩ ６ｕ１Ｘｂａ
■ ８ｕと３７℃で２時間反応させた後に１．２％アガ
ロースゲル電気泳動にかけ約２００塩基対のＤＮＡ断片
（ＮｄｅＩ−ＸｂａＩ断片）を得た。
、 ｅｔａｔ、： Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、ＵＳＡニア９．５７９３（１９８２））３μ９
を３０μρの反応液（２０ｍＭＴｒ ｉ ｓ −ＨＣｌ
ｐＨ７，５，５ｍＭｔＶＩＣｌ １５０ｍＭＮ
ａｃＩ、１ｍＭＤＴＴ）中でＮｄｅＩ ６ｕ１Ｘｂａ
■ ８ｕと３７℃で２時間反応させた後に１．２％アガ
ロースゲル電気泳動にかけ約２００塩基対のＤＮＡ断片
（ＮｄｅＩ−ＸｂａＩ断片）を得た。
次にｐｕ０１８プラスミド＜ｉ￥ｉ述）２μＧを２０μ
ｍの反応液（２０ｍＭＴ ｒ ｉ Ｓ −ＨＣｌｐＨ７
，５，５ｍＭＭ０ＣＩ １５０ｍＭ２ゝ ＮａＣＩ 、１ｍＭＤＴＴ）中でＰｓｔＩ １０ｕ。
ｍの反応液（２０ｍＭＴ ｒ ｉ Ｓ −ＨＣｌｐＨ７
，５，５ｍＭＭ０ＣＩ １５０ｍＭ２ゝ ＮａＣＩ 、１ｍＭＤＴＴ）中でＰｓｔＩ １０ｕ。
ＸｂａＩ ８ｕと３７℃で２時間反応させた後に１．
２％アガロースゲル電気泳動にかけ約２６７０塩基対の
ＤＮＡ断片（ＰｓｔＩ−Ｘｂａ■断片）を得た。
２％アガロースゲル電気泳動にかけ約２６７０塩基対の
ＤＮＡ断片（ＰｓｔＩ−Ｘｂａ■断片）を得た。
以上のようにして得られたＮｄｅＩ−Ｘｂａ：［断片０
．０２μＱ −Ｐ ｓ ｔ Ｉ −Ｘ ｂ ａ Ｉ断片
０．３μｑ１及び上記ＡでｐＶＳ （３）２６０３プラ
スミドより得られた約７６０塩基対のＰｓｔＩ−Ｎｄｅ
Ｉ断片０．０８ｕＣＪを２０１１ｆＪの反応液（６６ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ７，５，６，６ｍＭＭｑＣ
Ｉ １０ｍＭＤＴＴ、０．５υ ｍＭＡＴＰ）中ｒＴ４ ＤＮＡリガーゼ０．８ｕと１
５°Ｃで９１時間反応させた。この反応物を用いてエシ
エリシＶ・コリＪＭ１０９株を形質転換し、アンピシリ
ン耐性株の中から第１図に示されるようにＤＰＮＸ／１
８プラスミドを単離した。
．０２μＱ −Ｐ ｓ ｔ Ｉ −Ｘ ｂ ａ Ｉ断片
０．３μｑ１及び上記ＡでｐＶＳ （３）２６０３プラ
スミドより得られた約７６０塩基対のＰｓｔＩ−Ｎｄｅ
Ｉ断片０．０８ｕＣＪを２０１１ｆＪの反応液（６６ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ７，５，６，６ｍＭＭｑＣ
Ｉ １０ｍＭＤＴＴ、０．５υ ｍＭＡＴＰ）中ｒＴ４ ＤＮＡリガーゼ０．８ｕと１
５°Ｃで９１時間反応させた。この反応物を用いてエシ
エリシＶ・コリＪＭ１０９株を形質転換し、アンピシリ
ン耐性株の中から第１図に示されるようにＤＰＮＸ／１
８プラスミドを単離した。
、ＶＳ （１）ＩＣ−０（Ｔ）プラスミド（にｏｈａｒ
ａ、Ｈ，、ｅｔ ａｌ、：Ｖｉｒｏｌｏｇｙ：１５１．
２１（１９８６）１０μｑを１００μ、Ｑの反応液（２
０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ７，５，５ｍＭｆｖ
ｔｏｃＩ ５０ｍＭＮａＣ１，１ｍＭＤＴＴ）中
ｒＡａｔｌ［１５ｕ、ＢａｎＩｔ １６ｕと３７℃で
２時間反応させた後に１．２％アガロースゲル電気泳動
にかけ約１０８１０塩基対のＤＮＡ１片＜ＡａｔＩＩ−
Ｂａｎｆｆ断片）ヲ得り。
ａ、Ｈ，、ｅｔ ａｌ、：Ｖｉｒｏｌｏｇｙ：１５１．
２１（１９８６）１０μｑを１００μ、Ｑの反応液（２
０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ７，５，５ｍＭｆｖ
ｔｏｃＩ ５０ｍＭＮａＣ１，１ｍＭＤＴＴ）中
ｒＡａｔｌ［１５ｕ、ＢａｎＩｔ １６ｕと３７℃で
２時間反応させた後に１．２％アガロースゲル電気泳動
にかけ約１０８１０塩基対のＤＮＡ１片＜ＡａｔＩＩ−
Ｂａｎｆｆ断片）ヲ得り。
次に上記Ａで得られたｐＡＢＮ／１８プラスミド５μ９
を３０ｕｇの反応液（２０ｍＭＴｒ ｉ ５−ＨＣＩ
ｐＨ７，５，５ｍＭＭａＣＩ ２．１００ｍＭＮａＣ
ｌ、１ｍＭＤＴＴ）中でＡａｔＩ［１０ｕ１ＮｄｅＩ
１２ｕと３７℃で２時間反応させた後に１．３％アガ
ロースゲル電気泳動にかけ約１６５０塩基対のＤＮＡ断
片（ＡａｔＩ［−ＮｄｅＩ断片）ヲ得り。
を３０ｕｇの反応液（２０ｍＭＴｒ ｉ ５−ＨＣＩ
ｐＨ７，５，５ｍＭＭａＣＩ ２．１００ｍＭＮａＣ
ｌ、１ｍＭＤＴＴ）中でＡａｔＩ［１０ｕ１ＮｄｅＩ
１２ｕと３７℃で２時間反応させた後に１．３％アガ
ロースゲル電気泳動にかけ約１６５０塩基対のＤＮＡ断
片（ＡａｔＩ［−ＮｄｅＩ断片）ヲ得り。
更に上記Ｂで得られた。ＰＮＸ／１８プラスミド４０μ
ｑを１０．０１１の反応液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ
、５ｍＭＭ０ＣＩ ５０ｍＭ２ゝ ＮａＣｌ、１ｍＭＤＴＴ＞中でＢ ａ ｎ ＩＩ ６
０ ｕと３７℃で２時間反応させた。これに１５０ｍＭ
になるようにＮａＣｌを加え、ＰｓｔＩ ５ｕと３７
℃で４０分間反応させた後に１．３％アガロ−スゲルミ
気泳動にかけ約９１０塩基対のＤＮＡ所片（ＰＳｔＩ−
ＢａｎＩＩ１ｇｉ片）を得た。
ｑを１０．０１１の反応液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ
、５ｍＭＭ０ＣＩ ５０ｍＭ２ゝ ＮａＣｌ、１ｍＭＤＴＴ＞中でＢ ａ ｎ ＩＩ ６
０ ｕと３７℃で２時間反応させた。これに１５０ｍＭ
になるようにＮａＣｌを加え、ＰｓｔＩ ５ｕと３７
℃で４０分間反応させた後に１．３％アガロ−スゲルミ
気泳動にかけ約９１０塩基対のＤＮＡ所片（ＰＳｔＩ−
ＢａｎＩＩ１ｇｉ片）を得た。
以上のようにして得られたＡａｔＩ［−ＢａｎＩＩ断片
０．３μＱ、ＡａｔＩＩ−ＮｄｅＩ断片０．０５μＱ、
ＰｓｔＩ−ＢａｎＩ［断片０．０２５／、（Ｑ及び上記
ＡでｐｖＳ（３）２６０３プラスミドより得られた約１
０３０塩基対のＮｄｅＩ−ＰＳｔＩ断片０．ｏａμｏを
２０μ」の反応液（６６ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ
７，５，６，６ｍＭＭｏＣ１１０ｍＭＤＴＴ。
０．３μＱ、ＡａｔＩＩ−ＮｄｅＩ断片０．０５μＱ、
ＰｓｔＩ−ＢａｎＩ［断片０．０２５／、（Ｑ及び上記
ＡでｐｖＳ（３）２６０３プラスミドより得られた約１
０３０塩基対のＮｄｅＩ−ＰＳｔＩ断片０．ｏａμｏを
２０μ」の反応液（６６ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ
７，５，６，６ｍＭＭｏＣ１１０ｍＭＤＴＴ。
２箋
１ｍＭＡＴＰ）中でＴ４ ＤＮＡリガーゼ０．４Ｕと
１５℃で４６時間反応させた。この反応物を用いてニジ
エリシャ・コリＨ８１０１株を形質転換し、アンピシリ
ン耐性株の中から第１図に示されるように型間組換え体
、ＶＳＳ （１／３）ＢＮプラスミドを単離した。この
ｃＤＮ’Ａの構造を第２図に示した。
１５℃で４６時間反応させた。この反応物を用いてニジ
エリシャ・コリＨ８１０１株を形質転換し、アンピシリ
ン耐性株の中から第１図に示されるように型間組換え体
、ＶＳＳ （１／３）ＢＮプラスミドを単離した。この
ｃＤＮ’Ａの構造を第２図に示した。
実施例３
■、型間組換え休 イルスの回収
アフリカミドリザルＷ （ＡＧＭＫ）ｌ胞を５％新新生
面血清含むドゥルベツコー改変イーグルＭＥＭ培地中で
６ ｃｔｎ径のシャーレにおいて培養増殖させた。尚、
方法はＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓｆ
ｏｒ Ｖｉｒａｌ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌ ａｎｄ
ＣｈｌａｍｙｄｉａｌＩｎｆｅｃｔｉｏｎｓ、５ｔｈ
Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９７９） ｅｄ、ｂｙ Ｌｅｎｎｅ
ｔｔｅ。
面血清含むドゥルベツコー改変イーグルＭＥＭ培地中で
６ ｃｔｎ径のシャーレにおいて培養増殖させた。尚、
方法はＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓｆ
ｏｒ Ｖｉｒａｌ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌ ａｎｄ
ＣｈｌａｍｙｄｉａｌＩｎｆｅｃｔｉｏｎｓ、５ｔｈ
Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９７９） ｅｄ、ｂｙ Ｌｅｎｎｅ
ｔｔｅ。
Ｅ、Ｈ，、Ｓｃｈｍｉｄｔ、Ｎ、ｊ、、 （以下単に
Ｄ ｔａｇｎｏｓｔ １ｃＰｒｏｃｅｄｕｒｅｓと称す
る）に示されている方法に従った。次に実施例１あるい
は２のＣで得られたｐＶＳＳ （１／２）ＢＢあるいは
。ＶＳＳ （１／３）ＢＮプラスミド１０μｑをリン酸
カルシウム法（０ｎａｔａ、 Ｔ、 、 ａｔ ａｔ、
：Ｇｅｎｅ： ３２．１（１９８４））によりシャー
レに培養した細胞に取込ませた。このシャーレを３３．
０〜３４．０℃で３〜４日間培養し、増殖してくる型間
組換え体ウィルスＰＶＩ／２ （ＳＳ）ＢＢあるいはＰ
ＶＩ／３ （８８）ＢＮを回収した。この回収されたウ
ィルスを更にｍｏｉｌＱ 〜１０−４でＡＧＭＫ細胞
に接種し、３３．０〜３４．０℃で培養を行ない、多量
のウィルス液を作製した。
Ｄ ｔａｇｎｏｓｔ １ｃＰｒｏｃｅｄｕｒｅｓと称す
る）に示されている方法に従った。次に実施例１あるい
は２のＣで得られたｐＶＳＳ （１／２）ＢＢあるいは
。ＶＳＳ （１／３）ＢＮプラスミド１０μｑをリン酸
カルシウム法（０ｎａｔａ、 Ｔ、 、 ａｔ ａｔ、
：Ｇｅｎｅ： ３２．１（１９８４））によりシャー
レに培養した細胞に取込ませた。このシャーレを３３．
０〜３４．０℃で３〜４日間培養し、増殖してくる型間
組換え体ウィルスＰＶＩ／２ （ＳＳ）ＢＢあるいはＰ
ＶＩ／３ （８８）ＢＮを回収した。この回収されたウ
ィルスを更にｍｏｉｌＱ 〜１０−４でＡＧＭＫ細胞
に接種し、３３．０〜３４．０℃で培養を行ない、多量
のウィルス液を作製した。
■、型間組換え体 イルスの生物学的試験以下の試験方
法はＥＬＩＳＡ試験を除いたほかは全てＷ ＨＯ： Ｗ
ｈｏ、Ｔｅｃｈ、ＩｔｅＤ、Ｓｅｒ、 ：６８７ 、１
０７（１９８３）に示されている方法に従った。
法はＥＬＩＳＡ試験を除いたほかは全てＷ ＨＯ： Ｗ
ｈｏ、Ｔｅｃｈ、ＩｔｅＤ、Ｓｅｒ、 ：６８７ 、１
０７（１９８３）に示されている方法に従った。
まず、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を用
いたＥＬＩＳＡ試Ｍ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｐｒｏｃ
−ｅｄｕｒｅｓ ）では第５図、第６図に示したように
型間組換え体ウィルスＰＶ１／２ （８８）ＢＢは２型
をＰＶＩ／３ （８３）ＢＮは３型を示した。また型特
異的抗血清を用いた中和試論でも下記の第１表、第２表
に示したようにＰＶＩ／２ ＜８８）ＢＢは２型をＰＶ
１／３ （８８）ＢＮは３型を示した。温度感受性は下
記の第３表、第５表に示したようにＰｖ１／２（ＳＳ）
ＢＢは２型ワクチンであるＦ−２０９と同等、ＰＶＩ／
３ （８３）ＢＮは３型ワクチンであるＦ−３１０より
も強く、１型親株であるＰＶｌ （Ｓａｂ）ＩＣ−０（
ＴＡ）と同程度であった。カニクイザルを髄内接種によ
るサル神経毒力試験では下記の第４表、第５表に示した
ようにＰＶＩ／２ （８８）ＢＢ、ＰＶＩ／３ （ＳＳ
）ＢＮともに現行のワクチンと同程度かあるいはそれよ
りも低い病変指数を示した。更に遺伝的安定性をみるた
めに３７．５℃でアフリカミドリプル腎細胞による連続
継代を１０回行ない０．３．５．７．１０代継代したウ
ィルスについてｒｃｔマーカー試験を行なった。その結
果を第７図、第８図に示したがＰＶ１／２ （８８）Ｂ
Ｂは少し、ＰＶＩ／３ （８８）ＢＮは格段に現行のワ
クチン株よりも安定であった。
いたＥＬＩＳＡ試Ｍ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｐｒｏｃ
−ｅｄｕｒｅｓ ）では第５図、第６図に示したように
型間組換え体ウィルスＰＶ１／２ （８８）ＢＢは２型
をＰＶＩ／３ （８３）ＢＮは３型を示した。また型特
異的抗血清を用いた中和試論でも下記の第１表、第２表
に示したようにＰＶＩ／２ ＜８８）ＢＢは２型をＰＶ
１／３ （８８）ＢＮは３型を示した。温度感受性は下
記の第３表、第５表に示したようにＰｖ１／２（ＳＳ）
ＢＢは２型ワクチンであるＦ−２０９と同等、ＰＶＩ／
３ （８３）ＢＮは３型ワクチンであるＦ−３１０より
も強く、１型親株であるＰＶｌ （Ｓａｂ）ＩＣ−０（
ＴＡ）と同程度であった。カニクイザルを髄内接種によ
るサル神経毒力試験では下記の第４表、第５表に示した
ようにＰＶＩ／２ （８８）ＢＢ、ＰＶＩ／３ （ＳＳ
）ＢＮともに現行のワクチンと同程度かあるいはそれよ
りも低い病変指数を示した。更に遺伝的安定性をみるた
めに３７．５℃でアフリカミドリプル腎細胞による連続
継代を１０回行ない０．３．５．７．１０代継代したウ
ィルスについてｒｃｔマーカー試験を行なった。その結
果を第７図、第８図に示したがＰＶ１／２ （８８）Ｂ
Ｂは少し、ＰＶＩ／３ （８８）ＢＮは格段に現行のワ
クチン株よりも安定であった。
以上のことより、本発明による型間組換え体ウィルスＰ
Ｖ１／２ （３８）ＢＢ及びＰＶ１／３（８３）ＢＮは
従来の３ａｂｉｎ２型、３ａｂ ｉ ｎ３型株の弱毒性
の不安定性及び尻上の消失といった問題点を払拭した新
しい生ワクチン株として有用であることがわかる。
Ｖ１／２ （３８）ＢＢ及びＰＶ１／３（８３）ＢＮは
従来の３ａｂｉｎ２型、３ａｂ ｉ ｎ３型株の弱毒性
の不安定性及び尻上の消失といった問題点を払拭した新
しい生ワクチン株として有用であることがわかる。
サル神経毒力′ｔ、ｗ＆
ウィルス サル マヒ発生 病変指数 平均
１Ｆ−２０９１０，４００，４８ ２１，１６ ３０，１４ ４−０，７５ ５０，２２ ６０，２１ ＰＶ１／２（ＳＳＩＢＢ １
０．５２ ０．４２２＋０．０６ ３ ０．３１ ４ ｏ、ａｓ５
０＋５３ ６ − ０．２６ Ｆ−２０９：２盟ワクチン ＰＶＩ／２（！ｉ！Ｉ）ＢＢ：ｆｆ１ｍｊ体’ｙ４ルス
１Ｆ−２０９１０，４００，４８ ２１，１６ ３０，１４ ４−０，７５ ５０，２２ ６０，２１ ＰＶ１／２（ＳＳＩＢＢ １
０．５２ ０．４２２＋０．０６ ３ ０．３１ ４ ｏ、ａｓ５
０＋５３ ６ − ０．２６ Ｆ−２０９：２盟ワクチン ＰＶＩ／２（！ｉ！Ｉ）ＢＢ：ｆｆ１ｍｊ体’ｙ４ルス
第１及び第３図は本発明の環状二重鎖ＤＮＡの作製例を
示す図である。 第２及び第４図は組換え体プラスミドの遺伝子構造を示
す図である。 第５及び第６図は組換え体ウィルスと参照ウィルスの
ＥＬＩＳＡ試験の結果を示すグラフである。 第７及び第８図は連続継代による温度感受性の変化を示
すグラフである。 出願人代理人 ＦＬ 藤 −雄Ｂ素抗体法によ
る組換えイ Ａ ａｂｃ ａｂｃ ａｂｃ抗−ｐｖｉ
抗−ＰＶ２ ゛抗−ＰＶ３モノクローナル抗体 本ウィルスの型同定試験 ［１ｍ ：ＰＶｌ（Ｓａｂｌ工Ｃ−０（１型ｍ株）ａｂ
ｃ ａｂｃ ａｂｃ 抗−ＰＶＩ 抗−ＰＶ２ 抗−ＰＶ３ポリクロ
ーナル抗体 酵素抗体法による組換え体ライ１ 抗−ＰＶｌ抗−ＰＶ２ｍ 抗−ＰＶ３モノクローナル
抗体 ｊレスの型同定試験 口： ＰＶｌ （Ｓａｂ ）工Ｃ−０（ｌ型親株）抗−
ＰＶｌ 抗−ＰＶ２ 抗−ＰＶ３ポリクローナ
ル抗体 １ｏ９．ｏ差 ３６／３９．０ １ｏｇ１ｏ差 ３６／Ｆ９．５ に’ｌｏｇ
差 ３６７３９．０ ）−７
を 手続補正書坊式） ％式％ １、事件の表示 昭和６１年特許願第２４２６９４号 ２、発明の名称 環状二重鎖ＤＮＡ、それを含む微生物、それらを用いる
型間組換え体ウィルスの製造法及び得られた型間組換え
体ウィルス ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 財団法人 日本ポリオ研究所 ４、代 理 人 （郵便番号１００） 昭和６２年１月７日 ７、補正の内容
示す図である。 第２及び第４図は組換え体プラスミドの遺伝子構造を示
す図である。 第５及び第６図は組換え体ウィルスと参照ウィルスの
ＥＬＩＳＡ試験の結果を示すグラフである。 第７及び第８図は連続継代による温度感受性の変化を示
すグラフである。 出願人代理人 ＦＬ 藤 −雄Ｂ素抗体法によ
る組換えイ Ａ ａｂｃ ａｂｃ ａｂｃ抗−ｐｖｉ
抗−ＰＶ２ ゛抗−ＰＶ３モノクローナル抗体 本ウィルスの型同定試験 ［１ｍ ：ＰＶｌ（Ｓａｂｌ工Ｃ−０（１型ｍ株）ａｂ
ｃ ａｂｃ ａｂｃ 抗−ＰＶＩ 抗−ＰＶ２ 抗−ＰＶ３ポリクロ
ーナル抗体 酵素抗体法による組換え体ライ１ 抗−ＰＶｌ抗−ＰＶ２ｍ 抗−ＰＶ３モノクローナル
抗体 ｊレスの型同定試験 口： ＰＶｌ （Ｓａｂ ）工Ｃ−０（ｌ型親株）抗−
ＰＶｌ 抗−ＰＶ２ 抗−ＰＶ３ポリクローナ
ル抗体 １ｏ９．ｏ差 ３６／３９．０ １ｏｇ１ｏ差 ３６／Ｆ９．５ に’ｌｏｇ
差 ３６７３９．０ ）−７
を 手続補正書坊式） ％式％ １、事件の表示 昭和６１年特許願第２４２６９４号 ２、発明の名称 環状二重鎖ＤＮＡ、それを含む微生物、それらを用いる
型間組換え体ウィルスの製造法及び得られた型間組換え
体ウィルス ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 財団法人 日本ポリオ研究所 ４、代 理 人 （郵便番号１００） 昭和６２年１月７日 ７、補正の内容
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、弱毒ポリオウイルス１型の全遺伝子に相当する環状
二重鎖ＤＮＡのコート蛋白をコードする部位を、ポリオ
ウイルス２型あるいは３型の相当する遺伝子部位の二重
鎖ＤＮＡで置き換えた環状二重鎖ＤＮＡのうちで、動物
細胞に感染性を示し、かつポリオウイルスを産生し得る
環状二重鎖ＤＮＡ。 ２、弱毒ポリオウイルス１型の全遺伝子に相当する環状
二重鎖ＤＮＡのコート蛋白をコードする部位を、ポリオ
ウイルス２型あるいは３型の相当する遺伝子部位の二重
鎖ＤＮＡで置き換えた環状二重鎖ＤＮＡのうちで、動物
細胞に感染性を示し、かつポリオウイルスを産生し得る
環状二重鎖ＤＮＡを、プラスミドとして含むことを特徴
とするエシェリシヤ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌
。 ３、弱毒ポリオウイルス１型の全遺伝子に相当する環状
二重鎖ＤＮＡのコート蛋白をコードする部位を、ポリオ
ウイルス２型あるいは３型の相当する遺伝子部位の二重
鎖ＤＮＡで置き換えた環状二重鎖ＤＮＡのうちで、動物
細胞に感染性を示し、かつポリオウイルスを産生し得る
環状二重鎖ＤＮＡを、動物細胞にトランスフエクシヨン
することを特徴とするポリオ生ワクチンとして使用可能
な型間組換え体ウィルスの製造法。 ４、弱毒ポリオウイルス１型の全遺伝子に相当する環状
二重鎖ＤＮＡのコート蛋白をコードする部位を、ポリオ
ウイルス２型あるいは３型の相当する遺伝子部位の二重
鎖ＤＮＡで置き換えた環状二重鎖ＤＮＡのうちで、動物
細胞に感染性を示し、かつポリオウイルスを産生し得る
環状二重鎖ＤＮＡを、動物細胞にトランスフエクシヨン
して得られた型間組換え体ポリオウイルス。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61242694A JPS6394980A (ja) | 1986-10-13 | 1986-10-13 | 環状二重鎖ｄｎａ、それを含む微生物、それらを用いる型間組換え体ウイルスの製造法及び得られた型間組換え体ウイルス |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61242694A JPS6394980A (ja) | 1986-10-13 | 1986-10-13 | 環状二重鎖ｄｎａ、それを含む微生物、それらを用いる型間組換え体ウイルスの製造法及び得られた型間組換え体ウイルス |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6394980A true JPS6394980A (ja) | 1988-04-26 |
Family
ID=17092849
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61242694A Pending JPS6394980A (ja) | 1986-10-13 | 1986-10-13 | 環状二重鎖ｄｎａ、それを含む微生物、それらを用いる型間組換え体ウイルスの製造法及び得られた型間組換え体ウイルス |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6394980A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4334734A1 (de) * | 1992-10-13 | 1994-04-14 | House Food Industrial Co | Verfahren zur Herstellung von sofort löslichem Pulver |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60207582A (ja) * | 1984-03-30 | 1985-10-19 | Nippon Porio Kenkyusho | 組換えプラスミド |
-
1986
- 1986-10-13 JP JP61242694A patent/JPS6394980A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60207582A (ja) * | 1984-03-30 | 1985-10-19 | Nippon Porio Kenkyusho | 組換えプラスミド |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4334734A1 (de) * | 1992-10-13 | 1994-04-14 | House Food Industrial Co | Verfahren zur Herstellung von sofort löslichem Pulver |
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