JPS638400A - ヒト精子不動化ヒト単一クロ−ン抗体及びそれを産生するハイブリド−マ - Google Patents
ヒト精子不動化ヒト単一クロ−ン抗体及びそれを産生するハイブリド−マInfo
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- JPS638400A JPS638400A JP61153581A JP15358186A JPS638400A JP S638400 A JPS638400 A JP S638400A JP 61153581 A JP61153581 A JP 61153581A JP 15358186 A JP15358186 A JP 15358186A JP S638400 A JPS638400 A JP S638400A
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野]
この発明は、ヒト精子と特異的に反応するヒト単一クロ
ーン抗体及びそれを産生するハイブリトーマに関する。
ーン抗体及びそれを産生するハイブリトーマに関する。
この発明の単一クローン抗体は試薬又は避妊薬として用
いることがてきる。
いることがてきる。
[従来の技術及びその欠点]
従来より、原因不明不妊婦人の十数%に、精子不動化抗
体の存在か報告されている。また、これら精子不動化試
験により検出される抗体は、一種類ではなく何種類もあ
ると報告されている。
体の存在か報告されている。また、これら精子不動化試
験により検出される抗体は、一種類ではなく何種類もあ
ると報告されている。
ヘルらは、精管切除した患者の末梢血リンパ球とマウス
ミエローマ細胞とを融合させることにより、抗ヒト精子
単一クローン抗体を産生するハイブリトーマを確立した
(Herr、J、C,ら、”llumanantisp
erm monoclonal antibodies
constructedpos tvasec to
By″Riot、 Reprod、 12:695−7
11) 。
ミエローマ細胞とを融合させることにより、抗ヒト精子
単一クローン抗体を産生するハイブリトーマを確立した
(Herr、J、C,ら、”llumanantisp
erm monoclonal antibodies
constructedpos tvasec to
By″Riot、 Reprod、 12:695−7
11) 。
しかし、ヘルらによって報告された単一クローン抗体は
、酵素免疫分析及び間接免疫蛍光分析によりヒト精子に
結合することは示されたが、この単一クローン抗体の生
物学的活性は全く報告されていない。
、酵素免疫分析及び間接免疫蛍光分析によりヒト精子に
結合することは示されたが、この単一クローン抗体の生
物学的活性は全く報告されていない。
〔発明か解決しようとする問題点]
この発明の目的は、高力価の精子不動化及び精子凝集活
性を有するヒト単一クローン抗体及びこれを産生ずるハ
イブリトーマを提供することである。
性を有するヒト単一クローン抗体及びこれを産生ずるハ
イブリトーマを提供することである。
[問題点を解決するための手段]
本願発明者らは、不妊症婦人の末梢血リンパ球とマウス
ミエローマ、細胞とを細胞融合させることにより、高力
価のヒト精子不動化活性を有するヒト単一クローン抗体
を産生ずるハイブリトーマを得ることに成功した。この
発明のヒト単一クローン抗体は、λ鎖を有するヒト免疫
グロブリンMに屈し、精子不動化活性が5lqoとして
約5000以上であり、精子凝集価か約1:1600希
釈以上であり、ヒト射精精子、精漿及び精嚢に対して特
異的に反応し、ヒト母乳、ヒト血清、ヒト睾丸抽出液、
ヒト肝臓抽出液、ヒト肺臓抽出液、ヒト脳抽出液、ヒト
赤血球、ヒト白血球とは反応せず、ブタ射精精子とは弱
い交叉反応性を示すかウシ射精精子、ヤギ射精精子、ウ
サギ射1a精子、ハムスター精巣上体精子及びラット精
巣上体精子とは反応しない。
ミエローマ、細胞とを細胞融合させることにより、高力
価のヒト精子不動化活性を有するヒト単一クローン抗体
を産生ずるハイブリトーマを得ることに成功した。この
発明のヒト単一クローン抗体は、λ鎖を有するヒト免疫
グロブリンMに屈し、精子不動化活性が5lqoとして
約5000以上であり、精子凝集価か約1:1600希
釈以上であり、ヒト射精精子、精漿及び精嚢に対して特
異的に反応し、ヒト母乳、ヒト血清、ヒト睾丸抽出液、
ヒト肝臓抽出液、ヒト肺臓抽出液、ヒト脳抽出液、ヒト
赤血球、ヒト白血球とは反応せず、ブタ射精精子とは弱
い交叉反応性を示すかウシ射精精子、ヤギ射精精子、ウ
サギ射1a精子、ハムスター精巣上体精子及びラット精
巣上体精子とは反応しない。
[発明の効果]
この発明により、精子不動化活性及び精子凝集活性の極
めて高いヒト単一クローン抗体か得られた。
めて高いヒト単一クローン抗体か得られた。
この発明のヒト単一クローン抗体は、これを用いて受身
免疫することによって、又はこれを性器に局所的に補体
と併せて適用することによって避妊薬として用いること
がてきる。また、この発明のヒト単一クローン抗体の対
応抗原は避妊ワクチンとしての用途を有するが、この発
明の単一クローン抗体は、その対応抗原を精製する際の
試薬としての用途をも有する。
免疫することによって、又はこれを性器に局所的に補体
と併せて適用することによって避妊薬として用いること
がてきる。また、この発明のヒト単一クローン抗体の対
応抗原は避妊ワクチンとしての用途を有するが、この発
明の単一クローン抗体は、その対応抗原を精製する際の
試薬としての用途をも有する。
[発明の詳細な説明]
この発明のヒトハイブリドーマ及びヒト単一クローン抗
体は以下の工程により製造することがてきる。
体は以下の工程により製造することがてきる。
まず、血清中に高力価の精子不動化及び精子凝集抗体を
有する不妊婦人からリンパ球を採取する。リンパ球は末
梢血リンパ球てよい。リンパ球の採取は、広く知られた
フイコールーコンレー密度勾配遠心により行なうことが
できる。
有する不妊婦人からリンパ球を採取する。リンパ球は末
梢血リンパ球てよい。リンパ球の採取は、広く知られた
フイコールーコンレー密度勾配遠心により行なうことが
できる。
次に採取したリンパ球を、生体外て刺激する。刺激は、
ヒト精子及びPWMレクチンの存在下てリンパ球を培養
することによって行なうことかてきる。培養は、例えば
5xco□インキユベーター中で37℃で5日間行なう
ことがてきる。培養液中のリンパ球の初濃度は6 x
10’ないし7 x 10’細胞/ml 、精子の初濃
度は3 x 10’ないし3.5×10’細胞/1が好
ましい。また、PWMレクチンの培養液中の最終濃度は
約1:100程度か好ましい。
ヒト精子及びPWMレクチンの存在下てリンパ球を培養
することによって行なうことかてきる。培養は、例えば
5xco□インキユベーター中で37℃で5日間行なう
ことがてきる。培養液中のリンパ球の初濃度は6 x
10’ないし7 x 10’細胞/ml 、精子の初濃
度は3 x 10’ないし3.5×10’細胞/1が好
ましい。また、PWMレクチンの培養液中の最終濃度は
約1:100程度か好ましい。
次にこのようにして刺激したリンパ球とミエローマ細胞
とを融合させる。この細胞融合は、ポリエチレングリコ
ールの存在下て常法に従って行なうことかてきる。
とを融合させる。この細胞融合は、ポリエチレングリコ
ールの存在下て常法に従って行なうことかてきる。
融合後は、細胞を、常法に従い、フィーダー細胞を有す
る又は有さないマイクロプレートウェル中て例えば37
℃て5xco□インキユベーター中で培養することがて
きる。培養24時間後に培地をHATi!!択培地に代
えて培養した後、培養上清を常法であるサンドイッチ酵
素免疫分析法により試験してヒト免疫グロブリンを産生
じているリンパ球を選択する。
る又は有さないマイクロプレートウェル中て例えば37
℃て5xco□インキユベーター中で培養することがて
きる。培養24時間後に培地をHATi!!択培地に代
えて培養した後、培養上清を常法であるサンドイッチ酵
素免疫分析法により試験してヒト免疫グロブリンを産生
じているリンパ球を選択する。
次に、このようにして選択されたヒト免疫グロブリン産
生リンパ球のうち、抗ヒト精子抗体産生リンパ球を選択
する。この選択も酵素免疫分析によって行なうことがで
きる。マイクロプレートのウェルを洗浄したヒト精子で
コーティングし、これに培養上清を加えて一定時間後に
洗浄し、抗体か結合したかどうかを酵素免疫分析により
調べる。また、抗精子抗体産生の有無は、培養上清を用
いてマイクロ精子不動化テスト又は精子凝集テストをも
併せて行なう。
生リンパ球のうち、抗ヒト精子抗体産生リンパ球を選択
する。この選択も酵素免疫分析によって行なうことがで
きる。マイクロプレートのウェルを洗浄したヒト精子で
コーティングし、これに培養上清を加えて一定時間後に
洗浄し、抗体か結合したかどうかを酵素免疫分析により
調べる。また、抗精子抗体産生の有無は、培養上清を用
いてマイクロ精子不動化テスト又は精子凝集テストをも
併せて行なう。
この酵素免疫分析並びに精子不動化及び精子凝集テスト
により、抗ヒト精子抗体を産生するリンパ球が選択され
、これを常法に従ってクローニング操作を繰り返すこと
によってこの発明のヒトハイブリドーマが確立される。
により、抗ヒト精子抗体を産生するリンパ球が選択され
、これを常法に従ってクローニング操作を繰り返すこと
によってこの発明のヒトハイブリドーマが確立される。
以下、実施例に基づき、この発明をより具体的かつ詳細
に説明する。
に説明する。
[発明の実施例]
リンパ球の採取
強い精子不動化及び精子凝集抗体を有する、15年以上
不妊の39歳の女性から末梢血リンパ球を採取した。通
常の医学的検査によりこの女性を調べたところ、血清中
に高力価の精子不動化及び精子凝集抗体か存在すること
以外に不妊の原因は発見されなかった。彼女の血清中の
抗体力価は、精子不動化値が31.。とじて45.0
(礒島と香山、Quantitative esti
mation or spermissobilizi
ng ar+Libody in the 5era
of womanwith 5terility
or unknown eLiology: t
he 5Hsperv 1m5obilixati
on unit (Slso)、 In R
ecentAdvances in 1lusan
Reproduction (fl:a+1po
s daPaz、、A、、 Drill、 V、
八、、 l1yashi、 tl、、Redrig
ues。
不妊の39歳の女性から末梢血リンパ球を採取した。通
常の医学的検査によりこの女性を調べたところ、血清中
に高力価の精子不動化及び精子凝集抗体か存在すること
以外に不妊の原因は発見されなかった。彼女の血清中の
抗体力価は、精子不動化値が31.。とじて45.0
(礒島と香山、Quantitative esti
mation or spermissobilizi
ng ar+Libody in the 5era
of womanwith 5terility
or unknown eLiology: t
he 5Hsperv 1m5obilixati
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ecentAdvances in 1lusan
Reproduction (fl:a+1po
s daPaz、、A、、 Drill、 V、
八、、 l1yashi、 tl、、Redrig
ues。
11、 and 5chally、 八、V、
’eds)、 pplo−15,Excerpta
Medica、 As+sterdam; 1976)
、精子凝集値が1=32島釈(Friberg、 J、
(1974)、 A si@ple andsen
sitive +sicromeLhod for
demonsjration orsper園−
aggluLinaLing acLivity
in serum frominfertile
men and women、 AcLa
0bsLet。
’eds)、 pplo−15,Excerpta
Medica、 As+sterdam; 1976)
、精子凝集値が1=32島釈(Friberg、 J、
(1974)、 A si@ple andsen
sitive +sicromeLhod for
demonsjration orsper園−
aggluLinaLing acLivity
in serum frominfertile
men and women、 AcLa
0bsLet。
Gynecol、 5cand、 5upp1.36:
2l−29)てあった。末梢血リンパ球は、フイコール
ーコンレー密度勾配遠心により単離した。
2l−29)てあった。末梢血リンパ球は、フイコール
ーコンレー密度勾配遠心により単離した。
リンパ球の刺激
PWMレクチン(終濃度1:’100.米国ギブコ社製
)とIO!ウシ胎児血清(Fe2)とを含む15m1の
RPMI 1640培地に、採取したリンパ球1.Ox
10’個と、健常人からの洗浄した精子5 x 10
’個とを懸濁した。この混合物をコーニングプレート(
米国コーニング社製、コーニング−25820)の15
のウェルに分注し、 sx co、インキュベーター中
で37°Cで5日間培養した。培養後1個々のウェルか
ら採取された刺激されたリンパ球をプールし、2回洗い
、10−1のRPMl 1640培地中に懸濁した。こ
の刺激操作後、トリパンブルー染色法により調べたとこ
ろ、58zのリンパ球が生存していた。
)とIO!ウシ胎児血清(Fe2)とを含む15m1の
RPMI 1640培地に、採取したリンパ球1.Ox
10’個と、健常人からの洗浄した精子5 x 10
’個とを懸濁した。この混合物をコーニングプレート(
米国コーニング社製、コーニング−25820)の15
のウェルに分注し、 sx co、インキュベーター中
で37°Cで5日間培養した。培養後1個々のウェルか
ら採取された刺激されたリンパ球をプールし、2回洗い
、10−1のRPMl 1640培地中に懸濁した。こ
の刺激操作後、トリパンブルー染色法により調べたとこ
ろ、58zのリンパ球が生存していた。
細胞融合
繁田らの方法(Sperm−i+smobilizin
g monoclonalantibody to
human 5esinal plasma
antigens。
g monoclonalantibody to
human 5esinal plasma
antigens。
Cl1n、 Exp、 Immunol、 42:4
S8−462 (1980))に従い、分子l 100
0のポリエチレングリコールの存在下で、先に得られた
PWM刺激後、生存しているリンパ球51 x In’
個と、同数のマウスミエローマ細胞(Pl−MS−1/
1.Ag、 4: N5−1)とを融合した。
S8−462 (1980))に従い、分子l 100
0のポリエチレングリコールの存在下で、先に得られた
PWM刺激後、生存しているリンパ球51 x In’
個と、同数のマウスミエローマ細胞(Pl−MS−1/
1.Ag、 4: N5−1)とを融合した。
100.1の融合細胞を96個のウェルのそれぞれに入
れ、 5% Go□インキュベーター中て37℃て培養
した。96個のウェルのうち27個にはウェル当たりl
x In’個のリンパ球のみを収容し、他の69個の
ウェルにはウェルちたり4 x 1[1’個のリンパ球
と、支持細胞層として6 x In5個のマウス胸腺細
胞を収容した。培養24時間後に培地なHAT選択培地
に変え、培養12.19.及び230後に個々のウェル
の上清を後述するサンドイッチ酵素免疫分析法により試
験して゛ヒト免疫グロブリンを産生じているかどうか調
べた。培養23日後では、支持細胞層を用いない27ウ
エルのうち14ウエルて、支持細胞層を用いた69ウエ
ルのうち44ウエルて細胞の増殖か認められた。
れ、 5% Go□インキュベーター中て37℃て培養
した。96個のウェルのうち27個にはウェル当たりl
x In’個のリンパ球のみを収容し、他の69個の
ウェルにはウェルちたり4 x 1[1’個のリンパ球
と、支持細胞層として6 x In5個のマウス胸腺細
胞を収容した。培養24時間後に培地なHAT選択培地
に変え、培養12.19.及び230後に個々のウェル
の上清を後述するサンドイッチ酵素免疫分析法により試
験して゛ヒト免疫グロブリンを産生じているかどうか調
べた。培養23日後では、支持細胞層を用いない27ウ
エルのうち14ウエルて、支持細胞層を用いた69ウエ
ルのうち44ウエルて細胞の増殖か認められた。
酵素免疫分析によるヒト免疫グロブリンの検出サンドイ
ッチ酵素免疫分析に用いる全ての試薬は米国キャベルラ
ボラトリーズ製のものてあった、ポリビニルプレー、ト
(米国、ファルコン−3912)の96個のウェルを、
0.05M亜炭#!!l衝液(pH9,5)中ウサギ抗
ヒト免疫グロブリン(IgG+IgA◆IgM)抗血清
1gG分画(タンパク濃度0.8gg/+00 gl/
ウェル)てコーティングし、4℃で一夜培養した。プレ
ートの未結合領域は1%ウシ血清アルブミン(BSA)
と5%正常ウマ血清とを含むo、ts鷺リン酸緩衝液(
pH7,4) (ブロッキング溶液)をウェルに入れ
て室温て1時間インキュベートすることによってブロッ
クした。0.0S%のTveen20を含むリン酸緩衝
液てウェルを洗った後、50g+の培養上清を加え、室
温で2時間培養した。ヤギ抗ヒト免疫グロブリン血清か
ら作られたF(ab’)2をパーオキシダーゼて標識し
たものをブロッキング溶液て1 :400Gに希釈した
もの50.1をウェルに加えた。室温で1時間インキュ
ベートした後プレートを洗い、0.000 HJzを含
む0.1Mクエン酸緩衝液(pus、口)中オルソフェ
ニレンシアミン(和光紬薬工業社製)を終濃度0.02
$となるように加えた。反応は5ouL+のIOX I
I□S04を加えることによって停止し、マイクロプレ
ート光度計(MTP 12.コロナ電機社製)で測定し
た。その結果、増殖が認められた上記58ウエルのうち
、11ウエルからヒト免疫グロブリンが検出された。
ッチ酵素免疫分析に用いる全ての試薬は米国キャベルラ
ボラトリーズ製のものてあった、ポリビニルプレー、ト
(米国、ファルコン−3912)の96個のウェルを、
0.05M亜炭#!!l衝液(pH9,5)中ウサギ抗
ヒト免疫グロブリン(IgG+IgA◆IgM)抗血清
1gG分画(タンパク濃度0.8gg/+00 gl/
ウェル)てコーティングし、4℃で一夜培養した。プレ
ートの未結合領域は1%ウシ血清アルブミン(BSA)
と5%正常ウマ血清とを含むo、ts鷺リン酸緩衝液(
pH7,4) (ブロッキング溶液)をウェルに入れ
て室温て1時間インキュベートすることによってブロッ
クした。0.0S%のTveen20を含むリン酸緩衝
液てウェルを洗った後、50g+の培養上清を加え、室
温で2時間培養した。ヤギ抗ヒト免疫グロブリン血清か
ら作られたF(ab’)2をパーオキシダーゼて標識し
たものをブロッキング溶液て1 :400Gに希釈した
もの50.1をウェルに加えた。室温で1時間インキュ
ベートした後プレートを洗い、0.000 HJzを含
む0.1Mクエン酸緩衝液(pus、口)中オルソフェ
ニレンシアミン(和光紬薬工業社製)を終濃度0.02
$となるように加えた。反応は5ouL+のIOX I
I□S04を加えることによって停止し、マイクロプレ
ート光度計(MTP 12.コロナ電機社製)で測定し
た。その結果、増殖が認められた上記58ウエルのうち
、11ウエルからヒト免疫グロブリンが検出された。
酵素免疫分析による抗精子抗体の検出
96ウエルのポリビニルプレート(ファルコン−:19
12)を洗浄したヒト精子てコーティングした。
12)を洗浄したヒト精子てコーティングした。
コーティングは、50ル1の精子懸濁液(5x10’/
ml)を個々のウェルに加え、室温て空気乾燥すること
によって行なった。プレートは使用時まて4℃で貯蔵し
た。 +! BSAと2χ正常ウマ血清とを含むリンm
緩衝液を個々のウェルに加え、室温て1時間保持してウ
ェルのタンパク結合領域をブロックした。リン酸緩衝液
で洗った後、50ル1の培養上清を精子てコートされた
ウェルに加え、室温で1時間インキュベートした。その
後、先に述べた免疫グロブリンの検出と全く同様にして
抗ヒト精子抗体を検出した。その結果、ヒト免疫グロブ
リンが検出された11ウエルのうち1つのウェルから抗
ヒト精子抗体が検出された。
ml)を個々のウェルに加え、室温て空気乾燥すること
によって行なった。プレートは使用時まて4℃で貯蔵し
た。 +! BSAと2χ正常ウマ血清とを含むリンm
緩衝液を個々のウェルに加え、室温て1時間保持してウ
ェルのタンパク結合領域をブロックした。リン酸緩衝液
で洗った後、50ル1の培養上清を精子てコートされた
ウェルに加え、室温で1時間インキュベートした。その
後、先に述べた免疫グロブリンの検出と全く同様にして
抗ヒト精子抗体を検出した。その結果、ヒト免疫グロブ
リンが検出された11ウエルのうち1つのウェルから抗
ヒト精子抗体が検出された。
−ヒト 1 細 のクローニング抗ヒト精子抗体
か検出されたウェル中のハイi!JF−vを、151
Fe2を含むRPMI 1540培地中て6 x 10
’/ウエルのマウス胸醗細胞と共に37℃てsz co
2インキュベート中て培養した。培養は。
か検出されたウェル中のハイi!JF−vを、151
Fe2を含むRPMI 1540培地中て6 x 10
’/ウエルのマウス胸醗細胞と共に37℃てsz co
2インキュベート中て培養した。培養は。
96ウエルコーニングプラスチツクプレートの第1列の
8つのウェルに約1 x 10”ハイブリトーマ/ウェ
ルの濃度に上記培養液を入れ、1列ごとに1:2に段階
希釈して行なった。従って最後の列はt、2zに希釈さ
れた。培養17日後、96ウエルのうち4つのウェルて
細胞の増殖か認められ。
8つのウェルに約1 x 10”ハイブリトーマ/ウェ
ルの濃度に上記培養液を入れ、1列ごとに1:2に段階
希釈して行なった。従って最後の列はt、2zに希釈さ
れた。培養17日後、96ウエルのうち4つのウェルて
細胞の増殖か認められ。
そのうちの2って強い抗ヒト精子抗体か検出された。そ
のうちの1つのウェルからハイブリドーマを採取し、先
に行なったのと全く同様にして第2回目のクローニング
を行なった。その結果、96のウェルのうち46のウェ
ルて細胞の増殖が認められ、そのうちの42のウェルて
抗ヒト精子抗体の産生か認められた。42のウェルのう
ち、抗ヒト精子抗体価の最も高かったウェルからハイブ
リトーマを採取し、第3回目のクローニングを同様にし
て行なった。その結果、96のウェルのうち56のウェ
ルで細胞の増殖が認められ、5′6のウェルの全てで強
い抗ヒト精子抗体か検出された。これらのウェルのうち
の1つを取り、以下の実験に用いた。
のうちの1つのウェルからハイブリドーマを採取し、先
に行なったのと全く同様にして第2回目のクローニング
を行なった。その結果、96のウェルのうち46のウェ
ルて細胞の増殖が認められ、そのうちの42のウェルて
抗ヒト精子抗体の産生か認められた。42のウェルのう
ち、抗ヒト精子抗体価の最も高かったウェルからハイブ
リトーマを採取し、第3回目のクローニングを同様にし
て行なった。その結果、96のウェルのうち56のウェ
ルで細胞の増殖が認められ、5′6のウェルの全てで強
い抗ヒト精子抗体か検出された。これらのウェルのうち
の1つを取り、以下の実験に用いた。
このバイブリトーマを24ウエルのプラスチックプレー
ト(コーニング−25820)に移し37℃で5χCO
2インキユベート中て培養した。細胞か増殖した後、培
養物を組織培養フラスコ(コーニング−25100と2
5110)に広げて培養した。
ト(コーニング−25820)に移し37℃で5χCO
2インキユベート中て培養した。細胞か増殖した後、培
養物を組織培養フラスコ(コーニング−25100と2
5110)に広げて培養した。
精子不動化及び精子凝集試験
精子不動化試験を礒島と香山のマイクロ精子不動化試験
法(MicroLechnique of sperm
imsobilization test、 I
n [mmunology oflleprodu
ction (Bratanov、に、 Valcha
nov、 V、11. 。
法(MicroLechnique of sperm
imsobilization test、 I
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ction (Bratanov、に、 Valcha
nov、 V、11. 。
Dikov、 V、、 Georgieva、 R,a
nd Somlev、 B、 ads)pp215−2
19. Bulgarian Academy of
5cience。
nd Somlev、 B、 ads)pp215−2
19. Bulgarian Academy of
5cience。
5ofia、 1979)をわずかに修飾した方法によ
って、精子凝集試験をフリバーブ(文献は上記)のトレ
ー凝集試験法によって行なった。すなわち、まず、10
.1の段階希釈した検体をテラサキのプレート(ファル
コン−3014)の個々のウェルに入れ、液体パラフィ
ンをその上に積層した。2#Llのプールされた補体源
としてのモルモット血清と、11の活性なヒト精子懸濁
液(2x 10’/鵬1)とをウェルに加えた。補体の
コントロールとして2glの熱不活化(56°C230
分)モルモット血清を用いた。精子不動化抗体値は、5
01 M子不動化単位(SI5o)として計算した(1
島と香山(1976)、文献は上記)。精子凝集は、熱
不活化モルモット血清を含むウェル中で顕微鏡下で調べ
、WHO研修会、Aarhus、1974 (ローズ
ら、1971i)の方法によって評価した。
って、精子凝集試験をフリバーブ(文献は上記)のトレ
ー凝集試験法によって行なった。すなわち、まず、10
.1の段階希釈した検体をテラサキのプレート(ファル
コン−3014)の個々のウェルに入れ、液体パラフィ
ンをその上に積層した。2#Llのプールされた補体源
としてのモルモット血清と、11の活性なヒト精子懸濁
液(2x 10’/鵬1)とをウェルに加えた。補体の
コントロールとして2glの熱不活化(56°C230
分)モルモット血清を用いた。精子不動化抗体値は、5
01 M子不動化単位(SI5o)として計算した(1
島と香山(1976)、文献は上記)。精子凝集は、熱
不活化モルモット血清を含むウェル中で顕微鏡下で調べ
、WHO研修会、Aarhus、1974 (ローズ
ら、1971i)の方法によって評価した。
M1織培養フラスコに広げて培養した上記培養物の上清
は、1.s gg/slのヒトIgMを含んでいた。こ
の上清の精子不動化値を上記方法により調べたところ5
lsoとして5000単位であった。また。
は、1.s gg/slのヒトIgMを含んでいた。こ
の上清の精子不動化値を上記方法により調べたところ5
lsoとして5000単位であった。また。
精子凝集値を上記方法により調べたところ、1:160
0希釈てあった。このバイプリトーマは、強い精子不動
化抗体活性及び精子凝集抗体活性な示すIgMの産生を
低下することなく8力月以上m持生育している。細胞融
合後の培養日数とIgMの生産量並びに精子不動化値及
び精子凝集値を第1表に示す、なお、免疫グロブリンの
クラスは、H釦特異性ヤギ抗ヒトIgG(γ−特異性)
抗血清、H釦特異性ヤギ抗ヒトIgM(g−特異性)抗
血清、H鎖特異性ヤギ抗ヒトIgA(α−特異性)抗血
清、L鎖特異性(入、に)ヤギ抗ヒト免疫グロブリン抗
血清(いずれもマイルズ・サイエンティフィック社製)
を用いた寒天グルー内の二重免疫拡散法により試験した
。上記ヒトハイブリドーマの上清の硫酸アンモニウム沈
殿分画は、終−特異性及び入−特異性抗血清に対して単
一の沈降線を示した。
0希釈てあった。このバイプリトーマは、強い精子不動
化抗体活性及び精子凝集抗体活性な示すIgMの産生を
低下することなく8力月以上m持生育している。細胞融
合後の培養日数とIgMの生産量並びに精子不動化値及
び精子凝集値を第1表に示す、なお、免疫グロブリンの
クラスは、H釦特異性ヤギ抗ヒトIgG(γ−特異性)
抗血清、H釦特異性ヤギ抗ヒトIgM(g−特異性)抗
血清、H鎖特異性ヤギ抗ヒトIgA(α−特異性)抗血
清、L鎖特異性(入、に)ヤギ抗ヒト免疫グロブリン抗
血清(いずれもマイルズ・サイエンティフィック社製)
を用いた寒天グルー内の二重免疫拡散法により試験した
。上記ヒトハイブリドーマの上清の硫酸アンモニウム沈
殿分画は、終−特異性及び入−特異性抗血清に対して単
一の沈降線を示した。
第 1 表
53 1.5 5000
1:1500120 未検出
8400 未検出189 2.1
5900 1:3200249 2.
0 5900 1:]200抗体吸収試
験 上記ハイプリトーマの産生ずるヒト単一クローン抗体の
特異性を調べるために抗体吸収試験を行なった。抗体吸
収試験は、種々の組織抽出液(ホモジネート上清)、体
液、種々の!ll物の精子を免疫吸収体として用いて上
記バイプリトーマの培養上清を吸収し、残存する抗体活
性を精子不動化試験により求めることによって行なった
。正常ヒト血清のIH生理食塩水溶液で適当に希釈した
培養上清10寥1を、100ル1の段階希釈した免疫吸
収体と混合し、この混合物を4°Cで一夜インキユベー
トした。試験の前に予め培養上清の抗体活性を31.。
1:1500120 未検出
8400 未検出189 2.1
5900 1:3200249 2.
0 5900 1:]200抗体吸収試
験 上記ハイプリトーマの産生ずるヒト単一クローン抗体の
特異性を調べるために抗体吸収試験を行なった。抗体吸
収試験は、種々の組織抽出液(ホモジネート上清)、体
液、種々の!ll物の精子を免疫吸収体として用いて上
記バイプリトーマの培養上清を吸収し、残存する抗体活
性を精子不動化試験により求めることによって行なった
。正常ヒト血清のIH生理食塩水溶液で適当に希釈した
培養上清10寥1を、100ル1の段階希釈した免疫吸
収体と混合し、この混合物を4°Cで一夜インキユベー
トした。試験の前に予め培養上清の抗体活性を31.。
値て約lO単位に調箇した。インキュベート後、上清を
遠心分離しく9500g、 30分)、精子不動化値を
調べた。ヒト精液(RAS) 、ヒト母乳(IIM)及
び正常ヒト血清(NIIS)は硫酸アンモニウムて沈殿
させ、蒸留水に対して十分に透析し、凍結乾燥した。精
嚢内に貯蔵された体液についても同様に透析し、凍結乾
燥した。免疫吸収試験に際して、これらは生理食塩水に
溶解した。動物の精子は3回生理食塩水で洗った後免疫
吸収試験に用いた。結果を第1図及び第2図並びに第2
表に示す、なお、相対精子運動性は、被検試料について
の値(TX)とl0XNIIsを用いた対照試験におけ
る値(C%)との比(T/C%)を意味する。
遠心分離しく9500g、 30分)、精子不動化値を
調べた。ヒト精液(RAS) 、ヒト母乳(IIM)及
び正常ヒト血清(NIIS)は硫酸アンモニウムて沈殿
させ、蒸留水に対して十分に透析し、凍結乾燥した。精
嚢内に貯蔵された体液についても同様に透析し、凍結乾
燥した。免疫吸収試験に際して、これらは生理食塩水に
溶解した。動物の精子は3回生理食塩水で洗った後免疫
吸収試験に用いた。結果を第1図及び第2図並びに第2
表に示す、なお、相対精子運動性は、被検試料について
の値(TX)とl0XNIIsを用いた対照試験におけ
る値(C%)との比(T/C%)を意味する。
第 2 表
116一コC4単一クローン抗体の特性免疫グロブリン
クラス IgM(入)生物学的活性 精子不動化 + (50005lio)精子
摩集 + (1:1500希釈)ヒト組織
に対する特異性 射精精子 十 精液 十 母乳タンパク質 − 血清タンパク質 − 畢九 − 精巣上体 定かでない 精嚢貯蔵液 十 前立腺 士 肝臓 − 肺臓 − 脳 −赤血球
− 白血球 − !Ii特異性(精子に対する反応性) ヒト + ブタ 士 ウシ − ヤギ − ウサギ − ハムスター − ラット − 第1図には、ヒト及び種々の動物の精子についての結果
か示されている。図中、Xはヒト射精精子、○はブタ射
精精子、はクシ射精精子、口はヤギ射精精子、0はウサ
ギ射精精子、・はハムスターの精巣上体精子、マはラッ
トの精巣上体精子についての結果を示す。ヒト精子はそ
の量に依存して上記ハイブリトーマの産生ずるヒト単一
クローン抗体の精子不動化活性を吸収したか、他の動物
の精子はブタを除き全く吸収しなかった。ブタの精子は
弱い吸収能力(ヒト精子の約1/12)を有する。精子
不動化活性の低下は、精子吸収後の精子凝東活性の低下
と平行していた。
クラス IgM(入)生物学的活性 精子不動化 + (50005lio)精子
摩集 + (1:1500希釈)ヒト組織
に対する特異性 射精精子 十 精液 十 母乳タンパク質 − 血清タンパク質 − 畢九 − 精巣上体 定かでない 精嚢貯蔵液 十 前立腺 士 肝臓 − 肺臓 − 脳 −赤血球
− 白血球 − !Ii特異性(精子に対する反応性) ヒト + ブタ 士 ウシ − ヤギ − ウサギ − ハムスター − ラット − 第1図には、ヒト及び種々の動物の精子についての結果
か示されている。図中、Xはヒト射精精子、○はブタ射
精精子、はクシ射精精子、口はヤギ射精精子、0はウサ
ギ射精精子、・はハムスターの精巣上体精子、マはラッ
トの精巣上体精子についての結果を示す。ヒト精子はそ
の量に依存して上記ハイブリトーマの産生ずるヒト単一
クローン抗体の精子不動化活性を吸収したか、他の動物
の精子はブタを除き全く吸収しなかった。ブタの精子は
弱い吸収能力(ヒト精子の約1/12)を有する。精子
不動化活性の低下は、精子吸収後の精子凝東活性の低下
と平行していた。
第2図にはヒトの種々の組織の抽出液及び体液を用いた
同車−クローン抗体の吸収試験の結果か示されている0
図中、Xはヒト精液、○は精嚢貯蔵液、△はヒト母乳、
口は正常ヒト血清、・は寧丸抽出液、ムは精巣上体抽出
液、◆は前立腺抽出液についての結果を示す、抗体活性
はllAs 、精嚢貯蔵液及び前立腺抽出液により吸収
されたか他のいずれの器官の抽出液又は体液によっても
吸収されなかった。精巣上体の抽出液による免疫吸収は
材料不足のため定かではない。ヒトリンパ球及び赤血球
も吸収性を示さなかった。
同車−クローン抗体の吸収試験の結果か示されている0
図中、Xはヒト精液、○は精嚢貯蔵液、△はヒト母乳、
口は正常ヒト血清、・は寧丸抽出液、ムは精巣上体抽出
液、◆は前立腺抽出液についての結果を示す、抗体活性
はllAs 、精嚢貯蔵液及び前立腺抽出液により吸収
されたか他のいずれの器官の抽出液又は体液によっても
吸収されなかった。精巣上体の抽出液による免疫吸収は
材料不足のため定かではない。ヒトリンパ球及び赤血球
も吸収性を示さなかった。
第1図はヒト及び種々の動物の精子によるこの発明の単
一クローン抗体の免疫吸収性を示す図。 第2図はヒトの種々の組織の抽出液及び体液についての
この発明の単一クローン抗体の免疫吸収性を示す図であ
る。
一クローン抗体の免疫吸収性を示す図。 第2図はヒトの種々の組織の抽出液及び体液についての
この発明の単一クローン抗体の免疫吸収性を示す図であ
る。
Claims (2)
- (1)精子不動化抗体を保有する不妊婦人のリンパ球と
ミエローマ細胞とを融合させて得られるハイブリドーマ
によって産生され、λ鎖を有するヒト免疫グロブリンM
に属し、精子不動化値がSI_5_0として約5000
以上であり、精子凝集値が約1:1600希釈以上であ
り、ヒト射精精子、精漿及び精嚢に対して特異的に反応
し、ヒト母乳、ヒト血清、ヒト睾丸抽出液、ヒト肝臓抽
出液、ヒト脾臓抽出液、ヒト脳抽出液、ヒト赤血球、ヒ
ト白血球とは反応せず、ブタ射精精子とは弱い交叉反応
性を示すがウシ射精精子、ヤギ射精精子、ウサギ射精精
子、ハムスター精巣上体精子及びラット精巣上体精子と
は反応しないヒト精子不動化ヒト単一クローン抗体。 - (2)精子不動化抗体を保有する不妊婦人のリンパ球と
ミエローマ細胞とを融合させて得られ、λ鎖を有するヒ
ト免疫グロブリンMに属し、精子不動化値がSI_5_
0として約5000以上であり、精子凝集値が約1:1
600希釈以上であり、ヒト射精精子、精漿及び精嚢分
泌液に対して特異的に反応し、ヒト母乳、ヒト血清、ヒ
ト睾丸抽出液、ヒト肝臓抽出液、ヒト脾臓抽出液、ヒト
脳抽出液、ヒト赤血球、ヒト白血球とは反応せず、ブタ
射精精子とは弱い交叉反応性を示すがウシ射精精子、ヤ
ギ射精精子、ウサギ射精精子、ハムスター精巣上体精子
及びラット精巣上体精子とは反応しないヒト精子不動化
ヒト単一クローン抗体を産生するハイブリドーマ。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61153581A JPS638400A (ja) | 1986-06-30 | 1986-06-30 | ヒト精子不動化ヒト単一クロ−ン抗体及びそれを産生するハイブリド−マ |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61153581A JPS638400A (ja) | 1986-06-30 | 1986-06-30 | ヒト精子不動化ヒト単一クロ−ン抗体及びそれを産生するハイブリド−マ |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS638400A true JPS638400A (ja) | 1988-01-14 |
Family
ID=15565616
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP61153581A Pending JPS638400A (ja) | 1986-06-30 | 1986-06-30 | ヒト精子不動化ヒト単一クロ−ン抗体及びそれを産生するハイブリド−マ |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS638400A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0351045A2 (en) * | 1988-07-15 | 1990-01-17 | The Biomembrane Institute | Monoclonal antibody NUH2 capable of inactivating motility of sperm, antigen defined by said monoclonal antibody and methods of using said monoclonal antibody and antigen |
JP2008089008A (ja) * | 2006-09-29 | 2008-04-17 | Icom Inc | 連結構造、および筐体の脚構造 |
-
1986
- 1986-06-30 JP JP61153581A patent/JPS638400A/ja active Pending
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0351045A2 (en) * | 1988-07-15 | 1990-01-17 | The Biomembrane Institute | Monoclonal antibody NUH2 capable of inactivating motility of sperm, antigen defined by said monoclonal antibody and methods of using said monoclonal antibody and antigen |
EP0351045A3 (en) * | 1988-07-15 | 1990-07-18 | The Biomembrane Institute | Monoclonal antibody nuh2 capable of inactivating motility of sperm, antigen defined by said monoclonal antibody and methods of using said monoclonal antibody and antigen |
JP2008089008A (ja) * | 2006-09-29 | 2008-04-17 | Icom Inc | 連結構造、および筐体の脚構造 |
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