JPS6354328A - 創傷治癒組成物およびそれを用いた創傷包帯 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は内科、外科および生化学の分野に関する。さら
に本発明は、特に再生繊維状コラ−・ゲン。

ヘパリン、そして走化因子、成長因子または分化因子か
らなる創傷治癒組成物に関する。

（従来の技術） 創傷治癒の過程は１時間を追って起こる一連の事象から
なるが、該事象は創傷内に出現する各種の細胞浸潤物に
よって特徴づけられる。負傷直後において、凝固過程は
凝固に関する体液性様相および細胞の応答の両方を包含
する。主要な細胞応答は１血小板と凝固タンパクすなわ
ちトロンビンおよびコラーゲンとの反応に関係する。こ
の凝固過程がいったん完了すれば、各種の白血球が創傷
中に規則正しく、そして再現性のある順序で出現する。

白血球より少し遅れて、繊維芽細胞、内皮細胞および毛
細血管が創傷内に出現する。繊維芽細胞は結合繊維成分
、特にコラーゲンおよびプロテオグリカンの形成の要因
となる。この繊維芽細胞は、はるか後の段階で弾性ＩＷ
維の形成の要因となる。

このように創傷は、初１す１の繊維芽細胞および上皮細
胞を包含する。細胞１／ベルの複雑な過程である。この
過程は血小板、マクロファージ、好中球。

内皮細胞、筋繊維芽細胞、そ１．て恐らく他の未同定の
細胞型によ、って別の効果を受ける。成長因子がこれら
の細胞にインビトロで影響を与えることは明らかである
が、生化学１ノベルにおいて創傷治癒に包含される過程
は、は七んと理解されていない。このよ・うな成長因子
６．二゛は、形質転換成長因子（ＴＧＦ−σ、　ＴＧＦ
−β）、血小板由来増殖因子（Ｐ叶Ｇ）。

繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、表皮成長因子（ＥＧＦ
）および結合組織活性化因子（ｃＴＡＰ−］］Ｉのよう
なＣＴＡＰ）が含まれる。しかしながら、　ＰＤＧＦま
たはＦＧＦの調製物をハムスターモデルの全層性創傷に
対して局所的に適用したところ、創傷治癒に何ら有意の
刺激を与えなかった（（１９８６）　Ｊ、　Ｄｅｒｍａ
ｔｏｌ、　Ｓｒｕｇ。

０ｎｃｏ１．　１１　：６．　ＰＰ、　６１７−６２５
）　＊創傷治癒モデルにおける成長因子の他の研究には
以下のものがある：　（１９８３）　５ｃｉｅｎｃｅ　
２旦：１３２９−１３３ｂ（１９８６）　Ａｎｎ、　　
Ｓｕｒｇ、じ２０３：１４２−１４７８　（１９８５）
Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　　Ｉｎｖｅｓｔ、　　胆：２３２３
−２３２９；　　（１９８２）　Ｊａｐａｎ。

Ｊ、　　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、、　　３２：１９８−２
０１；　　（１９８２）　Ｊ、　　Ｓｕｒｇ、　Ｒｅｓ
。

３３：１６４−１６９：　　（１９８５）Ｐｒｏｅ、Ｎ
ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｅｉ、ＩＪｓＡ８２ニア３４０−
７３４４；　　（１９８５）　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏ
！、　　１００：１２１９−１２２７；　　（１９８０
）　　Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、
　υＳＡ　７７：４３７９−４３８ｂ　　（１９８２）
　　Ｊ、　　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　　Ｒｅｓ、　　　８
：４１３−４１７：（１９８５）　Ｅｘｐ、　Ｍｏ１．
　　Ｐａｔｈｏｌ、旦：２７４−２８１；　　（１９８
６）Ｊ、　　Ｓｕｒｇ、　　Ｒｅｓ、　　４０：３１５
−３１９゜血小板が成長因子を含むことば知られている
。

しかし、これらの因子が創傷部位において通常。

放出されるかどうかは決定されていない。コラーゲンは
インビトロで血小板凝集および脱顆粒化反応を誘発する
ことが知られている。しかしまた。

これらの反応が局所的な創傷部位においてインビボでも
起こるかどうかは明らかではない。要約すると、血小板
のインビトロでの生化学的活性はインビボにおいても有
効であると想像されるが、創傷治癒に関する包括的な生
化学的分析は、まだ達成されていない。

い（つかの先行特許の公１１には、創傷治癒を促進させ
るために、コラーゲンとグリコサミノグリカンの組み合
わせを用いることが提富されている。

Ｙａｎｎａｓらは一連の米国特許を発行した。これらの
特許には２人工皮膚として用いられ得る層状複合体が記
載されている。第１の特許、すなわち米国特許第４，０
６０，０８１号には、底層（皮膚側）がグリコサミノグ
リカンと架橋したコラーゲンであるような複合体が記載
されている。グリコサミノグリカンを添加してコラーゲ
ンを可溶化させ、沈澱を生じさせる。この沈澱を均質化
し２次いでグルタルアルデヒドと架橋させる。米国特許
第４，３５０，６２９号には、この過程の変法が記載さ
れている。すなわち、グリコサミノグリカンをコラーゲ
ンに添加する前にグルタルアルデヒドを添加する方法で
ある。米国特許第４，４１８．６９１号には、さらに別
の変法が記載されている。すなわち、コラーゲン−グリ
コサミノグリカンの格子を生育可能な上皮細胞。

間葉細胞、あるいは繊維芽細胞によって充填する方法で
ある。この特許によれば、ｊ−記細胞はＦ、ＧＦおよび
ＰＤＧＦのよ・うな、細胞の再生産を増大さ一仕る物質
で事前処理し得る。

欧州特許出願第８５３０１１２７郵（１９８５年９月１
１日公開、　Ｎｏ、１５４４４７）には、］ララーンお
よび、走化性を誘発させるヘパリンまたは・＼バリン硫
酸のよう２．１：グリコ勺ミノグリカンの）懸濁液から
なる創傷治癒組成物が記載されている。

創傷治癒におけるＦＧＦおよびＰＤＧＦの役割ば、それ
ぞれ以下の文献に記載されている：威且個−五兆ナク滅
Ｉｙ四子（１９８６）　、ジョン　ワイリー・　アンド
　サンズ、インコーポレ・−・テッド、　ＰＰ、　１−
３６゜およびむ上！−（１９８６）邦：　１５５−１６
９゜本発明は、新規の創傷治癒組成物を与える。この組
成物の生化学的活性は上記の欧州特許出願に記載されて
いる懸濁液よりも優れている。

（発明の要旨） 本発明の組成物は、軟組織の創傷治癒組成物であって、
（ａ）繊維状コラーゲン；（ｂ）コラーゲンを基準にし
て約０．１〜約１０重景％のヘパリン、ヘパリン’８４
以のグリコサミノグリカンまム・はこれらの７昆合物；
および（ｃ）少なくとも１゛つの走化因子、成彩因子ま
たば分化因子の有効量、の混合物からなる組成物である
。

好ましい因子は、　ＰＤＧＦ、　ＦＧＦま／′１・番４
、てれらの混合物である。

上記の組成物を固体支持体に担持してなる創傷包帯は。

本発明のもう一つ別の様相である。

パ割−９−実−施方−汰 本発明の組成物は、を椎動物における皮膚創傷。

真皮創傷、粘膜創傷または上皮創傷のような軟組織の創
傷治癒に対して有用である。本発明の組成物は、特にヒ
ト、室底家畜および農場家畜、競技用動物そして愛玩動
物を含む咄乳類Ｇこおける皮膚創傷の治癒に対して有効
である。本発明の組成物は、以下に列挙するようなあら
ゆる種類の全層性皮膚創傷または中間層皮膚創傷を治療
するために用いられ得る：外傷、外科手術による創傷、
熱または薬品による創傷（熱傷）、放射線による創傷お
よび褥渣のような慢性潰瘍、そ（−で血管病、血液病お
よび代謝病に起因する皮膚潰瘍、感染もしくは新生物。

本発明において用いられるコラーゲンは繊維状であって
、ヘパリンまたはヘパリン類似のグリコサミノグリカン
を結合し得る。ヘパリンの結合能力により、■型コラー
ゲンまたは■型コラーゲン。

あるいはそれらの混合物が好ましい。コラーゲンは、そ
れが適用される個体とは、遺伝的に類似しない源（例え
ば、同種異系の源または異種の源）に由来し得る。コラ
ーゲンが異種である場合、　（例えば抗原決定基を取り
除くために酵素処理または他の処理によって）精製し、
免疫抗原性の可能性を軽減することが好ましい。コラー
ゲン繊維は再生されており、架橋されていてもいなくて
もよい。本組成物に用いるのに適したウシ真皮の再生繊
維状コラーゲンとしては、コラーゲン　コーポレーショ
ン（バロ　アルド、カルフォルニア）の市販品（商標Ｚ
ＹＤＥＲＭ　＠　）を利用し得る。水性懸濁液の形であ
る場合、繊維状コラーゲン濃縮物は。

約１〜７０■／　ｍｌの範囲である。処理目的に対して
は、コラーゲン濃度の範囲は１５〜３５■／１ｎ１であ
るのが好ましい。懸濁液中のコラーゲン濃度に依存して
、懸濁系の粘稠性は半透明ゲルから流動性シロップまで
の範囲を取る。

ヘパリンまたはヘパリン類似のグリコサミノグリカンは
、コラーゲンを基準にして約０．１〜約１０重量％、好
ましくは約０．３〜３重景％、そして最も好ましくは約
１％の範囲の量の繊維状コラーゲンと混合される。ヘパ
リンは主要な商業製品である。ヘパリンの断片および誘
導体は、ヘパリンＱこ対して化学的類似性を有すること
が知られている。

ここで用いられているように、“ヘパリン類似のグリコ
サミノグリカン”という用語は、このような断片および
誘導体を包含することを意図している。ただし、このよ
うな断片および誘導体が１本組成物中においてヘパリン
と機能的に同等である（すなわち、コラーゲンおよび各
種因子と結合して効力のある創傷治癒を与える）場合に
ついてである。

本発明に用いる走化因子、成長因子または分化因子は、
天然または合成（組喚え型）によるものであり、かつヒ
トもしくは他の哺乳類のものであり得る。ヒトＦＧＦ　
（酸型または塩基型のいずれか）およびヒｌ−ＰＤＧＦ
が好ましい、他のこのような因子には、　ＥＧＦ、ＴＧ
Ｆ−α、　ＴＧＦ−βおよびＣＴＡＰ−ＩＩＩが含まれ
る。天然の源（下垂体、脳）からＦＧＦを単離する方法
は、　Ｂｏｈｌｅｎら（１９８４）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ
ｔｌ、　Ａｅａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　８１：５３６４に記載されている
。血小板からＰＤＧＦを単離する方法は＋　Ｒａ１ｎｅ
ｒら（１９８２）　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ＋ｍ、−２５’７：５１５４に記載
されている。　Ｘｅ１ｌｙら（１９８５）　ＥＭＢＯＪ
、土：　３３９９には、　ＰＤＧＦＯ組換え型を作る手
順が開示されている。これらの因子の合成的類似体は、
天然分子の生化学的活性を保持していれば用いられ得る
。このような類似体は。

“走化因子、成長因子または分化因子”という用語ある
いは特別な因子を記述するために用いられる特定の用語
、すなわち例えば“［’ＧＦ”またはＰＤＧＦ“の範囲
内にあることを意図するものである。このような類似体
は２合成遺伝子の発現または部位特異的な突然変異誘発
によって変更された遺伝子の発現によるような通常の遺
伝子工学によって製造し得る。ＰＤＧＦを用いるような
いくつかの場合には。

この因子は本組成物中に天然の形（すなわち、血小板と
して）、あるいは粗製または部分的に精製された。放出
物または抽出物として含有され得る。

またあるいは、これらの因子は有意量の他の不純物を含
まない実質的に純粋な形で含有され得る。

本組成物中に含有される因子の量は、含まれている特別
の因子およびその特定の活性に依存する。

たいていの場合、これらの因子はコラーゲンに基づいて
０．０１〜１％の範囲の量で存在する。

本発明に用いられる血小板は、を椎動物の血液。

好ましくは哺乳類の血液から、脱顆粉化を妨げる条件下
で単離される。このような条件は既知であり、典型的に
は血液を抗凝血剤溶液と混合し、そしてこの混合物から
血小板を遠心分離することを包含する。哺乳類の血小板
は緩衝液で希釈され。

次いで繊維状コラーゲン−ヘパリン混合物に添加される
。血小板の最終的な体積希釈率（これは濃縮血小板の体
積によって表わされる）は、約１：１０〜１　：　１０
．０００．好ましくは１：５０〜１：１００の範囲であ
る。コラーゲンに基づく体積％によって表せば、濃縮血
小板は、この混合物に０．０１〜ｌＯ％。

好ましくは２〜１０％の範囲内のレベルで添加される。

本組成物に用いられ得る血小板放出物は、凝集後に放出
される顆粒成分であって、血管形成活性。

走化活性１分裂促進活性、結合組織の沈着活性。

または表皮細胞増殖活性を有する顆粒成分からなる。血
小板放出物は、血小板を音波処理するかまたは血小板′
Ｍ、濁液を試薬（この試薬は血小板を凝集させ、そして
顆粒成分を放出させる）で処理することによって調製さ
れ得る。このような試薬の例としては、トロンビン、コ
ラーゲン、　ＡＤＰおよび免疫複合体がある。このよう
な処理を実施した後、固体（例えば、細胞片、凝集した
血小板）を例えば遠心分離法によって分離する。この放
出物は、ヘパリン−セファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
）カラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーに
かけて精製し得る。本混合物に用いられた放出物の量は
、コラーゲンに基づいて０．０１〜１０体積％、好まし
くは２〜１０体積％の濃縮血小板に相当する量である。

換言すれば、このような量の濃縮血小板から誘導される
上記の量の放出物が用いられる。

繊維状コラーゲン、ヘパリンおよび因子に加えて１本組
成物の水性製剤は典型的に緩衝剤および塩類を含有する
。これらの緩衝剤および塩類は。

この水性混合物をおおよその生理学的ｐＨおよびイオン
強度（すなわちｐＨ６，８〜７．４；イオン強度（ｒ／
２）０．１〜０．２）で維持する。局所麻酔薬（例えば
、リドカイン（ｌ　１ｄｏｃａ　１ｎｅ）　）　ｒ静菌
薬（例えば、スルファデアジン（ｓｕ　ｌ　ｆ　ａｄ　
ｉ　ａｚ　ｉ　ｎｅ）およびその１艮塩またはナトリウ
ム塩）、抗生物質（例えば、アンピシリン（ａｍｐｉｃ
ｉｌｌｉｎ）　）　、ゲル化剤（例えば、ゼラチン）、
もしくは血清タンパクのような少量の他の添加剤を創傷
治癒組成物に含有させ得る。

繊維状コラーゲン、ヘパリンおよび因子の混合物は、創
傷部位に対し局所的に適用し得る。この組成物は、それ
自体もしくは閉鎖包帯の形で適用し得る。本組成物をそ
れ自体で用いる場合、木組酸物はその粘稠性に依存して
軟膏剤、ゲル剤、ローション剤、噴霧剤、粉剤または糊
状剤として適用される。創傷が陥没している場合２本組
成物は創傷に填入される。本組成物は、好ましくはこの
組成物を創傷部位に保持する手段、そして開放傷の場合
には、水化されたこの組成物を維持する手段と共に通用
される。皮膚創傷に対して、このような手段は、オプサ
イト（Ｏｐｓ　ｉ　ｔｅ）創傷包帯のような、適当な水
蒸気透過率を有する包帯、もしくは本組成物の上に置か
れるおそらく皮膚の移植片または皮膚弁によって例証さ
れる。

閉鎖包帯の形で適用される場合２本組成物を。

繊維状または非繊維状の裏材あるいは海綿のような２合
成の固体支持体あるいは天然の固体支持体に注入するか
、被覆するか、吸着するか、さもなければ塗布し、そし
て得られたこの複合体が創傷部位に貼付けられる。

（以下余白） （実施例） 以下の実施例は２本発明およびその従来技術との関係を
さらに例証するものである。これらの実施例は１本発明
をいかなる様式にも限定することを意図したものではな
い。

Ａ、−ユｊレー々Ｓ乙ニーごバ」ンー　ハ　　入　の言
二説試験的な創傷治癒組成物は、逐次的な方法で調製さ
れた。まず最初に１０ｗ１の市販のウシ真皮の繊維状コ
ラーゲン（ＦＣｉ　３５■／−）を１１ｎ１のヘパリン
（Ｈ；３．３■／−）と混合することによって繊維状コ
ラーゲン／ヘパリン（ＦＣ−Ｈ）を調製した。

第２に、ハートレイ系モルモットから採取した３〇−の
血液から分画遠心分離により標準的な方法を用いて単離
し、そして精製した。最終的な濃縮された脱顆粒化して
いない血小板細胞のベレットを３ｉのタイロード緩衝塩
類溶液（ＴＢＳ）に再懸濁させた。第３に、３つの異な
る希釈率の血小板を含有する複合体を以下のようにして
調製した：ａ）１−の血小板を２−のＦＣ−Ｈと混合し
、最終的な血小板希釈率１／１２を与える（ＰＣ−Ｈ／
ＰＬ−１２）　；　ｂ　’）血小板をＴＢＳで１／１０
に希釈し１次いで１！Ｒ１の血小板を２−のＦＣ−Ｈと
混合する（ＦＣ−）１／ＰＬ−１２０）　　；またはＣ
）血小板をＴＢＳで１　／１００に希釈し２次いで１−
の血小板を２Ｍ１のＦＣ−Ｈと混合する（ＦＣ−）１／
ＰＬ−１２００）。２−の（ＰＣ−Ｈよりむしろ）　Ｆ
Ｃを混合した１ｉの血小板を含有する対照材料も調製し
た。

血小板を分画遠心分離により標準的な方法を用いて単離
した。最終的な洗浄された血小板細胞のベレットを２０
−〇トリス緩衝液（濃度２０ｗＭ、　ｐＨ７，５；０、
１４ＭのＮａＣ１，１５ｍＭのＫＣＩ、　　５　ｍＭの
グルコースおよび２ｍＭのＣａＣ１ｚを含有）に再懸濁
した。トロンビン（７単位／−血小板）を添加して凝集
と放出を誘発させた。室温にて１０分後、凝集した血小
板を４℃にて２０分間、遠心分離法（２２６１０Ｘ　ｇ
　）によって取り除いた。この放出物中の血小板タンパ
クの濃度は、ローリ−分析により６４２μｇ／ｌｓｌと
測定された。血小板放出物は使用時まで一７０℃にて冷
凍貯蔵した。この放出物をインビトロで試験したところ
、ヒトの皮膚の繊維芽細胞の増殖を刺激することが見い
出された。

血小板放出物の一部をヘパリン−セファ０−ズ力ラムの
クロマトグラフィーにかけて次のようにして精製した：
　２０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７，６；　０．１５Ｍ
　ＮａＣ１および１　ｍＭ　ＣａＣ１ｇを含有）で事前
に平衡化されたヘパリン−セファローズＣＬ−６Ｂのカ
ラム（０，７Ｘ９Ｃ１１）に５−の血小板放出物を注入
した。

試料を注入した後、このカラムを同じ緩衝液を用いて、
　　２７８ｎｍにおける吸光度がすっかりバックグラウ
ンドレベルに達するまで洗浄した。カラムに結合したタ
ンパクを２０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７，６；２、Ｏ
Ｍ　ＮａＣ１およびＩ　ｎ＋Ｍ　ＣａＣ１ｇを含有）、
で溶出した。

得られたフロースルー（ｆ　ｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）
フラクション（非結合フラクション）および２月のＮａ
Ｃ１溶出液（結合フラクション）を収集して、プールし
。

さらに０．１Ｍの重炭酸アンモニウム（ｐＨ８）に対し
て透析し、そして凍結乾燥した。凍結乾燥した試料は２
０＋＋＋Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ７，６；　１　ｍＭ　
ＣａＣ１ｚを含有）に再懸濁し、不可溶残留物を遠心分
離によって除去した。クンバク濃度ばローリ−分析によ
って測定した。

放出物またはクロマトグラフィーにかけた放出物を、用
いた血小板の濃縮体積に等しい割合で繊維状コラーゲン
およびヘパリンと混合した。

Ｃ−、！！Ｉ−傷よｙ火 創傷はハートレイ系モルモットの真皮に、６１１の生検
穿孔鋏を用いて創った。これらの創傷をＦＣ。

ＦＣ−Ｈ，ＦＣ−Ｈ／ＰＬ−１２、ＦＣ−Ｈ／ＰＬ−１
２０またはＦＣ−Ｈ／ＰＩ、−１２００の各複合体で充
填１−７２次いでこれらの創傷部位を閉鎖皮膚包帯で被
覆した。創傷部位は。

５日後または１１日後に外科手術Ｑこよって除去され。

固定された。これらの創傷部位を包埋して、切片化し、
そしてＭｉ織学的検査のためにヘマトキシリン−エオシ
ン染色法（Ｈ＆　Ｅ）またはゴモリ三色染色法を用いて
染色することによりコラーゲンを可視化した。

Ｄ、那漕−坪−価− 組織学的パラメターを数値的に評価するために以下の基
準を用いた。

創傷または皮下埋込部位における相対的な細胞数（例え
ば、繊維芽細胞、マクロファージ、好酸球、リンパ球、
形質細胞、多形核好中球（ＰＭＮ）　。

マクロファージ巨大細胞またはアゾイボサイト（脂肪細
胞））を０＝３＋の尺度で類別（７た。ここで、０は目
視可能な細胞が存在しないこと；１十はわずかな細胞が
散在する、：、と；２千は多くの細胞が散在すること；
３Ｆは多数の細胞を含み凝集１．７た塊が存在すること
、に対応１．２でいる。

創傷部位および押込部位の血管分布をＯ＝３＋の尺度で
類別した。ここで、０ＢＪＪＩ視可能な血管が存在しな
いこと；１＋はいくらかの小さな血管が存在すること；
２（・は多くの小さな血管とわずかな大きな血管が存在
すること；３＋ば多くの大きな血管が存在する、τと；
に対応し２ている。

ホストの新しいコラーゲン量をＯ”’　３＋の尺度で類
別した。ここで、新しいコラーゲン（これはわずかに着
色している構成中の微細繊維として定義される）が創傷
面積の１７３までを満たしている場合は１＋；新しいコ
ラーゲンが創傷面積の１／３−２／３を満たしている場
合は２＋；そして新しいコラーゲンが創傷面積の２７３
を越える部分を満たしている場合は３＋、に類別した。

上皮の成熟度も０〜３＋の尺度で類別した。ここで、扁
平細胞からなる薄い上皮は１＋；それほど扁平でない基
底細胞を有するより薄い上皮およびわずかに発育した顆
粒層は２＋；そして円形の基底細胞を有する薄い上皮、
よく発育した顆粒層および広範囲の角質化は３＋、に類
別した。４倍の対物レンズを有する接眼マイクロメータ
ーを用いて上皮の長さと創傷の幅を測定した。これらの
データは接眼マイクロメーターの目盛単位（０，２３龍
＝１目視単位）で報告されている。

表１には創傷部位において観察された細胞の応答が要約
されている。表１に示されたデータは。

第１図〜第４図にグラフの形で与えられている。

（以下余白） ８０表」」ち（墜第ユ旧ヒづ」１凹迦元Ａ」４１Ｌ膨９
甘 肉芽Ｍｉ織の付着、繊維増多、新しいホストのコラーゲ
ンおよび創傷の血管新生は、血小板の量が多いほど増大
した（表１．第１図および第２図）。

表１．第３図および第４図に与えられている形態測定の
結果は、新しい上皮によって被覆された創傷の割合（％
）および５日間で新しく形成された上皮の長さを表して
いる。新しい上皮の量は、　ＦＣ−Ｈ／ＰＬで処理した
創傷の方が血小板を用いない創傷よりも多かった。この
差は統計的に有意であった（Ｐ　＝０．０２）。血小板
で処理した創傷について測定されたこのような差は、創
傷表面および中間の真皮レベルにおいても、血小板で処
理していない創傷より大きかった。ＦＣ−Ｈ／ＰＬで処
理した創傷部位において観察された上皮再形成の割合（
％）の差は比較的小さい（第３図）が、新しい上皮の実
際の長さは、　ＰＣ−Ｈで処理した対照部位の１．７〜
２．１倍であり、またＦＣで処理した創傷部位の２．９
〜３．５倍であったことは重要である。測定値がこのよ
うに明らかに不均衡である理由が、血小板／ＦＣ−Ｈで
処理した創傷における中間の真皮の測定値（表１）が大
きいという発見にあることはほぼ確実である。

この発見は、これらの処理された部位において創傷の拘
縮がそれほどなく、従って新しい上皮によって被覆され
なければならない創傷表面が非常に広範囲に拡がってい
ることを示唆している。創傷部位をＦＣ−Ｈで処理する
とＦＣのみで処理した創傷部位よりも広範囲に拡がる肉
芽組織の付着がもたらされた。しかしながら、このこと
は形態計量分析では確認できなかった（表１．第１図）
、血小板の量が多い場合（すなわち、希釈率が１／１２
の場合）２組織部分に見られる複合体材料は、　！６３
ｉ維芽細胞の浸入によって小さく密度の低い点在する部
分に分散していた。

Ｐ？ＩＮおよびリンパ球を有する部位の炎症は、複合体
を用いたすべての場合に軽微であり、炎症の程度は創傷
部位における血小板の用量には無関係のようである。巨
大細胞が時々３観察されたが。

これらは埋込材料に関連するものではなく、また血小板
を用いて調製された埋込材料を用いた場合によく見られ
るというものでもない。好酸球、形質細胞または脂肪細
胞はまったく観察されなかった。

表１に与えられている結果には、さらに血小板を有する
ＦＣおよび血小板を有さないＦＣで充填された創傷部位
におけるＭｉ織学的発見が要約されている。血小板の濃
度が高い創傷は、　ＦＣまたはＦＣ−１１のみを与えら
れた対照よりも繊維増殖が顕著であり（第１図）、また
血管が小さい（第２図）。血小板を含む創傷における上
皮形成は不完全ではあるが、新しい上皮表面の長さはＦ
Ｃを含む対照創傷よりも長い（表１．第３図〜第４図）
　　；ＦＣ／ＰＬを含む創傷の上皮再形成の度合はＦＣ
−Ｈを含むが血小板を含まない創傷より大きく　、　Ｆ
Ｃ’−Ｈ／ＰＬを含む創傷より小さい。ＦＣ複合体は、
微細繊維状の下部構造を有するコラーゲンからなる。大
きくて密度が高く、そして均質な塊として目視された。

この複合体内には、連装または不規則な空隙が多少見ら
れた。複合体に血小板を含有させると、この複合体は繊
維芽細胞および新しいコラーゲンが浸入することによっ
て分離された１点在する小さな部分に分割された。この
複合体内には、少数のリンパ球。

ＰＭＮまたは巨大細胞が見られた。好酸球、形質細胞ま
たは脂肪細胞はまったく観察されなかった。

いろいろな量の血小板を用いた日数１１の場合の創傷間
の組織学的な差は９日数５　（上述）の場合はど顕著で
はなかった。すべての創傷は新しい上皮によって完全に
被覆された。そして上皮の質は複合体中の血小板の数に
関係しているようであり。

血小板の数が多いほど上皮の質は高かった（表１）。

これらの場合２表皮はより厚＜、多くの円形の基底細胞
を存していた。そしてこの表皮は、より明確なケラトヒ
アリン層との分化が増大し、角質化が進んでいた。すべ
ての創傷において見られる複合体は日数５の場合よりも
少な（、この複合体は繊維芽細胞が十分に浸入していた
。各群において見られる肉芽組織および新しいコラーゲ
ンの量は同一であった（表１）。高濃度の血小板で処理
した創傷はど多くの血管が見られたが、このことは数値
分析によって確認されなかった（表１）。軽微な炎症プ
ロフィールが観察された：すなわち。

これらの組織部分に観察されたリンパ球、マクロファー
ジ、巨大細胞および核凝縮した好中球はほんのわずかで
あった。

ｂ、　ハ　　　　る　゛　　コーー゛ン：１１すべての
創傷が完全に上皮再形成されていた。

上皮の質はＦＣ−血小板複合体で処理した創傷部位にお
いて明らかに良好であった（表１）。これらの場合１表
皮はより厚く、多くの円形の基底細胞を有していた。そ
してこの表皮は、より明確なケラトヒアリン層との分化
が明らかに大きく増大し。

角質化が進んでいた（表１）。ＦＣ−血小板で処理した
創傷部位は、繊維増殖および血管新生が対照の創傷部位
はど顕著には現れなかった。ＦＣ複合体は血小板の用量
が大きいほどよ（分散していたが。

これは明らかに繊維芽細胞が浸入することによってこの
複合体が分割されたためである。ホストの新しいコラー
ゲン合成が各部位で見られた。観察されたリンパ球、巨
大細胞および核凝縮した好中球は少数であった。形質細
胞はまったく認められなかった。

組織学的な評価に加えて、動物の血清学的評価を献体か
ら採取した血液を用いて行い、コラーゲンまたはコラー
ゲン−血小板複合体に対する抗体についてＥＬＩＳＡを
行った。コラーゲンまたはその複合体に対する抗体を発
生させた動物はなかった。

複合体の試料を同じ動物の創傷部位に隣接した皮下組織
の部位にも入れた。埋込物は５日後または１１日後に除
去した。有意の繊維増殖、新しいコラーゲンの形成、炎
症、または繊維細胞による埋込物の被包は観察されず、
従って制御できない発育の可能性は認められなかった。

上述したモルモットモデルにおける各種の生体材料を２
年間以上にわたって試験したところ、血小板を含有する
複合体は、創傷治癒の速さが有意に増大することを示し
た唯一の材料であった。この複合体が創傷治癒の程度を
増大させることを示すデータも存在する（血小板／ＦＣ
−Ｈ複合体は創傷の拘縮を抑制する）、拘縮がケロイド
または過形成性廠痕の形成に関係する場合９本復合体は
傷痕を残さない治癒の機構を与え得る。

ヘパリン（２５０μｓ／ｍｊ）を有するかまたは有さな
い純粋な繊維状コラーゲン（２５■／ｍｆ、　ＺＹＤＢ
ＲＭｅコラーゲン）の水性懸濁液を無菌条件下で各種の
ペプチド成長因子と混合し、コラーゲン、ヘパリン（含
有する場合）および成長因子の最終濃度をそれぞれ２５
■／ｄ、　　２５０μｇ／−および２〜８μｇ／−とし
た。滅菌したポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）
製延伸チューブ（直径ＩＮ、孔の大きさ９０μ１１１）
にコラーゲン／成長因子の混合物を充填し、麻酔をかけ
た成体の［ＳＤクラット腹部の皮下に挿入した。１０日
後、このチューブを除去し、断片に分割してＤＮＡ含量
の分析およびＭｉ織学的評価を行った。これらの測定に
よって、創傷修復を目的とした部位における細胞および
血管の数、および／またはこの部位において増殖した細
胞および血管の数が与えられる。ＤＮＡ含量は１双のチ
ューブ断片（長さ５ｍ）について測定された。組織学的
評価はパラフィンに埋め込まれたＨ／Ｅ切片標本につい
て行った。細胞数は同一チューブの別個の断片における
３１の格子について計数した。ＤＮＡ測定および組織学
的評価の結果を以下の表２に示す。

（以下余白） ＰＤＧＦのみ、　ＦＧＦのみ、あるいはＰＤＧＦとＦＧ
Ｆの組み合わせを含有するコラーゲン／ヘパリン複合体
は、試験を行った他の複合体よりも平均の細胞数が実質
的に多いことを示した。

試験した濃度では、　ＴＧＦ−βはヘパリンの有無によ
って影響を受けないようであり、またＴＧＦ−β。

コラーゲンおよびヘパリンからなる組成物は分裂促進活
性またはＭｉ織学的活性を示さなかった。しかしながら
、　ＰＤＧＦおよび／またはＦＧＦを含有する上記に対
応した組成物はこれらの活性を示した。

これらの試験において、　ＰＤＧＦ、　ＦＧＦ　、コラ
ーゲンおよび−・バリンの組み合わせが明らかに最高の
活性を示した。

（発明の要約） 本発明は軟組織の創傷治癒象■酸物であって、繊維状コ
ラーゲン、ヘパリン、および有効量の成長因子、走化因
子または分化因子、好ましくはＦＧＦまたはＰＤＧＦの
混合物からなる組成物に関する。ここで、上記の因子は
合成的または精製された因子。

あるいは脱顆粒化していない血小板または血小板放出物
の形で混合され得る。

■−図頁■皿ニーな一説一■ 第１図は以下に記述の組織学的検査の結果を表すひと組
の棒グラフである。この図は試験に用いた各組成物で処
理した創傷部位の組織学的な切片標本における明白な繊
維増殖を示している。

第２図は以下に記述の組織学的検査の結果を表すひと組
の棒グラフである。この図は試験に用いた各組成物で処
理した創傷部位の組織学的な切片標本における明白な血
管新生を示している。

第３図は以下に記述の組織学的検査の結果を表すひと組
の棒グラフである。この図は試験に用いた各組成物で処
理した創傷部位の組織学的な切片標本における明白な上
皮再形成を示している。

第４図は以下に記述の組織学的検査の結果を表すひと組
の棒グラフである。この図は試験に用いた各組成物で処
理した創傷部位のＭｉ織中学的切片標本における明白な
総上皮長（接眼マイクロメーターの目盛単位）を示して
いる。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、軟組織の創傷治癒組成物であって、 （ａ）繊維状コラーゲン； （ｂ）コラーゲンを基準にして約０．１〜約１０重量％
   のヘパリン、ヘパリン類似のグリコサミノグリカンまた
   はこれらの混合物；および （ｃ）少なくとも１つの走化因子、成長因子または分化
   因子の有効量、 の混合物からなる組成物。 ２、前記因子が血小板由来増殖因子、繊維芽細胞成長因
   子またはこれらの混合物である、特許請求の範囲第１項
   に記載の組成物。 ３、前記因子が脱顆粒化していない血小板または同等量
   の血小板放出物の形をとる特許請求の範囲第１項に記載
   の組成物。 ４、前記繊維状コラーゲンが I 型コラーゲン、III型コ
   ラーゲンまたはこれらの混合物である特許請求の範囲第
   １項、第２項、または第３項に記載の組成物。 ５、前記繊維状コラーゲンが再生繊維状コラーゲンであ
   る特許請求の範囲第１項、第２項、第３項、または第４
   項に記載の組成物。 ６、前記血小板由来増殖因子または前記繊維芽細胞成長
   因子がヒトの血小板由来増殖因子またはヒトの繊維芽細
   胞成長因子であり、前記脱顆粒化していない血小板また
   は前記血小板放出物がヒトの血小板またはヒトの血小板
   放出物である特許請求の範囲第２項、または第３項に記
   載の組成物。 ７、創傷治癒組成物を担持する固体支持体からなる創傷
   包帯であって、該創傷治癒組成物は （ａ）繊維状コラーゲン； （ｂ）コラーゲンを基準にして約０．１〜約１０重量％
   のヘパリン、ヘパリン類似のグリコサミノグリカンまた
   はこれらの混合物；および （ｃ）少なくとも１つの走化因子、成長因子または分化
   因子の有効量、 の混合物からなる。