JPS63503194A - ヘパリン検定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヘパリン検定 発明の背景 本発明はヘパリンを検定する特異的方法に関する。

ヘパリンはトｐンビンーフィブリノゲン血液凝固（ｅｌｏｔｔｉｎｇ　）系の抑 制剤であり、クロット生成の防止が重要である処置を受ける患者、例えば体外血 液循環及び／又は治療を受ける患者に用いられる。

全血中のへ７１リンのレベルは多くの方法で測定することができ、最も簡単な方 法は活性化凝固時間（ＡＣＴ）の測定である（バッターレイ（Ｈａｔｔ＠ｒａｌ ＊ｙ）、１９６６Ｊ、Ａ、Ｍ、Ａ、１９１４３６）。この方法はけいそう土で処 理した血液が凝固するのにかかる時間を測定する。血液中の生理学的に活性なヘ パリンの量とりレットが生成するのくかかる時間遅れとの間に直線関係がある（ プル（Ｂｕｌｌ）等、１９７５、Ｊ、　Ｔｈｏｒａｅ、　Ｃａｒｄｉｏｖａｓｅ ＳＳｕｒｇ。

６９：６８５）。現在性なわれている心臓外科のほとんどのタイプは北米におい て１年当り約４００．ＯＤＤの冠バイパスを含み、患者の高レベルのヘパリン化 及び心肺のバイパスの間に体外酸素付加サーキットを必要とする。ヘパリン逆転 を常習的に処置の終りに静脈内硫酸プロタミンによって行ない及び患者の凝結状 態は活性化凝固時間を監視することＫよってたどる。プロタミンを用いることに よる致命的な反応を含む多くの合併症が説明されてきた。

ヘパリン逆転は本方法によって必ずしも完全とは言えず加強的医療ユニットにお いて追加のプロタミンを必要とするかもしれない。また、手揄後数時間で患者を 復温する間にヘパリン活性が脂肪貯蔵から動員される「ヘパリン−リバウンド」 の現象が説明されてきて及びこの期間中の温度の出血の一因になり得る。第２の 方法はヘパリンの化学的測定を必然的に伴う。この方法は発色団であるアズ−、 ＩＩ／Ａを用いる（クライン（Ｋｌｅｉｎ）等、１９８２、Ａｎａｌ、　Ｂｌｏ ｃ、　１２４　：　５９）　にの化学的検定は生理学的検定と異なり他の抗凝固 薬の存在によって側番されずヘパリンの生理学的及び非生理学的に活性な両方の ７ラグメントを検出せず、それで血液を体外的に循環或は処理する間或は後のヘ パリン及びプロタミン治療を管理するのに適当でない。

血液凝固に側番する他の所定の因子の分析はハツト（Ｈｔ＋ｔｔ）等、１９７２ 、Ｊ、　Ｌａｂ、　Ｃ１１ｍ、Ｍｓｄ、　７９　：　１０２７に記載され、部分 精製したヘパリナーゼをプルトロンビン及び部分トロンボプラスチン時の実行に 先立って血漿サンプルに加えた。ヘパリン作用の排除がこれらの凝結試験につい て立証されたが、酵素の使用は凝結状態の他の尺度に伸展されなかった。著者は 下記の記述によって論文の終りＫし【いる： 「この試薬の利用可能性はヘパリン治療を受けているひどい病気の入院患者にお ける凝結機構を詳細に検査することを可能にしよう。ヘパリナーゼの使用が有用 になるであろう特異的臨床状況は、（１）すでにヘパリンで治療されている播種 性の脈管内凝結を有する患者：（２）ヘパリンからクーマシン（ｃｏｕｍａｄｉ ｎ　）治療に変わっている心節梗塞或は静脈血栓塞栓病を有する患者である。標 準化量のヘパリナーゼを常習ペーシスで市販の凝結検定試薬に加え、こうしてヘ パリンによる思いも寄らない血漿汚染から誤りが生ずるのを回避することが完全 に可能である。」このレポートに記載されている凝結試験及び方法は心臓血管手 術の必要に適用し得ない。ヘパリナーゼはまた患者に戻す前に血液を脱ヘパリン 化するためにも用いられてきた（ランガー（Ｌａｎｇｖｒ　）等、１９８２、サ イエンス２１７：２６１）。

ヘパリン−ＡＣＴ　（作用）投与一応答法は心臓血管手術においてヘパリン及び プロタミン治療を著しく向上させたが、いくつかの問題が残っている。外科的処 置の終りにおける完全なヘパリン逆転にもかかわらず、いく人かの患者は「ヘパ リンリパウンド」と呼ばれる早い（８時間まで）ｖ＃後期間にヘパリンに関係し た凝結欠損を発生する（エリスン（Ｅｌｌｌｍｏｎ）等、１９７４Ｊ、Ｔｈｏｒ ａｅ。

Ｃａｒｄｌｏｖａ＊ｃ、　Ｓｕｒｇ、　６７　７２ｊ−７２９）６　ＡＣＴは長 引かされることになり及び特異的治療は一層多くのプロタミンを必要とする。他 方、心肺バイパス及び体外循環はヘパリンに関係しない数多くの第２凝結欠損を 誘発し得る。

このような欠損は血液希釈、低温症、血小板障害、播種性凝結成はフィブリン溶 解によって引き起こされ得及び手術室或は術後期間における出血傾向として現わ れ得る。

ＡＣＴはこれらの障害によって長引かされることから、出血傾向はヘパリンに起 因され得る。しかし、これらの第２の凝結欠損はプロタミン可逆性でない。ヘパ リン活性の特異的及び迅速な定量は利用可能でなく、はとんどの患者はこの状態 でプロタミン及び血液生成物により「ショットガン」方式で治療される。よく知 られたプロタミン治療の危険は第２の凝結欠損の特異的確認を極めて望ましい目 的にする。

発明の要約 発明は、−面において、血液サンプル中の活性な抗凝血性ヘパリンの迅速な特異 的測定方法を特徴とする。方法はサンプルを２又はそれ以上の７リコートに分は 及びヘパリン分解性化合物、好ましくはヘパリナーゼをこれらの内の１つに加え ることを含む。

発明のその他の特徴及び利点は好ましい実施態様についての下記の説明及び請求 の範囲の記載から明らかになるものと思う。

好ましい実施態様の説明 図はへｌ（リナーゼ治療を有する或は有しない活性化凝固時間（ＡＣＴ）の結果 をグラフ的に表示するものである。

血液サンプルは任意の標準手段によって得ることができる。これらのサンプルに おいて血液凝固速度に影響する因子の量の測定は、任意の標準方法、例えば全血 凝結時間（ＷＢ　ＣＴ　）或は活性化凝固時間（ＡＣＴ）によって行なうことが でき、これらの両方において、測定はへバリン濃度に対し直線関係な有する（ヤ ング（Ｙｏｔ＋ｎｇ）、１９８２、Ｉｎ　Ｕｔｌｅｙ（ａｄ）　Ｐａｔｈｏｐｈ ｙｓｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｔ＠ｅｈｎｌ　−ｑｕｅｓ　ｏｆ　ｃａｒｄｌｏｐ ａｌｍｏｎａｒｙ　ｂｙｐａｓｓ、１巻、ウイリアミズ及びウイルヤング、バル チモ７８Ｂ−１０５頁）。各検定を第一に例えばＷＢＣＴ及びＡＣ丁試験におい て標準化して関係及び直続関係が真実であり続ける時間限界をめるべきである。

ＡＣＴ試験の場合、これは１００−６００秒である。

血液サンプル内のヘパリンを分解するために、任意の酵素或はヘパリンに対し特 異性の他の分解性試薬を用いることができる。フラボバクテリウムへバリウム（ Ｆ１ａｖｏｂａｅｔ＠ｒｉｔ＋ｍ　ｈ＠ｐａｒｉｔ＋ｍ　）から単離した酵素ヘ パリン活性を用いるのが好ましい。この酵素はヤング（Ｙａｎｇ）標準の手順に よって一部精製した形で容易に単離することができる。手短かく言えば、これは ヒト四キシルアパタイトクｐマドグラフィー、ゲル濾過りｐマドグラフィー、り 田マトホーカシングによる酵素の精製を要する。

好ましくは、次いで酵素を更に過剰の蒸留水に対して３回透析させ、１５Ｉｓ（ α２−α４ｗ９タンパク質／倒３）アリコート中−２０℃において６−２４時間 凍結させ、真空中凍結乾燥させることによって精製する。かかる酵素標本は０℃ において６週間より以上の間保存することができる。一実施態様において、酵素 を実際５−５ｃｍ”の注射器内で凍結乾燥させてもよく、該注射器はパッケージ 或は容器として働き及び後に血液サンプルを得るのに使用してもよい。ヘパリナ ーゼの使用量は、検定するサンプル中に存在するヘパリンの最大量を分解するの に必要とする量より過剰である限り臨界的なものではない。通常、血液のサンプ ル各２−について精製ヘパリン活性１０−５０ユニツト（タンパク質５０−１５ ０μり）が適当である。（ヘパリナーゼ１ユニットは３７℃において１時間当り ヘパリン１■を分解する：ヘパリン１岬は１５０ユニツトのヘパリン活性を有す る）。

ヘパリンについての検定は血液サンプルの２つの７リコートについて同時に標準 の血液凝固試験を行なうことを含む。この試験の前Ｋ或は間に、２つのアリコー トの内の１つをヘパリナーゼで処理しなければならない。２つの測定の間の差異 が血液サンプル中のヘパリンの量の直接の尺度であり及びヘパリンの精確な量は 図に示す通りの標準カーブから推定することができる。

ヘパリナーゼによる処理は血液サンプルを過剰のヘパリナーゼと固体状で或は溶 液で穏やかに混合することを含む。例えば、ヘパリナーゼ粉末を収容する注射器 を含む検定キットを提供することができる：血液サンプルを注射器内に吸い込み 及び注射器を穏やかに１０秒間逆さにすることができる。この方法は室温（１５ −２５℃）において行なうことができる。

ニットのヘパリンで体外で（・Ｉ−マｔｗｏ）ヘパリン化した。

各血液サンプル２　ｃｐｓ　”アリコートについて人ＣＴ試験を行ない、同時に 各血液サンプル２ｃＭ”アリコートを、透析及び凍結乾燥させたヘパリナーゼ１ ６２９（４７：ｘ、ニット）を収容する注射器の中に引き、注射器を穏やかに１ ０秒間逆さにすることによって混合し及びサンプルについてＡＣＴ試験を行なっ た（Ｉ（ＡＣＴ試験）。ヘモクロン（Ｈｅｍｏｃｈｒｏｎ　）　４００装置（イ ンターナショナルテクニダインコーポレーション）を使用してＡＣＴ及びＨＡＣ Ｔ試験を行なった。結果を下記に示す： 試験血液　１２　３　４５６７Ｂ　平均及びＳ、Ｄ。

ＡＣＴ対照　９３１（Ｎ　９２１１１　１０７１１２　９４１０２１ｏｔ５＋／ −ｓ、。

ＨＡＣＴ対照　１１５　Ｂ？Ｓ　ｑｑ　１００．　８７１２６９５　９８　ｔｏ ｎ、ｓ＋／−１３，３人ＣＴヘパリン　７０１　７９８　４５９　６５２　４０ ４　５１７　６４３　６３Ｂ　６０ｔ５＋／−１３ｔ２ＨＡＣＴ−ｕξミリン１ １８　１１８　１１５　１１６１１６１１　１０２　１１５　１１＆２＋／−７ ，８ＡＣＴ及びＨＡＣＴ対照はヘパリンを含有せず及びＡＣＴ試験において同様 の結果を与えた。対照的に、ヘパリン含有サンプルは、ヘパリナーゼ処理しない で、大きく伸びた凝固時間を示した。これらのサンプルは、ヘパリナーゼ処理し た後に対照よりずっと低いが大きい凝固時間を有していた。ＨＡＣＴ対照結果及 びＨ［ＡＣＴヘパリン結果の間の差異は非ヘパリン血液凝固因子の存在を表わし 得る。

ＨＡＣＴ試験の特異性をめるために、クエン酸塩（ｅｌｔｒａｔ・）をいくつか のチューブに加えて上記の検定を繰り返した。過剰のクエン酸塩（１５−ｓＱを 各チューブに加え、次いで血液をα１％ＣａＣＣａＣ１４ｌで一部再石灰化して 部分的であるが測定可能な凝結欠損を与えた。

この添加は血液中のカルシウムの不足をシミュレートするもので、ヘパリンのレ ベルに関係がない。特徴的な結果を下記に示す： ９８秒　２１６秒　６５３秒　２９９秒これらの結果は、血液中にクエン酸塩の 存在することが、ヘパリンの存在しない場合でさえ、ＡＣＴ結果を増大すること を示す。ヘパリンのレベルはＡＣＴ結果及びＨＡＣＴ結果の差異、すなわち４２ ４（６５３−２２９）秒であるので、この問題を解消する。この図はヘパリンレ ベルの正確な尺度として用いることができる。検定結果は迅速に（１１分以内で ）−へ／々リンを除く処理を必要とする場合の臨界的要因−得られたことを注記 する。

上記の検定の結果を図に示す。実線はＨ人ＣＴ／ＡＣＴ試験結果をヘパリン濃度 に関係させるために行なった検定から推定した標準カーブを表わす。上記のクエ ン酸塩検定において、ＡＣＴ結果は６５３秒であった。医師がこの値を実際のヘ パリン濃度を代表していると見るならば、その場合等量のプロタミン（５ユニツ ト）を加えてヘパリンを中和するであろう。ＨＡＣＴ結果は２２９秒の値を与え 、差は２２４秒であった（図上、完全な円とじて示す）。この値は血液中かなり 少ない量のヘパリン（３ユニツト）に相当する。すなわち、ＨＡＣＴ結果が無け れば、医者はほとんど７０％過剰のプロタミンを加え、おそらく患者を危うくさ せることになろう。後者のＡＣＴ試験の結果を用いてヘパリン濃度を推定するな らばとのヘパリン濃度の過大計測は繰り返されることになろう、というのは、過 剰のプロタミンの添加でさえ、その高いレベルがヘパリンによるのでなくプロタ ミンによって除かれない他の因子によって引き起こされる場合に、ＡＣＴ値を通 常のレベルにもたらさないからである。ＨＡＣＴ試験により、医師はヘパリン原 因の作用を特異的に治療し及び非ヘパリン作用を知ることができる。

この検定は血液透析、体外膜ｒＲ素付加、心肺バイパスの間に全身系の抗凝血作 用の合併症を患う多くの患者、特に子供を治療する医師にとって有用である。ま た、この検定はヘノリンのレベルを知ることが重要である他の全ての状態におい て有用である。

ヘパリナーゼは注射器内で凍結乾燥粉末として用いる必要はなく、液体として溶 液で及び任意の容易に入手し得る装置或は系、例えばテストチューブ或は酵素を 必要とする通りに分配することができる自動化機械でさえも含むキットで用いる ことができる。同様に酵素はビーズ或はフィルターに固定させ及びこの形でＡＣ Ｔ’／ＨＡＣＴ試鹸の前に用いて血液サンプルを処理することができる。

ヘパリナーゼ処理した及び非処理のサンプルの血液凝固時間の同時測定は必須で はないが、測定をある時間離して行なう場合よりも正確な結果を与える。同様に 、ヘノ（リナーゼは血液凝固時間を測定する直前よりもむしろ測定時に加えるこ とができる。

その他の実施態様は以下の請求の範囲内である。

手続補正書（方式） ％式％ 補正をする者 事件との関係　特許出願人 〒１０３ 住　所　東京都中央区日本橋３丁目１３番１１号油脂工業会館同 補正の対象 特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の特許出願人の欄 明細書及び請求の範囲の翻訳文　各１通図面の翻訳文　１通 委任状および翻訳文　各２通 補正の内容　別紙の通り 明細書、請求の範囲及び図面の翻訳文の浄書（内容に変更なし）国際調査報告

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. １．血液サンプル中のヘパリンの特異的測定方法であって、該サンプルを少なく とも２つのアリコートに分け、へパリン分解性化合物を該第１アリコートに加え 、該第１アリコート及び第２のヘパリン分解化合物処理しないアリコートの凝固 時間を測定し、該第１及び第２アリコートの凝固時間の差異を該血液サンプル中 のへパリン量の尺度として求めることを含む方法。
2. ２．前記ヘパリン分解性化合物がへパリナーゼである特許請求の範囲第１項記載 の方法。
3. ３．前記へパリナーピを前記第１アリコートに加える前に透析し及び凍結乾燥す る特許請求の範囲第２項記載の方法。
4. ４．前記凝固時間を活性化凝固時間或は全血凝結時間として測定する特許請求の 範囲第２項記載の方法。
5. ５．へパリン分解性化合物を含む系を含む血液サンプル中のへパリンのレベルを 求めるテストキツト。
6. ６．へパリン分解性化合物がへパリナーゼである特許請求の範囲第５項記載のキ ット。
7. ７．前記系が血液採取注射器、テストチユーブ、ビーズ或は前記へパリナーゼを アリコートすることができる機械である特許請求の範囲第６項記載のキット。
8. ８．前記へパリナーゼが透析し及び凍結乾燥した標本の形である特許請求の範囲 第６項記載のキット。