JPS63503193A

JPS63503193A - 耐基質および生成物性のメタノ−ルオキシダ−ゼによるアルコ−ルのアルデヒドおよび過酸化水素への変換

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Publication number: JPS63503193A
Application number: JP62501317A
Authority: JP
Inventors: ホイバーグ，デイン・エイ; ハットフィ−ルド，ジ−・ウェズリ−; モイド，ハリス・エス; シャープ，ジャニス・エイ
Original assignee: アメリカン・バイオジェネティックス・コ−ポレ−ション
Priority date: 1986-02-04
Filing date: 1987-02-04
Publication date: 1988-11-24
Also published as: EP0292503A4; WO1987004725A1; AU597947B2; EP0292503A1; AU7034787A; US4920055A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】耐基質および生成物性のメタノールオキシダーゼによるアルコールのアルデヒドおよび過酸化水素への変換発明の背景この発明は、メタノールもしくはエタノールのような低級アルキルアルコールを、酸素の存在下に、ホルムアルデヒドもしくはアセトアルデヒドのような低級アルキルアルデヒドおよび過酸化水素に変換するメタノールオキシダーゼ（ＥＣ１，１，３，１３）酵素の利用に関するものである。

ホルムアルデヒドの通常の工業的な製造方法は、銀もしくは金属酸化物の触媒の存在下における３００〜６００℃での空気中でのメタノールの触媒的酸化である。得られる生成物は蒸留によって精製される。典型的な最近の方法では、約９０％の化学量論的な収率が得られている。製造されたホルムアルデヒドの価格は、消費されたメタノールの価格のおよそ３倍である。ホルムアルデヒドの典型的な製造方法は、米国特許第２８１２３０９号および第２８４９４９２号に開示されている。１９８４年のホルムアルデヒドの米国における生産量はおよそ５７億ボンドであった。

ホルムアルデヒドは、主に尿素−ホルムアルデヒド、フェノールおよびメラミンポリマーを含むポリマーの生産に用いられている。

アセトアルデヒドを合成する最も一般的な方法は、おそらく塩化パラジウム触媒によるエチレンの液相酸化である。

またアセトアルデヒドはエタノールの部分的酸化によっても製造される。単位ボンドあたりのアセトアルデヒドの価格は、エタノールの価格のおよそ５０％以上である。１９８３年おけるアセトアルデヒドの米国における生産量はおよそ５億６０００万ポンドであり、世界生産量は２３億ボンドに達する。アセトアルデヒドは、酢酸、無水酢酸、ｎ−ブタノールおよび合成香料などを含む数多くの生産物の合成において重要な前駆体である。

過酸化水素（Ｈ２０２）は、通常２−エチルアントラヒロドキノンのようなアルキルアントラハイドロキノンの酸化により製造される。この方法では、出発物質がキノンに酸化され、続いてパラジウム触媒の存在下に水素によって出発物質にまで還元される。。

１９８４年における過酸化水素の米国における生産量は約３億７５００万ポンドであった。１モルをベースとした過酸化水素の価格は、およそメタノールの７倍である。過酸化水素は織物および木材バルブに対する漂白および脱色剤として、ならびに化学プロセスにおける酸化剤として広く利用されている。また、リグノセルローズの残渣（小麦の麦わら、トウモロコシの穂軸およびトウモロコシの茎）を反御動物の家畜による消費に適するようにさせることもできる。Ｍ、Ｓ、　Ｋｅｒｌｅｙ等による５ｃｉｅｌｃｅ２３０．８２０〜８２２　（１９８５）を参照。

近年、いくつかの微生物がメタノールを炭素源として利用できる可能性を有していることが確認された。このような生物の１つがＨａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（ハンセヌラ　ポリモルフ）である。この生物のメタノール利用のメカニズムの最初のステップは、メタロールのホルムアルデヒドおよび過酸化水素への好気性酸化である。

ＣＨ１ＯＨ２＋０２　→　ＨＣＨＯ＋Ｈ２０２生体系の中では、得られた過酸化水素は即座にカタラーゼによって酸素および水に分解される。

メタノールからホルムアルデヒドを製造する工業的な製造法に、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａからのメタノールオキシダーゼ（ＥＣ１，１，３，１３）を用いる可能性は、Ｂａｒａｔｔｉ等によって検討された。この研究は、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ、１ｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉ。

ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　１０．　３３３−３４８　（１９７８）に記録されている。Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａＤＬ−１（Ｌｅｖｉｎｅ　ｅｔ　ａｌ、。

Ａｐｐ　１．　Ｍｉ　ｃ　ｒｏｂ　ｉ　ｏ　１．　２６．　９８２　（１９７３））を用いて、著者等はメタノールのホルムアルデヒドおよび過酸化水素への変換における触媒作用における結合および非結合の形態でのメタノールオキシダーゼの活性を研究している。この方法は非常に低いメタノール濃度では成功したが、メタノール濃度がリッターあたり１００ミリモル（ｍ　Ｍ　）より過剰になると酵素が本質的に不活性になった。１００ｍＭの濃度は、容積で約０６４％メタノールの水溶液に相当する。これは工業的に可能なプロセスに対して必要なメタノールの原料濃度以下である。

原料濃度に関連した他の潜在的な限定要因は、生成物濃度である。工業的なプロセスにおいては、経済的な生成物の分離および回収が許されるほど十分に高い生成物濃度を達成することが重要なことである。過酸化水素による酵素の不活性化は、明らかにＢａｒａｔｔｉ等により開示された製造方法の有用性を制限するものである。

それゆえに、この発明の目的は、容積で０．５％より多いメタノール濃度の利用を許容する、アルコールのアルデヒドおよび過酸化水素への酵素による変換のプロセスを提供することにある。

この発明の他の目的は、容積で０．５％より多い生成物濃度の増加を許容する、アルコールのアルデヒドおよび過酸化水素への酵素による変換のプロセスを提供することに我々は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）の受入番号第３４４３８号のＨａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａの特別の菌種から誘導されたメタノールオキシダーゼを含む成る種のメタノールオキシダーゼの酵素が、アルコールのアルデヒドおよび過酸化水素への変換の工業的に可能性のある方法に使用することができ、アルコールの原料および生成物濃度を５％もしくはそれ以上にできることを発見した。これは、従来技術において議論したプロセスをはるかに超える重大な改善であることを意味している。この微生物の培養は工業的に利用可能であり、米国、メリーランド２０８５２．ロックビル。

パークローンドライブ１２３０１．アメリカン・タイプ・カルチャーコレクションのカタログから入手したものである。

したがって、この発明は生体外でのアルコールのアルデヒドおよび過酸化水素への酵素による変換のプロセスを含み、水、低級アルキルアルコールもしくは低級アルケニルアルコール（すなわち５もしくはそれより少ない炭素数を有する）好ましくはメタノールもしくはアリルアルコール、およびメタノールオキシダーゼを、反応領域に導き、前記プロセスの間どこかの部分でアルコールの濃度が容積で少なくとも０．５％である反応混合物を形成するステップと、反応混合物中で大気圧より大きな圧力下で酸素を含んだガスとともに少なくともいくらかの水と接触させることにより反応混合物に酸素を添加するステップと、反応混合物中のアルコールをアルデヒドおよび過酸化水素に酵素により変換するステップとを備えている。

この発明の範囲内にある一実施例においては、メタノールオキシダーゼが低級アルキルもしくは低級アルケニルアルコールをアルデヒドおよび過酸化水素に変換するプロセスに用いられており、ここでは本質的にアルコールを酸化する性質およびその酵素の安定性を減滅することのない変形のみによって、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａＡＴＣＣ３４４３８の遺伝子のものと区別される塩基配列をメタノールオキシダーゼが有するように遺伝子が書き直される。

この発明の好ましい実施例に従えば、アルコールの原料水溶液は少なくとも容積で１％のアルコールであり、好ましくは容積で少なくとも２％もしくは３％のアルコールであり、さらに好ましくは容積で少なくとも４％もしくは５％のアルコールである。

この発明の他の好ましい実施例においては、アルデヒドもしくは過酸化水素の生成物濃度は少なくとも容積で０゜好ましくは容積で少なくとも２％もしくは少なくとも３％のアルデヒドもしくは過酸化水素であり、さらに好ましくは容積で少なくとも４％もしくは５％のアルデヒドもしくは過酸化水素である。明らかに、所定のアルコール濃度を維持するため反応領域にアルコールを継続的に導入することを含むプロセスにおいて、所定の濃度よりも高い生成物濃度が時間外に達成されるかもしれない。

好ましくは、少なくとも１．５もしくは２気圧の下で、酸素が反応混合物に添加され、再循環され得る。低い沸点のアルデヒド生成物は、この再循環ガスにより濃縮することができる。

好ましい一実施例では、この発明の製造方法はアルコールの水溶液にメタノールオキシダーゼをバッチ式プロセスによって混合することを含む。他の好ましい実施例では、この発明の製造方法はメタノールオキシダーゼによりアルコールをアルデヒドおよび過酸化水素に変換する連続的なプロセスである。この連続的なプロセスにおいては、酵素は適当な支持体に固定することができ、その上もしくはその中をアルコール溶液が通過する。これに代えて、半透過性の膜もしくはフィルタの系を用い、反応領域中にメタノールオキシダーゼを保持し、その一方でアルコールが反応領域に入り、反応生成物が反応領域から去るのを許容させてもよい。

この発明のさらに他の好ましい観点に従えば、生成したアルデヒドを生成した過酸化水素から分離するステップを含む。１つの適当な分離技術は蒸留であり、これによりアルデヒドはより高い沸点の過酸化水素から蒸留され分離される。もしカタラーゼを用いて反応中生成した過酸化水素を酸素と水に分解させれば、正味の生成物はアルデヒドである。

この発明のさらにその他の観点によれば、上記のプロセスは特定の低級アルキルおよび低級アルケニルアルコールをそれらのそれぞれのアルデヒドおよび過酸化水素に変換するのに用いることができる。例としては、エタノールのアセトアルデヒドおよび過酸化水素への変換、メタノールのホルムアルデヒドおよび過酸化水素への変換およびアリルアルコールのアクロレインおよび過酸化水素への変換である。

この発明の特別の好ましい実施例では、メタノールオキシダーゼ酵素はＨａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａＡＴＣＣ３４４３８と本質的に同じアミノ酸配列を有しており、酵素は好ましくはＨａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏ１３／ｍｏ　ｒｐｈａＡＴＣＣ３４４３８がら誘導されたものである。

上記プロセスのすべてにおいて、反応混合物のｐＨは、好ましくは約６．５および９の間に維持され、さらに好ましくは約７および８の間である。このｐＨは、炭酸もしくは重炭酸緩衝液のような揮発性の緩衝液により調製することができる。重炭酸アンモニウムは、好ましい緩衝液の１第１図は、アルコールをアルデヒドおよび過酸化水素に連続もしくはバッチ式で変換するための装置を示す略図である。

第２図は、アルコールを低い沸点のアルデヒドに連続的に変換するための装置を示す略図である。

第３図は、アルコールをアルデヒドおよび過酸化水素に変換する他の反応領域の構造の略図である。

好ましい実施例の詳細な説明Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａの酵母は〜（メタノールから導かれた）ホルムアルデヒドのキシルロース−５−リン酸への固定、その生成物のジヒドロキシアセトンおよびグリセルアルデヒド−３−リン酸への変換、および最終的なキシロース−５−リン酸の再生を含むメタノール利用経路を有している。その経路の最初のステップには、メタノールのホルムアルデヒドおよび過酸化水素への酸化が含まれており、これはメタノールオキシダーゼによって触媒作用を受ける。このメタノールオキシダーゼは７００５０の分子量を有する同じサブユニットの８量体であり、酵素としての総計の分子量として５６０４００を与えるものである。メタノールの代謝に含まれるメタノールオキシダーゼおよび他の酵素にコードされた遺伝子の表現は、グルコースリプレッションを受ける。メタノールの存在下において、メタノールオキシダーゼは細胞中で高い濃度になり、総計の細胞蛋白質の２０％はどを含む。この特定のメタノールオキシダーゼは、酵素複合体（ＦＡＤ）の一部としての自己酸化のコツアクタを含み、多くの他のバクテリアおよび酵母のメタノールオキシダーゼと異なり、付加的な酵素反応によって再生しなければならないＮＡＤのような容易に解離するコツアクタを必要としないので、工業的利用には魅力的なものである。

好ましいメタノールオキシダーゼは、受入番号第３４４３８号の下にＡＴＣＣから入手することのできるＨａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａの菌株から誘導されるメタノールオキシダーゼと機能的に同一のものである。この菌株は、しばしば文献ではＣＢ５４７３２と呼ばれる。

この生物のメタノールオキシダーゼの遺伝子の塩基配列およびこの酵素を作り上げているサブユニットのアミノ酸配列は、この菌株により同定された。Ｌｅｄｅｂｏｅ　ｒ等によるＮｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　９．３０６３−３０８２　（１９８５）を参照されたい。この酵素のアミノ酸配列およびこの酵素にコードされた遺伝子の塩基配列は、付属のアペンディックスＡに掲げた。もちろん、アルコールのアルデヒドおよび過酸化水素への変化に効率的に触媒作用を示す酵素の能力を残しながら、酵素のアミノ酸配列における比較的重要でない変更を行なうことが可能である。

突然変異の結果としてまたは遺伝子工学によって変更が起こったとしても、そのようなわずかな変更の酵素は、特定のアミノ酸配列を有する酵素と等しいものであり、したがってこの発明の範囲内に入るものと考えられる。この発明の範囲内のメタノールオキシダーゼ酵素はまた、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａＡＴＣＣ３４４３８のメタノールオキシダーゼの活性サイトと同じ活性サイトを有するすべての酵素を含むものである。

最後に、この発明の製造方法はまた、菌株ＡＴＣＣ３４４３８と区別されるＨａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ菌株から誘導されたメタノールオキシダーゼ酵素の利用を含むものであり、この酵素は、容積で少なくとも０゜５％の過酸化水素もしくはアルデヒドの生成物濃度中で活性を保持しており、好ましくは容積で少なくとも０．７％もしくは１％の過酸化水素もしくはアルデヒドであり、さらに好ましくは、容積で少なくとも２％、３％、４％もしくは５％の過酸化水素またはアルデヒドである。簡単な選択法としては、所望の安定性を有するＨａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａの酵素を見分けることであるかもしれない。その方法には、以下に述べるように生物を成長させ酵素を分離し、その後所定の濃度のアルコールおよび所定の濃度の生成物中におけるアルコールのアルデヒドおよび過酸化水素への変換に触媒作用を示す酵素の能力を測のに適したメタノールオキシダーゼの活性を選択するには、精製された（少なくともカタラーゼの活性には束縛されない程度に精製された）酵素を、たとえば容積で１％、２％、５％、７％および１０％のような高いメタノール濃度の存在下にその活性を評価する。また、過酸化水素およびホルムアルデヒドの生成物の高い濃度の存在下でもその活性を評価する。この反応において、１％の生成物および１％のメタノールの存在下に反応が開始したときはメタノールオキシダーゼは２％の生成物を生成することができ、２％の生成物および１％のメタノールの存在下に反応が開始したときは３％の生成物を生成することができるに違いない。

また、好ましくは、３％の生成物および１％のメタノールの存在下に反応が開始したときは４％の生成物を生成することができ、４％の生成物および１％のメタノールの存在下に反応が開始したときは５％の生成物を生成することができるに違いない。

好ましいメタノールオキシダーゼは、メタノール（および好ましくは他のアルコール）をアルデヒドおよび過酸化水素に変換することができ、少なくとも０．５％のメタノールの濃度中において活性であり、好ましくは少なくとも１％、２％、３％または４％の濃度において活性である。

それらは少なくとも０．５％の過酸化水素の濃度において活性であり、好ましくは少なくとも１％、２％、３％または４％の濃度において活性である。それらは少なくとも１％、２％、３％または４２６のホルムアルデヒドの濃度において活性である。それらは、少なくとも１００、好ましくは少なくとも１８０、さらに好ましくは少なくとも２２０モル生成物／分／活性サイトモルのターンオーバ数を有している。それらは２ｍＭもしくはそれ以下のメタノールに対してＫｍＯ値を有しており、０．４ｍＭもしくはそれ以下の酸素に対してはＫｍＯ値を有している。それらは、少なくとも１日間の反応中安定である。そしてそれらは少なくとも１５日間の貯蔵中安定である。

好ましいメタノールオキシダーゼ酵素は、遺伝子工学的技術によるクローニングおよび増幅によるＨａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ遺伝子から製造することができる。しかしながら、好ましい技術は、単なるＨａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａの成長および生物内でのメタノールオキシダーゼの合成の誘導である。

酵母の成長培地については技術的によく知られている。

Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａは、グルコースもしくはメタノールの培地中で成長させることができる。

適したグルコースの培地には、重量で０．４％ＮＨ４Ｃｕ、０．１％ＫＨ２ＰＯ４，０，１％に２ＨＰＯ４，０，０５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０，０，０５゜％の酵母の抽出物および１％のグルコースが含まれる。適したメタノールの培地には、同様の窒素、カリウム、リンおよびイオウ源が、容積で０．５％から３％のメタノールとともに含まれるであろう。

グルコースおよびメタノールにおける酵母の成長速度は同様である。グルコース中での細胞の倍加時間は、１２時間よりやや短い。メタノール中での細胞の倍加時間は、１２時間よりやや長い。酵母をグルコース培地中で成長させる場合、メタノールオキシダーゼの製造は酵母を１：１０に希釈してグルコース培地から容積で３％のメタノール培地にすることにより誘発され、対数的に遅くなり、２８ ℃でおよそ２４時間となる。

メタノールの存在下に得られたＨａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａは、メタノールオキシダーゼの形態中にその合計の細胞蛋白質の２０％はどを含む。

（２）　酵素の生成粗細胞抽出液であっても、ホルムアルデヒドおよび過酸化水素製造に触媒作用を示す十分な酵素が含まれているが、このような抽出液にはまた、過酸化水素を水および酸素に変換するカタラーゼ（パーオキシダーゼ）が含まれている。

したがって、過酸化水素の最適の収率を達成させるためカタラーゼを取り除くには、メタノールオキシダーゼ酵素の成る程度の精製が必要である。

れ均質にされる。均質にする前にｐＨを約７．５に調製するのにリン酸緩衝液を用いることができる。細胞崩壊の後、細胞の破片は遠心分離により除去することができる。上澄みの溶液は、細胞のない酵素の抽出液となる。

特に好ましい精製技術は、イオン交換カラムを用いて、粗製の細胞のない抽出液からメタノールオキシダーゼを精製する方法である。この精製手法は、短時間に多量の蛋白質を製造するには、比較的早く、高価でなく有効な方法である。たとえば、ＤＥＡＥ−セルロースカラムから溶離された蛋白質は、細胞状のカテラーゼを含んでいない。Ｈａｎ５ｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａからのメタノールオキシダーゼは、およそ０．３ＭのＮａＣ１で塩傾斜溶離を用いて、ＤＥＡＥ −セルロースから溶離される。この段階で、酵素はおよそ８０〜９０％の純度である。塩傾斜よりむしろバッチ式の溶離を用いて、カラムからさらにメタノールオキシダーゼを溶離することにより、この手法を短縮化することができる。酵素はより低い純度であるが、反応に影響を与えることができる汚染菌はカタラーゼ（これは、２Ｈ２０２−２Ｈ２０＋０２の反応に触媒作用を示す）のみであり、また使用する条件の下ではカタラーゼはＤＥＡＥ−セルロースと結合しないので、外部からの汚染は取るに足らないものである。

有効なイオン交換の精製の技術の一例は、以下の実施例１で述べるものである。

実施例１：酵素の精製Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ細胞は遠心分離（５０００ｘｇ、１０分間）により集め、（細胞：緩衝液の比率をおよそ１：２とした）ｐＨ７，５の５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液中に再び懸濁する。細胞は、合計で３分間“Ｂｅａｄｂｅａｔｅｒ”ホモジナイザー中で破壊する（氷上での５分間の冷却間隔で、３０秒間のバーストを６回行なう）。抽出物は１６０００ｘｇ、４℃で、２０分遠心分離し、上澄みの溶液は、ｐ）Ｉ７．５の５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液で平衡にしたＤＥＡＥ−セルロースカラムに注ぐ。カラムは、すべての吸着されていない蛋白質がカラムから洗い出されるまで、ｐＨ７，５の５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液で洗浄する。メタノールオキシダーゼはｐＨ７，５の５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液中の０〜０．６ＭのＮａＣ１からの直線状の塩傾斜により、ＤＥＡＥ−セルロースから溶離する。メタノールオキシダーゼを含んだフラクションを集め、（Ｎ）Ｉ４　）２　ＳＯ４（４０〜８０％飽和）の沈澱により濃縮する。精製のデータは表１に掲げた。

表１．ＨＡＮＳＥＮＵＬＡ　ＰＯＬＹＭＯＲＰＨＡからのメタノールオキシダーゼの精製実施例１で得られた酵素の純度は、５ＤＳ−ポリアクリルアミドのゲルの電気泳動により決定する。最終的な（ＮＨ４）２　ＳＯ４の沈澱のステップの後残ったメタノールオキシダーゼは、９５％以上の純度である。

カタラーゼは、エタノールオキシダーゼの精製の副生成物として得ることもできる。メタノールオキシダーゼは結合するにもかかわらず、カタラーゼはＤＥＡＥ −セルロースカラムとは結合しない。メタノールオキシダーゼの活性を含むカラムのフロースルーは、８０％（飽和）の（ＮＨ４）２ＳＯ４による沈澱で蓄積し濃縮する。このカタラーゼは、１００００ユニツト／分／ｍｇの特別の活性を有しており、メタノールオキシダーゼの約１０００倍活性である。したがって、カタラーゼおよびメタノールオキシダーゼの活性を等しくするためには、カタラーゼの濃度を用いるメタノールオキシダーゼのそれのおよそ１０００分の１にしなければならない。

好ましいＨａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａにより製造されたメタノールオキシダーゼは、２５℃から３７℃の広い温度範囲にわたる温度安定性を示す。したがって、メタノールをホルムアルデヒドに変換する間、熱の形態をとったエネルギ入力は反応段階でほとんどもしくは全く必要ない。

酵素はまた６、５から９．０のｐＨの範囲にわたって活性を保持している。（酵素は酸性のｐＨでは不安定である。

）好ましいプロセスのｐＨは７．０から８．０であり、さらに好ましくは７．５のｐＨである。特定のプロセスにおいては、ＮＨ，Ｃｏ、のような相対的に揮発性の緩衝液を用いることが望ましいかもしれない。これは、生成段階の蒸留により生成物から除去することができる。表２に示すように成る種の緩衝液が酵素の活性に何らかの影響を与える。

表２．異なる緩衝液中でのメタノールオキシダーゼの活性ＮａＨＣｏ、　０．０５　６１ＮａＨＣＯ，０，０１５３ＮＨ，Ｃ０，０，０５７６ＮＨ，Ｃｏ、　０．０１　５７な　し　５７好ましい緩衝液はリン酸塩および炭酸塩もしくは重炭酸塩の緩衝液であり、リン酸カリウム、重炭酸ナトリウムおよび重炭酸アンモニウムを含み、すべてｐＨ７，５に調整されている。

好ましいメタノールオキシダーゼ酵素はメタノールに対し最も高い親和性を示すが、他の低級アルキルおよび低級アルキレンアルコールにもまたかなりの程度の活性を有している。４もしくはそれより小さい炭素数の直鎖アルコ−、ルは特に好ましい。メタノールは別として、酵素はエタノールおよびアリルアルコールに対し最も高い活性を示し、それらを変換してそれぞれ、アセトアルデヒドおよびアクロレインにする。種々の基質に対するメタノールオキシダーゼの特異性を表３に示す。

表３．メタノールオキシダーゼの基質特異性基　質　相対的活性度メタノール　１００エタノール　６７ｎ−プロパツール　１９イソプロパツール　Ｏｎ−ブタノール　１２イソブタノール　０イソアミルアルコール　０アリルアルコール　６５グリセロール　０Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａＡＴｃｃ３４４３８からのメタノールオキシダーゼは、２．０ｍＭのメタノールに対しＫｍの値を有し、２２０モル生成物／分１モル活性サイトのターンオーバ数を有する（すなわち、１ｇの酵素が１分あたりＣＨ２ＯおよびＨ２０□をそれぞれおよそ０．１ｇ生産する）。これらの値は、希釈した酵素濃度（く５μｇ／ｍｆｌ）で測定され、そこでは反応速度が時間および酵素濃度に対して１ｇである。比較的高い酵素濃度で、通常の実験条件の下では、酸素が速度を制限するようになる。これは、同じ反応容器でそれぞれ１μｇ／ｍｆＬの酵素を含むものを比較する場合において、反応容器の１つを空気混和を増加するため振り、他方を静かな状態のままとして、生成物の生成速度の違いが認められるという事実から証明される。このことは、高い酵素濃度で最大の反応速度を得るためには、反応混合物中に酸素を導入することが好ましいことを示している。

従来の技術プロセスと関連して研究されてきたメタノールオキシダーゼ酵素と異なり、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐ。

１　ｙｍｏ　ｒｐｈａＡＴｃｃ３４４３８からのメタノールオキシダーゼは、メタノールおよび反応生成物の存在下において著しい安定性を示す。メタノールオキシダーゼの反応速度は、およそ１０％メタノール（容積で）の濃度までのメタノールの存在下、直線性を維持する。３０％（容積で）の高いメタノール濃度では活性の８０％を維持している。

したがって、この発明の範囲内の工業的に可能なプロセスは、少なくとも容積で０．５％のメタノール原料濃度を使用することができ、好ましくは少なくとも容積で１％、２％もしくは３％であり、さらに好ましくは容積で少なくとも４％もしくは５％である。また、１０％もしくは２０％の濃度もまた、いくらかの酵素活性を失いながら使用することができる。

（４）　酵素濃度に関する酵素の活性Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａからの好ましいメタノールオキシダーゼは、幅広い酵素濃度にわたって安定である。１から１０００μｇ／ｍ　ｆＬの酵素濃度では、反応速度が数時間の間直線性を維持しており、容積で１０％エタノールに達する濃度であってもそうである。

この発明の方法において結合していない酵素を用いる場合には、反応領域中の酵素濃度は好ましくは０．１μｇ／ｍｌｌから１０００μｇ／ｍＷまでである。成る応用においては、酵素濃度の下限は１μｇ／ｍ（Ｌ／もしくは１０ｎｇ／ｍ１１であり、濃度の上限は１００μｇ／ｍｌｌもしくは５００μｇ／ｍ　（Ｊ、である。

高い生成物の濃度における好ましいメタノールオキシダーゼの安定性は、実験により確かめられている。すべての濃度は容積をベースにしてなされている。第１の反応は、１％メタノールおよび０％生成物（０％過酸化水素および０％ホルムアルデヒド）で開始し、生成する生成物の増加は時間の関数として決定した。第２の反応は３％過酸化水素、３％ホルムアルデヒドおよび１％メタノールの存在下で開始した。第１の反応においては、４時間よりわずかに長い間に生成物濃度が０％から１％に上昇し、実験が終了するまでの２０時間は１％で安定に維持されていた。第２の反応においては、約５時間の間に生成物濃度が３％から４％に上昇し、実験が終了するまでの２０時間の間安定に維持されていた。それぞれの実験におけるこの１％の生成物濃度の上昇は、化学量論的な増加であり、メタノールが生成物にほぼ完全に変換したことを示している。このことはメタノールオキシダーゼ酵素が４％までの生成物濃度において活性のままであること、および反応が完全に進行したこと、およびこれらの条件の下では生成物が安定であることを証明している。

（６）　反応領域への酸素の導入この発明のアルコールのアルデヒドおよび過酸化水素への酵素による酸化においては、酸素分子（０２）は変換プロセスにおいて化学量論的に消費される。したがって、生成物に変換するメタノールもしくは他のアルコールのそれぞれのモルについて、０２の１モルが反応混合物から消費される。実験室スケールの５μｇ／ｍＱ、程度の低い酵素濃度であっても、反応混合物中への酸素の拡散は律速となる。

したがって、高い酵素濃度を利用した大規模の製造プロセスは、反応混合物の空気混和から重大な利益を受ける。

空気もしくは他の酸素を含んだガスのスパーンングまたはバブリングのような、その反応混合物中を通しての直接の空気酸化は、必要な空気を供給するための選択枝のうちの１つである。しかしながら、この方法は、相対的に揮発性のアルデヒド生成物を失うかもしれない。成る応用では、過酸化水素の経済的価値が比較的大きなものであるので、このようなアルデヒドの損失は耐え得るものである。

しかしながら、多くの場合、ホルムアルデヒドのようなアルデヒドを環境に排出することは好ましくない。これらは人間および動物にとって有害だからである。

アルデヒドの損失を防止する１つの方法は、反応領域へ導入する前に、原料の酸素を多くすることである。

シャルルの法則によれば、液体中に溶解するガスの量は、そのガスの分圧に直接に比例する。したがって、ガスおよび液体に圧力をかけると、より多くの酸素が液体中に溶解し、空気による混和よりも純粋な酸素による混和によれば、より多くの酸素が液体中に溶解する。液体中へのガスの吸収速度は、またガス−液体の界面の表面積に依存する。この表面積を最大にする１つの技術は、液体中にガスをバブリングするとき、泡の大きさを極小にすることである。

酸素添加は、アルコール溶液中を通して酸素を含むガスをバブリングすることによって行なうことができる。エアレージジンのガス中の酸素濃度を高くすればするほど、より多くの酸素が液体中に溶解する。酸素添加段階において大気圧よりもガスの圧力を高くすることにより、多量の酸素を溶解させることができる。

１つの好ましいプロセスにおいては、たとえば、酸素添加段階は、加圧チャンバ内で行なわれる。このチャンバは反応チャンバもしくは反応領域と同じであってもよい。加圧した酸素添加を反応領域の外で行なう場合には、反応混合物の０□ の泡立ちを避けるため、反応領域もまた高い圧力に維持することが望ましい。これはまた、溶液中にアルデヒドを保持する役割も果たす。

液体の酸素添加に関する種々の適当な技術は、米国特許第４０６７６９６号、米国特許第４１８２７３９号および米国特許第４１３８２８８号に開示されている。

連続プロセスの一実施例においては、酸素を多く含んだ液体は連続的に反応領域に流れる。上述したように、水−アルコールの原料混合物に多く含ませてもよい。反応領域に導入する前に、アルコール原料の本質的な希釈が必要であれば、希釈する水自身に別に酸素添加することもできる。

同様に、バッチ式のプロセスにおいても、加圧した反応領域に導入する前、もしくはメタノールオキシダーゼ酵素と結合させる前に、メタノールおよび水の全体のバッチに酸素添加することができる。これに代えて、バッチ式のプロセスであっても、酸素添加された水および／またはメタノール溶液の連続的な流れを反応領域中に導いてもよい。

反応領域の外での反応混合物の酸素添加は可能であるが、好ましい酸素添加の方法は反応領域中の反応混合物の直接の酸素添加である。装置を簡略化することに加えて、これはまたより多くの量の酸素の利用を許容するものである。

反応で消費された酸素が連続的に補給されるからである。

アルデヒドの損失は、反応領域から出るガスの再循環、および／または、酸素からアルデヒドを分離する濃縮チャンバを通り反応領域から出るガスを送り込むことにより避けることができる。

反応領域においては、既に述べたｐＨ１酵素濃度、メタノール濃度および生成物濃度のプロセスの条件が用いられるー。反応領域における平均滞留時間は、もちろん成る程度すべてのこれらのファクタに依存する。しかしながら、７゜５のｐＨでは、反応領域における好ましい平均滞留時間は、主に酸素濃度および酵素濃度の関数となる。

酵素および基質の濃度は、反応が完全になされる時間を決定する。この時間は究極的には反応領域に加えることのできる酸素の濃度に依存する。非限界の条件では、分あたり１７６０モルのメタノールを１７６０モルのホルムアルデヒドおよび１７６０モルの過酸化水素に変換するのに、１モルの酵素は分あたり１７６０モルの酸素を必要とする。

酵素を酸素で飽和するには、およそ４ｍＭの酸素濃度が必要である。（酸素に対するメタノールオキシダーゼのＫｍの値がおよそ０．４ｍＭだからである）。４ｍＭの酸素濃度で、酵素の最大の反応速度が達成される。酸素濃度が４ｍＭを維持するように供給して、４ｍＭの酸素で、２．２μモル／リッタの酵素は、１分あたり４ｍモルのメタノールを４ｍモルのホルムアルデヒドおよび４ｍモルの過酸化水素に変換する。

しかしながら、標準の温度および圧力では、空気で飽和された緩衝液中での酸素の濃度はおよそ０．２ｍＭであり、これは酵素の最大の速度を与えるのに必要な酸素濃度のおよそ２０分の１である。したがって、高い反応速度を維持するためには、緩衝液中の酸素濃度を反応領域の加圧によって有利に増加させることができる。このため、反応領域中で必要な時間は、酸素が与えられる速度と直接に関係してくることが非常に明らかである。

連続プロセスでは、反応領域にメタノールオキシダーゼを保持する何らかの手段は望ましいものである。酵素は、ＤＥＡＥ−セルロースもしくはイオン交換物質に物理的な吸着によって固定することができる。実施例１の条件の下では、酵素がＴＥＡＥ−セルロースもしくは他の吸着剤に結合しているので、洗浄段階の後のＤＥＡＥ−セルロースカラム（もしくは他の吸着剤）はそれ自身反応領域を構成させることができる。したがって、粗細胞抽出液を精製させると同時に、実施例１の条件の下で吸着剤に固定することができる。この吸着剤：酵素複合体は、その後反応領域に用いることができる。

結合酵素を用いる他の１つとして、半透膜もしくは限外ろ過物質を、反応領域の下流の境界として設けることができる。多数の半透膜および限外ろ過物質が知られており、そして適切な製品に対する選択の基準は容易である。すなわち、低級アルキルもしくはアルケニルアルデヒド、過酸化水素および緩衝液のような小さな物質を通過させ、そして（分子量が約５６０４００である）比較的大きなメタノールオキシダーゼを留めるものでなければならない。好適な材料には、セルロースおよび再生セルロース膜および限外ろ過シリコン膜および他のあらゆる一般的な透析もしくは限外ろ過材料が含まれる。反応容器中で使用するのに適した膜もしくはろ過材料を選択するのに考慮すべき他の基準は、以下のようなものである。基質（アルコール）または生成物（アルデヒドおよび過酸化水素）と反応してはならない。破裂することなく反応領域において受ける圧力に耐えることができるものでなければならない。そして、反応領域における滞留時間を制限もしくは決定しないような流速を有しなければならない。透析膜は、非反応性で、高い圧力を維持できるほど十分に強いという基準に合うものである。しかしながら、標準的な膜を通る流速は相対的に低い。孔の大きさをかなり大きくした膜を用いることにより、流速は増加させることができる。セルロースアセテートの膜は特に適当なものである。メタノールオキシダーゼは５６０４００の分子量を有しているので、２５００００以上の分子量を有する種を維持できる孔のサイズをもった膜を使用できる。使用できる他の膜には、“Ａｍ１ｃｏｎ”膜のような限外ろ過膜が含まれる。“Ａｍ１ｃｏｎ”は、ＹＭ１００限外ろ過膜に対するＡｍ１ｃｏｎ　Ｃｏｒｐ。

の商標である。（この特別の膜は、酵素を結合するには不利なものである。）また、反応領域から酵素を回収する限外ろ過システムは、成る応用には好ましいものであるかもしれない。

反応領域の出口での半透膜もしくは限界ろ過フィルタに加えて、反応領域の入口に第２の半透膜もしくは限外ろ過フィルタを設けることもできる。この第２の半透膜もしくは限外ろ過フィルタは、しかしながら、連続的な原料の流入が反応領域からの戻る汚染を防止する装置では除去することができる。一般的な逆止弁を、第２の半透膜もしくはフィルタの代わりに用いることもできる。

バッチ式および連続の反応プロセスを実施例２および３にそれぞれ述べる。

Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａＡＴｃｃ３４４３８からのメタノールオキシダーゼは、実施例１から得る。１００μｇ／ｍｕの酵素濃度を与えるのに十分な量の、容積で４％のメタノール水溶液を入れた１０リツターの反応容器中に酵素を添加する。水溶液は、０．１モルのリン酸カリウム緩衝液でｐＨ７，５に緩衝されている。容器は、７０ｐｓｉの圧力で２７℃に維持されている。４ｍモル０２／分の速度で反応混合物中に酸素を連続的にバブリングすることにより、攪拌および酸素の補給を行なう。

７０時間後、反応は完結する。反応容器中の内容物は、５００００の分子量を除去するチューブ状のセルロース透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ　Ｐｏｒ　ｂｒａｎｄ；ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、から入手できる）の中を通過させる。酵素のなくなった透析物は、およそ容積で４％の過酸化水素および容積で４％のホルムアルデヒドを含む。

ホルムアルデヒドおよび過酸化水素へのメタノールの変換のための連続プロセスにおいては、容積で１０１．４％のメタノール水溶液が反応容器に加えられる。

溶液はリン酸カリウム緩衝液（０，１モル）でｐＩ（７，５に緩衝される。実施例１からの１．０グラムのメタノールオキシダーゼ酵素が添加され、反応容器中で１００μｇ／ｍＬの酵素濃度が与えられる。反応容器は酸素で１０気圧に保たれ、４ｍモル／分の酸素が混合物中にスパーンされる。反応容器の上部からガスが除去される。そして、ガスは反応容器を通り再循環される。空気もしくは酸素が、溶液中に過剰の酸素を維持するため、再循環ガスに加えられる。１０００００の分子量をカットオフする限外ろ過材は、反応容器の入口および出口に設けられる。容積で４％のメタノールを含んだ緩衝メタノール水溶液は、反応領域に連続して導かれ、２．５ｍｍ／分の速度で反応生成物が連続して限外ろ過材を通り反応容器から連続的に除去される。反応容器の出口の限界ろ過材は、そこに蓄積した酵素を除去するため定期的にバックフラッシュされる。そしてその酵素は反応容器の中に再循環される。新しい酵素は、活性な酵素濃度がおよそ１００μｇ／ｍｆＬを維持するように、０．５ｇた反応混合物はおよそ４％のホルムアルデヒド、４％の過酸化水素およびわずかなパーセントのメタノールを含む。

Ｃ８反応生成物の分離生成物は、互いに蒸留によって分離することができる。

水溶液中のホルムアルデヒド（ホルマール）の沸点は大気圧で９６℃であり、過酸化水素のそれは大気圧で１５２℃である。メタノールはまだ反応しておらず、したがってホルムアルデヒドとともに蒸留される反応混合物中にはまだ残っている。メタノールは一般に安定化剤としてホルムアルデヒド溶液に添加されるので、メタノールおよびホルムアルデヒドの分離をさらに行なうということは通常必要でない。したがって、精製段階には、おそらくホルムアルデヒドおよびメタノールおよび水のおよそ１００℃における蒸留が含まれる。残っている過酸化水素は、必要であれば、残っている水を蒸留することによってさらに濃縮することができる。

蒸留技術に加えて、過酸化水素からアルデヒドを分離するには、プレベーパレーション膜もしくはＳｔｒａｔｈｍａｎによるＴｒｅｎｄｅ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ。

ｇｙ、　１１２．　（Ｎｏ、５．１９８５）に記載されたような他の膜プロセスを使用して行なうことができる。Ｍｉ　１　ｔｏｎ　Ｒｏｙ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　２０１　１Ｖｙｌａｎｄ　Ｒｏａｄ、　Ｉｖｙｌａｎｄ、　ＰＡ　１８９７４ −０５７７により製造されたような超臨界流体抽出システムもまた、反応生成物の分離に用いることができる。

実施例２および３のプロセスは、実施例４〜１２に示すように、異なる生成物を多数の態様に変形させることができる。

実施例４：ホルムアルデヒドへのメタノールの変換実施例１で得られた０、１μ ｇ／ｍｆＬのカタラーゼを反応混合物に添加する以外は、実施例２および実施例３のプロセスを繰返す。このような条件の下では、カタラーゼは生成する過酸化水素を酸素および水に変換する。メタノールオキシダーゼの反応において消費される酸素のそれぞれのモルについては、カタラーゼ反応において０．５モルの酸素が放出される。これらの反応における酸素の包合により、添加される酸素の必要量は減少する。生成される最終生成物はホルムアルデヒドのみである。実施例３で記載した蒸留もしくは他のプロセスは生成物を濃縮させるのに用いることができるが、通常はこの生成物をさらに生成することは不要であろう。

実施例５：アセトアルデヒドおよび過酸化水素へのエタノールの変換メタノールをエタノールに置き換えて、実施例２および３のプロセスを繰返す。

メタノールオキシダーゼの濃度を１５０μｇ／ｍ　ｆＬに増加し、流速および反応時間は実施例３と同じにする。反応生成物はアルデヒドおよび過酸化水素である。

実施例６：アセトアルデヒドへのエタノールの変換カタラーゼを実施例４で述べたように反応容器中に含ませ、実施例５のプロセスを繰返す。これらの条件の下では、カタラーゼは生成した過酸化水素を酸素および水に変換する。反応の最終では、生成物はアセトアルデヒドのみである。生成物を濃縮するため蒸留することは可能であるが、通常はこれをさらに精製することは要しないであろう。

実施例７：アクロレインおよび過酸化水素へのアリルアメタノールオキシダーゼは、アリルアルコールをアクロレインおよび過酸化水素に変換するときも用いることができる。アクロレインおよび過酸化水素を生成させるため、メタノールをアリルアルコールに置き換えて実施例２および３を繰返す。メタノールオキシダーゼの濃度は２００μｇ／ｍαに増加させ、実施例２の時間は７０時間に維持し、実施例３の反応容器への流速はおよそ２．　５ｒｒｌｊ／分に維持する。酵素反応の最終では、反応生成物を蒸留により分離する。大気圧におけるアクロレインの沸点は５２℃である。

実施例８ニアクロレインへのアリルアルコールの変換メタノールオキシダーゼと同じく反応容器にカタラーゼを導入することによって、実施例７の反応においてアクロレインのみを生成することが可能である。メタノールをアリルアルコールに置き換えて、実施例４のプロセスを繰返し、メタノールオキシダーゼの濃度を１５０μｇ／ｍｌＬに増加し、連続式プロセスにおいては２．　５ｒｒｌ！／分、の流速を、バッチ式プロセスにおいては７０時間の反応時間を維持する。このような条件の下で、カタラーゼは生成した過酸化水素を酸素および水に変換する。反応の最終では、アクロレインのみが生成物となる。生成物を濃縮するために蒸留することができるが、これはさらに精製することを必要としない。大気圧におけるアクロレインの沸点は５２℃である。

実施例９：プロピオンアルデヒドおよび過酸化水素へのｎ−プロパツールの変換メタノールオキシダーゼは、ｎ−プロパツールをプロピオンアルデヒドおよび過酸化水素に変換するのに用いることができる。メタノールをｎ−プロパツールに置き換えて、実施例２および３のプロセスを繰返す。メタノールオキシダーゼの濃度は５２６μｇ／ｍｌに増加し、実施例２および３の他の反応条件はそのままにする。酵素反応の最終では、反応の生成物を蒸留により分離することができる。大気圧でのプロピオンアルデヒドの沸点は４９℃である。

実施例１０：プロピオンアルデヒドへのｎ−プロパツールの変換メタノールオキシダーゼと同様にカタラーゼを反応容器に導入することにより、実施例９の反応でプロピオンアルデヒドのみを生成することができる。そこで、メタノールをｎ−プロパツールに置き換えて、実施例９のプロセスを繰返す。実施例２のメタノールオキシダーゼの濃度を５２６ｍｇ／ｍ１ｌＬに増加し、実施例３の反応容器中への液体流速を２．５ｍｆＬ／分に維持する。この条件の下で、カタラーゼは生成する過酸化水素を酸素および水に変換する。反応の最終では、プロピオンアルデヒドのみが生成物である。

生成物を濃縮するためには蒸留することができるが、これはさらに精製を必要とするものではない。

実施例１１ニブチルアルデヒドおよび過酸化水素へのｎ−ブタノールの変換メタノールオキシダーゼは、ｎ−ブタノールをブチルアルデヒドおよび過酸化水素に変換するのに用いることができる。そこで、メタノールをｎ−ブタノールに置き換えて、実施例２および３のプロセスを繰返す。それぞれの場合における酵素濃度は８５０μｇ／ｍｌに増加する。酵素反応の最終で、反応の生成物は蒸留により分離することができる。大気圧でのブチルアルデヒドの沸点は７４．８℃ である。しかしながら、ブチルアルデヒドは２５℃で水に溶解するので、相分離が起こり相を別個にするまで、温度低下することによって分離を行なわなければならない。

に導入することにより、実施例１１の反応でブチルアルデヒドのみを生成することができる。０．１μｇ／ｍＱのカタラーゼを反応容器に導く以外は、実施例１１のプロセスを繰返す。これらの条件の下で、カタラーゼは生成した過酸化水素を酸素および水に変換する。反応の最終では、ブチルアルデヒドのみが生成物である。生成物を濃縮するために蒸留することができるけれども、生成物はさらに精製する必要のないものである。大気圧でのブチルアルデヒドの沸点は７４．８ ℃である。しかしながら、ブチルアルデヒドは２５℃以上で水に溶解するので、相分離が起こり相が別個になるまで、温度を低下させることにより分離が可能なる。

Ｅ、　プロセスの装置この発明に従いアルコールをアルデヒドおよび過酸化水素に連続的に変換する適当な装置を、図１に模式的に示す。

アルコール源１０および水源１２が設けられる。入口管路１４は、アルコールおよび水を反応領域１６に導く。図１において、反応領域１６はまた空気混和もしくは酸素添加チャンバを受ける。反応領域１６は、好ましくは加圧チャンバもしくはコンテナーまたは複数のチャンバもしくはコンテナーである。反応領域はこれに代えて、引き伸ばされた構造を備えてもよい。そのような構造の一例はチューブである。反応領域１６は反応混合物２０を含んでいる。この反応混合物には、入口管路１４を通り反応領域に導かれた水およびアルコール、メタノールオキシダーゼ酵素ならびに酸素が含まれる。アルコールへのメタノールオキシダーゼ酵素の作用のため、反応混合物２０はまた、アルデヒドおよび過酸化水素を含む。

酸素源２１からの酸素を含んだガスを反応領域１６に導くため、ガス人口２２のような手段が設けられる。このガスは好ましくは酸素ガス、すなわち０２である。反応領域１６は、反応を早め、反応混合物２０中に溶解する酸素の度合を高めるため、通常加圧されている。好ましい酸素添加技術は、スバージング技術である。反応領域１６の至るところに酸素が泡として分散するようにするためには、多孔性材料２４もしくは他の一般的な材料を反応領域１６に有利に含めることができる。ガス出口２６を通り反応領域１６からガスが除去される。ガス出口２６からのガスをガス人口２２に戻す再循環のための手段３０もまた、設けることができる。このような再循環手段３０は、保存した酸素および再導入するあらゆる蒸発したアルデヒドの両方を反応領域１６および反応混合物２０に戻すという利点を有している。再循環はまた、ホルムアルデヒドのような健康上良くない生成物を環境に排出するのを回避する。反応領域１６の中にもしくは反応領域１６に接続して、好ましくは反応混合物を攪拌もしくは混合するための手段が設けられる。図１において、攪拌手段は多孔性材料２４および多孔性材料２４を通り通過する酸素を含んだガスであり、反応領域１６の中で反応混合物２０を連続的に攪拌し混合する泡を生成する。

反応領域１６は、酵素回収手段３４によりその出口３２で結合している。酵素回収手段３４は透析膜もしくは限外ろ過材とすることができる。酵素回収手段３４は、アルデヒドおよび過酸化水素ような小さな分子量の種を通過させることができ、その一方で高い分子量の種、特にこの発明で用いる５６０４００の分子量を有するメタノールオキシダーゼ酵素を留める。酵素回収手段３４上への流れの限定による酵素の蓄積を避けるためには、酵素回収手段３４の単位面積あたりの流速は低く保たれる。いかなる与えられた処理用のためにも、半透膜を大きくすることによりこれを実行する。定期的に、蓄積した酵素を除去するため酵素回収手段は洗浄することができる。これは、酵素回収手段３４を通して液体のバックフローを導くか、もしくは液体回収手段３４を通してではなく横切らせて液体の流れを方向付けることにより行なうことができる。酵素回収手段３４から回収された酵素は、管路３６を通り反応領域１６１；戻される。

反応領域中で生成したアルデヒドおよび過酸化水素は、反応領域１６から、出口３２および酵素回収手段３４を通り分離領域４０に向かう。分離領域４０は、過酸化水素からアルデヒドを分離するための蒸留装置を備えることができる。実際問題として、より揮発性のアルデヒドが、ガス混合物として過酸化水素から分離することができる。ホルムアルデヒドの場合、このガス混合物はまた、水および少量のメタノールを含む。ホルムアルデヒドの場合、容器５１中の最終生成物の中にメタノールおよび水が存在するにもかかわらず、通常はさらに精製することを必要としない。

なぜならば、ホルムアルデヒドは、通常水溶液として販売され、その水溶液は通常少量のメタノールにより安定化されているからである。

分離段階においては、過酸化水素は水溶液として分離領域から貯蔵容器５２に除去される。過酸化水素は通常水溶液として販売される。しかし、必要であるならば一般的な技術を用いてさらに濃縮することもできる。適当な分離装置により、いくらかの水が回収され、再循環路４１を通り再度導入される。

この発明に従うバッチ式プロセスもまた、図１の装置テ行なうことができる。水、アルコールおよび酵素は入口管路１４を通り反応領域１６内に導かれ、反応混合物２０を形成し、所望のレベルまで反応領域１６に満たされる。反応混合物２０は、ガス人口２２および多孔性材料２４を通り反応領域１６中に導入される酸素ガスとともに反応領域１６内に留まる。ガスはガス出口２６から除去され、再循環手段３０を通り再循環する。反応混合物２０を通る酸素ガスを含んだガスのバブリングは、反応混合物２０が本質的に均一になるように攪拌および混合を与える。反応が所望の段階まで完了したとき、反応混合物２０は水、アルデヒドおよび過酸化水素を、はとんどもしくは全くアルコールを存在させずに含んでいる。その後、反応混合物２０は出口３２を通り反応領域１６から除かれる。酵素は酵素回収手段３４により反応混合物２０から除去され、反応混合物は分離領域４０に進行する。次に反応領域１６は、再び反応混合物２０によって満たされ、プロセスが繰返される。

図２はアルデヒドのみを製造するためのいくらか異なる装置を示す。アルコール源１１０および水源１１２は、吸い込み管路１１４を通り、反応混合物１２０を含んだ反応容器１１６に与えられている。図１の装置とは異なり、この場合の反応混合物１２０は、水、アルコールおよびメタノールオキシダーゼ酵素に加えて、カタラーゼを含んでいる。酸素は、ガス人口１２２を通り多孔性材料１２４を通って、酸素源１２１から反応領域１１６中に供給され、ガス出口１２６を通って反応領域１１６から除かれる。

反応混合物１２０中のカタラーゼは、過酸化水素の水および酸素への分解に触媒作用を示す。したがって、このプロセスにおける正味の反応は、酸素の消費を伴う、アルコールのアルデヒドへの変換である。

アセトアルデヒドのような生成された成る種のアルデヒドは、メタノールオキシダーゼが安定な温度において、水の蒸気圧よりも高い蒸気圧を有する。したがって、反応領域１１６から去る酸素とともにニガス出口１２６を通り多量のアルデヒドが除かれる。この発明の実施例では、反応領域１１６から去るガスは、ガス出口１２６を通りコンデンサ１３０に向かう。コンデンサ１３０は、反応領域から出たガス中にあるアルデヒドおよび水を、水系のアルデヒド生成物とし、これをコンデンサ出口管路１３２を通り貯蔵容器１５１に除去する。酸素は、再循環路１３４を通りコンデンサ１３０から離れ、ガス人口１２２を通り反応領域１１６に再び導入される。

図２のシステムは、このプロセスの分離段階を非常に簡略化できるという利点を有している。なぜなら、生成物が多少の水およびわずかの量のアルコールを含んだアルデヒドのみだからである。

もう１つのタイプの反応領域構造を図３に示す。この実施例では、アルコールおよび水は入口管路２１４を通り導かれ、混合領域２１６中でメタノールオキシダーゼ酵素と混合される。アルコール−水−酵素混合物は、反応混合物を含み、次に１つもしくはそれ以上のチューブ２２０（点線で示す）の中を通り、好ましくは一般的な層流の条件の下に流れる。流速は、アルデヒドおよび過酸化水素へのアルコールの変換が、チューブ２２０の下流の端２２２に反応混合物が到達する時間に本質的に終了するように制御される。

酸素は、混合領域２１６中もしくは水およびアルコール中に、それらが入口２１４に導かれる前に導入することができる。しかしながら、反応混合物への連続的な酸素の導入が好ましい。これは、ガスを透過し、水を透過しないチューブ２２０を使用することにより行なうことができる。

この発明の実施例では、酸素はチューブ２２０を通り反応混合物中に連続的に拡散し、そこで消費される。ガスを透過し水を透過しない材料の適当な物の１つは、ＧＯＲＥＴＥＸの商標の下にＷ、Ｌ、Ｇｏｒｅ　Ｃｏｍｐａｎｙから販売されているタイプの微孔性ポリテトラフルオロエチレンがある。この材料の製造は、米国特許第３９５３５６６号および第４１８７３９０号に開示されている。ガス透過性のチューブ２２０を用いる場合には、それらを圧力容器２２４で取り囲むことが好ましい。加圧された酸素は、圧力容器２２４中に導かれる。

チューブ２２０の下流の端２２２から出た反応混合物は、透析膜、限外ろ過材、または反応混合物の残りから酵素を分離するための他の適当な手段を備え゛た、酵素回収手段２３４の中を通る。回収された酵素は、管路２３６を通り混合領域２１６に再循環することができる。混合領域２１６から酵素回収手段２３４までの全体の装置は、この発明の実施例において反応領域を構成している。反応混合物はアルコールを使い尽くすようになり、反応混合物が反応領域の一端から他方端に移動するにつれて生成物濃度が増加する。これと同じ結果は、分離した複数のコンテナーを備え、反応混合物がコンテナーからコンテ゛ナーへ流れ、そして反応混合物が反応領域を通って進むにつれて、生成物の濃度が増加し、アルコールの濃度が減少するような、反応領域を有することによっても達成することができる。

対　冒国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．生体外でアルコールをアルデヒドおよび過酸化水素に酵素により変換する方法であって、水、アルキルアルコール（Ｃ１からＣ５）もしくはアルケニルアルコール（Ｃ１からＣ５）およびメタノールオキシダーゼを、反応領域に導き、前記方法を行なう間中、或る点で容積で少なくとも０．５％のアルコール濃度を有した反応混合物を形成するステップと、大気圧よりも高い圧力で、反応混合物中の少なくとも幾分かの水を酸素を含んだガスに接触させることによって、前記反応混合物に酸素を添加するステップと、前記反応混合物中の前記アルコールをアルデヒドおよび過酸化水素に酵素により変換するステップとを備える方法。
２．前記反応領域が前記酸素添加のステップの間中少なくとも１．５気圧に加圧されている、請求の範囲第１項の方法。
３．前記反応領域の少なくとも一部が、ガス透過性で液体不透過性のチューブであり、その中で前記酸素を含んだガスが前記チューブの壁を通り前記反応混合物中に導かれる、請求の範囲第１項の方法。
４．前記反応領域が、一連の分離したコンテナーを備え、前記反応混合物が前記コンテナーを順次通過する、請求の範囲第１項の方法。
５．前記アルコール濃度が少なくとも容積で１．０％である、請求の範囲第１項の方法。
６．前記アルコール濃度が少なくとも容積で２．０％である、請求の範囲第１項の方法。
７．前記反応領域から出た前記反応混合物のアルデヒド濃度が、少なくとも容積で０．５％である、請求の範囲第１項の方法。
８．前記アルデヒド濃度が少なくとも容積で１．０％である、請求の範囲第７項の方法。
９．前記アルデヒド濃度が少なくとも容積で２．０％である、請求の範囲第８項の方法。
１０．前記反応領域を出た前記反応混合物中の過酸化水素の濃度が、容積で少なくとも０．５％である、請求の範囲第１項の方法。
１１．前記過酸化水素の濃度が、容積で少なくとも１．０％である、請求の範囲第１０項の方法。
１２．前記過酸化水素の濃度が、容積で少なくとも２．０％である、請求の範囲第１０項の方法。
１３．前記反応領域から酸素を含んだガスを取り除くステップと、前記酸素を含んだガスを前記反応領域中の前記反応混合物と接触させて再循環するステップとをさらに備える、請求の範囲第１〜１２項のいずれかの方法。
１４．前記酸素を含んだガスが酸素である、請求の範囲第１〜１３項のいずれかの方法。
１５．前記メタノールオキシダーゼ酵素が、アルコールを酸化する性質および酵素の安定性を本質的に減らさないような変形のみによってＨａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａＡＴＣＣ３４４３８の遺伝子とは異なる塩基配列を有したメタノールオキシダーゼ遺伝子によってエンコードされている、請求の範囲第１〜１４項のいずれかの方法。
１６．前記メタノールオキシダーゼ酵素が、ＨａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙもｏｒｐｈａＡＴＣＣ３４４３８から誘導された、請求の範囲第１〜１５項のいずれかの方法。
１７．前記メタノールオキシダーゼ酵素が、容積で０．５％のメタノール濃度および容積で１．０％のホルムアルデヒド濃度中で活性である、請求の範囲第１４、１５または１６項のいずれかの方法。
１８．前記アルコールがメタノールである、請求の範囲第１〜１７項のいずれかの方法。
１９．前記アルデヒドが前記反応領域からガスとして連続的に取り除かれる、請求の範囲第１〜１８項のいずれかの方法。
２０．生成する正味の生成物がアルデヒドとなるように、過酸化水素の水および酸素への分解に触媒作用を示すために前記反応混合物中にカタラーゼを導くステップをさらに備える、請求の範囲第１〜１９項のいずれかの方法。
２１．約７．０から約８．０までのｐＨに、揮発性の緩衝液で前記反応混合物のｐＨを調整するステップをさらに備える、請求の範囲第１〜２０項のいずれかの方法。
２２．前記緩衝液が重炭酸アンモエウム緩衝液である、請求の範囲第２１項の方法。
２３．前記メタノールオキシダーゼ酵素がアペンディックスＡで特定するアミノ酸配列を有する、請求の範囲第１から１４または１６から２２項のいずれかの方法。