JPS63502341A - 血管形成促進活性を有する脂質含有組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 血管形成促進活性を有する脂質含有組成物見豆夏分互 本発明は、血管形成促進活性を有する脂質含有組成物に関する。

先立且翌 血管形成とは、新しく血管が形成されることによって、血液循環が高まる過程を いう。血管形成の分野は、　１００年以上も前から研究対象としてよく研究され てきた０例えば、フィアシャウＲ，ディークランクハフテルンゲシュベルステ。

ヒルシュバルト、ベルリン（１８６３）　；チイニルシュ、Ｃ０，ディーハウト ミットアトラス、ライプチヒ（１８６５）を参照されたい。（宿主の血管系と固 型腫瘍の生存、増殖との関連の重要性が観察されている）、正常な組織にごく微 量の血管形成因子が発見されるに及んで、興味が一段と高まった０例えば。

ダモー等、プロシーディングスオブザナショナルアカデミーオブサイエンシス　 ユニ　３０６８−３０７２（１９８１）　；キスン等、２二　３４　：　２３１ −２４３（１９８３）　；　（活性化したリンパ球およびマクロファージ）；フ レデリック等、サイエンス　２２４　：　２８９−３９０（１９８４）　：　（ ヒト胞状液）ニブルゴス　ヨーロピアンジャーナルオブクリニカルインベスティ メント　１３　２８９−２９６（１９８３）　；　（羊膜顆粒及び胎盤）、キャ テロット等、プロシープされたい、しかし、これらの組織に見い出されたごく微 量の血管形成因子は１組織や器官で発生する通常の増殖、発達と同程度の血管形 成活性しか示さない、血管形成因子は病理組織からもみつかっている０例えばワ イス等、ブリティシュジャーナルオブキャンサー、並：　４９３−４９６（１９ ７９）　；フエンセラウ等、ジャーナルオブバイオロジ力ルケミストリー壜咀： 　９６０５−９６１１（１９８１）、マツクアスラウ等、エクスペリメンタルセ ルリサーチ　月９　：　１８１−１９０（１９７９）　；　（腫瘍細胞）；クマ ール等、ランジット　ス：　３６４−３６７（１９８３）　；ブラウン等、ラン ジット　１　：　６８２−６８５（１９８０）（関節炎患者の滑液）；ヒル等、 エクスペリエンティア　担：　５８３−５８５（１９８３）　（糖尿病のガラス 体物質）：ゴールドスミス等、ジャーナルオブジアメｉカンメディカルアソシエ ーション　２５２　：　２０３４−２０３６が通常の増殖、発達を越える活性と 比較的多量の因子を示した最初の報告である。この因子はネコの網組織のクロロ ホルム／メタノール画分（ＣＭＦｒ）に見い出された。キャッツィムプーラスと ゴールドスミス名で″血管形成因子と血管を形成させる方法”というタイトルの 下に出願番号６７２．６７４号として１９８４年８月２０日に出願されている。

この出願はここでの参照として編入されているゴールドスミス等の粗脂質抽出物 をＣＭＦｒに認められる活性よりはるかに高い血管形成活性をもつ種々の画分に 精製されることがわかった。

さらに脳由来のガングリオシドのような市販のガングリオシド他の脂質を含む成 分も血管形成の性質を有することもわかっている。また、既知の脂質を含む化合 物の組成物が血管形成の性質をもつこともわかっている。

血管形成活性を有する脂質を含む化合物の発見は新しい技術である。以前は蛋白 性の血管形成因子に注意が向けられていた０例えばクマール等、ランジット　ｎ 　：　３６４−３６７（１９８３）（３００から１０’ダルトンの蛋白性因子） ：キスシ等、上記（７０ｋｄ以上の蛋白性因子）；パンダ等、上記（約２−１４ ｋｄの蛋白質）；プルゴス等、上記（１００−２００ｋｄの蛋白混合物）などで ある。

今回、予期せぬことにガングリオシド、グリコリピド、セラミド、セレブロシド 、リン脂質、スフィンゴシトなどの脂質を含む分子の成分が血管形成活性を高め る作用を有することがわかった。

見豆立！Ｌ 哺乳動物起源の血管形成活性を有する脂質を含む成分について述べる。加えて、 古くから知られている脂質含有化合物の混合物の血管形成を有する新しい組成に ついても明らかにする。また、既知の脂質を含む成分が予期せぬことに血管形成 活性を有することも明らかにする。

凰夏凰ｌ主腹豆 （図面中の写真は、いずれも生物の形態を示すためのものである） 図１は、ナンバー６４２．６２４でも明らかにしたＣＭＦｒを取得する方法を示 したものである。

図２と図３は、図１に示したＣＭＦｒをさらに分画する方法を示している。

図３は後述する方法で得た別の両分をさらに分画する方法を示している。

図４はＣＭＦｒで処理した後のウサギの角膜に形成された毛細血管を示している 。

図５は、間質に形成された多数の毛細血管を示している。

図６−１７は発明のＣＡＭアッセイに基き直線による分類をグラフで示したもの である。

図１８−２４は生体内においてＣＭＦｒを用いて再形成された脈管の写真とその グラフを示している。

成熟ネコ、メス、２．４−３．２ｋｇの筋肉内に好ましくは７．０■／ｋｇの濃 度でケタミンを注射して麻酔した。一旦麻酔したのち、既知の手術法で腹部の中 央を開腹した。網を除去し滅菌したプラスチックバックに入れ４℃に保った。同 時に、皮下脂肪も除去し、網組織と同様の方法で処理し、非網組織脂質のコント ロールとして用いた。適当な無菌技術を用いて網の重量を測定し、プラスチック の表面に広げ、手術用ハサミを用いて４ｄ程度の大きさに切った。切った網の個 々の重量は７〜６６ｇであった。これを滅菌したサーニングブレンダーに入れ予 め４℃に冷却したリン酸緩衝食塩水（以後ＰＢＳとする）　３００＋ａＱを加え た。網の小片を２０．５００ｒｐｍで５分混ぜ、網のホモジネートを得るため滅 菌した２５０ＩＩＩＱのプラスチックビンに移し１６００Ｘｇ、　４℃、２０分 間遠心分離した。遠心分離後、３つの明らかに分離できる両分が認められた。即 ち１種々の混合物であるベレット部分、すべての蛋白性の成分を含む濁ったホモ ジネート、そして浮上するクリーム色の脂質ケーキである。これら３つの両分を 個々に分離した。

種々の成分からなるペレットを完全に除去した。濁ったホモジネート画分を硫酸 アンモニウムで完全に飽和しく１００％飽和）、この画分の全蛋白成分を沈でん させた。角膜アッセイにより、濁ったホモジネート画分にも、全蛋白性でん（Ｐ ＢＳに再懸濁）画分にも血管形成活性は認めら札なかった。

浮上する脂質ケーキとして単離された脂質画分は明らかに２つの層から構成され ていた。上層の泡状の成分とより密度の高いぎっしり詰った層でこの層は上層よ り色が濃かった。両層の活性を調べると両層にも血管形成活性成分が著量含まれ ていることがわかった。この理由は、これらの脂質層の各々が個々におよび組合 さって１本発明の活性脂質画分を含んでいるからである０両層を含む脂質ケーキ の重量は、もとの網の全重量の約９３％であり、活性を有する血管形成因子成分 を含む濃縮有機溶媒抽出物を調製するのに用いるのはこの脂質ケーキである。

活性を有する脂質画分の抽出に用いた脂質ケーキの量と比率を表■に示した。

１　３１．２　Ｎ　Ｒ３，６ ２６５，７５６，０３，２ ３５０、１４８，３３，１ ４６１、ＯＮＲ７，１ ５３８，０３７，０３，５ ６３９，９Ｎ　Ｒ３，０ ７７，８６，２２，４ ８２２，３２１，４３，４ ×　重量（ｇ） ＮＲ＝測定せず 所定量の脂質ケーキにクロロホルム−メタノール（２：１゜ｖ／ｖ）約２１ｍを 加えニーベルバッハ８５７５型ミクロブレンダーで２分間ホモゲナイズした。脂 質／有機溶媒ホモジネートを臨床用遠心分離で２００　Ｘ　ｇ、１０分間室温で 遠心分離し、透明で金色の上澄と粒状物質からなる沈でんとに分けた。上澄をと り減圧下、３７℃でロータリーエバポレータによりクロロホルム／メタノールを 完全に除去した。溶媒の除去法は他にも既知の方法がありロータリーエバポレー ションにかえて行ってもよい、得られた粘性の液体を好ましくはＰＢＳ約４艷に 懸濁し、角膜およびカム・アッセイに供した。

■、晟！貫立夏取畏 上記のようにして得たＣＭＦｒをヘキサン（抽出物Ｌｏｇにつき約６０ｍ１ｌの ヘキサン）に溶解後、０．６６倍量に相当する９５％エタノールを加えた。充分 混合後、分離させた。上層（ヘキサン）を９５％エタノールで再抽出し、得られ た下層と最初の抽出で得たエタノール層を合せた。エタノール層をヘキサンで再 抽出し、得られたヘキサン層を最初の抽出で得たヘキサン層と合せた。ＷＪ層の 溶媒を乾燥除去し、゛′ヘキサン上層物質″と゛エタノール下層物質”を得た（ 以後それぞれヘキサン−ＵＰ、エタノールＬＰと呼ぶ）。

エタノールＬＰ画分をフオルヒ等、ジャーナルオブノ（イオロジカルケミストリ ー２里：　４９７−５０９（１９５７）に従い分配した［即ち１両分をクロロホ ルム／メタノール（２：１゜２０倍容量、　ｖ／ｖｔ）に溶解し、０．２倍容量 の水を加える０層を充分混和機分離させた］、フオルヒ分配の上層を除去し。

下層を０．４倍量のメタノール／水（１：　１）で洗浄した。ここで得られる上 層のメタノール層をフオルヒ分配で得られた上層と合せ溶媒を除去して得られた 両分を以後″フオルヒＵＰ”と呼ぶ、下層も同様に溶媒除去し、以後゛′フオル ヒＬＰ”と呼ぶ。

フオルヒＬＰをクロロホルムに溶解し、バンス等、ジャーナル、オブリピドリサ ーチ　見：　６２１−６３０（１９６７）に記載のケイ酸によるクロマトグラフ ィ、ユニシルカラム、を行った。カラムを各々２０倍量のクロロホルム、アセト ン／メタノール（９：　１）　、メタノールで順次溶出した。この連続溶出によ り、中性脂質（クロロホルム）、糖脂質（アセトン／メタノール）、リン脂質（ メタノール）が分離される。

フオルヒＵＰを１■当りメタノール／水（１：　１）約３−に溶解し、ウィリア ムス等、ジャーナルオブニューロケミストリー　並（１）　：　２６６−２６９ （１９８０）記載の方法でＣ１８逆相カートリッジにかけ、４倍量のメタノール ／水（１：　１）で洗浄し、溶媒を除去し″非脂質ＵＰ物質″を得た。さらに４ 倍量のクロロホルム／メタノール（２：　１）で“脂質ＵＰ物質″を得た。

脂質ＵＰ物質をメタノール／クロロホルム／水（６０：３０：８）に溶解し、ク リスティ、リピドアナリシス、パーガモンプレス、２訂版、　ｐ１０９−１１０ （１９８２）に従いＤＥＡＥ−セファデックスアセテートカラムにかけた。この カラムを１０倍量のメタノール／クロロホルム／水で溶出し、″中性脂質上層画 分”即ち″中性脂質ＵＰ”と名づけた画分が得られた。

またメタノール／クロロホルム１０．８酢酸ナトリウム（６０：３０：８）で抽 出することによりガングリオシド画分が得られた。両画分の溶媒をロータリーエ バポレータで除去しＣ１８逆相カートリジでグリコシド画分を脱塩した。

クロロホルム−メタノール画分に容量比で１０倍量の１％酢酸を加えマグネチッ クスターラーで１０−１２分間撹拌して抽出を行った。抽出物を２００ｍ１容の びんに入れ２０００ｒｐ＋ｍ、　５分遠心分離した。上層、即ち酢酸に不溶の両 分を除去した。

酢酸可溶画分に等量のクロロホルムを加え、上記のように遠心分離して２層に分 けた。各層をそれぞれ互いに反対の溶媒で洗浄後クロロホルム量すべてをプール した。クロロホルムを揮散させることにより“酢酸可溶”画分を得た。

フオルヒＵＰ及び“ＰＢＳホモジネート”画分のアフィニティクロマトグラフィ （ヘパリン及びゼラチン結合）は次のようにして行った。

ヘパリン−セファロースＣＬ　−６Ｂビーズもしくはゼラチン−セファロースビ ーズ（各々約３ｇ）を焼結ガラスフィルター中、　４５０ｍ１Ｌの水で洗浄した 。セファロースビーズを水に懸濁し、２．５Ｘ９ａａのクロマトグラフィカラム に充てんした。過剰量の水を流し、乾燥した試料（例えばフオルヒ−ＵＰ）を０ ．０１リン酸緩衝液ＰＨ７，０に懸濁し、このカラムにかけた。溶出は同緩衝液 で行った（　２　ｍｌ　／　ｗｉｎの流速でトータル１００ｍｆｌ）　、溶出は 、ますカラム内の塩を除去するため１００ｍ１の水で洗浄した。ヘパリンもしく はゼラチンに結合する物質の溶出は、０．５１酢酸５０ｍ１で行った。酢酸を蒸 発させたのち検定に供するためリン酸緩衝液に再懸濁した。

クロロホルム／メタノール（２：　１　、　ｖ／ｖ）脂質画分についてシリカゲ ルクロマトグラフィを用いてさらにそれらの組成、亜両分を明らかにした。この ようなりロマトグΣＢ（Ｅ、ホフマン編集）、エルスピア、ニューヨーク、１９ ８３．記載の方法によった。我々の方法は、クロロホルム／メタノール脂質抽出 物５．０ｍｌを予めクロロホルムで平衡化したシリカゲル（１００−２００メツ シュシグマ化学会社）を充てんしたクロマトグラフィカラムにがけた。溶出は以 下の溶媒１００ｍ１ｉで順次行った。：クロロホルム；酢酸エチル：酢酸エチル ／メタノール（３：　１）　；メタノール／水（４：１）、最後にクロロホルム ／メタノール／酢酸／水（２５：　１５：　４　：２）　２００ｍ１！、各溶媒 による５つの溶出画分（１−Ｖ）が得られた。

ゲル浸透クロマトグラフィをセファデックスＬＨ−２０カラムで行った。クロロ ホルム−メタノール抽出物またはエタノール−ＬＰの１００■をカラムにかけク ロロホルム−メタノール（１：　１）で行った１両分を集め検定のために溶媒を 除去した。

■・貫分立分梶 下層の糖脂質を展開溶媒としてクロロホルム／メタノール／水（６０：３５：　 ８　）を用イルＨＰＴＬＣを行なイスベンナーホルム、ジャーナルオブニューロ ヶミスト！−１：４２（１９５６）記載のオルシノールスプレー試薬で発色させ た。

同時にウルマン等、ジャーナルオブリピドリサーチ。

１９　：　９１０−９１３（１９７８）記載の方法でパーベンゾイル誘導体にし てＨＰＬＣでも分析した。上層の複雑な中性糖脂質画分をＨＰＴＬＣ及びフォル スマン及び５ＳＥＡ−１抗体を用いるイムノブロッティングで調べた。上層の複 雑な中性糖脂質画分の主要成分を、調製用ＴＬＣまたはイアトロビーズカラム（ ＩＸ５０ａｏ、　６０ｕ）でカンテイ等、ジャーナルオブバイオロジカルケミス トリー　ηユ（２４）　１４８６５−１４８７４（１９８２）　：ハコモリ等、 ジャーナルオブバイオロジカルヶミストリー罎但（７）　４６７２−４６８０（ １９８４）記載のヘキサン／イソプロパツール／水による溶出法でさらに精製し た。

ガングリオシド画分をメタノール中０．２５Ｎ水酸化ナトリウムで３７℃、２時 間処理し、氷酢酸で中和後Ｃ１８逆相カートリッジで脱塩した。アルカリ処理し たガングリオシド画分を次にＤＥＡＥ−セファデックスカラムにがけ、　０．０ ２Ｍ、　０．０８Ｍ、　０．０５Ｍ酢酸アンモニウム（メタノール中）で溶出す ることにより各々モノ、ジ、ポリシアロガングリオシド画分を得た。レディーン 等、メソッドインエンザイモロジイ、■、８３、パートＤ　ｐ１３９−１９１（ １９８２）参照。

ガングリオシド画分を、０．４　Ｘ　５０ＣＩ１１．１０μｍ粒径のイアトロビ ーズカラムでクロロホルム／メタノール／水（６５：　３５　：８）で溶出する ことにより個々の成分に分離した。　１．２ｍＱずつ画分を集め、一部をＨＰＴ ＬＣで分析し、単一成分を含む画分をプールした。非脂質画分をメタノールで抽 出し、遠心分離して上澄を除去した。不溶性の残渣を水にとがし。

水、メタノール可溶画分をいくっがの溶媒系を使ってＨＰＴＬＣで調べた。

精製したガングリオシドを窒素ガスで乾燥し、０．０２５％ＣａＣＱ、を含む０ ．０５Ｍ酢酸緩衝液３００μＱを加えた。■コレラ玉のノイラミニダーゼ（１０ ０μＱ、　０．１ユニツト）を加え、３７℃、３時間インキュベートした。クロ ロホルム／メタノール（２：１）　２ｍ１ｌを加えて反応を停止し、逆相カート リッジにかけ非脂質成分を水で溶出した。残存するガングリオシドと脂質反応産 物をメタノール及びクロロホルム／メタノールで溶出し、ＨＰＴＬＣで調べた。

遊離したシアル酸も上記レディーンに従って調製したトリメチルシリル誘導体と してＴＬＣで調べた。

糖、脂肪酸の分析は、まず糖脂質を上記レディーンの方法及びコツレック等、ア ナリティ力ルバイオケミストリニ　９４　：　３６−３９（１９７９）の方法に 従ってメタノール中無水０．７５Ｎ　ＨＣＱ中でメタツリシスした。脂肪酸のメ チルエステルをＴＬＣで分析した。またメチルグリコシドを上記のコッレック等 記載と同様の０ｖ−１でカラムでトリメチルシリル誘導体として分析した。下層 の中性糖脂質をＨＰＴＬＣ分析するために、両分をピリジン中にベンゾイルクロ リドでパーベンゾイル化し上記ウルマンの方法に基き非コーティングジバックス 力ラムを用いグラジェント溶出、２３０ｎｍで検出するＨＰＬＣで分離定量した 。ダイレクトプローブマススペクトロメトリーのために糖脂質、またはガングリ オシド試料（５−５０Ｍｇ）を２５μＱピリジン／ヘキサメチルジシラン／トリ メチルクロロシラン／Ｎ、０−ビストリメチルシリルトリフルオロアセタミド中 でトリメチルシリル化した。まず誘導体１〜５μｇを試料カップに入れ、３０℃ ／ｗｉｎの速度で１００℃から５０℃に昇温した。マススペクトルは、テクニベ ント、モデル５６にデータシステム付のフィンニガンモデル４５００クアドルポ ールマススペクトロメータを用いて得た。

条件はイオン化電流０．５ｍＡ、イオン化電圧７０ｅＶで行った。

イオン化温度は１５０℃であった。　１００＋＋＋／ｅから９５０ｍ／ｅのマス レンジの反復スキャンは５秒間隔で行った。

糖脂質をアルミニウム強化ＨＰＴＬＣ上でクロロホルム−メタノール−水（６０ ：　３５　：　８）で展開し、乾燥後、ブロックハウス等、ジャーナルオブバイ オロジカルケミストリー〃狙：　１３２２３−１３２２５（１９８１）記載のヘ キサン９０．０５％ポリイソブチルメタクリレート中に浸漬した。次にプレート を１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳに２時間浸漬後、抗体溶液に４０℃２時 間浸した。上層の中性糖脂質のプレートをアメリカンタイプカルチャーコレクシ ョン（ＴＩＢ１２１）から購入したフォルスマンモノクローナル抗体ＩｇＭで処 理した。

ジシアロガングリオシド画分のＴＬＣプレートを発明者が調製したＧＤ３モノク ローナル抗体ＩｇＭで処理した。　ＰＢＳで洗浄後、プレートを西洋ワサビペル オキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＭと４０℃２時間反応させた。　ＰＢＳで洗 浄後、２０％メタノール、０．０２５％Ｈ２０□を含む０．０２Ｍ　）−リスー ＨＣＱ緩衝液で調製した３３ｍＮ　４−クロロ−ナフトールでプレートを発色さ せた。

ＴＶ−１ｊＢ失拉１暖 ネコの網組織をホモゲナイズし、遠心分離し浮上するケーキをクロロホルム／メ タノールで抽出しさらに図２に示すように分画した。ヘキサン層にはＣＭＦｒ中 の物質の約９８％を含んでおり、ＴＬＣで分析すると主にトリグリセリドからな っていることがわかった。アルカリメタツリシス及び得られた脂肪酸のメチルエ ステルのＧＣ／ＭＳ分析から１４：０，１６：０゜１６：１，１７：０，１８： ０，１８：１，１８：２がトリグリセリドの主要脂肪酸であった（ここで、最初 の数字は脂肪酸の炭素鎖長、後の数字は不飽和結合の数°を示す）。

エタノール層の物質をフオルヒ溶媒分配し、エタノール層脂質の８０％を構成す る下層脂質をユニシルカラムで分画した。ユニシルカラムから回収した中性脂質 画分もまた主にトリグリセリドから構成されており、ＴＬＣ分析から少量のコレ カテロールと遊離脂肪酸が検出された。アセトン溶出糖脂質をＴＬＣで分析した ところへキソシルセラミド、ラクトシルセラミド、グロボトリアロシルセラ゛ミ ド、グロボシドの移動度に相当する成分が存在した。これらの糖脂質のＨＰＴＬ Ｃによる定量分析法は以下に述べる。メタノール溶出リン脂質画分をＴＬＣで分 析したところ、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエ リンの移動度に相当する成分が存在した。

エタノール層の物質の重量で約２０％がフオルヒーＵＰ中に回収された。このフ オルヒーＵＰの物質を逆相カートリッジにかけ、非脂質画分をメタノール−水で 溶出し、脂質をクロロホルム／メタノールで溶出した。脂質ＵＰの物質をＤＥＡ Ｅカラムにかけ、カラムに保持されない中性脂質画分を集めたところ脂質ＵＰの ４０％を構成していることがわかった。この両分をＨＰＴＬＣで分析すると、ク ロボシトより下に移動する糖脂質が主体でより複雑な微量の糖脂質を含んでいた 。

ガングリオシド画分をＤＥＡＥカラムで、酢酸アンモニウムのメタノール溶液で 溶出し逆相カートリッジで脱塩した。

）ＩＰＴＬｃ分析の結果ＧＭ３．ＧＭＩ、ＧＤ３といくつかの微量のポリシアロ ガングリオシドの移動度に相当するレゾルシノール成分の存在が確認された。こ れらのガングリオシドをさらに精製し同定する方法を以下に記載する。

非脂質上層画分（非脂質−ＵＰ）を乾燥しメタノールで抽出した。この物質の多 くはメタノール可溶性ではないので懸濁液を遠心分離し上澄を除去した。不溶性 の物質は容易に水に溶けた。これをＴＬＣで分析すると、この水溶性画分には唯 一つのニンヒドリン陽性バンドが認められた。この水溶性物質のほとんどは塩で あると考えられる。メタノール可溶性物質には少なくとも６つのオルシノール及 びニンヒドリン陽性成分が含まれており、トリメチルシリル化後ＧＣ／ＭＳ分析 した結果、糖、アミノ酸、ペプチド、糖ペプチドの複雑な混合物であった。絹繊 維の粗脂質抽出物から得た両分の重量分布を表■に示した。

糖脂質画分の一部をベンゾイルクロリドのピリジン溶液でベンゾイル化しバーベ ンゾイル化誘導体をＨＰＬＣで分析し２３０ｎｍで検出した。その結果を図３に 示す、この両分中の糖脂質組成を％で示すと、（ＪｃＣｅｒ　（Ｎｆａ）　、　 ２６％；　Ｇａ１２Ｃｅｒ（Ｎｆａ）ｔ９．６％；　ＧＱｃＣｅｒ　（）ｌｆａ ）　＋　ＧａｎＣｅｒ　（Ｈｆａ）　＋　Ｇａｕｓｓ　２　Ｃａｒ　（Ｎｆａ） 　、　１２％；ＬａｃＣｅｒｙｌ１％：　ＧｂＯｓｅ３Ｃｅｒ、１０％；　Ｇｂ Ｏｓｅ４Ｃｅｒ、２６％であった。

上層の中性脂質画分をＨＰＴＬＣで調べると標準のグロブシトよりわずかにゆっ くりと移動するオルシノール陽性物質が約９０％で、同時により、極性の高い３ 〜４コのオルシノール陽性成分を少量含んでいた。フォルラマン及び５ＳＥＡ− １抗体によるイムノブロッティングの結果からフォルラマン陽性成分が大部分を 占め、　５ＳＥＡ　−１陽性酸分は存在しなかった。主要成分をイアトロビーズ カラムでさらに精製しメタツリシス後ＧＣ／ＭＳで分析した。ヘキソ、−スの比 率は、ＣＱｃ／ＧａＱ／ＮＡｃＧａＱ＝　１：２：２であった。存在する脂肪酸 は、主として　、インタクトな糖脂質もシリル化し、ダイレクトプローブマスス ペクトロメトリーで分析した０図３に示したようにスペクトルから、末端にヘキ ソサミン、内部にヘキソース残基、Ｃ−１８スフインゴシン及び脂肪酸が存在す ることがわかった０以上のデータから、糖脂質はフォルラマンペンタグリコシル セラミドであることがわかった。結合の位置やコンフィギユレーションについて は直接測定していないが、抗体との反応性、糖脂質分析の結果からこの構造に間 違いない。

（以下余白） ガングリオシド画分を穏やかなアルカリ処理してエステル結合を切ってＤＥＡＥ −セファデックスクロマトグラフィを行なうとモノ、ジ、ポリシアロガングリオ シド画分に分離できた。モノシアロガングリオシド画分をＨＰＴＬＣで分析する と主として、標準の０Ｍ３の移動度と同一のトリプレットなバンドの成分と量は 少ないがＧＭＩに相当する成分を含んでいた。モノシアロガングリオシド画分を イアトロビーズカラムでさらに精製して、０Ｍ３に相当する成分のみを含む両分 をプールした。これをノイラミニダーゼで処理し、得られた脂質を）ＩＰＴＬＣ とダイレクトプローグＭＳで調べるとラクトシルセラミドであることがわかった 。遊離したシアル酸をＧＣ分析するとＮ−アセチルノイラミン酸のみからなって いることがわかった。インタクトなガングリオシドをメタツリシスし、糖と脂肪 酸をＧＣ分析した。　（ＪｃＩＧａＱ比は１：１であることがわかった。一方、 脂肪酸のＧＱｃｌＧａＱ比は主に１６：０，１８：０，１８：１，２０：０，２ ２：０，２３：０，２４：０，２４：１からなっていることがわかった。この標 品をトリメチルシリルエーテル誘導体としてダイレクトプローブマススペクトロ メトリーで調べた。マススペクトルは標準の０Ｍ３（シアリル［２−３］ガラク トシル［１−４］グルコシ［１−１１セラミド）のスペクトルに類似していた。

ジシアロガングリオシド画分をＨＰＴＬＣで調べると主にＧＤ３と同じ移動度に 移動する成分を含んでいた。これをイアトロビーズカラムでさらに精製し、ＧＤ ３のみを含む画分をプールした。この標品をメタツリシスし、メチルグリコシド 及び脂肪酸のメチルエステルをＧＣ／ＭＳで調べた。　ＧＩΩ／ＧａＤ比は１： １、脂肪酸は主として１６：０，１８：０，１８：１，２４：０，２４：１であ った。これをノイラミニダーゼで処理し、得られた脂質をＨＰＴＬＣ及びダイレ クトプローブＭＳ分析したところ、ラクトシルセラミドと同定された。遊離した シアル酸は、ＧＣ分析の結果、Ｎ−アセチルノイラミン酸のみからなっていた。

　ＴＭＳ誘導体のダイレクトプローブＭＳからＧＤ３に相当するスペクトルが得 られた。そこで我々の研究室で調製したＧＤ３に反応するモノクローナル抗体を 用いてイムノブロッティグするとこの物質はこの抗体と反応することがわかった 。

またポリシアロガングリオシド画分をＨＰＴＬＣで調べるとガングリオシドＧＤ 　１　ａ、ＧＴ　１　ｂに相当する成分が含まれていることがわかったが、量的 に不足だったのでそれ以上の分析はできなかった。

■、ムαＵヨ腹 図１に示した脂質標品及びシリカゲルクロマトグラフィ分画画分１−Ｖの血管形 成活性を次のような方法でウサギの角膜で調べた：ニュージーランドホワイトラ ビットの静脈内にベンドパルビタールを注射して（３０■／ｋｇ）麻酔した１表 ■に示した各標品から、脂質懸濁液５０μｎをウサギの目の角膜の基質内に２５ Ｇの注射針を通して投与した。投与後、２，４，６，８．１０日目上ウサギの角 膜を観察し、また手術用顕微鏡によっても観察した。血管の造成と角膜の浮腫お よび／または炎症に注意した。視覚的に観察し、１０日目上ウサギを殺し、ホル マリン固定した摘出眼球から６μｍの厚さの組織標本スライドをつくり、既知の 方法でヘマトキシリン及びエオシンで染色した。血管形成陽性の写真を記録した 。

血管形成活性の応答を次のようにランクづけした。：０゜血管形成を認めず、角 膜も透明；１＋、縁に赤色をしだ量（きよう）膜血管の拡張を認める；２＋、縁 から投与部位の２／３に至っていくつかの血管を認める；３＋縁から投与部位に いくつもの血管が認められそれが角膜の１０−２０％に相当する場合；４＋、縁 から投与部位にかけて密集した血管形成を認め、角膜の少なくとも３０−４０％ に相当する場合。

比較のために、網組織の脂質ケーキの水懸濁液と皮下の非網組織の脂肪種晶も調 製して活性を調べた。皮下脂肪標品を調製するため、皮下脂肪組織３ｇとＰＢ５ ４ｍｌとを混ぜエーベルバッハモクロブレンダーで４℃、２分間ホモゲイナイズ した。同じように網組織の脂質ケーキの水懸濁液を調製するため脂質ケーキ４ｇ にＰＢＳ４ｍｌを加え４℃、２分間ホモゲナイズした。遠心分離して蛋白画分と 脂質画分に分ける前の金網組織ホモジネートも評価した９表■以下に結果を記載 した。

（以下余白） 表　■ ２４　Ｎｏ、１　０（炎症） ２５　Ｎｏ、２　０（炎症） ２６　Ｎｏ、３　０（炎症） ２７　ＰＢＳ単独　Ｎｏ、１　０ ２８　Ｎｏ、２　０ ２９　Ｎｏ、３　０ 以上のデータはクロロホルム／メタノール脂質抽出物を角膜の１か所に５０μΩ 投与した場合、もっともすぐれた血管形成活性が得られたことを示している。一 方、全網組織のＰＢＳホモジネートと抽出前の脂質ケーキのＰＢＳホモジネート にわずかな活性が認められた。しかし、　ＣＡＭアッセイですぐれた血管形成活 性を示したＰＢＳホモジネートからアフィニティクロマトグライでヘパリン結合 性成分が濃縮されたことは注目すべきである（表■参照）。

ＰＢＳ単独や皮下の非網組織の脂肪ホモジネートには全く活性が認められなかっ た。しかし、表■のデータを複雑化しているのは、ネコの腹壁から得た皮下脂肪 を角膜に投与した場合、２日以内に激しい炎症が現われたことである。

クロロホルム／メタノール脂質標品の水懸濁液を投与したときの角膜の応答は迅 速で、強い活性が認められた。抽出脂質画分の投与後２４時間以内に、軽い炎症 がおこったが４８時間以内にはおさまった。この投与直後の炎症は、しばしば目 かられずかに流出物を伴い、翠膜領域に小さな斑点が現われ、角膜が若干曇るの が特徴である０間質の血管形成とともに、バンヌス、即ち角膜の縁周辺に幕状の 血管形成が投与後３〜４日に認められる。７日から１０日上京でに。

血管は角膜内で密集し１組織化したネットワークを形成するようになる。これは 図３の写真に示しである。１０日上京摘出した眼球の組織学的県究で角膜間質内 にたくさんの毛細血管が形成されているのがわかる０間質内の数多くの毛細血管 を示すため組織切片の写真を図４に示しである。

溶媒抽出脂質画分の水懸濁液がわずか５０μＱの単回投与で血管形成活性を有し ていることはとくに注目すべきことである。この血管形成の過程や応答の機構は 不明であるが、組織化された血管ネットワークを形成するようになる新しい血管 を造成しているのは明らかである。

図３に示すようにＣＭＦｒをシリカゲルクロマトグラフィでさらに精製した。５ つの脂質並両分それぞれについて角膜アッセイしたところ亜画分■のみに血管形 成活性が認められた。しかし亜画分■全体の活性はクロロホルム／メタノール脂 質抽出標品の活性より小さかった。亜画分■〜■は単独では血管形成活性が認め られないが、亜画分■といっしょにすると血管形成活性が高まった。

上記の実験からＣＭＦｒに血管形成活性が存在することが示された１次に図１に 示した方法で調製した別の両分を用いて実験を行った。これは以下に述べるＣＡ Ｍアッセイである。

ＣＡＭアッセイにおいては両分の効力を示すものとして“血管形成インデックス ″を算出した。さらに″識別ユニット”も算出した。この２つについては後に解 説する。

記載する実験は上記の実験で得た網組織由来の両分に限らない、より活性のある 両分の一般的分子組成を脂質を含む分子、ことにガングリオシドを含むこと一度 定めておけば既知の別の脂質含有分子が使える。予想外にも、このような物質の 多くが強い血管形成活性を有していた。さらに。

市販のガングリオシドを新しい組合せで使用する実験も行った。この場合も予期 せぬことに血管形成活性が認められた。いくつかの異ったガングリオシドを混ぜ 合せたものが相加的な血管形成効果以上の活性をもつことは興味大である。

Ｖｌ、ＣＡＭアーセイ 抽出物、分画画分等の血管形成効果をニワトリ肝葉尿膜アッセイ（”ＣＡＭアッ セイ”）によって調べた。

ＣＡＭアッセイはニワトリ受精卵を用い、次のように行った。

方！ｌ」１ ふ卵４目上の受精卵の殻にドリルで２ｄの穴をあける。

この穴を“窓”として使用する。この穴をセロファンテープでしっかりと封じる ０次にこの卵を３７℃でさらに４日間インキュベートする。

デコ≦（久１日１Ａ ふ卵８目上にアガロース０．４ｇとＰＢＳｌＯｍｌを混ぜ、小さなガラスバイア ルびん中で１００℃に加熱し５０℃に冷えたら２％ＢＳＡのＰＢＳ溶液と混ぜる 。この混合物（２％アガロース＋１％ＢＳＡ、　ＰＢＳ中）を湯浴で暖める。ピ ペットで被験溶液（即ち抽出物、両分、組成物）２０〜４０−とアガロース混合 物１滴と撹拌しながら混ぜる。固化して大きなディスクができたらさらに４つの 小さなディスクに切る。

上ヘーイスクを　く ふ卵８目上に漿尿膜上にディスクを置く、つまり漿尿膜上の種々の度合で血管形 成がはじまっている場所を選んでディスクを置く、ディスクを置く場所はニワト リ胎児から約１ａｍ離れたところにし、離れすぎて漿尿膜上の卵殻の内側にはり つけたりしてはならない、このようにした卵をさらに４日間インキュベートする 。用いる器具はすべて予め９８％エタノールにつけておく。

プラスチーターイスク コルクポーラ−でプラスチックディスクをつくる。各ディスクに被験溶液を２． ５ｍｌのせ、乾燥させた。さらに２．５ｍｌの被験溶液をのせ、乾燥させた。デ ィスクを調製後上記のように漿尿膜上においた。

羞果立■做 ふ卵１２目上に“窓”をビンセットで広げた。

次に顕微鏡で卵を観察した。ディスク周辺の血管形成と他の領域の血管形成を比 較した。ディスク周辺の新生血管の度合を評価し他の卵のディスクの評価と比較 した。

各ディスクの効果を次のような基準で１〜５段階に分けた。

１＝ディスク周辺に形成された血管分枝が１つか２つの小領域の場合：陰性 ２＝ディスク周辺に形成された血管分枝が３つか４つの小領域の場合：応答弱 ３＝パ車輸のスポーク状″ディスク周辺に血管の分枝が増加した場合：応答並 ４＝″車輪のスポーク状”ディスク周辺に“３”よりも強い血管分枝が認められ た場合：応答強５＝″車輸のスポーク状”ディスク周辺に著しい血管分枝が認め られた場合：応答極めて強 プラス、マイナスの表示も使用した。　ＣＡＭアッセイの値の範囲を１−（全く 応答せず）から５（著しく強い応答）までとした。

前述の評価方式に基き、′血管形成インデックス”　（以後の表で“Ａ　ｌｔイ ンデックスまたは単に“′Ａ”と表示）もめた。Ａインデックスは血管形成の比 較分析である。

″血管形成“インデックス”は 最大可能スコア とした。

例えば１２回のＣＡＭアッセイ中″弱”が７回、″並″が１回、１強”が０で“ 陰性”が４回とするとＡインデックス表■に図ｘ、ｎ、ｍに示した方法で得た抽 出物の分析結果を示した。ここに示した用語は図に用いた用語と同じである。

ネコ、ウシ、ブタ、イヌの網組織から得た試料の結果を示した。

表　■ ネコＣＭＦｒ　４１　２８．９８　４６．３４　１７　４　１ウシ＃　１４　３ ５．２７　３５．７１　５　４　０ブタＩｔ　１８　２４．９　６１　７　０　 ０ヒツジ＃　４　２３．３５　５０．００　２　０　０イヌ　ＩＩ　４　４５． ０５　０　３　１　０ネコＰＢＳ上澄　１５　１９．１２　７３．３３　４　０ 　０１％酢酸可溶、上層　１８　２８．１７　４４．４４　６　４　０１％酢酸 可溶、下層　１０　２８．７２　７０．００　１　２　０ネコ皮下脂肪　６　２ ０．０３　８３．３３　０　１　０ブタ皮下脂肪　８　３３．４３　３７．５０ 　５　０　０ネコ脂質ケーキ　５　１３．３６　１００　０　０　０化ΔＬ惣　 因捌伊欧　Δ　窟匹」牡１１１轄琶Ω吐旦ΩＵネコーヘキサン上層　２４　１６ ．７　７５　６　０　０ウシ−ヘキサン上層　４　１５．０５　７５　３　１　 ０ブタ−ヘキサン上層　２３　３５．４　３０　１６　０　０ネコ−エタノール 下層　１８　２１．９　７２　５　０　０ウシ−エタノール下層　５　１３．３ ６　１００　０　０　０ブタ−エタノール下層　２２　１９．４　６４　７　１ 　０ネコ一フオルヒ上層　４４　２８．８　５０　１３　９　０ブタ一フオルヒ 上層　１０　１８．７　８０　１　１　０ヒツジ一フオルヒ上層　４　１８．４ ０　１００　０　０　０イヌ一フオルヒ上層　４　２３．４０　１００　０　０ 　０ネコ一フオルヒ下層　４４　３３．２　４１　１６　８　２ブタ一フオルヒ 下層　１５　２２．７　６０　６　０　０ヒツジ一フオルヒ下層　４　１０．０ ０　１００　０　０　０イヌ一フオルヒ下層　４　３８．４０　２５　３　０　 ０ＣＩ８カラム゛ 化ゴＬ惣　匹賂伊敗　Δ　窮匡傷ｍｗ農紅鼠Ωυ一旦Ωｌネコ、Ｃ１８脂質　４ 　３５．０５　５０　１　１　１ブタ、Ｃ１８脂質　１４　２５．８　６４　５ 　０　０ネコＣ１８・非脂質　８　１５．８８　７５　１　１　０ネコ、全ガン グリオシド　１２　２７．８　５０　３　３　０ＤＥＡＥ　カラム（つづき） ブタ、中性ガングリオシド　１４　３３．４　５０　０　０　０ＤＥＡＥ　カラ ム（つづき） 仁企１　晒刈胆　Δ　釧匣済■賜憬紅掴影鮒ブタ、モノ、ジオシア０　１８　２ ８．６　４４　１０　０　０ガングリオシド ネコ、下層、クロロホルム／ム２２　３０．０　３６　１３　１　０ブタ、下層 、クロロホルム　９　３４．１　２２　７　０　０ネコ、下層、メタノ−／Ｌ／ 　２６　３３．１　２３　２０　０　０ブタ、下層、メタノール　１１　３４． ０　２７　８　０　０イアトロビーズ Ｉ　４４５０３１０ Ｉｆ　４　１５　７５　１　０　０ ＩＩＩ　４　４１．７５　２５　２　１　０ＩＶ　４　４３．４　０　４　０　 ０ Ｖ　４　３３．３５　２５　２　１　０１　５　３２．０８　４０　４　０　０ ｎ　７　２４．７７　４３　３　１　０ｍ　６　３３．４０　３３　２　２　０ ＩＶ　４　２９．４４　８０　１　０　０Ｖ　５　２５．３６　６０　２　０　 ０ＶＩ　５　２９．４０　４０　３　０　０■　５　２２．７２　６０　２　０ 　０■　６　３２．２７　３３　３　１　０１Ｘ　３１フ、８７　１００　０　 ０　０Ｘ　３　３３．４０　３３　１　１　０ＸＩ　４　４０．０５　２５　１ 　２　０アフ　ニーイ　クロマトグラフィ 次に示す表■でも表１〜■と類似のデータを示す、ただし、試料はすべてガング リオシドである。第一のグループはネコの網組織由来のガングリオシドである。

ガングリオシドをモノ、ジ、トリシアル化成分に分け、１：１または１：１：１ の比率で混合した。ブタの網組織由来のガングリオシドも同じ分析を行った。″ スペルコ”のグループも既知の市販のガングリオシドの分析を提供した（スペル コのＮｉｌ〜４）、しかし、＆５〜８は新しいガングリオシド組成である。

この表では“ＤＵ”すなわち“識別ユニット”の値も示した。

“ＤＵ”値をめるためにＡインデックス値をクラス■化合物Ｓ１と陰性平均％ｓ １、クラス■化合物ＳＩＩと陰性平均％Ｓ　と陰性平均％８　を用いた。ｓＩ、 Ｓ！、ｓｎ、ＳＩＩはｎ　１ 化合物の各クラスの配分の中心を定めている。これを用いてＶ□と％＋２及びＸ □Ｔｔ　Ｘ２Ｔ　；　”重量係数”を次の式でめる。

Ｗｚ＝　８　８　ＸＩ？＝（ＳＳＩＩ　＋　５１　）　／２Ｗｚ＝　ｓ　ｓ　Ｘ ｚｙ＝（Ｓｓｎ　＋　Ｓ　１　）　／２■　！ ＤＵ値が小さくなればなるほどこの試料の血管形成活性が高い、ＤＵ値による化 合物をランク付し、よい方から順次並べて表Ｖに示す。

表　■ 化合物　シ訟笑」Ｌ工＾−梼ＷＭ旦 吏」開園 酸七りジ旧ガングリオシド　１２　３９．１７　２７．８　５０　３　３　０モ ノシアロガングリオシド　ＧＭ３　１８　２６．７７　３４．１　３９　１０　 １　０ジシアロガングリオシド　ＧＤ３　１５　９４．５９　１５．１　１００ 　０　０　０トリジアロガングリオシド　１７　７５．６３　２１．６　８２　 ３　０　０モノ、ジ、トリ（混合）　２３　０．５４　３１１１．９　１３　１ ９　１　０モノ、ジ（混合）　９　２１．０６　３４．１　３３　６　０　０モ ノ、ト１バ混合）　１６　６．６６　３７．５　１４　１３　０　０ジ、トリ（ 混合”）　８　２５．８４　３０．９　３７　３　２　０中性ガングリオシドフ オルツマン　４９　３７．８５　２９．０　４９　２５　０　０モノ、フォルラ マン（混合）　１６　８０．６７　２０．９　８７　２　０　０表　■（つづき ） 二化−金一物一　主成分　甲羽　−囚一　」（−襲Ｎ丙　ＷＭ　互層ＧＭＩ　Ｇ ＭＩ　８２３．５６３８．４　３７　２３０脳ｉ：；Ｍ３ａ３１４３８．７７２ ９．１　５０　６　ｔ　。

Ｚづ辺／ｍｌ力級り 精製混合ガングリオシド　１２　２１．４５　３２．８　３３　７　１　０モノ シアロガングリオシド　団１　１２　４７．２８　２６．２　５８　５　０　０ ジシアロガングリオシド　Ｇ）ｌａ　９　２１．５１　３２．６　３３　６　０ 　０七ノ／トｉバ混合）　５　９３．２７　２１．４　１００　０　０　０ジ／ トｉバ混合）　６　４．３６３８．９　１７　５００モノ／ジ／トリ（混合）　 ６　１０．５６　４１．２　１７　４　１　０１り網相趣 モノシアロガングリオシド　２９　５２．０　２３．２　６２　１１　２　２ジ シアロガングリオシド　２８　４６．４４　２５．８　５７　１０　２　０トリ ジアロガングリオシド　２５　４０．７４　２８．９　５２　１２　０　０モノ 、ジット１パ混合）　２６　５５．２８　２１．８　６５　９　０　０モノ、ジ （混合）　１８　３３．２１　２８．６　４４　１０　０　０モノ、トリ（混合 ）　２６　３４．４１　２７．０　５０　１３　０　０ジ、トリ（混合）　２７ 　４５．１３　２７．０　５６　１２　０　０表　■ ガングリオシド血管形成能 ランク　ＤＵ　化−二合−−掬 １　−１０．５６　スベルコ、モノｌジ／トリ混合物２　０．５４　ネコ網、モ ノフジｌトリ混合物３　４．３６　スペルコ、ジ／トリ混合物４　６．６６　ネ コ網、モノｌトリ混合物５　１９．９０　スベルコ、モノ／ジ混合物６　２１． ０６　ネコ、モノｌジ混合物７　２１．４５　スペルコ、精製混合ガングリオシ ド８　２１．５１　スペルコ、ジシアロ ９　２３．５６　０Ｍ１ １０　２５．８　ネコ網、ジノトリ混合物１１　２６．７７　ネコ網、モノシア 口（ＧＭ３）１２３３゜２１　ブタ網、七ノ／ジ混合物１３　３３．６７　スペ ルコツトリジアロ１４　３７．８５　ネコ網、中性ガングリオシド、フォルスマ ン１５　３８．７７　０Ｍ３ １６　３９．１７　ネコ網、酸性ＤＥＡＥガングリオシド１７　４０．７４　ブ タ網、トリジアロガングリオシド１８　４５．１３　ブタ網、ジノトリ混合物１ ９　４６．４４　ブタ網、ジシアロガングリオシド２０　４７．２８　スペルコ 、モノシアロガングリオシド２１　５２．００　ブタ網、ジシアロガングリオシ ド２２　５５．２８　ブタ網、モノｌジノトリ混合物２３　７５．６３　ネコ網 、トリジアロガングリオシド２４　８０．６７　ネコ網、モノｌフォルスマン混 合物２５　９３．２７　スペルコ、モノ／トリ混合物２６　９４．５９　ネコ網 、ジシアロガングリオシド以上の結果は、ＣＭＦｒはＣＡＭアッセイに対し血管 形成活性もっているが、図■に示したようなステップで精製した画分はより強い 活性を示している０例えは表ｍでネコのＣＭ？’ｒ（表■の一番最初の欄）はＡ 値が２８．９８だが４６．３４％は陰性である。一方、　ＤＥＡＥカラムで精製 したモノシアロガングリオシドはＡ値が３４．１で陰性は３９％しかない、逆に 、ＤＥＡＥカラムから得られる脂質でない両分はこれらの値がそれぞれＡ＝２３ ．６．陰性６７％と精製しているにもかかわらず活性が低下した。また、ネコ網 由来のモノ、ジ、トリジアロガングリオシド混合物はＡ＝３８．９．陰性わずか １３％であった。

もうひとつの比較データが表■のデータから導き出せる。

表■、■に示したＤＵ値はＡ値だけでなく陰性パーセントも考慮されることから より実際的な効力を示すよい方法である。　ＤＵ値が低ければ低いほどその物質 の効力は高い、従って表■のように既知のガングリオシドの新しい混合物（スペ ルコモノ、ジ、トリジアロガングリオシド）やネコのモノ。

ジ、トリジアロガングリオシドを含む両分が最も効力の高い組成である。

一方、以上の結果を図６〜１６にグラフで示した。

この図は、種々の物質に対する直線分類グラフである。

直線分類グラフは、血管形成インデックスを陰性パーセントに対してプロットし た。個々の物質グループの平均値と各々２つのグループ毎の比較からＴ値をめる 。このＴ値が他のものよりも効力があるか否かのインデックスになる。

図■に調べたすべての試料を用いＴ値についてのガイドラインを示した。以後図 ７〜１６では種々のグループについてたものは、血管形成活性の比較上有望であ るものを意味する０図１６に最も活性の強い組成を示す。

図１７は、既知のジ及びトリジアロガングリオシドの新しい混合比率での血管形 成インデックスと、陰性パーセントを示したグラフである。このグラフからジ及 びトリジアロガングリオシドの混合比は１：２が最もよいことがわかる。

このグラフは、抗原−抗体結合をプロットしたときに得られるカーブと似ている ことが注目される。これは、結合反応が沈でん形成や凝集反応をおこす抗原−抗 体型の反応がおこっていると思われる。

以後の実験は、上述のＣＭＦｒが生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ）で血管形成能をもっ ていることを示している。この実験は連続ナンバー６７２．６２４、ファイル１ ９８４年８月２０日で報告されている。

表■〜■に示したようにＣＭＦは血管形成インデックスは低いがＤＵ値はさらに 分画した両分や同様の調べた混合物より高い（ＣＡＭアッセイ）、従って、さら に精製した両分ですぐれた結果が再現性よく得られるであろうことは経験豊かな 人なら考えるに違いない。

一方スベルコやシグマ薬品会社から購入した市販の脂質化合物や個々の研究者よ り譲受した化合物についてもＣＡＭアッセイしてしらべた０表■にその結果を示 す。

表　■ びガング１オシド −Ｋ」Ｌ潰−匹μｓ　Δ　９匹　！琶互セレブロシド（スペルコ）　１６　３６ ．３　３８　９１０ガングリオシド（スペルコ’）　１５　３４．３　３３　８ ２０グロボシド（スペルコ）　１フ　詞、６２９１０２０ステリルグルコシド（ スペルコ）　１６　４３．０　１９　１１　２　０セラミド（スベルコ）　１７ 　３２．２　４１　８２０セラミドガラクトシド（スベルコ）２０　２７．０　 ６０　７１０セラミド、タイプ■（シグマ）　１８　３１．９　４４　１０００ セレブロシド、タイプＩ（シグマ）　１９　３０．２　５３　８１０セラミド、 タイプ■（シグマ）　１６　３０．５　３７　１０００セレブロシド、タイプ■ （シグマ）　１３　３０．３　３８　８００スルフアチド（シグマ）　７　２８ ．７　５７　３００スルフアチド（スベルコ）　６　３０．０　５０　３００グ ルコセレブロシド（シグマ）　７　２６．７　４３　４００セラミドトリヘキソ シト（シグマ）　４　３８．４　２５　３００ステリルグルコシド（スペルコ） 　６　４６．８　０　５１０ガング１オシド 一止−合−物一　匹釜　Δ　か可　叉琶旦ＧＭＩ　８　３８．４　３７　２３０ 精製ＧＭＩ　１５　３２．５　２７　１１　０　０ＧＭ３　１４　２９．１　５ ０　６１０精製ＧＭ３　１７　２９．１　４７　８　１　０ＪＬｔＪＬ　明星　 Δ　心色！社旦 スフィンゴミエリン（脳）（シグマ）　８　２０．９　１００　０００ホスフア チジルコリン（シグマ’）　１０　３３．４　４０　６００ホスフオイノシチド （シグマ）　３　３１．１　３３　２００スフインゴミエリン（卵黄）　６　２ ２．２　８３　１００兜−ＪＬＪＩｍ−寛 ！（資）ΔＬ潰−因堅　Δ　ハ里！琶盈トリステアリン（シグマ）　２１　３６ ．５　４３　８３１トリオレイン（シグマ）　４４５２５０３０モノステアリン （シグマ）　４　５０．０　０　２２０モノオレイン　４　５０．０　０　２２ ０ジステアリン（シグマ）　３　２６，７　６７　０１０ジオレイン（シグマ） 　３　１３．３　１００　０００トリパルミチン（シグマ）　４　５　１０００ ００トリアラキドン（シグマ）　４　４１．７　０４００パラフインオイル（フ ィッシャー）４４０　０４００ステロイド 」ζΔＬ１−　印釜　Δ　ｐ亜Ｗ、琶旦エルゴステロール（スペルコ）　１４　 ３７．７　３６６３０デスモスチロール（スペルコ）　４　２６．７　５０　２ ００ラノステロール（スペルコ）　８　２８．４　３８　５００ステイグマステ ロール（スベルコ）　６　３７．９　３３　４００経験ある人なら哺乳動物の肝 、脳、上皮組織などと同様植物ことに種子にも活性を有する画分がありそうだと 考えるに違いない、植物はレシチンを含んでおり、血管形成活性の高いレシチン がみつかるかもしれない１合成して得られる脂質の中にも活性の高いものがある かもしれない。

組織内で正常な血管形成を故意に破砕させた部位で水不溶性の脂質標品が血管を 新生させるかどうかの実験を行った。成熟した雌のネコの筋肉内に７ｍｇ／ｋｇ の濃度でケタミンを注射して麻酔させた。ネコをあお向けにし雨後足のひざとそ 径部の間を切開する。大腿部の動脈をとり出して結紮し、そ径部と一番目の大腿 動脈の分枝（ハンター導管）の間を除去する。切開した部位を縫合し、ただちに 静脈内に塩化第一スズ／テクネチウム９９を投与する。これは組織内で赤血球に 結合する放射活性物質である。この放射活性の部位と量をガンマカメラでスキャ ンすることにより調べる。

このようにして、放射活性物質をラベルされた赤血球を運ぶ血管、毛細血管を見 ることができる。

塩化第一スズ／リン酸塩標品は、ピロリン酸ナトリウムｌＯ■、トリメタリン酸 ナトリウム３０■、塩化第−スズ０．９５■を含んでいる。この標品にＰＢＳ２ ．ＯｍＱを加えてとかしそのｌｒｒ＆をネコの気管の静脈内に投与する。２０分 後１０ミリキュリーのテクネチウム−９９＋ｏを静脈内にする。イメージングス キャン及び血流のデジタルインテグレーションは次のように観察した。

ネコを手術したのち１手術部位のバックグラウンドの放射活性の“ベースライン ”スキャンを行ない、続いて大腿動脈を除去した部位の右足の２か所にクロロホ ルム／メタノール抽出物６〜７−と等量の蒸発させた粘性のＰＢＳ懸濁液を筋肉 内に投与する。擬薬として左足の同様の部位にＰＢＳのみを投与した０通常の環 境下でこの種の手術による応答として、大腿動脈を除去した部位に新しい血管及 び毛細血管が形成され、血流がつながるかどうかをみた。術後各々の足に新しく 生じた血流の割合と度合を比較し、クロロホルム／メタノール抽出脂質標品の血 管形成能を直接評価した。

続いて客足の所定部位に塩化第−スズ／テクネチウム−９９＋ａを静脈内投与し 、客足を術後３，６．９日目にスキャンした。

以上の結果を図１８−２０に示す、結果は（網組織の脂質画分を投与した）ネコ の右足に新しい血管が形成され、次にコントロールの左足にも放射活性がカウン トされた。術後７２時間では放射活性の差は２９．６％、６日目には左足に比べ ３８．２％右足が高かった。９日目には、左足に比ベロ５．８％右足が高かった ０図１８−２０の写真は、クロロホルム／メタノール抽出脂質画分を用いての結 果である０図２１に示すように、塩溶液のみを投与した場合に比べ脂質を投与し たときの放射活性は直線的に増加した。左足に比べ右足の血管形成の増加は１時 間当り０．２５％であった。このことは明らかに、脂質画分の血管形成効果によ り右足に新しい血管が生じ、組織化されていることを示す、しかし、このデータ は、次に示すコントロール実験により示されるように脂質標品を用いることによ る共通の組織内効果の可能性を見のがしている。

もう１つのコントロールとして、別のネコを使って上記のように大腿動脈を除去 した。しかし、この実施例では。

何の注射も行なわなかった。術後３日及び６日にガンマカメラでスキャンし図２ ２−２４に示した。左右の足をスキャンしたところ図２２に示すように３日後に は新しい血管再生効果の差は認められなかった０図２３は術後６日目の片方の動 脈を示し、図２４は同じく６日目に背部からみたものである。

その結果調べた３日目、６日目とも左右の足の放射カウント数に差は認められず 、初めの実験と比べ血管形成の度合は極めて少なかった。実際、初めの実験での 左右（コントロール）の場合より今回の追加実験での血管形成は著しく劣った。

この点と左足（コントロール）の血管形成が比較的高かった（右足よりは低いが ）という初めの実験の結果から、初めの実験では、右足の脂質標品の一部がおそ らく左足へ移行したと考える根拠がある。

ＣＭＦｒを用いたｉｎ　ｖｉｖｏ　（生体内の）実験を、ヘキサン／エタノール で得た別の物質を用いて再度行った。この両分と、　ＣＭＦｒの比較は表■−■ に示しているので、経験のある人は、これらの精製した抽出物は、迅速かつすぐ れた血管形成活性を有していると結論づけるであろう。

血管形成活性を有する脂質分子を含む組成が哺乳動物組織から得られた。治療上 効果のある投与量での組成は、予め予期せぬ経路での血管形成活性に影響するこ とを示している。ｊｉｉ乳動物組織や植物組織のような脂質を含む網に似た組織 が血管形成活性のある分子を含むものとして期待できる。血管形成活性のある分 子の構造に基いて合成された脂質も期待できる。

実際には、静脈内、筋肉内、経口、局所的など既知の方法で投与できる。投与量 は患者によって異なる。

ここで用いた用語や表現は、記述用語として用いたもので限定されたものではな く、ここで示した性質と同等のものを排除する用語や表現として用いるつもりは ない、従って発明の範囲内で種々の修正が行なわれることは認める。

飢１１移八インデックス（Ａ） 独管形城イシヂックス（Ａ） 丘？を形式インチ”ツクス　（Ａ） ＆管丹多滅インチ−７クス　（Ａ） 血Ｖ形成イ〉テ”・７クス　（Ａ） ２９．６％　増力口 Ｆｉｇ、旧 ６上京Ｕ打績） ３８．２　％　増力口 ん泥、；対ハ右足り枚射冶柑カク訃の増加・７６国際調査報告 ｌ１１＋−４６＠１ｉｌ−Ｎ４．ｆ’、ｊ／ｇ％ｇ必ｚｃ４（／　−Ａ　６１　 Ｋ　３７／２２　８６１５−４Ｃ＠発明　者　マクリュアー、ロバート　ニス　 アｏ発　明　者　シン、ロバート　ニス　アメリカ合衆国、　０１７２０　マサ チューセッツ、アクトン、ワシントーブ　２７番地 □メリカ合衆国、　１００２４　ニュー　ヨーク、ニュー　ヨーク、ウニ″テイ ーセブンス　ストリート　２４繻地合衆国、　０１８９０　マサチューセッツ、 ウィンチェスタ−９ｌ　ストリート　暖地

Claims (44)

【特許請求の範囲】
1. １．血管形成活性を示す量で少なくとも１つのタイプの血管形成活性を有する脂 質含有分子を含んだ血管形成活性を有する組成物。
2. ２．組成物が、ガンダリオシドであることを特徴とする特許請求の範囲第１項記 載の組成物。
3. ３．組成物が、モノジアロガングリオシドであることを特徴とする特許請求の範 囲第１項記載の組成物。
4. ４．組成物が、ジシアロガングリオシドであることを特徴とする特許請求の範囲 第１項記載の組成物。
5. ５．組成物が、トリジアロガングリオシドであることを特徴とする特許請求の範 囲第１項記載の組成物。
6. ６．組成物が、モノ、ジ、トリジアロガングリオシド混合物であることを特徴と する特許請求の範囲第１項記載の組成物。
7. ７．組成物が、モノ、ジシアロガングリオシドであることを特徴とする特許請求 の範囲第１項記載の組成物。
8. ８．組成物が、モノ−、トリ−シアロガングリオシドを含むことを特徴とする特 許請求の範囲第１項記載の組成物。
9. ９．組成物が、ジ−、トリ−シアロガングリオシドを含むことを特徴とする特許 請求の範囲第１項記載の組成物。
10. １０．ジシアロガングリオシドとトリジアロガングリオシドの構成比率がそれぞ れおよそ０：３から３：０の範囲であることを特徴とする特許請求の範囲第９項 記載の組成物。
11. １１．ジ−及びトリ−シアロガングリオシドの比が約１：２であることを特徴と する特許請求の範囲第９項記載の組成物。
12. １２．組成物がリン脂質を含むことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の組 成物。
13. １３．組成物がセラミドを含むことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の組 成物。
14. １４．組成物がセレブロシドを含むことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載 の組成物。
15. １５．組成物が中性脂質であることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の組 成物。
16. １６．組成物がレシチンであることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の組 成物。
17. １７．組成物がスフインゴツドを含むことを特徴とする特許請求の範囲第１項記 載の組成物。
18. １８．組成物が動物組織由来の脂質含有分を含むことを特徴とする特許請求の範 囲第１項記載の組成物。
19. １９．脂質含有分子が網組織由来であることを特徴とする特許請求の範囲第１８ 項記載の組成物。
20. ２０．網組織がネコ、ウシ、ブタ，あるいはイヌの網組織から選ばれた網組織で あることを特徴とする特許請求の範囲第１９項記載の組成物。
21. ２１．網組織がネコの網組織であることを特徴とする特許請求の範囲第２０項記 載の組成物。
22. ２２．組成物が植物組織由来の脂質含有物質を含むことを特徴とする特許請求の 範囲第１項記載の組成物。
23. ２３．植物組織がレシチン含有組織であることを特徴とする特許請求の範囲第２ ２項記載の組成物。
24. ２４．前記分子が合成によってつくられたものであることを特徴とする特許請求 の範囲第１項記載の組成物。
25. ２５．哺乳動物の組織を第１の溶媒と接触させて血管形成活性を有する脂質含有 分子を抽出する工程及びさらに前記血管形成活性を有する脂質含有分子を含む第 １の溶媒と第２の溶媒とを接触させて、血管形成を阻害する物質は抽出させない で、前記血管形成活性を有する脂質含有分子だけを第２の溶媒に抽出する工程か らなり、前記第１溶媒と前記第２溶媒とは互いに不溶性のものである血管形成活 性の高い組成物を得る方法。
26. ２６．第１の溶媒がクロロホルム−メタノール混液であることを特徴とする特許 請求の範囲第２５項記載の方法。
27. ２７．第２の溶媒がヘキサン−エタノール混液であることを特徴とする特許請求 の範囲第２５項記載の方法。
28. ２８．第１の溶媒がクロロホルム−メタノール混液であつ第２の溶媒がヘキサン −エタノール混液であることを特徴とする特許請求の範囲第２５項記載の方法。
29. ２９．特許請求の範囲第２８項記載の方法で得た抽出物。
30. ３０．血管形成活性を有する脂質含有第２溶媒をヘキサンとエタノールの層の成 分とに分離する特許請求の範囲第２５項記載の方法。
31. ３１．エタノール層をクロロホルム−メタノール・水混合液と合せることにより 上層と下層に分配する特許請求の範囲第３０項記載の方法。
32. ３２．特許請求の範囲第３１項記載の方法で得られた抽出物。
33. ３３．上層をメタノールー水、続いてクロロホルム−水混液と混ぜ２層に分ける ことを特徴とする特許請求の範囲第３１項記載の方法。
34. ３４．特許請求の範囲第３３項記載の方法で得られた抽出物。
35. ３５．クロロホルム−メタノール部分をメタノール、クロロホルム、水混液と混 ぜ、続いてメタノール、クロロホルム、酢酸ナトリウム混液と混ぜ２層に分ける 特許請求の範囲第３３項記載の方法。
36. ３６．特許請求の範囲第３５項記載の方法で得られた抽出物。
37. ３７．下層をクロロホルム、アセトン、メタノールの順に混ぜ、３つの部分に分 ける特許請求の範囲第３１項記載の方法。
38. ３８．特許請求の範囲第３７項記載の方法で得られた抽出物。
39. ３９．酢酸ナトリウムを含む特許請求の範囲第３５項の方法で得られた抽出物。
40. ４０．哺乳動物組織をヘキサン−エタノール混合溶媒と接触させて前記混合溶媒 に血管形成活性を有する脂質含有分子を抽出し；前記混合溶媒を除去し；前記得 られた抽出物を第２溶媒であるヘキサン−エタノール混合溶媒と接触させて血管 形成活性を有する脂質含有分子を前記第２溶媒に抽出し；ヘキサンを除去し；エ タノール抽出物をクロロホルム、メタノール及び水からなる溶媒と接触させ、そ の結果得られた混合物を上層と下層とに分離し；前記上層をメタノールー水混合 溶媒及びクロロホルム−メタノール混合溶媒と接触させ；このように処理した上 層をメタノールークロロホルム部分とメタノールー水部分とに分け；前記メタノ ールークロロホルム部分をクロロホルム−メタノール−水混合溶媒及びクロロホ ルム−メタノール−酢酸塩含有化合物の混合物と接触させ；このように処理した メタノールークロロホルム部分をクロロホルム−メタノール−水部分と酢酸塩を 含む部分とに分け；精製する工程からなる血管形成活性を有する脂質含有分子を 含む組成分の製造法。
41. ４１．該下層をクロロホルム、アセトン、メタノールと接触させ分離した面分を 得る特許請求の範囲第４０項記載の方法。
42. ４２．特許請求の範囲第１項記載の組成物を使った患者の治療で、効果的な投与 量を定める患者の血管形成を高める方法。
43. ４３．特許請求の範囲第２項記載の組成物を使った患者の治療で、効果的な投与 量を定める患者の血管形成を高める方法。
44. ４４．組成物を経口、静脈内もしくは局所的に投与する特許請求の範囲第４２項 記載の方法。