JPS63501502A - スクリーニングおよび処理方法 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
スクリーニングおよび処理方法
本発明は抗体を使用して特定の望ましくない細胞、たとえば癌細胞に対して毒素
を放出することに関する。
抗体を使用して癌細胞を標的として毒素を放出することは多くの特許及び公報に
報告されてきた。たとえば、本明細書に参考文献として含めであるボイシン（Ｖ
ｏｉｓｉｎ ）ら′の米国特許第４．３４０，５３５号には、ジスルフィド結合
によってリシンの毒性Ａ鎖に共有結合した抗体からなる上記の如き抗体！毒素複
合体（いわゆる”免疫毒素”）が記載されている。
一般に、本発明は、抗原非特異的、種特異的抗体に結合した毒素からなる組成物
を特徴とする。（本明細書で使用されているように、”抗原非特異的”とは特定
の嗜乳類種たとえば、ウサギやマウスの細胞に選択的に結合するという意味で特
異的（すなわち種特異的）であるが、特定の細胞、たとえば癌細胞に選択的には
結合しない（すなわち抗原非特異的）抗体をいう。
毒素は非特異的抗体に共有結合され得るが、より好ましり１瓢これらは、抗原非
特異的抗体に共有結合されている抗毒素抗体によって結合され得る。
も５１つの好適具体例において、上記組成物の抗原非特異的種物異的抗体は、抗
原非特異的抗体が種特異的である哺乳類の種から放出され、（すなわち産生され
る）望ましくない細胞にとっては抗原特異的である抗体と複合体を形成し；この
具体例の組成物は、抗原特異的”標的”抗体が交叉結合試薬によるむしろ抗原非
特異的抗体により毒素に結合している免疫毒素として使本発明は、哺乳類が産生
ずる抗体が望ましくない種類の細胞に対して毒素を放出する能力を測定する方法
であって、望ましくない種類の細胞および要約の最初の２つのバラグラフに示し
た特定の組成物（つまり、すぐ上に述べたもの程複雑でない組成物であって、そ
れに対して特異的抗体である種が特異的である組成物が、抗原特異的抗体が産生
された哺乳類の細胞と同じである）と抗体を接触させ、細胞の死グを、毒素を望
ましくない種類の細胞に放出する抗体の能力の基準として測定することを含む方
法を特徴とする。この方法は、他の抗体よりも該細胞に毒素を放出する能力が比
較的に大きい抗体を抗体混合物からスクリーニングするのに使用できる。効果的
な一般的スクリーニング試薬におけるこれらの組成物を使用する上記新しい方法
によれば、スクリーニングの前に各抗体を細胞毒にすることを必要とせずに効力
の高い細胞毒性を有する抗体を簡便迅速にスクリーニングできる。
する。
毒素（殺癌細胞剤）を抗癌抗体（癌細胞ハンター、典型的には癌細胞をマウスに
注射し、これにより形成したハイブリドーマを培養してつくられる）に化学的共
有結合により結合することにより“免疫毒素”をつくることが知られている。
これは毒素と抗癌抗体の両方を減成する傾向があるという不利な点を有する。
本発明者は、毒素を抗癌抗体ではなく、毒素または抗癌抗体のいずれかに対して
“親和性”〆（イムノアフィニティー）を有する中間体抗体に結合すれば改良さ
れた物質が得られることを見出した。特に好適な具体例では、第二の中間体抗体
が含まれ、この抗体は毒素か抗癌抗体の一方に対する親和性を有し；２つの中間
体抗体は化学共有結合原子価によって結合されている。
特に有用なスクリーニング化合物と方法は外側の中間体抗体（化学結合以外、す
なわち第二中間体抗体によって毒素と結合していない）を使用することによって
提供され、該外側の中間体抗体は一組の抗癌抗体（その特性は比較試験されるべ
きである）に対して親和性を有する。
本発明によればＳ素または抗癌抗体のいずれかの化学的減成を防止でき、好適具
体例においてはそれら両方の減成を防止できる。
本発明の他の特徴および利点は下記好適具体例および特許請求の範囲から明らか
であろう。
本発明の好適鈴す別成物と方法を以下に記載する。
−ス １−ニン ＝゛
非特異的抗ウサギ抗体に共有結合した抗リシン抗体からなる一般的スクリーニン
グ試薬先駆物質を次のようにしてつくった。
免疫特異的に精製されたヤギ抗リシン（６Ｘ １０−’Ｍ＞（ベクター・ラブダ
（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）より市販）および抗ウサギＩｇＧ（６Ｘ １０−’
Ｍ）（ウサギＩｇａ−ジアミノヘキサンアガロースでアフィニティクロマトグラ
フィーにより精製されＵ、Ｓ、バイオクミカル・コーポレーションより市販）を
いっしょに０．０２Ｍゲルタールアルデヒド及び０．０１３Ｍ３．３’−イミノ
ビスプロピルアミンと０．１５Ｍ ＮａＣ１０，０５Ｍ Ｎａ２ＳＯ４溶液（ｐ
Ｈ７，６）中で室温で１時間反応させた１次いでＮ ａ Ｂ Ｈ４（０，０２Ｍ
＞を加え、交叉結合反応を０．０２Ｍエタノールアミン（ｐＨ７，６）で停止さ
せた。使用前に交叉結合抗体組成物を透析し０．２２ミクロンのフィルター（Ｍ
ｉｌｌｅｘ ＧＶ）を通して濾過することにより滅菌した。リジンを上記先駆体
に添加することにより、リジンと抗体ウサギ抗体が抗リシン抗体によって結合し
ている一般的スクリーニング試薬の合成を完成する。
緩肛逢几昨区良１
抗小細胞癌腫抗体に共有結合した抗リシン抗体からなる細胞特異的結合物は次の
ようにしてつくった。
第一段階、すなわち抗小細胞癌腫抗体の産生はＨ６９細胞株の細胞を使用して行
なわれ１．これは１０％の炭酸ガスを含む雰囲気下に１０％ＦＣ３を添加したＲ
ＰＭＩ−１６４０培地に保持された。Ｂａ１ｂ／ｃマウスと任意に交配されたウ
サギを従来方法により、完全フロインドアジュバント中の８６９細胞で繰返し免
疫した。血清のＩｇ分画を３分の１飽和硫酸アンモニウム溶液による沈殿によっ
て得た。
マウス抗小細胞癌腫ポリクロナール抗体を上記のようにゲルタールアルデヒドを
使用してヤギ抗リシン抗体に交叉結合した。
−・スクリーニング試薬のスクリーニングでの上述の如く調製された一般的スク
リーニング試薬を使用して、ウサギ抗小細胞癌腫抗体（上述の如く製造）の不均
質集団を次のようにスクリーニングした。
各抗小細胞癌腫抗体試料（２０μｇ）を約１８，０００個の１Ｍ１容旦のＨ６９
ｍ胞とインキュベートした。対照は通常のウサギ免疫グロブリンであった。上述
の一蝦的なスクリーニング試薬先駆体く抗ウサギ抗体に交叉結合した抗リシン）
２０ｍｃｇをリシンＡ鎖（Ｒｉｃｉｎ Ａｃｈａｉｎ）（Ｅ−Ｙラボラトリーズ
社製）と結合させて、０．１Ｍラクトースを含むＩＭｌのＲＰＭＩ−１６４０中
にｌＸｌ０−’Ｍの濃度で添加した。
上記細胞を一般的スクリーニング試薬とともに１時間インキュベーションし、２
１１ずつの水冷ダルベツコ（Ｄ ｕｌｂｅｃｃｏ）のリン酸塩緩衝液を加えた生
理塩水で２回洗った。蛋白質の合成、すなわち細胞死の逆数を、上記の如く処理
された８６９ａｌ胞１５．６２５個を０．１Ｍラクトースを含有する０ 、 ｉ
ｉｌｌのロイシンを含まないＲＰＭＴ−１６４０中０．０２５ＭｅＣ”Ｃロイ
シンとともに３７℃でインキュベートし、ｌ４Ｃ−ロイシンの取り込みを１公害
たりのカウント（ＣＰＭ）として測定することにより測定した。対照として、上
記一般的スクリーニング試薬を含まない培地中でインキュベートされた細胞のＣ
ＰＭを測定した０間接的免疫毒素による８６９腫瘍細胞殺生を示した（間接的免
疫毒素の抗腫瘍活性；数値は３回の測定値の平均値および標準偏差である）：
免疫グロブリン Ｃｌ４０イシンカウント／分正常ウサギ １９４±２４
ウサギ抗Ｈ６９３３±１７
対照に比べて低い１４Ｃ−ロイシン取り込みは、リシンＡ鎖のＨ６９ＭＢ胞への
放出によって生起した細胞死を示している。
”Ｃ−ロイシンリ取り込みが低い程、抗小細胞癌腫抗体がリシンＡをＨ６９細胞
に放出するのにより効果的であることを示している。
毒素放出のメカニズムは次のように信じられている。該細胞の存在下には、試薬
先駆体（抗すシン／抗つサギ免疫グロブリン結合物）は免疫親和性によってリシ
ンＡ鎖に結合される；抗小細胞癌腫抗体も試薬先駆体に免疫親和性により結合し
てＨ６９細胞に対してリジン含有複合体を放出する。毒素の細胞に対する放出が
抗小細胞癌腫抗体によって効果的に行なわれる程、細胞死は拡大し、”Ｃ−ロイ
シン取り込みは低くなる。
−・スフ１−ニング； の゛釦４又１史肚治療用イムノトキシンを製造するには
、上記試薬先駆体をリジンＡ鎖および望ましくない種類の細胞たとえば小細胞癌
腫細胞のような癌細胞に対するウサギ抗体と混合し、抗体とりシンＡ鎖の両方を
免疫親和性により試薬先駆体に結合する。免疫毒素を他のりシンをベースとする
免疫毒素が投与されてきた（たとえば上記のボイシン（Ｖｏｉｓｉｎ）らの文献
）と同じ方法で患者に投与する。
細 、−的１合物の
上記細胞特異的結合物を他のりシンをベースとする免疫毒素が使用されてきたと
同じ方法（たとえば上記ボイシンらの文献）で使用して小細胞癌腫を、治療でき
る。
上述の結合物を殺Ｈ６９ａｌ胞能力について下記の如く試験した。結合物とりシ
ンＡ鎖（上述の如く溶液状態で）をＨ６９細胞とインキュベートし、細胞を洗い
、そのうち１００，０００個の細胞を０．０２５ ＭｃＣ’Ｈ−ロイシンでイン
キュベートシ、ＣＰＭを蛋白合成および細胞死の逆数の目やすとして上記の如く
測定した。
直Δλ生匠
他の具体例も下記請求の範囲の範囲内にある。
たとえば、抗体に結合できるいかなるトキシンも使用できる。
もう１つの例はジフテリアトキンシであって、その１部はメラニン形成細胞刺激
ホルモンに結合して標的にされた細胞毒（バチャ（Ｂａｃｈａ）ら、米国特許第
４，４６８，３８２号、本明細書で参考文献としている）となる０種々の抗体が
適当な哺乳類の種から得られ、望ましくない細胞に対する抗体はモノクローナル
でもポリクローナルでもよい、細胞死の測定は種々の同位元素を使用した技術お
よび使用しない技術、たとえばＪ、Ｃｌ１ｎ。
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 ７．９１に記載された方法のようなｐＨ−依存性比色方
法を使用して行うことができる。
補正書の翻訳文提出書
（特許法第１８４条の７第１項）
昭和６２年５月２９日
特許庁長官 小 川 邦 夫 殿
１、特許出願の表示
ＰＣＴ／ＵＳ ８６１０１８６６
２、発明の名称
スクリーニングおよび処理方法
６、特許出願人
住 所 アメリカ合衆国ロード・アイランド州０２９０２゜グロヴイデンス、エ
ディ・スト’Ｊ−） ５９３名称 ロード・アイランド・ホスピタル新大手町ビ
ル ２０６号室
５、補正書の提出日
昭和６２年２月６日
６、添付書類の目録
（１）補正書の翻訳文 １通
補正された請求の範囲
（１） 第１抗体群のうちのどの第１抗体があらかじめ決められた種類の標的細
胞に対して該細胞を不唇４化ｆ筈仕方で毒素を効果的に放出する能力を有するか
を決定する方法であって、該標的細胞に上記群の別個の第１抗体および該第１抗
体すべてを認識する第２抗体に結合した毒素からなる一般的スクリーニング剤を
別々に加え、
該第１抗体と該一般的スクリーニング剤が添加されている細胞の不活性化を別々
に測定し、
イむ
該別個の第１抗体と結合した標的細胞の不活勿を比較し、そして
該第１抗体群のうちのどの第１抗体が所望の能力を有するが決定することからな
る方法。
（２）毒素が上記第２抗体に共有結合している請求の範囲第１項の方法。
（３）上記第２抗体が抗毒素である第３抗体に共有結合している請求の範囲第１
項の方法。
（４） 第１抗体がモノクローナルおよびポリクローナルである請求の範囲第１
項の方法。
（５） 第１抗体群が抗癌抗体の不均質集団から得られる請求の範囲第１項の方
法。
（６） 第１抗体群がモノクローナル抗体の群からなる請求の範囲第１項の方法
。
国際調査報告
・・・＊１Ｍａｌ・・・・・・・・・・・・・・・・ｆｃＴ７Ｕｓ８６ ／ ０
１８ Ｓ灼
Claims (8)
- （１）あらかじめ決められた哺乳類の種に対する抗原非特異的抗体に結合した毒 素からなる組成物。
- （２）毒素が抗原非特異的抗体に共有結合されている請求の範囲第１項の組成物 。
- （３）毒素及び抗原非特異的抗体が該抗原非特異的抗体に共有結合された抗毒素 抗体により結合されている請求の範囲第１項の組成物。
- （４）抗原非特異的抗体が、上記哺乳類の種から得られ望ましくない種類の細胞 に対して特異的である抗体と複合体を形成している請求の範囲第１項または第３ 項の組成物。
- （５）免疫親和性により毒素に対する抗体に結合された毒素からなり、該抗体は 望ましくない種類の細胞に対して特異的である抗体と複合体を形成している免疫 毒素。
- （６）毒素に対する抗体が、望ましくない種類の細胞に対して特異的である細胞 特異的抗体に共有結合している請求の範囲第５項の免疫毒素。
- （７）哺乳類で産生された第一抗体が望ましくない種類の細胞に対して毒素を放 出する能力を測定する方法であって、該抗体を、望ましくない種類の細胞と該哺 乳類の種に対する抗原非特異的抗体に結合した毒素からなる組成物とに接触させ 、該第一抗体が望ましくない種類の細胞に対して毒素を放出する能力の目やすと して細胞死を測定することからなる方法。
- （８）哺乳類の種が産生する抗体の混合物のうち、どの抗体が、あらかじめ決め られた種類の細胞に対して毒素を放出する能力について該混合物中の他の抗体に 比較してより大であるのか決定する方法であって、該混合物の抗体を上記望まし くないし種類の細胞と該哺乳類の種に対する抗原非特異的抗体に結合された毒素 からなる組成物とに別々に接触させることからなり、他の抗体に比較してより大 きな細胞死をもたらす上記混合物の抗体は該毒素を上記細胞に放出する能力が他 の抗体に比較してより大である方法。
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