JPS63500800A

JPS63500800A - Insertion of a gene encoding an interferon-induced protein into an animal

Info

Publication number: JPS63500800A
Application number: JP50574986A
Authority: JP
Inventors: スタエリ，ピ−タ−; ハレ，オットー; リンデマン，ジャン; バイスマン，チャールズ
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1985-07-31
Filing date: 1986-07-31
Publication date: 1988-03-24
Also published as: WO1987000864A1; EP0231374A1; EP0231374A4

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Abstract] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】インタフェロン誘発された蛋白をコードする遺伝子の動物中への挿入本発明は、インクフエロン誘発された蛋白をコードする遺伝子の動物中への挿入に関するものである。さらに本発明は、ウィルス感染から動物を保護しうるインタフエロン誘発された蛋白をコードする遺伝子を動物中へ挿入することからなるウィルス感染に対する動物の保護方法に関するものである。好適具体例において、本発明はインフルエンザウィルスに対したとえば哺乳動物または鳥類などの動物を保護する方法に関するものである。オルトミキソウイルス感染はヒト（インフルエンザ）、馬（馬インフルエンザおよび咽頭インフルエンザ）並びに豚（豚インフルエンザ）を含む各種の哺乳動物における感染、並びに七面鳥、アヒルおよび鶏を含む各種の鳥類動物にューキャスル病および家禽疫病）における感染を引き起す〔ザ・インフルエンザ・ウィルス・アンド・インフルエンザ、キルボーネ編集、アカデミツク・プレス出版、ニューヨーク（１９７５））、感染はしばしば死亡および／または重大な経済上の損失をもたらす。約２５年前、同系交配実験ネズミｆｆ：Ａ２Ｇは、試験した他′の全での同系交配種に対し致死的であるインフルエンザウィルスの投与に対し耐性であること〔リンデンマン、パイロロジー、第１６巻、第２０３頁（１９６４））、およびこの特徴はＭｘと呼ばれる単一の優性対立遺伝子によって受け継がれることが突き止められた〔リンデンマン、Ｐｒｏｃ、Ｓｏｃ。Ｅｘｐ、　Ｂ　ｉ　ｏ　１．、　Ｍｅｄ、　、第１１６巻、第２０３頁（１９６４））、それ以来、僅か１ｒｉの他の耐性実験種ＳＬ／Ｎ１ＡＬか見い出されていない、インビボおよびインビトロ試験が示すところでは、インフルエンザウィルスに対するこの耐性は、インクフェロン（α型もしくはβ型であるが、Ｔ型でない）によって媒介され〔ハラ−等、ジャーナル・エキスベリメンタル・メジメン、第１４９巻、第６０１〜６１２頁（１９７９）；ハラ−等、ネイチャー、第２８３巻、第６６０−６６２頁（１９８０）；アルンハイターおよびステへり（Ａｒｃｈ、Ｖｉｒ、）、第７６巻、第１２７頁（１９８３）；ステへり等、パイロロジー、第１３２巻、第４５６−４６１頁（１９８４）　）　、かつＩ型ＩＦＮで刺戟した後、Ｍｘ＋細胞（Ｍｘ−細胞でない）はＭｘと命名した蛋白を生産する〔ホリスベルガー、ス°テヘリおよびハラ−、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス。ＵＳＡ、、第８０巻、第１９１０〜１９１４頁（１９８３））。Ｍ　ｘ　”およびＭｘ−〇ＩＦＮ処理したネズミ細胞が他のウィルスに対し示す感受性には差がなかったので〔ハラ−等、ネイチャー、第２８３巻、第６６０〜６６２頁（１９８０））、Ｍｘ遺伝子の作用はミキソウイルス特異性である。■ 型のＩＦＮは、Ｍｘの他に多くの蛋白を誘発し或いはその細胞内レベルを増大させる。現在まで、インフルエンザウィルスに対する耐性がＭｘ発現自身によるものであるかどうか、或いは他のＩＦＮ銹発された蛋白を補なうにはＭｘが必要とされるかどうか決定することができなかった。さらに、実験ネズミおよび野性ネズミの両者にはＭｘ−遺伝子の頻度が高いため、Ｍｘ＋が野性もしくは突然変異の表現型を示すかどうかが明らかでなかった。本発明者等は、ネズミＭ　ｘ　ＣＤ　Ｎ　Ａを分離しかつその構造を決定し、ネズミ細胞におけるＭｘの発現はＩＦＮ（インクフエロン）処理がなくともインフルエンザウィルスに対し耐性を付与するのに充分であることを示し、さらにＭｘ −表現型はＭｘ遺伝子における欠失から生ずることを確認した。本発明者等は、ＴＦＮ−αで処理したラットおよびヒト細胞が抗−Ｍｘ抗体に対し交差反応する蛋白を合成することを突き止め、このことはこれら蛋白がネズミＭｘ蛋白に対し構造上の相同性を有することを示している。本発明者等は、ヒト細胞がＩＦＮ−α（ＩＦＮ−γでない）誘発に呼応して８０．０００ダルトンの蛋白を合成しかつこの蛋白が他のヒトもしくはネズミ蛋白には見られない少な（とも１種の抗原決定子とネズミＭｘとを共有することを突き止めたＣＰ、ステへり。等、モレキュラ・セルラー、バイオロジー、第５巻、第２１５０−２１５３頁（１９８５））。さらに本発明者等は、ネズミＭｘ　ｃＤＮＡが多くの哺乳動物におけるゲノムＤＮＡにハイプリント化することを突き止めた０本明細書において、特記しない限り、Ｍｘ蛋白と言う用語は抗Ｍｘ抗体に対し交差反応するポリペプチド或いはネズミＭｘ　ｃＤＮＡに対しハイブリッド化するＤＮＡによりコードされるポリペプチドを包含すると了解すべきである。　。本発明者等は、欠陥Ｍｘ遺伝子を有しかつインフルエンザに対し感受性である動物細胞の耐性を、この細胞中へＭｘ遺伝子を挿入することにより実質的に向上させうろことを突き止めた。遺伝子の天然補体の１部としてＭｘ遺伝子を有する細胞はインフルエンザに対する耐性を発生するが、これはインクフヱロンで処理した後においてのみである。さらに本発明者等は、永久的に発現されるＭｘ遺伝子を細胞中へ挿入することにより、動物細胞中にＭｘ蛋白を生せしめれば、この細胞はインフルエンザウィルスに対し永久的に耐性になることを突き止めた。この種の細胞、特に動物におけるこの種の細胞は、遺伝子の天然補体の１部としてこの種の遺伝子を有する細胞よりもインフルエンザウィルスに対し耐性が大である。何故なら、後者は抗ウイルス状態が確立される前に先ず最初にインクフェロンを産生せねばならないからである。同様に、Ｍｘ蛋白以外のインクフェロン誘発された蛋白に関する遺伝子を動物細胞中へ挿入すれば、この種の細胞がインクフェロンにより刺戟されていなくても、インクフェロンＴＡＢされた蛋白を生産させることができる。さらに、インクフエロン誘発された蛋白は他の有利な作用をも与える。たとえば、インタフェロンは細胞表面にてＨＬＡクラス■型蛋白およびβ−マイクログロブリンの発現を誘発し、かつ表面にこれら蛋白を有する癌細胞は免疫系によって一層容易に破壊されることが示されている〔ヒュイ等、ネイチャー、第３１１巻、第７５０〜７５２頁（１９８４）、タナ力等、サイエンス、第２２８巻、第２６−３０頁（１９８５）；ワリソヒ等、ネイチャー、第３１５巻、第３０１〜３０５頁（１９８５））、たとえば、表面にＨＬＡクラスＩ型蛋白およびマイクログロブリンを肴するＩ！瘍細胞が生物内で発生すれば、これは急速に破壊されて癌を発生しない。かくして、本発明者等による知見は、抗ウイルス性のインクフェロン誘発された蛋白をコードする遺伝子を動物へ与えることにより、インフルエンザまたはその他のオルトミキソウイルス感染に対しヒトを含む動物を保護する方法をもたらす。これは、過当な遺伝子を胚芽系組織の細胞中（好ましくは、受胎した卵細胞もしくは極めて早期の胚芽中）へ挿入し、次いで動物中へのこれら細胞（好ましくは受胎した卵細胞または極めて早期の胚芽）の発生を容易化させて行なうことができる。このようにして動物における感染の潜在的部位の細胞中でなく、動物中へ遺伝子を挿入すれば、所望の遺伝子を永久に保持しかつウィルス感染に対し耐性となるこの種の動物の子孫を生せしめることができる。同様にして、オルトミキソウイルスに対する耐ウィルス特性以外の有利な性質、たとえばピコルナウィルス感染のようなウィルス感染（たとえば口蹄疫ウィルス）またはたとえば犬ジステンパもしくはリンデルペスト（牛に感染する）のようなバラミキソウィルス感染に対する抗１ｔ！！特性もしくは抗ウイルス特性を有するインクフエロン誘発された蛋白をコードする遺伝子を動物（たとえばヒトを含む哺乳動物並びに鳥類および魚類）に対して付与することができる。遺伝子を胚芽系組織の細胞中へ挿入する場合、この挿入は動物中に現存する細胞或いは動物から取出されている細胞を用いて行なうことができる。たとえば、卵子を動物の輸卵管から流出させ、試験管内で受胎させ、所望の遺伝子を微量注入し、次いで動物へ手術して戻し、または他の動物へ移植・することができる、さらに、胚芽（たとえば１細胞もしくは２細胞の胚芽）を微量注入することもできる。これらの技術は、ハマー等、ネイチャー、第３１５＠、第６８０〜６８３頁（１９８５）に充分記載されている。本発明は、天然インクフェロンの誘発なしに或いはインクフェロン誘発された蛋白の不充分な発現の下で動物中にインクフェロン誘発蛋白を生産させる方法に関するものであり、この種の蛋白をコードする遺伝子を動物中へ挿入することがらなっている０本発明の好適具体例においては、インクフェロン誘発された蛋白をコードする遺伝子を含んだ組換ＤＮＡ分子をたとえば１細胞胚芽のような動物細胞中へ挿入し、かつ動物中へのこれら細胞の発生を容易化させる。これら組換ＤＮＡ分子が挿入されている動物細胞を培養して、産業上有用な量の所望蛋白を製造することができる。好適具体例において、本発明はウィルス感染に対する動物の保護方法に関するものであり、この方法はウィルス感染から動物を保護しうるインクフェロン誘発された蛋白をコードする遺伝子を、感染に対し感受性である動物中へ挿入することからなっている。好ましくは、インクフェロン誘発された抗ウイルス性蛋白をコードする遺伝子を含んだ組換ＤＮＡ分子をたとえば１１１１１胞胚芽のような動物細胞中へ挿入し、かつ動物中へのこの細胞の発生を容易化させる。より好適な具体例において本発明は、感染に対し感受性である動物中へ、Ｍｘ蛋白をコードする遺伝子を挿入することからなる、インフルエンザウィルスによる感染に対し動物を保護する方法に関する。好ましくはＭｘ蛋白は、保護すべき動物の種類に通富見られるようなＭｘ蛋白である。たとえば、豚Ｍｘ蛋白をコードする遺伝子が豚中へ挿入される。特に好適な具体例においては、Ｍｘ蛋白（たとえば豚Ｍｘ蛋白）をコードする遺伝子を含んだ組換ＤＮＡ分子を、たとえば１細胞胚芽のような動物細胞（たとえば腫細胞）中へ挿入し、がつ動物中へのこの細胞の発生を容易化させる。好ましくは、Ｍｘ遺伝子の発現は構成プロモータもしくはウィルス感染に対し特に感受性である組織（たとえば呼吸器官もしくは腸管の粘膜）にて活性であるプロモータ、或いは外来薬剤（インクフエロンを含む）により便利に活性化しうるプロモータの制御下にある。本発明の方法は、動物がインクフェロン誘発遺伝子を持たない場合或いはインクフェロン誘発された蛋白の発現が不充分である場合に有益である。本明細書中で使用する「インクフェロン誘発された蛋白の不充分な発現」という表現は、１つもしくはそれ以上の理由でインクフエロン誘発された蛋白の発現を増大させかつ／または連続的にすることが望ましいことを言味する。これは次の場合のいずれかとすることができる：＋１１動物はインクフェロン誘発された遺伝子を有するが、この遺伝子はインクフェロン誘発の後にのみ所望の蛋白を発現し、かつ所望蛋白の発現を連続的にするのが有利な場合；または（２）動物は所望のインクフェロン誘発された遺伝子を有するが、細胞に対するこの種の遺伝子の１回もしくはそれ以上の追加が有利である場合。さらに本発明は、インクフェロン誘発された蛋白をコードする遺伝子を含んだ組換ＤＮＡ分子で形質転換された動物細胞、並びにこの種の細胞を含む動物に関するものである。好適具体例において、本発明はウィルス感染に対し細胞を保護しうるインタフェロン誘発された蛋白をコードする遺伝子を含んだ組換ＤＮＡ分子により形質転換され、自然状態においてウィルス感染に対し感受性である動物細胞に関し、さらにこの種の細胞を含む動物に関するものである。特に好ましくは、ウィルス感染はインフルエンザであり、がっ遺伝子はＭｘ蛋白をコードする遺伝子である。或いは、Ｍｘ蛋白と類似した抗ウィルス作用を有するポリペプチド（たとえば、Ｍｘ蛋白の断片であるポリペプチドまたはより安定もしくはより効果的となり或いはインビボにて一層高い治療指数を存するよう改変したＭｘ蛋白の誘導体）をコードする遺伝子を、Ｍｘ蛋白をコードする遺伝子の代りに用いることもできる。すなわち、本明１ｉＩ書においては特記しない限り、「インクフェロン誘発された蛋白」と言う用語は、たとえばＭｘ蛋白のような天然の蛋白だけでなく、インクフェロンＸｆｆ　Ｑされた蛋白の作用と同様な生物学的作用を存する他のポリペプチドをも包合すると了解すべきである。一般に、本発明の方法は、天然状態においてインクフェロン誘発された蛋白のための所望遺伝子を持たず、或いは構成的に活性な型でこの遺伝子を持たず、或いはＩＦＮ刺戟後に抗ウイルス保護を与えるのに充分な量で蛋白を生産しないような動物細胞に適用することができる。しかしながら、本発明の方法は、さらにこの種の遺伝子の１種もしくはそれ以上を既に有する動物細胞に対し、インクフエロン誘発された蛋白をコードする遺伝子の１種もしくはそれ以上を追加して、天然のＩＦＮ制御下で構成的にまたは任意にインクフエロン誘発された蛋白を全ての組織もしくは成る種の組織で所望の効果（たとえば、ウィルス感染に対する抗性）を生せしめるのに充分な量にて生産させるように適用することもできる。さらに本発明は、式：％式％を有するポリペプチドにも関するものであり、ここで単一文字のアミノ酸コードによって示されるアミノ酸は次のように規定される：Ａ−Ａ、Ｉａ　Ｃ＝ＣｙｓＤ＝Ａｓｐ　Ｅ＝Ｇ１ｕＦ＝Ｐｈｅ　ｃ＝ｃｔｙＨ＝Ｈｉｓ　Ｉ＝１１ｅＫ””Ｌ）’Ｓ　Ｌ＝ＬｅｕＭ＝Ｍｅｔ　Ｎ＝ＡｓｎＰ＝Ｐｒｏ　Ｑ＝Ｇ１ｎＲ＝Ａｒｇ　５＝ＳｅｔＴ＝Ｔｈ　ｒ　Ｖ＝Ｖａ　ＩＷ＝Ｔｒｐ　’　Ｙ＝Ｔｙｒさらに本発明は、他の動物の細胞によって合成されるふズミＭｘ蛋白と同類であるポリペプチド、特にネズミＭｘ蛋白に向けられたモノクローナル抗体２Ｃ１２ＣＰ、ステへり等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２６０巻、第１８２１−１８２５頁（１９８５））で免疫沈澱させうるＩＦＮ誘発性の８０，０００ダルトンのヒトＭｘポリペプチドに関するものである。さらに本発明は、上記ポリペプチドを含む医薬組成物、並びに動物（たとえばヒトを含む哺乳動物並びに鳥類および魚類）におけるウィルス感染の治療（治療または予防）のためのポリペプチドの使用に関するものである。ウィルス感染の治療に同様な用途を有する上記ポリペプチドの誘導体および断片も作成しうろことが了解されよう。この種のＨＲ４体および断片も本発明の範囲内に包含されると考えられ、上記ポリペプチドに対する説明（たとえば下記の治療方法および組成物の説明）は特記しない限りこれらの誘導体および断片をも包含すると了解すべきである。さらに本発明は、上記ポリペプチドを製造するのにを用な組換ＤＮＡ分子にも関するものである。好適組換ＤＮＡ分子ん）Ｃ−ＧＴＧＣＧＣＣＣＣＴにＴＡＴＴＣＡ　ＣＣＴＣＡ　Ｔ　ＣＣＡ　ＣＡ　ＣＣＣＴｃＡＣｒＧＧＣＴＣＴＧＧＧＴにＴＧＣ−ＡＧＣＡｌ：Ａ：ｌＡ　ＣＣＴＣ−ＣＣＣＣＴＧＣＣＴＣＣＣＡＴ　ＣＣＣＴＣＴ　ＣＡＴＴαχ℃ＡＣＣＡ　ＧＡ　Ｇ　ｈ　−ＣＡＧＧＡＣＡＴＡＣＡＴＣＣＡＡＡＡＡＣＡＡＣＡＧＡＣＣＡＴＣ入八ＣＣＴＧＣ；Ｔ（、ＧＴＡＧＴＣＣＣＣＡにごＡＡＴＣＡＧＧへＣＴＡＣＡＴＧＡＴＡＧＴＣＡＡＧＴＣＣＡＧＡ（１；ＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＡＴＣＣＡＡＣＡＣＣＡＧＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＣＴＣＡＧＧＣＴＴＴＴＣＡＧＡＡＡＧＡ（、ＣＡＡＧＴＣＴｒＣＴｒＣＡ＋ＩＩＧＣ；ＡＴＣＡＣＴＣＡＧＧＡＡ（、ＡＴＣλＡＡτ八λＡＴＡＧへＡＧＴＣＡＴＣＡ（、ＡにＴＣＣＡＡＧＣｃＡＧＧＡＧｃτＣＣ入Ｇ人ＡＣ。ＴＡＣＣＧＴ（１；（ＡＣ；ＡＣＡＴＡＣＣＡＣ，入ＡＧＡＴＧＡＣＡＧＡＡＣ（、＾ＣＣ入ｒｃｒｃｃｒロ工τＣＧＴにＡＡτλ人ＡＡＴＣｋＧＴＧＣＣＴτ ＣＡＡＴＡＧＧＡＡＴＡＴＣＡＴＣ入ＡＴＴＴ　ＧＡＴＡＣＡＡＧＣＡＣＡ　ＧＣＡＧＴＧＡＣＡＣＣＡＧｋＧＡＧｋＡＣａＡＡＧＡＡＧＴＴＣＣＴＧλんりＫに（ＧＧＣｈ　−＝τ入ＡＧＣＣτＧＣＡτＣＡＧＣ，ＣＴＣＧＧＣＡＧＡＡＧＣ”ｎＧｃｃＡＡＡ’：’τＣＴＣＣＣＡＴのＤＮＡ配列、（′ｂ）前記ＤＮＡ配列に対しハイブリッド化しかつ発現に際しアミノ酸配列が上記に示されたポリペプチドまたはその他のＭｘ蛋白（ヒ）　Ｍ　ｘ蛋白を含む）をコードするＤＮＡ配列、およびＴＣＩ遺伝子コードの結果として上記ＤＮＡ配列まで縮退しかつアミノ酸配列が上記されたポリペプチドまたはその他のＭｘ蛋白（ヒトＭｘ蛋白を含む）をコードするＤＮＡ配列よりなる群から選択されたＤＮＡ配列を特徴とする。図面の簡単な説明第１図は電気泳動により分析したゲルフラクション１０〜１９からのｍＲＮＡ％Ｍｘ”　ＢＡＬＢ−Ａ、２Ｇ−ｍｘ細胞（＋）からの未分画ｍＲＮＡおよびＭｘ −ＢＡＬＢ／ｃ細胞（−）からの未分画ｍＲＮＡの免疫沈澱された翻訳生成物の放射能写ス図を示しく詳細については実施例１参照）、第２Ａ図はｐＭｘ３４ｃＤＮＡ挿入物の制限地図を示し、第２Ｂ図はｐＭｘ３４ｃＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列および対応のアミノ酸配列を示し、これらヌクレオチドの番号はＧｓのストリングの後の第１ヌクレオチドから出発し、第２Ｃ図はネズミＭ　ｘ蛋白のアミノ酸配列を示し、アミノ酸の番号は第１メチオニン残基から出発し、第２Ｄ図はＭｘ−ＤＮＡをクローン化してｐＭｘ３４を生成させたベクターｐＨ０３２７を示し、クローン化はｃ、ＤＮＡがＳＶ４０早期プロモータから転写されるような方向性で５ｓｔＴ部位に挿入され、第３図はｐ　Ｓ　Ｖ　２−　ｎ　ｅ　ｏ　（ａ）もしくはｐＳＶ２−ｎｅｏおよびｐ　Ｍ　ｘ　３４プラスミドＤ　Ｎ　Ａ　（ｂ）により形質転換されたＧ４１８−耐性ＮＩＨ３Ｔ３細胞のＭｘ特異性抗体による免疫螢光性を示し、ｐＭｘ３４で形質転換された細胞のみがその核内にＭｘ蛋白を含有し、第４図はインフルエンザウィルス（ａ、ｂ）またはｖＳｖ（ｃ、ｄ）が感染したトランスフェクトＮＩＨ３Ｔ３細胞の特異性抗体による免疫螢光性を示し、細胞を組換Ｍｘ蛋白（ａ、Ｃ）の合成およびインフルエンザウィルス蛋白山）もしくはＶＳＶ　Ｇ蛋白（ｄｌの合成につき分析し、この図面は校内にＭｘ蛋白を有する細胞がウィルス複製の徴候を示さないのに対し、殆んどまたは全＜Ｍｘ蛋白を核内に持たない細胞がその細胞質中にウィルス蛋白ををすることを示し、第５図はＩＦＮ処理したＭｘ’″およびＭｘ−細胞からのＲＮＡにおけるＭｘ特異性転写物を示し、その際ポリソーム結合したｍＲＮＡのノーザンプロット（３μｇ）をｐ　Ｍ　ｘ３４挿入物の１．Ｏｋｂ　ＢａｍＨＩ制限断片にノ＼イブリッド化させ、血清を含まない媒体（Ｃ）もしくは３００Ｕ／ｍｌのネズミＩＦＮ−α／ β（ＩＦＮ）のいずれかで処理したＢＡＬＢ−Ａ２Ｇ−Ｍｘ　（Ｍｘ”）およびＢ　、Ａ　Ｌ　Ｂ　／　Ｃ（Ｍｘ−）胚芽細胞からｍＲＮＡを作成し、第６図はＭｘ　ｃＤＮＡに関するネズミゲノム配列のサウザン移動分析を示し、その際ネズミ肝臓ＤＮＡ試料（１０μｇ）を制限エンドヌクレアーゼで切断し、０．８％アガロースゲルで電気泳動にかけ、ニトロセ、ルロース膜へ移しかつＭｘ　ｃＤＮＡの（Ｐ”　）−放射能標識された断片でハイブリフト化させ、さらにＢＡＬＢ−Ａ２Ｇ−ｍｘ　（＋）もしくはＢＡＬＢ／ｃ　（−）ネズミ（Ａ）からのＤＮＡをＭｘｃＤＮＡのヌクレオチド６５８〜２３１７に対応する断片或いはＭｘ　ｃＤＮＡの１．０ｋｂ　ＢＡＭ　Ｈ１１部（Ｂ）　へハイブリッド化させ、異なるネズミ種からのＥｃｏＲＩ−切断ＤＮＡ　（Ｃ）およびＨ４ｎｄｎ［−切断ＤＮＡ　（Ｄ）をヌクレオチド６５８〜２３１７に対応するＭＸ　ＣＤＮＡの同じ断片と比較した。Ｍｘ蛋白以外のインクフェロン誘発された蛋白をコードする遺伝子も、下記する方法を用いて動物細胞中へ導入することができる。この種の他の蛋白は２’、５ ’オリゴアデニレートシンセターゼ〔バグリオニ、セル、１１７−１！、第２５５頁（１９７９）；バグリオ二等、バイオケミストリー、第１８巻、第１７６５ −１７７０頁（１９７９））、蛋白キナーゼ〔ジャルビス等、セル、第１４巻、第８７９〜８８７頁（１９７８））、グアノシン結合蛋白〔ディング等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２５８巻、第７７４６〜７７５０頁、（１９８３））、）（ＬＡ　Ｉ型〔バシャム等、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス、第７９巻、第３２６５−３２６９頁（１９８２）；ヨシエ等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２５７巻、第１３１６９〜１３１７２頁（１９８２））、β２−マイクログロブリンＣローザ等、ＥＭＢＯＪ、、第２巻、８２３９頁（１９８３））　、並びにフィル等により分離された他の蛋白〔ネイチャー、第３０１巻、第４３７〜４３９頁（１９８３）、およびアンチバイラル・リサーチ、第３巻、第３０３−３１４頁（１９８３））を包含する。所望のインクフェロン誘発された蛋白をコードする遺伝子は、一般に遺伝子が発現制御配列に作用結合されている組換ＤＮＡ分子の１部として細胞中へ導入される。インクフェロン誘発された蛋白をコードする遺伝子を含んだ組換ＤＮＡ分子を宿主細胞中へ導入する方法は次の通りである：（ａｌ直接的微量注入〔ハマー等、ネイチャー、第３１５巻、第６８０〜６８３頁（１９８５）；山）ウィルスベクターの使用〔ムニオン等、ジャーナル・パイロロジー、第７巻、第８１３〜８２０頁（１９７１））；（Ｃ１細胞−細胞融合、すなわち植換中に包封された所定数の染色体の細胞に対する融合〔ホルニエール等、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス、第７４巻、第３１９〜３２３頁（１９７７））；＋ｄｌカルシウムーＤＮＡ錯体の微量沈澱物の細胞エンドシトシス〔バチエッチおよびグラハム、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス、第７４巻、第１５９０〜１５９４頁（１９７７）；マイトランドおよびマクドーガル、セル、第１１巻、第２３３〜２４１頁（１９７７）；ペリセル等、セル、第１４巻、第１３３〜１４１頁（１９７８）；ビグシー等、セル、第１４巻、第７２５〜７３１頁（１，９７８）；および１９８１年９月３日公開のＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ３１１０２４２６号参照〕　；（ｅ）ミニセル融合；（１１エレクトロポレーシヨン〔ノイマン等、ＥＭＢＯＪ、、第１巻、第８４１頁（１９８２））：ｆｇｌ　Ｄ　Ｎ　Ａを有するリポソームとの融合〔フロシーおよびババハドゴプール、マイクロバイオロジー・アンド・イミュノロジー、第９６巻、第１７１〜１９１頁（１９８２）におけるカレントトピックス〕　；（ｈｌプラスミドＤＮＡを有する細面性原形質との融合〔ショフナー、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス、第７７巻、第２１６３−２１６７頁（１９８０）；ラスールザデガン等、ネイチャー、第２９５巻、第２５７〜２５９頁（１９８２））。上記技術のいずれか１つの使用は、たとえば情報挿入の効率、ＤＮＡの特定の性質もしくは情報に関する選択性、ＤＮＡ断片の許容寸法などの各種の因子に依存する。カルシウム−ＤＮＡ錯体の微量沈澱物を用いる場合、選択標識を有する遺伝子を含め複数の無関係な遺伝子を用いることができ、かつ共存結合していないＤＮＡの混合物をコンプレツシヨンによって導入することができ、すなわちＤＮＡの種々異なる断片がしばしば同時に感受性細胞中へ入る。したがって、選択標識を有するような細胞は、導入することが望ましい遺伝子（たとえば、ＭＸ蛋白の遺伝子）の遺伝能力をも有すると思われる。本発明を実施する際、所望の遺伝子は１細胞胚芽中へ導入されると思われる〔たとえばハマー等、上記〕、これは微量注入によるトランスゲニックウサギ、羊および豚の生産につき記載している。さらに、動物中への胚芽の発生は、好ましくは他の雌動物（養母）中への移動によって容易化される。しかしながら、所望の遺伝子は他の組織の細胞、たとえば骨髄細胞、肝臓細胞および腸粘膜の細胞にも導入することができる〔米国特許第４，４９７，７９６号〕。さらに、所望の遺伝子は呼吸器官の細胞にも導入することができる。インクフェロン誘発された蛋白のための遺伝子を動物中へ導入する一般的な目的は、動物へ所望の蛋白（たとえば保護作用または他の幾つかの有利な作用を有する蛋白）を付与することにある。しかしながら、本発明の方法は、適当な宿主（たとえば動物細胞）を用いてインクフェロン誘発された蛋白を産業生産するのにも適用することができる。後者の目的で、当業者はベクターの発現制御配列に作用結合された所望のＤＮＡ配列を有する発現ベクターによって適当な宿主を形質転換基せ、この宿主を適当な増殖条件下で培養し、かつ培養物から所望のポリペプチドを回収するという公知方法から選択することができる。好ましくは、宿主細胞を静止期に達せしめた後、所望ポリペプチドを回収することができる。本発明のポリペプチドは、ウィルス感染に対し細胞を保護する際に細胞内でこれを発現させるのに有用である。しかしながら、ポリペプチドまたは他のインクフェロン誘発された蛋白は、たとえばヒトにおいて、これらがを劾であるインフルエンザおよび／または他のウィルスに対し予防および／または治療用途にてかっ／またはこれらウィルス病の伝染を防止するため次のように施こすこともできる：ｆａｔ呼吸器官（たとえば鼻の通路および／または肺）への噴霧、（ト））注射、または（Ｃ１局部投与。これらの用途の場合、たとえば無凹水（注射用もしくは鼻腔内用）のような慣用の医薬上許容しうるキャリヤ、或いは皮膚病学上許容しうるクリームまたは軟膏と配合される。好ましくは、ポリペプチドまたは他のインクフェロン誘発された蛋白は凍結乾燥され（好ましくは、たとえばグリシンのような増量剤を用いて）、かつ次いでたとえば無菌水のようなキャリヤにより使用前に再編成される。本発明のポリペプチドまたはその他のインクフェロン誘発された蛋白は、１日１回の投与で或いは分割投与（たとえば毎日４回）で投与することができる。正確な投与量は処方医などの臨床医によって決定され、患者の種類、患者の年齢および体重、患者の病状、処方された医薬に対する患者の反応、並びに患者における副作用の観察に依存する。本発明の好適具体例においては、抗インフルエンザに有効量のヒトＭｘ蛋白を、この種の治療を必要とするヒトに対し予トδ的にまたは治療的に投与する。組１ＤＮＡ法によるヒトＭｘ蛋白の製造については、後記実施例９に記載する。以下の説明は、その後の研究または産業上の目的で有用なインクフェロン誘発された蛋白を発現させかつ次いで分離するためのを用な指針とすることを！図するが、当業者は記載した多くの技術がインクフェロン誘発された蛋白の分離を所望せずに、所望の生物学的作用（たとえば抗ウィルス作用）を生物内もしくは細胞内で生せしめる目的でインクフエロン誘発された蛋白を発現させようとする場合にも有益であることが判るであろう。インクフエロン誘発された蛋白をコードするＤＮＡ配列をクローン化しかつ発現させる際、広範な種類のベクターを使用することができる。これらは、たとえば染色体、非染色体および合成のＤＮＡ配列の断片よりなるベクター、たとえばＳＶ４０の各種の公知誘導体、公知の細菌性プラスミド、たとえばｃｏ　ＩＥｌ、ｐｃＲｌ、ｐＢＲ３２２，ｐＭＢ９を含むイー・コリからのプラスミドおよびその誘導体、広範囲の宿主プラスミド（たとえばＲＰ４）、ファージＤＮＡ、たとえばファージλの多数の誘導体（たとえばＮＭ９８９）、並びにその他のＤＮＡファージ、たとえばＭ１３およびフィラメント状一本ｉｎ　Ｄ　Ｎ　Ａファージ、酵母プラスミド、たとえば２μプラスミドもしくはその誘導体、並びにプラスミドとファージＤＮＡとの組合せから誘導されるベクター、たとえばファージＤＮＡもしくはその他の発現制御配列を用いるよう改変したプラスミドを包含する。それぞれ特異性クローン化もしくは発現ビークルには、各種の部位を選択してインクフエロン誘発された蛋白をコードするＤＮＡ配列を挿入することができる。これらの部位は一般にこれらを切断する利尿エンドヌクレアーゼによって命名され、かつ当業者に充分認識されている。これらの部位へＤＮＡ配列を挿入して組換ＤＮＡ分子を生成させる各種の方法も周知されている。これらは、たとえばｄＧ−ｄＣもしくはｄＡ−ｄＴ、ｆ：端結合、直接的結合、合成リンカ−、エンドヌクレアーゼおよびポリメラーゼ結合修復反応に続く結合またはＤＮＡポリメラーゼ、および適当な一本鎖雛型によるＤＮＡストランドの延長に続く結合などを包含する。勿論、本発明に有用なりローン化もしくは発現ビークルは、選択したＤＮＡ断片を挿入するための制限エンドヌクレアーゼ部位を持たなくても良いことを了解すべきである。率ろ、ビークルは他の手段によって断片へ結合することもできるであろう。インクフェロン誘発された蛋白をコードするＤＮＡ配列の発現には、これらのＤＮＡ配列を発現ベクターにおける１種もしくはそれ以上の発現制御配列に作用結合させる。選択したＤＮＡ配列をクローン化ビークル中へ挿入する前または後に行ないうろこの種の作用結合により、発現制御配列は挿入されたＤＮＡ配列の発現を制御しかつ促進することができる。広範な種類の発現制御配列（作用結合した際にＤＮＡ配列の発現を制御する配列）の任意のものをこれらベクターに使用して、インクフェロン誘発された蛋白をコードするＤＮＡ配列を発現させることができる。この種の有用な発現制御配列は、たとえばＳＶ４０の早期および後期プロモータ、上ａｃ系、土工上系、工人旦もしくは工上工系、ファージλの主オペレータおよびプロモータ領域、ｆｄコート蛋白の制御領域。３−ホスホグリセレートキナーゼまたはその他の糖分解酵素のプロモータ、酸ホスファターゼのプロモータ（たとえばｐｈｏ５）、酵母α−接合因子のプロモータ、並びに原核もしくは真核細胞またはそのウィルスおよび各種のその組合せの遺伝子の発現を制御することが知られたその他の配列を包含する。哺乳動物細胞においては、さらにデヒドロホレートレダクターゼをコードする単位へ遺伝子を結合させ、かつ宿主である支那ハムスター卵細胞に対し選択することにより発現単位を増殖させることも可能である。ベクターまたは発現ビークル（特に本発明で使用される選択ＤＮＡ断片および発現制御配列を挿入すべく選択される部位）は、たとえば特定の制限酵素に対し怒受性の部位の個数、発現すべき蛋白の寸法、ベクター配列に対する開始コドンおよび停止コドンの相対的位置のような発現特性など各種の因子、並びに当業者に認識されたその他多くの因子によって決定される。特定蛋白配列に対するベクター、発現制御配列および挿入部位の選択はこれら因子のバランスによって決定され、必ずしも全ての選択が所定の場合に同等に有効であるとは限らない。本発明の好適具体例において、イー・コリにてＭｘ蛋白を発現させることを所望する場合は、バタテリオファージλ（ＰＬ）から誘導された発現制御配列を用い、これをＭｘｃＤＮＡに融合させて、原核配列の末端におけるＡＴＧをＭｘ配列の第２コドンに隣接させる。インタフェロン誘発された蛋白を発現させることを所望する場合は、次の異なる種類のプロモータを使用することができる：（１１構成プロモータ；（２）　天然のインクフェロン依存性プロモータ（たとえばＭｘを天然で欠如するか、またはこれを極めて弱く発現する動物）；（３）増大した発現割合を有するが、まだインクフェロン依存性（全ての動物に対し）であるハイブリッドプロモータ〔ハイブリッドプロモータの説明については、ライヤルス等、セル、第４１巻、第４９７〜５０７頁（１９８５）を参照することができる〕　；または（４）　インクフェロン以外の物質に依存するプロモータ。ヒトを含む哺乳動物または鳥類の細胞にてＭｘ蛋白の発現を達成しようとする場合は、好ましくはメクロチオニンプロモータを用いる。次いで、発現制御配列に作用結合した所望の遺伝子を有する組換ＤＮＡ分子を用いて広範な種類の適当な宿主を形質転換させ、これら宿主（形質転換体）が遺伝子を発現しかつノλイブリフトＤＮＡによりコードされるインクフエロン誘発されたポリペプチドを生産することができる。さらに、この組換ＤＮＡ分子を用いて宿主を形質５．換させ、これによりこの宿主が複製に際しインクフェロン誘発された蛋白をコードする遺伝子源としてさらに組換ＤＮＡ分子を生成するようにすることもできる。動物細胞（たとえば上記したようにヒトを含む哺乳動物細胞または鳥類細胞）の他、さらに組換ＤＮＡ分子およびインクフェロン誘発蛋白を生産するには広範な種類の宿主が有用である。これらの宿主はたとえばイー・コリ、バチルスおよびストレプトミセスのような細菌類、並びに酵母のような真菌類、並びに組織培養の植物細胞を包含する。上記用途に対する適当な宿主の選択は、当業者で認識された多くの因子によって決定される。これらは、たとえば選択ベクターとの適合性、副生物の毒性、所望ポリペプチドの回収容易性、発現特性、生物安全性およびコスト等を包含する。特定の組換ＤＮＡ分子またはポリペプチドにつき、これらファクターのいずれかだけで宿主を完全に選択することはできない、寧ろ、これら因子をバランスさせねばならず、必ずしも全ての宿主が特定の組換ＤＮＡ分子の発現に対し同等に有効でないことを認識すべきである。クローン化もしくは発現ビークルの選択部位に挿入されるＤＮＡ配列は、所望ポリペプチドをコードする実際の遺伝子の１部でないヌクレオチドを含んでも良く、或いはこの蛋白のための全遺伝子の断片のみを含んでも良いことが了解されよう、必要とされることは、どのＤＮＡ配列を用いても形質転換された宿主が所望のインクフエロン誘発されたポリペプチドを生産することのみである。たとえば、本発明の方法に使用されるＤＮＡ配列は、発現ベクターにおける同じ解読枠にて少なくとも１種の真核もしくは原核キャリヤ蛋白をコードするＤＮＡ配列または少なくとも１種の真核もしくは原核信号配列をコードするＤＮＡ配列またはその組合せの１部に融合させることができる。この種の構成は所望ＤＮＡ配列の発現に役立ち、宿主細胞からの所望ポリペプチドの精製を向上させまたはその分泌および熟成を可能にする。或いは、ＤＮＡ配列をＡＴＧ開始コドンを単独で、または所望ポリペプチドの第１アミノ酸をコードする配列に直接融合された他のコドンと組合せて含むこともできる。この種の構成は、たとえばメチオニルまたはその他のペプチジルポリペプチドの生産を可能にする。次いで、このＮ−末端メチオニンもしくはペプチドを各種の公知の方法により細胞内または細胞外で切断し、或いはポリペプチドをメチオニンまたはこれに結合した他の融合体と共に使用することもできる。以下、限定はしないが実施例により本発明を説明する。実施例実施例１蛋白ＭｘをコードするｍＲＮＡの部分精製、対応Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃおよび同系のＢＡＬＢ−Ａ２Ｇ−Ｍｘネネズからネズミ胚芽細胞を作成した〔ステへり等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第２６０巻、第１８２１〜１８２５頁（１９８５）、アルミハイターおよびステへり、アルチ・パイロロジー、第７６巻、第１２７頁（１９８３））。これらの細胞を、１０％胎児牛血清を含をするジュルベッコの改変最小必須培地で培養した。これら細胞を３〜５回使用した。融合性の細胞単層（約１０７個の細胞／　１５０　ｙ１皿）を、３００単位／ｍｌの部分精製されたネズミ■ＦＮ−α／β（１０７単位／■）を含有する血清を含まない培地で３時間処理した〔トベイ等、Ｐｒｏｃ、Ｓｏｃ、Ｅｘｐ、Ｂｉｏｌ。Ｍｅｄ、、第１４６巻、第８０９〜８１５頁（１９７４））。コロンおよびバングにより実質的に記載されたようにしてポリソーム結合したｍＲＮＡを分離した〔ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２５７巻、第９２３４〜９２３７頁（１９８２））、ただし、ポリ　（Ａ）”　ＲＮＡをフェノール／クロロホルムでの抽出によってさらに精製した。ベセスダ・リサーチ・ラボラドリース社から入手したウサギ網状赤血球溶解物のインビトロ蛋白合成系において、製造業者の指針にしたがいｍＲＮＡを翻訳した。放射能活性アミノ酸としてＳ２５メチオニン（１２００Ｃｉ／ミリモル；２ｐｃｉ／μｆｆ）を用いて１０．ｃｏｇ／ｍｌのｍＲＮＡを１８μβの反応物で翻訳した。このｍＲＮＡを部分精製するため、Ｍｘ＋胚芽細胞から得られた６　０　ｐ　ｇのポリ（Ａ）”　ＲＮＡを寸法分画し、メチル水銀−ヒドロキシアガロースでの電気泳動により１０００　Ｕ／ｍｌのｍｕ−ＩＦＮ　ｃｔ／βで次のように３時間処理した：６０μｇのポリ　（Ａ）′″ＲＮＡをＩＦＮ−処理されたＢＡＬＢ−Ａ２Ｇ−Ｍｘ胚芽細胞からエタノールで沈澱させ、２０ミリモルのメチル−ＨｇＯＨを含有する６０μｌの０．５×電気泳動緩衝液（５０ミリモルのｌａ酸と５ミリモルの硼酸ナトリウムと１０ミリモルの硫酸ナトリウムと１ミリモルのＥＤＴＡを含有）に熔解させ、５０“Ｃにて５分間培養し、３Ｃ１１１Ｘ０．２ＣＩ１１のスロフトに充填し、かつ６ミリモルのメチル−ＨｇＯＨを含有する電気泳動緩衝液にてＬＧＴ　（低ゲル化温度）アガロース（ＦＭＣコーポレーション社）の１２％ゲルに対し’ｆＥ−ｆｉ液で電気泳動にかけ、これについてはベイソーおよびダビッドソンによりアナリチカル・バイオケミストリー、第７０巻、第７５頁（１９７６）に記載されている０次いで、このゲルを０．２モルの酢酸アンモニウムと２０ミリモルの２−メルカプトエタノールとの溶液中に１０分間浸漬し、次いでこれを４０枚の寸法２ｍｌのスライスに切断した。ｍＲＮＡを１固々のゲルフラクション力）ら抽出し、そのＰＨ固々のアガローススライスを６５℃にて３分間溶解させ、フェノールおよびクロロホルムで抽出し、かつエタノールでの沈澱により個々のゲルフラクションからｍＲＮＡを回収した。個々のゲルフラクション（１０〜１９）のｍＲＮＡの１部またはＩＦＮ−処理されたＭｘ”　ＢＡＬＢ −Ａ２Ｇ−ｍｘ細胞（＋）もしくはＭｘ−ＢＡＬＢ／ｃ細胞（−）のいずれかからの未分画ｍＲ，ＮＡ１００μｇを、放射能活性アミノ酸として３３ｇメチオニンを用いることにより、網状赤血球溶解物のインビトロ蛋白合成系で翻訳した。６μｌの各翻訳生成物を４３μｌのＰＢＳで希釈し、Ｍｘ蛋白に対する抗体を含をする１μ！のネズミ高免疫血清〔ステへり等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２６０巻、第１８２１〜１８２５頁（１９８５））を添加し、かつこの混合物を４　’ｃにて２時間培養した。抗体を蛋白Ａ−セファローズで回収し、免疫沈澱した蛋白をステへり等によりジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２６０ｔ−１第１８２１−１８２５頁（１９８５）に記載されたように８％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動（頂部から底部への電気泳動）によって分析し、さらに放射能写夏によって可視化させた。長さ約３ｋｂのｍＲＮＡを有するゲルフラクションは、蛋白ＭｘをコードするｍＲＮＡを含有した（第１図）。Ｍｘ　ｍＲＮＡ活性が１０〜２０倍？Ｅ縮された０、５／ｊｇのポリ（Ａ）”　ｍＲＮＡフラクションを使用して、オカヤマおよびベルクの方法〔モレキュラ・セルラー・バイオロジー、第２巻、第１６１〜１７０頁（１９８２））にしたがい、ベクター処理されたｃＤＮＡ合成を行なったが、その際ｐＫ　ＣＲ〔オーハレ等、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス・ＵＳＡ、第７８巻、第１０５２７〜３１頁（１９８１））から誘導したクローン化ベクターｐＨＧ３２７を用い、３ｓｔｌリンカをｐＫＣＲの独特なりａｍＨ１部位に挿入してＢａｍＨ１部位を再生させ、リンカに整列させた。ＳＳｔ■部位におけるクローン化を行なうことにより、クローン化した配列および１３ａｍＨＩの便利な切断を可能にした。得られたハイブリッドプラスミドを用いて、ハナハンの方法〔ジャーナル・モレキュラー・バイオロジー、第１６６巻、第５５７〜５８０頁（１９８３））によりイー・コリ菌株ＤＨ−１細胞を形質転換させた。１ｇのＲＮＡは約２Ｘ１０’ の形質転換体を発生した。Ｍｘ″特異性のｃ　ＤＮＡ挿入物を存する組換プラスミドを同定するため、Ｍｘ部位の対立遺伝子が相違し〔ステへり等、パイロロジー、第１３２巻、第４５６頁（１９８４））かつその結果として蛋白Ｍｘを合成する能力が相違する同系ネズミ種Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃおよびＢＡＬＢ−Ａ２Ｇ−Ｍｘを利用した（Ｂａｌｂ／ｃ種はＭｘ−であり、Ｍｘ蛋白を蓄積しない）〔ステへり等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２６０巻、第１８２１〜１８２５頁（１９８５）；ホリスベルガー、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス、第８０巻、第１９１０〜１９１４頁（１９８３））。Ｍｘ−同系ネズミのＩＦＮ−処理された細胞におけるｍＲＮＡ複合体は蛋白ＭｘをコードするｍＲＮＡ以外には殆んど同一であると仮定して、コロニーハイブリッド化の差〔セント・プローブ、セル、第１６巻、第４４３頁（１９７９）ｉヘイジメーカー、ジーン、第８巻、第３９１頁（１９８０））によりｃ　ＤＮＡ保存物をスクリーニングした。ハイブリッド化プローブとして、未分画でな（寸法分画された（約長さ３ｋｂ）のＩＦＮ処理されたＢＡ、ＬＢ−Ａ２Ｇ−Ｍｘ細胞またはＩＦＮ処理されたＢ　Ａ、　Ｌ　Ｂ　／　ｃ細胞のいずれがのｍＲＮＡがら作成・コリＤＨ−１（直径９０のプレート当り５００１固）を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地で増殖させた。タウブおよびトンプソンの方法〔アナリチカル・バイオケミストリー、第１２Ｅｉ！、第２２２〜２３０頁（１９８２）　）によりコロニーハイプリント化のためのフィルタを作成した０選択されたメチル−ＨｇＯＨアガロースゲルフラクションから回収したｍ　ＲＮ　Ａの逆転写用のプライマとして、オリゴｄＴを用いることによりｐ３２放射能標識したｃＤＮＡ　（２ｘ　１０’　ｃ　ｐｍ／ｐｇ　ＲＮＡ）を作成した。「＝」プローブを作成するためＩＦＮ処理されたＢＡＬＢ／Ｃ胚芽細胞からのｍ　ＲＮ　Ａを使用し、「＋」プローブを作成するためＩＦＮ処理された同系ＢＡＬＢ−Ａ２Ｇ−Ｍｘ胚芽細胞からのｍＲＮＡを使用した。先ず最初にフィルタを「−」プローブにハイブリッド化させた。放射能写真の後、ハイプリント化プローブを、０．５Ｍ　ＮａＯＨで室温にて５分間培養しかつ０．５　Ｍ　トリス− ＭＣＩ（ｐＨ８）で中和することによりフィルタから洗浄した０次いで、これらフィルタを「＋」プローブにバイブリソ、ド化させた。ハイブリッド化は、１５０ｍＭのトリス−ＭＣＩ（ｐＨ５）と０．７５ＭのＮａＣ１と５ｍＭのＥＤＴＡと０．２％のＳＤＳと０．０２％の生血清アルブミンと０．０２％のポリビニルピロリドンと０．０２％のフィコールと０．２■／ｍ＋の鮭楕子ＤＮＡとを含有する溶液中にて５Ｘ１０’ｃｐｍ／ｍ＋で６５℃にて１４時間行なった。これらフィルタを０．２　ｘＳＳＣ（ＳＳＣは０．１５ＭのＮａＣ１および０．０１５　Ｍクエン酸ナトリウムである）および０．２％ＳＤＳの溶液にて６５℃で洗浄し、かつフィルタをフジＲＸフィルムに一７０℃にて強化スクリーンを介して露出させた。「＋」プローブにハイブリッド化するが「−」プローブにはハイブリッド化しないコロニーを釣り上げて再クローン化した。分析した１０．０００種のクローンのうち、ＢＡＬＢ−Ａ２Ｇ−Ｍｘ細胞からのｃＤＮＡに強力にハイブリッド化するがＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ細胞からのｃＤＮＡには検出可能にハイブリッド化しない２種のコロニーを同定した。これら２種のコロニーの刷出したｃＤＮＡ挿入物は互いにハイブリッド化し、このことはこれらが思らく同じｍＲＮＡ種類から誘導されたことを示している。大きい方のクローン（ｐＭｘ５）の挿入物は長さ約１ｋｂであった。これはＩＦＮ処理されたＢＡＬＢ・Ａ　２　Ｇ　−Ｍ　ｘ細胞のｍＲＮＡに対しハイブリッド化したが、Ｍｘ　ｃＤＮＡにつき予想されるように未処理比較細胞のｍＲＮＡにはハイブリッド化しなかった。さらに、このｃＤＮＡを次のようなハイブリッド化翻訳分析により同定した：ｍＭｘ５プラスミドＤＮＡもしくはベクターＤＮＡをニトロセルロースフィルタに結合させ、かつＩＦＮ処理されたＢＡＬＢ−Ａ２Ｇ−Ｍｘ細胞のポリ（Ａ）”ＲＮＡにハイブリッド化させた。ｐＭｘ５ＤＮＡを固定したがベクターＤＮＡを固定せず、Ｍｘ蛋白をコードするｍＲＮＡを効率的に結合し、これは変性条件下でフィルタから遊離されたＲＮＡをインビトロで翻訳しかつこの生成物を免疫沈澱およびゲル電気泳動により分析して示した。かくして、ｐＭｘ５は思ら（Ｍ　ｘ蛋白をコードするＭｘＲＮＡに対し相補的なｃＤＮＡを含有すると結論された。この結論に対する明確な証明は、下記するような形質転換実験によって得られた。予備的なノーザン形質転換分析を次のように行なった：上記したようなメチル− ＨｇＯＨアガロースにより３μｇのポリ　（Ａ）”　ＲＮＡを電気泳動にかけた。電気泳動後、ゲルを０．２Ｍの酢酸アンモニウムと２０ｍＭの２−メルカプトエタノールに１５分間浸漬し、水で１０分間洗浄し、かつＲＮＡを２０ＸＳＳＣによりニトロセルロース膜へ移した〔トーマス、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス、第７７巻、第５２０１〜５２０５頁（１９８０））、この膜を８０℃にて減圧下に２時間焼成し、かつ２０ｍＭのＰｉｐｅｓ　（ｐＨ６，４）と５ｘｓｓｃと５０％のホルムアミドと０．２■／ＩＩ＋１の鮭楕子ＤＮＡと０．１％のＳＤＳと０．０４％の牛血清アルブミンと０．０４％のポリビニルピロリドンと０．０４％のフィコールとよりなる溶液中で４２℃にて６時間予備ハイブリッド化した。ニック翻訳により２　ｘ　１０”　ｃ　ｐｍ／μｇの比活性まで放射能標識したＭｘ　ｃＤＮＡの制限断片２×１０　’　ｃ　ｐ　ｍ／ｍｌにて同じ緩衝中で４２℃にて１８時間ハイブリッド化した０次いで、この膜をＩ　Ｘ５ＳＣと０．１％のＳＤＳとで５０℃にて洗浄し、かつ−７０℃にて放射能写真にかけた。この分析は、ＲＮＡにおける全長ＭＸが長さ約３．５ｋｂであり、ｐＭｘ５のｃＤＮＡ挿入物よりもずっと長いことを示した。したがって、全長Ｍｘ　ｃＤＮＡの分離を行なった。全長Ｍｘ　ｃＤＮＡクローンを分離するため、ｃＤＮＡ保存物（全部で約１０，０００種の独立した形質転換体を有する４つのバッチ）を液体培養で増殖させた。形質転換したイー・コリＤＨ−１（培地１１当り２．５Ｘ１０’）を、１００ μｇ／＋ｏｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地にて静止期まで増殖させた。これら培養物から作成したプラスミドは、室温にて１０分間にわたりｐＨ１２，４で処理し、次いでトリス−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）での再生とフェノール抽出とエタノール沈澱とによりスーパーコイル型につき濃縮した９次いで、このＤＮＡをＬＧＴアガロースの０．８％ゲルにより電気泳動にかけ、約２０００ｂｐより大きくかつ約５ｏｏｏｂｐまでの挿入物を有するプラスミド（適当な比較と対比した移動から推定）を分離し、かつこれを使用してイー・コリＤＨ−１を形質転換させた。コロニーハイブリッド化用のフィルタを作成し〔タウブおよびトンプソン、アナリチカル・バイオケミストリー、第１２６巻、第２２２〜２３０頁（１９Ｂ２））、かつｐ　Ｍ　ｘ５のニック翻訳され、Ｐ″２放射能標識された（１０”ｃｐｍ／μｇ）挿入物へハイブリッド化させた。ハイブリッド化および洗浄の条件は上記と同様である。陽性クローンを釣り上げかけ再クローン化した。約２００，０００　ｆｔのアンピシリン耐性コロニーを、ｐＭｘ　５のニック翻訳挿入物に対するハイブリッド化によって分析した。２００．０００　［のコロニーのうち約１％が陽性のハイブリッド化信号を与えた。さらに、任意に選択した４８種のクローンを特性化した。全クロー、ンの挿入物は、ポリＡから上流の約ｌｋｂに位置する単一のＢａｍＨＩ部位を有した。１種のクローンの挿入物は長さ３．３　ｋｂ　（ｐＭｘ３４）であり、１２種のクローン（ｐＭｘ４１を含む）は２．５〜２．８　ｋ　ｂの挿入物を有し、かつ残余のクローンは２．５　ｋ　ｂより短い挿入物を有した。９ＭＸ３４およびｐＭｘ４１については実施例２に記載するように詳細に特性化した。さらに、イー・コリＤＳ−１０にてネズミＭｘ蛋白を発現させるため、完全な作成を行なった。先ず最初にＴｒｐプロモータをＭｘコード配列に融合させて、ＡＵＧコドンに末端整列させた。イー・コリＤＳ−１０を得られた組換ＤＮＡ分子で形質転換させ、かつこの形質転換体を３０℃にて増殖させた０次いで、形質転換体をリゾチームで破壊しかつ解凍した。破壊した細菌を遠心分離した後、上澄液を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、次いで推定のＭｘ蛋白を膜フィルタに移した。次いで、蛋白含有の膜をＭｘに対するネズミ抗体と共に培養した。Ｓ−ペルオキシダーゼ酵素に結合した山羊抗−ネズミ抗体を用いて、抗原−抗原複合体を検出し、したがって７２．０００〜７５，０００ダルトンのバンドはネズミＭｘ蛋白として陽性であると同定された。実施例１に記載したように得られた制限断片をポリヌクレオチドキナーゼにより５’　（Ｐ”　’　）標識するか、或いはクレノーＤＮＡポリメラーゼによりまたは末端トランスフェラーゼにより、放射能標識されたジデオキシ−ＡＴＰを用いて３′（Ｐ”　’　）−標識し、かつマキサムおよびギルバートの方法〔プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス。ＵＳＡ、第７４巻、第５６０〜５６４頁（１９７７））にしたがい配列決定した。ｐＭｘ３４のｃＤＮＡ挿入物における制限地図およびヌクレオチド配列を第２区に示す。ヘテロポリマ配列は３２１８個のヌクレオチドからなり、かつ１２＠固のＧ残基が存在し、次いで約８０個のＡ残基が存在した。番号付けはＧｓのストリングに続く最初のヌクレオチドから出発した。ヌクレオチド２１４における最初のＡ、　Ｔ　Ｇから位置２１０７におけるＴ　Ａ　Ａ　停止コドンまで存在する開放解読枠は、６３１個のアミノ酸を有する蛋白をコードする。最初のＡＴＣコドンの上流における配列は３個の解読枠の全ての翻訳停止信号を含み、このことはｐＭｘ３４がＭｘ　ｃＤＮＡの完全なコード化領域を有しかつ次のＡＴＧコドンが位置８０２に位置するため位置２１４におけるＡ、　Ｔ　Ｇで翻訳が開始すると思われることを示している。Ｍｘ　ｃＤＮＡコード化配列に続いて１１０８ｂｐの３′−非翻訳領域が存在し、この領域は位置３１９９における一致したポリＡ付加信号Ａ　、６．、　Ｔ　Ａ　Ａ　Ａを含有する。プラスミドｐＭｘ　３４を含有するイー・コリ　（イー・コリＤＨ−１／ｐＭｘ３４と命名する）を１９８５年７月３０日付けでアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託し、ＡＴＣＣ嵐５３２０７が付与された。逆転写酵素のエラーおよびその他のクローン化の間違いを最小化するため、ｐＭｘ３４とは無関係に生じたｐ　Ｍ　ｘ　４１のヌクレオチド配列を決定した。ｐＭｘ４１の２６５０ｂｐ挿入物は、Ｍｘ゛特異性ｍＲＮＡの不完全コピーであった。ｐＭｘ４１の配列はｐ　Ｍ　ｘ　３４のヌクレオチド６５８〜３２１８に対応し、１個のヌクレオチドの相違もなかった。蛋白Ｍｘの予想アミノ酸配列を第２Ｂ図に示す。番号付けは、配列の最初のメチオニンから出発する。主たるＭｘ！Ｉｌ訳生成物は６３１個のアミノ酸残基よりなり、７２，０３７の分子量を有する。ｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列から推定したＭＸ、蛋白は、６３１個のアミノ酸から構成される。Ｍｘ蛋白の計算分子！７２，０３７を実験値７２，５００　Ｃホリスベルガー等、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス、第８０巻、第１９１０〜１９１４頁（１９８３）　）　、７５．０００　（ステへり等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２６０巻、第１８２１−１８２５頁（１９８５））および７８　、０００〔ホリスベルガー等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２６０巻、第１７３０−１７３３頁（１９８５））と比較することができ、これらは天然Ｍｘ蛋白の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により推定された。驚くことに、Ｍｘ蛋白は帯電アミノ酸が極めて多い幾つかの領域を有し、たとえば位置７６〜８９のセグメントは３（固の陰帯電したアミノ酸と６個の陽帯電したアミノ酸とを存し、位置９３〜１０７のセグメントは８個の陰帯電した残基を有し、また位置５１１〜５２２の断片は１個のアミノ酸を除いて交互に塩基性と酸性との残基で構成される。４０個のカルボキシ末端残基は２６個の親水性残基を含み、そのうち２０個が帯電している。位置６０６〜６１４のセグメントは７（固の塩基性アミノ酸で構成される。陽帯電した領域は、核酸のような陰帯電した細胞成分と相互作用する。親水性範囲の幾つかは酸性残基の緻密な列で構成され、成るものは交互に塩基性および酸性であり、また成るものは主として塩基性残基、特に配列Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ”Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌ’ｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇをカルボキシ末端の近傍に有する。（カルボキシ近位）の塩基性アミノ酸の範囲Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌは、ＳＶ４０大型Ｔ抗原の核位面になると思われる〔カルゾロン等、セル、第３９巻、第４９９−５０９頁（１９８４＞）。Ｍｘ蛋白の予想配列と４．ｏｏｏ＋ｆｆｉ以上の公知蛋白配列とのコンピュータによる比較では、インフルエンザウィルス蛋白とＭｘ蛋白との間に顕著な相同性を検出しなかった。Ｓ　Ｖ　４．０早期プロモータに対する相対的位置およびプラスミドｐＭｘ、３４におけるＭｘ　ｃＤＮＡの方向性は、真核細胞におけるその発現の試験を可能にする。５ｘ１ｏ’個のＮＩＨ３Ｔ３ネズミ細胞を、１０％の胎児牛血清を含有するジュルベソコの改変最小必須培地にて直径９０１１の皿で１８時間培養した０次いで、１０ｍ１の新鮮な培地を添加し、その４時間後に２０部ｇの燐酸カルシウム沈澱したＤＮＡを添加した。１部ｇのｐＳＶ２−ｎｅｏ　（サウザンおよびベルク、ジャーナル・モＩ／キュラ・アプライド・ゲネチフクス、第１巻、第３２７〜３４１頁（１９８２））プラスミドＤＮＡと、Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃの肝臓から得られた２０部ｇの高分子量キャリヤＤＮＡとを用い、或いは１．ｃ＋ｇのｐｓＶ２−ｎｅｏと２０部ｇのＳ；ｌｉ＋−線状ｐＭｘ　３４プラスミドＤＮＡとを用いて、ウィグラ等の方法〔プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス、ＵＳＡ、第７７巻、第３５６７−３５７０頁（１９７９））にしたがいＤＮＡ沈澱物を作成した。混合物を３７℃にて２０時間維持した後、ＤＮＡ含を培地を新たな培地と交換し、かつこれら細胞を２４時間増殖させた。次いで、これらをトリプシン処理しかつ１：８の分割比にて新たなプレートに接種した。２４時間後に培地を１■／徊１の０４１８（ゲネチシン、ギブコ社）を含有する培地と交換し、この培地を２〜３日毎に交換した。耐性クローン（プレート１枚当り５０〜１００個）が２週間後に出現した。これら細胞に、ｐＳＶ２ −ｎｅｏプラスミドＤＮＡ　（形質転換細胞には薬剤０４１８に対する耐性を付与）の１部と線状化したＩＩ）　Ｍ　Ｘ　３４プラスミドＤＮＡの２０部もしくはキャリヤＤＮＡの２０部とによってトランスフェクトさせた。これらの細胞を、１■／ｍｌのネオマイシン同族体Ｇ４１８（ギブコ社）が補充された培地に保った。０４１８耐性を発現する永久トランスフェクトされた細胞を選択し、単一クローンを分離することなく各プレートのＧ４１８耐性細胞を保存した。免疫螢光分析を用いて、約１００種の個々の０４１８耐性の形質転換体につき蛋白Ｍｘを合成する性質を示す保存物の能力を分析した。Ｇ４．１８Ｍ性細胞をガラスカバースリップ上にて２０時間増殖させ、ＰＢＳで洗浄し、３％バラホルムアルデヒドで２５℃にて１０分間固定し、かつ０．５％トリトンＸ−１００で５分間透過性にした。Ｍｘ蛋白を検出するため、固定されかつ透過性にした細胞を、Ｍｘ蛋白にりＪする抗体を有する０、４％ネネズ高免疫血清と共に、５％の正常山羊血清を含有するＰＢＳ中にて１５分間培養した〔ステへり等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２６０巻、第１８２１〜１８２５頁（１９８５））、結合した抗体を示すため、ガラスカバースリップ上ＩｇＧＣノルジツク社）と共に２５゛ｃにて１５分間培養し、５％正常山羊血清を含有するＰＢＳ虫で１：５０に希釈し、ＰＢＳで洗浄しかつ５．０ｍＭトリス −ＨＣ１（ｐ）１８．６　）および５０％グリセリン中に入れた。ライヘルド− ユング・ポリバール顕微鏡を用いて、紫外線入射光の螢光顕微鏡分析のために用いた。原Ｍｘ＝３Ｔ３ネズミ細胞、およびＭＸ　ＣＤＮＡでなくｐＳＶ２−ｎｅｏプラスミドでトランスフェクトされた３Ｔ３細胞は、これらがＩＦＮで処理されていてもいな（でも蛋白Ｍｘを合成することができなかった（第３Ａ図および第４図）、これに対し、Ｍｘ　ｃＤＮＡでトランスフェクトされた３Ｔ３細胞の高比率はＭｘ蛋白を合成した。Ｍｘ　ｃＤＮＡはＳＶ４０早期プロモータの制御下で発現されたので、組換Ｍｘ蛋白はトランスフェクトされた細胞内で構成的に合成され、ＩＦＨによる誘発を必要としなかった。ＩＦＮ処理されたＭｘ＋細胞における天然蛋白と同様に、組換蛋白Ｍｘはトランスフェクトされた３Ｔ３細胞の核中に蓄積した（第３Ｂ図）、プレート３４／６から生ずるトランスフェクトされた細胞の約３０％がＭｘ蛋白を合成した（第３Ｂ図）。ＩＦＮによる処理は、トランスフェクトされた細胞におけるＭｘ蛋白発現に対し検出可能に影響を与えなかった。形質転換細胞においてＭｘ蛋白はＳＶ４０早期プロモータの制御下で構成的に転写されるので、これはＭｘ遺伝子の発現が単に転写制御の下に置かれる限り予想された結果である０個々の細胞におけるＭｘ蛋白発現のレベルは変化することができた。トランスフェクトされた細胞の少数は、１０００　Ｕ１０＋１のＩＦＮ−α／βで１８時間処理した充分誘発されたＭｘ”胚芽細胞と同程度のＭｘ蛋白（免疫螢光染色により測定）を含をしたのに対し、Ｍｘ蛋白発現性３Ｔ３細胞の大半は低濃度のＭｘ蛋白を含有した０組換および天然Ｍｘ蛋白は３［の異なる特異性モノクローナル抗体との反応性において区別することができず、かつウェスタンプロットにおいてこれらは同じ見掛は分子量を有した。保存物３４／６の細胞を、０４１８含有の培地中で３ケ月以上増殖させた。この期間の後、蛋白Ｍｘ発現性細胞の個数並びに相対的発現レベル（免疫螢光分析により測定）は比較的一定に留まり、これは蛋白Ｍｘが細胞増殖を阻害しなかったことを示している。希釈を制限することにより、蛋白Ｍｘ−生産性３Ｔ３細胞をクローン化した。２サイクルのクローン化および増殖の後、約９５％の蛋白Ｍｘ生産性細胞を存する培養物を得たが、これら培養物はまだ非生産性細胞を含有し、培養物３４／６におけると同様に個々の細胞の蛋白Ｍｘ発現レベルは均一でなく、このことはトランスフェクト細胞におけるＭｘ蛋白合成の錯体調整を示唆している。ガラスカバースリップ上のトランスフェクトされた３４／６細胞の培養物に、インフルエンザＡウィルスの菌株ＦＰＶ−Ｂ或いは比較実験として小水胞性口内炎ウィルス（Ｖ　Ｓ　Ｖ）のインディアナ株を感染させた。１ｍｌ当り約１０’個のプラーク形成単位（ＰＦＵ）までＮＩＨ３Ｔ３細胞上で増殖させたプラーク精製したウィルスから各ウィルスを作成した。これら細胞をいずれかのウィルスにより、２％ＦＣ３（胎児牛血清）を含有する培地で１細胞当りｌ０ＰＦＵの倍率にて室温で３時間感染させた０次いで、これらの細胞を培地で２回洗浄し、２％ＦＣ３を含有する培地中で３７℃にて３〜４時間培養した。これらの条件下で、ＮＩＨ３Ｔ３比較細胞培養物の個々の細胞の９８％は、特異性抗ウイルス抗体での免疫螢光分析で分析した際、陽性となった。細胞を室温にて３％パラホルムアルデヒドにより１０分間固定し、かつこれらを０．１％トリトンＸ−１００により５分間透過性にした。Ｍｘ蛋白とウィルス蛋白（すなわち、どのウィルスを感染用に使用するかに応じてインフルエンザウィルス蛋白もしくはＶＳｖＧ蛋白）を同時に監視するため、固定されかつ透過性にした細胞をＭｘ蛋白に指向されるネズミ抗体とウィルス蛋白（インフルエンザもしくはＶＳＶ）に対するウサギ抗体との混合物で処理した。０．４％のＭｘ蛋白に対する抗体を含有するネズミ高免疫血清〔ステへり等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２６０巻、第１８２１〜１８２５頁（１９８５））と、０．２％のインフルエンザウィルスに対するウサギ抗血清と、２．５％のｖｓｖ　ｃ蛋白に対するウサギ抗血清〔アルンハイター等、セル、第３９巻、第９９−１０９頁（１９８４））とを使用した。これら抗血清を、５％の正常山羊血清を含有するＰＢＳで希釈した。これら抗体を有する混合物を２５℃にて１５分間培養した。Ｍｘ蛋白に結合した抗体を可視化させるため、ローダミン結合した山羊抗−ネズミ抗体（ノルジツク社）を使用した。ウィルス蛋白に結合−ウサギ抗体（ツルジンク社）を使用した。培養物をこれら標識された抗体に対し５％の正常山羊血清を含有するＰＢＳ中２％にて室温で１０分間反応させた。カバースリップをＰＢＳで洗浄し、これらを５０ｍＭのトリス−ＨＣＩ（ｐＨ８，６）と５０％のグリセリンとに入れ、かつ個々の細胞をＵＶ入射光螢光顕微鏡分析によりローダミン−およびフルオレシン −特異性螢光の両者につき分析した。このように免疫螢光技術を用いて、個々の細胞を蛋白Ｍｘを合成する能力と同時にインフルエンザウィルス蛋白の合成につき分析することができた。第４図に示す通り、フルオレシン核によって証明されるようにＭｘを生産した細胞（第４ａ図）はインフルエンザ特異性蛋白を含有しなかった（第４ｂ図）、インフルエンザ特異性蛋白を生産する細胞はＭｘ陰性である。かくして、組換Ｍｘ蛋白を含有するトランスフェクト細胞はインフルエンザウィルス蛋白の合成を可能にしなかったのに対し、Ｍ！蛋白を欠如する細胞はインフルエンザウィルスＦＰＶ−Ｂに対し感受性であった（第４ａ図および第４ｂ図）。Ｍｘ蛋白発現性細胞はインフルエンザウィルスに対し選択的に保護された。Ｍｘ蛋白を欠如する細胞とＭｘ蛋白を含有する細胞との両者は、ローダミンｖＳｖに対し完全に感受性であった（第４Ｃ図および第４ｄ図）０個々の細胞のインフルエンザウィルスに対する耐性程度は可変であった。高濃度のＭｘ蛋白を有する細胞は充分保護されたのに対し、低濃度のＭｘ蛋白しか含有しない細胞は小程度しか保護されなかった。Ｍｘ蛋白と１細胞当り１０プラ一ク形成単位の倍率にてインフルエンザＡウィルスＦＰＶ−Ｂで感染された７４６個の個々の３４／６１［１胞のインフルエンザウィルス蛋白の相対量を記録した。３７℃にて３時間後、免疫螢光分析により各細胞を、Ｍｘ蛋白およびインフルエンザウィルス蛋白の高生産体、恒生産体または非生産体のそれぞれとして分類した。第１表は多量のＭＸ蛋白を合成した細胞の１００％がインフルエンザウィルスに対し耐性であったことを示している。第１表トランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＭｘ蛋白の合成とインフルエンザウィルスの阻止と多量　０　０　３６少量　２４　５４　７６検出できず　３８５　１６２　９殆んどＭｘ蛋白を生産しなかった細胞の約５０％はインフルエンザウィルスに対する特異性抗体で染色可能であったのに対し、検出可能量のＭＸ蛋白を含有しなかった細胞の９８％はインフルエンザウィルス陽性であった。同一の培養において、高レベルのＭｘを発現する細胞がインフルエンザウィルスに対し耐性であるのに対し、Ｍｘ蛋白を欠如する細胞は充分感受性であることを示すことにより、クローン化配列がＭｘ１９能をコードすることを証明した。Ｍｘ蛋白がＩＦＮの添加なしにその抗ウィルス活性を発揮しうるかどうかの質問については、ｙｅｓと答えられる。ＩＦＮ誘発されたＭｘ４″細胞と同様なレベルにてＭｘ蛋白を発現したＭｘ　ｃＤＮＡ形質転換３Ｔ３細胞は、ＩＦＮを添加しなくてもインフルエンザウィルス感染に対し耐性であった。かくして、予想外に、Ｍｘの存在はＩＦＮ処理がなくてもインフルエンザウィルス感染に対し細胞を保護するのに充分である。しかしながら、天然のＭｘ細胞は、ＩＦＮで処理された後にのみインフルエンザウィルスに対し耐性を発生す、る。実施例５Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃまたは同系ＢＡＬＢ・Ａ２Ｇ−Ｍｘネネズの細胞を、血清を含有しない培地または３００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−α／βを含有する培地で３時間処理して、ポリソーム結合したポリ　（Ａ）“ＲＮＡを作成した。各調製物のｍＲＮＡ３μｇをメチル水銀ヒドロキシル−アガロースゲルで電気泳動しくベイリーおよびダビソドソン、アナリチカル・バイオケミストリー、第７０巻、第７５頁（１９７６））、ｍＲＮＡをニトロセルロース膜へ移し、次いでこのｍＲＮＡを放射能標識されたＭｘ　ｃＤＮＡプローブにハイブリッド化させた〔トーツス、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス、第７７巻、第５２０１−５２０５頁（１９８０）　）　。ＩＦＮ処理されたＭｘ’″細胞は長さ約３．５　ｋ　ｂのｍＲＮＡを含有し、これはＭｘ　ｃＤＮＡに対し強力にバイブリフト化した。未処理比較細胞からのｍＲＮＡはＭｘ　ＣＤＮＡに対しハイブリッド化しなかった（第５図）、Ｍｘ　ｃＤＮＡのコード化領域から得られたプローブと、反復配列を有するＭｘｃＤＮＡの３′非コード化領域から得られたプローブとにより同一の結果が得られた。ＩＦＮ−α／βに呼応してＭｘ−胚芽細胞はＭｘ　ｃＤＮＡプローブにハイブリッド化したｍＲＮＡを合成することを突き止めた。このｍＲＮＡはＭｘ＋細胞のＭＸ−特異性ｍ　ＲＮ　Ａよりも短い約２００〜５００個のヌクレオチドであった。Ｍｘ−細胞のポリソームポリ（Ａ）＝　ＲＮＡ調製物は極めて低濃度のこのｍＲＮＡを含有し、ノーザンプロットで検出するのに丁度足る濃度であった（第５図）、未処理比較細胞ではＭｘ特異性ｍＲＮＡを検出することができなかった０Ｍｘ　＋およびＭｘ−細胞のＭｘ−特異性ｍＲＮＡの合成は、したがって同様な制御下にあると思われる。さらに、３ｕｇのポリ　（Ａ）”　ＲＮＡをＱ、５　ａｏＸ　Ｏ，２００スロツトに充填しかつ１．２％のシグマ■型アガロースのゲルで電気泳動することにより、分析ゲル電気泳動を行なった。電気泳動の後、これらゲルを０．２Ｍの酢酸アンモニウムと２０ｍＭの２−メルカプトエタノールとの溶液に１０分間？＋　 ’ｔＭし、かつ臭化エチジウムで染色するかまたはこれらのゲルをノーザン移動分析に使用した。Ｍ　ｘ−ネズミの欠陥の性質を調べるため、放射能標識されたｐＭｘ４１の１．６５ｋ　ｂ　Ｂ　ａ　ｍＨ！断片をプローブとして使用することにより、Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃネズミからの染色体ＤＮＡのサウザンプロットを分析した。　第６Ａ図に示すように、同系ＢＡＬＢ−Ａ２Ｇ−ＭｘおよびＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃネズミの制限パターンは同一でなかった。ＥｃｏＲＩ−切断されたＭｘ±ＤＮＡの５ｋｂおよび７．５　ｋ　ｂにおけるバンドはＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃＤＮＡでは存在しなかったが、約４ｋｂにおける新たなバンドが出現した。Ｂａ　ｍ　ＨＩ切断されたＤＮＡにおける２、３ｋｂの弱いバンドと６．５　ｋ　ｂの強いバンドとはＭｘ−ＢＡＬＢ／ｃ　ＤＮＡには欠如した代りに、７ｋｂに新たなバンドが検出された。同様に、Ｍ　ｘ　：！：Ｄ　Ｎ　Ａの３ｋｂおよび１０ｋｂのＨ４ｎｄｌｌ＋断片はＭｘ−ＤＮＡにおける９ｋｂ［ｉ片で置換され、かつ５ｋｂ　Ｐｓｔ＋断片は２．５　ｋ　ｂ断片で置換された。サウザンブローブとしてＭｘ　ｃＤＮＡの放射能標識されたｌ、Ｑ　ｋ　ｂのＢａｍＨＴ断片を用いて、Ｍｘ“ネズミからのＤＮＡにおけると同様にＭｘ−ネズミからのＤＮＡに対し僅かな重なったバンドを得た（第６Ｂ図）、これらの結果は、ＢＡＬＢ／ＣゲノムのＭｘ遺伝子における欠失と一致する。この欠失ば恐らくエキソンとイントロンとの両者を含むと思われ、Ｍｘ　ｃＤＮＡの位置２３１７におけるＢａｍＨＩ部位の上流に位置すると思われる。８種の異なるネズミ種の制御パターンを比較した（第６Ｃ図および第６Ｄ図）。２種の同系ｆｔＢＡＬＢ−Ａ２Ｇ−ＭｘおよびＳＬ／ＮｉＡ、並びに異種の親戻り動物（Ｔ９ＸＣＢＡ）ＦｌｕＲは表現型においてＭｘ”であったのに対し、同系種ＢＡＬＢ／ｃ　Ｊ、Ａ／Ｊ、１２９／ＪおよびＣ５７ＢＬ／６Ｊは同一のＥｃ　ｏＲＩ制限パターンを示し、このことはこれらの種類がＭｘ遺伝子の同一欠如を有することを示唆している。種類ＣＢＡの制限パターンは他のＭｘ一種類とは明らかに相違し、かつＨｉ　ｎｄｌ−切断ＤＮＡにおいてもＣＢＡＤＮＡとＭｘ”　ＤＮＡとの間に明らかな相違が見られた。Ｍｘ”　ＤＮＡで得られたｌ　Ｏｋｂにおける強いバンドはＣＢＡネズネズ検出されず、その代りに５ｋｂにおけるバンドが見い出された。かくして、少なくとも２種の異なるＭｘ一対立遺伝子が同系種類の間で生じ、長さおよび／または位置において異なる欠失を伴なった。これら２種類の欠失が独立しているのか、或いは一方が他方から誘導されるのかどうかは、まだ未知である。これらの結果は明らかに、Ｍｘ−の頻度にもかかわらず野性の表現型がＭｘ＋であり、かつＭ　ｘ−は欠失によってこれから生ずることを示している。実験種類におけるＭ　ｘ　”の優性はファウンダー効果によるものであるが、ハラ−等により野性種に見い出されたＭｘ一対立遺伝子の高頻度は説明されないままである。実施例日ネズミＭ　ｘに対し相同性を有する他の哺乳動物蛋白の免疫沈澱分析他の哺乳動物におけるネズミＭ　Ｘに対し相同性の蛋白が存在するかどうかを決定するため、他の動物からのインクフェロン誘発された蛋白に対するネズミＭｘ特異性抗体の交差反応性を分析した。３種の異なるモノクローナル抗体（５Ｄ１１．６Ｄ４および２Ｃ１２）（ステへり等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２６０巻、第１８２１〜１８２５頁（１９８５）　）を使用して、ヒトおよびラット細胞をネズミＭｘに対し相同性の蛋白の存在につきスクリーニングした。ＴＦＮ処理された細胞および未処理細胞（比較）を３２５メチオニンで代謝的に標識し、かつこれら細胞の細胞質抽出物を免疫沈澱分析に使用した。ＩＦＮ−α／β処理した同系ＢＡＬＢ −Ａ２Ｇ−Ｍｘ　（Ｍｘ”）細胞〔ステへり等、上記〕からの細胞抽出物で免疫化したＢＡＬＢ／ｃ　（Ｍｘ”’）ネズミからモノクローナル抗体５Ｄ１１．６Ｄ４および２Ｃ１２を作成した。ネズミ細胞の細胞質抽出物を免疫沈澱分析した際、３種のモノクローナル抗体は全てネズミＭｘ蛋白に対し高特異性を示し、かつ単一の７５，０００ダルトンの蛋白を沈澱し、これはポリクローナル抗−Ｍｘ抗体と同様であった〔ステへり等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２６０巻、第１８２１−１８２５頁（１９８５））。ヒト細胞の細胞質抽出物を免疫沈澱分析した際、ｒ　ＦＮ−α誘発の後に新鮮な肺血液リンパ球（ＰＢＬ）、培養されたヒト胎児肺細胞（ＨＦ、ＬＣ）、並びに新生児および成人供与体からの培養皮ｒｔ繊維芽細胞のような種々の細胞により合成された２Ｃ１２−交差反応性ヒト蛋白を見い出した。健全供与体からのヒトＰＢＬをイー・コリ産生されたＩＦＮ−α２（１０”Ｕ／■）または天然ＩＦＮ −α（１０’Ｕ／■）と共に培養した。他のＰＢＬは、比較として未処理のままにした。これら細胞を３７℃にて２時間維持した後、細胞を洗浄しかつ細胞蛋白を３３５メチオニンで代謝的に標識した０次いで、細胞抽出物を作成し、かつステへり等の方法〔ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２６０巻、第１８２１−１８２５頁（１９８５））にしたがってその１部をネズミＭｘ蛋白に対する抗体により免疫沈澱しうる蛋白につき分析した。全ヒト供与体（１１種の全て）のＩＦＮ処理されたＰＢＬは、モノクローナル抗体２Ｃ１２で免疫沈澱しうる８０．０００ダルトンの蛋白を合成した。この蛋白は未処理比較細胞では検出できなかった。イー・コリ産生したＩＦＮ−α２および天然ＩＦＮ−αは、ＰＢＬにおいてこの蛋白の合成を誘発する能力において区別できなかった。ネズミＭｘ蛋白に対する２種のイカのモノクローナル抗体（６Ｄ４および５Ｄ１１）はヒト蛋白に対し反応しなかった。また、ポリクローナル抗血清〔ステへり等、上記〕は、低いが顕著な交差反応の測定値を示した。次いで、ＨＦＬＣをネズミＭｘに対し相同性の蛋白の合成につき分析した。この場合も、モノクローナル抗体２Ｃ１２はＩＦＮ−α２誘発された８０．０００ダルトンの蛋白を沈澱したが、６Ｄ４もしくは５Ｄ１１は沈澱しなかった。この蛋白は、未処理ＨＦＬＣでは検出できなかった。１ｍｌ当り５〜２５ＵのＩＦＮ− α２の濃度は明らかに交差反応性のヒト蛋白の合成を誘発させた。この誘発は１２５Ｕ／ｍｌにて一層顕著となり、かつ６２５もしくは３１２５Ｕ／ａ＋１にて最大値に達した。ＨＦＬＣは、ＩＦＮ処理の開始後２時間で比較的低割合にて交差反応性蛋白を合成した０合成の割合は時間と共に増大し、かつ６〜１２時間で最大に達した。ＨＦＬＣ抽出物において、モノクローナル２Ｃ１２は低濃度で存在する第２のＩＦＮ−α２誘宛蛋白（分子量約７５．’０００グルトン）と反応した。この蛋白は８０．０００ダルトンの蛋白の減成生成物または未改変先駆体を示し、或いはこれは独特なｍＲＮＡの生成物である。次いで、ＨＦＬＣの抽出物を種々の時間にわたり高濃度（１０’　Ｕ／ｍｌ）のイー・コリ産生されたＩＦＮ−γ（５×１０’Ｕ／■）で処理したが、認めうる量の８０．０００ダルトンの蛋白を検出することができなかった。ＩＦＮ−γのこの調製物はＨＦＬＣに対し他の点では活性であり、これは６７にのＧＢＰ、すなわち種々異なる種類のＩＦＮにより繊維芽細胞で誘発されるグアニレート結合蛋白の合成を誘発する能力、或いはＨＦＬＣにおけるウィルス複製を阻止する能力によって証明された。さらに、同様な手順を用いて、未処理でなくＩＦＮ処理されたラットの胚芽細胞は、抗−Ｍｘ抗体に対し交差反応する蛋白を合成することを突き止めた。モノクローナル抗体５Ｄ１１および６Ｄ４は単一のＩＦＮ−誘発された７２，０００ダルトンの蛋白を免疫沈澱するのに対し、２Ｃ１２は多量の２種の８０、０００ダルトン蛋白と少量の７２．０００および６５．０００ダルトンの蛋白を免疫沈澱させた。ヒトおよびネズミにおけると同様に、抗−Ｍｘ抗体に対し交差反応する全てのラット蛋白は未処理の比較細胞には存在せず、ＩＦＮ−αで処理された細胞にて強力に誘発されるが、ＩＦＮ−ｒで処理された細胞では誘発されなかった。さらに、抗体２Ｃ１２は高度の特異性を示した。これは正常な未処理細胞に存在する全てのヒト蛋白を識別することができなかった。°さらに、これは蛋白Ｍｘ基以外全てのネズミ蛋白に対し特異的に反応しなかった〔ドライジング等、パイロロジー、第１４０巻、第１９２−１９６頁（１９８４）；ステへり等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２６０巻、第１８２１〜１８２５頁（１９８５））。上記の結果は、２Ｃ１２交差反応性蛋白が少なくとも１種の独特な抗原決定子（他のヒトもしくはネズミ蛋白には見られない）とネズミＭｘとを共有すること、並びにこの実施例で記載したヒトおよびネズミ蛋白の両者の合成がＩＦＮ−αにより誘発されるがＩＦＮ−γでは誘発されず、したがって同様な制御下にあると思われることを示している。かくして、上記の２０１２交差反応性蛋白は、ネズミＭｘ蛋白のヒト同族体であると思われる。実施例９ヒトＭｘ　ｃＤＮＡの分離および発現先ず最初に、ネズミｃＤＮＡに対するヒト遺伝子の交差ハイブリッド化に対する最適条件を決定した。この決定のため、先ず最初に３ｆｔの制限酵素（たとえばＢａｍＨＩ、ＥｃｏＩｒおよびＢｇｌＩ［）とネズミｃＤＮＡ比較とを用いて全ヒトＤＮＡのサウザンプロットを作成した。ヒトＤＮＡを許容しうる条件下でネズミｃＤＮＡとハイブリッド化させた後、種々異なる厳密な条件下で洗浄して、交差ハイブリッド化のための最適条件を決定した。次いで、充分なＭｘ、ｍＲＮＡ含有量を有するヒト細胞ラインまたはその組織、並びに最適ＩＦＮ誘発条件を決定した。この決定のため、まず最初にヒトリンパ球およびヒト細胞ライン（たとえばヘラ細胞、ＨＥＬ６０細胞、ＷＩＳＨｌ［１胞。単細胞、リンパ芽球およびダウジ細胞）を種々異なる濃度（０，３０，３００，３０００Ｕ／ｍｌ）のヒトインクフエロンαで０．２．４および１０時間にわたり処理した。次いで、ＲＮＡおよび必要に応じポリ　（Ａ）′″ＲＮＡを各試料並びに陽性比較細胞（Ｉ　ＦＮ誘発されたネズミＭ　ｘ　”細胞）から精製した０次いで、ニック翻訳されたネズミＭｘ　ｃＤＮＡを用いて、上記のような最適条件下でＲＮＡをドツトしかつノーイブリッド化させた６次いで、放射能分析によりノーイブリッド化を定量化し、かつ適当なＭＸ　ｍＲＮＡ含有量を有するヒト細胞ラインもしくは組織並びに最適ＩＦＮ誘発条件を決定した。ヒトＭｘ　ｍＲＮＡ含有のポリ　（Ａ）”ＲＮＡを作成しかつ特性化するため、上記で決定された条件下にてヒトＭＸｍＲＮＡの最良の原料であることが判明した細胞を誘発させた。次いで、標準法によりポリ（Ａ）”ＲＮＡを精製し、かつノーザンプロット分析を行なってＭｘ　ｍＲＮＡの長さを決定した。次いで、ｃ　ＤＮＡ保存物を作成しかつスクリーニングした。ノーザンプロット分析により特性化されたポリ　（Ａ）”　ＲＮＡを雛型として用いることにより、ガブシーホフマン法でｃＤＮＡを作成した。二重鎖ｃＤＮＡをＥＣＯＲ■ＣＯＲ−ゼで処理し、次いで二重鎖ｃＤＮＡをＤＮＡリガーゼによりＥＣ０ＲＩリンカ−に結合させた。アガロースゲルで分画した後、Ｍｘ　ｍＲＮＡの長さ±２００ヌクレオチドに対応するｃＤＮＡフラクションをλｇｔｌｏの横方向断片（アーム）に結合させ、次いで得られた組換ファージを組込んだ０次いで、このファージを用いてイー・コリに感染させた。感染した細菌を常法にしたがってプレート塗抹した（Ｔ、マニアチス等、モレキュラ・クローニング・コールド・スプリンク′ハーバ−・ラボラドリース社、ニューヨーク　（１９８２））。次いで、得られた保存物を上記したような最適交差反応条件下で、ニック翻訳されたネズミｃＤＮＡでスクリーニングした。クローン化されたＭｘ　ｃＤＮＡを特性化するため、先ず最初に推定Ｍｘ　ｃＤＮＡをスミスービルンシュティールによる方法〔ヌクレイツク・アシッド・リサーチ、第３巻、第２３８７頁（１，９７６））による制限地図化にかけた。次いで、マキサム−ギルバート法〔プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス、ＵＳＡ、第７４巻、第５０６−５６４頁（１９７７））により、ＭＸ　ＣＤＮＡを配列決定しかつこの配列をネズミＭｘ　ｃＤＮＡの配列と比較して、相同性の程度を決定した。ヒ）Ｍｘ　ｃＤＮＡの機能競合性を試験するため、先ず最初に上記のように決定されたコード化配列を（構成）ＳＶ４０早期プロモータの制御下で補乳動物発現ベクターｐβＧにクローン化させた０次いで、このベクターをＭｘネズミＬ細細胞へ、並びにヒトヘラ細胞およびＣｏｓ細胞中へ導入した。次いで、ネズミＭｘ　（これはヒト蛋白に対し交差反応することが示されている）に対する螢光性抗体を用いて、−次的および永久に形質転換された細胞にてその場におけるＭｘの発現を試験した。形質転換細胞にインフルエンザウィルスを感染させた後、上記したように螢光性抗−インフルエンザ抗体を用いてその場でウィルス複製につき評価した〔ステへり等、セル、第４４巻、第１４７−１５８頁（１９８６）参照〕。ヒトＭｘ蛋白を生成させるため、ヒトＭｘのコード化配列を各種のプロモータ（たとえばＴｒｐ、λ、ＰＬもしくはｔａｃ）および種々異なる３′非コード化領域に融合させて、イー・コリで発現させた。或いは、Ｍｘコード化配列を［ＦＮ信号配列に結合させて、ＤＨＦＲ−プラスミドにて発現させ、その際メトトレキセート増殖技術を用いた０次いで、免疫学的方法〔たとえばＰ、ステへり等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２６０巻、第１８２１〜１８２５頁（１９８５）　）により発現を測定した。免疫親和性クロマトグラフィーに関する方法によってＭｘを精製した。細胞フリー系および組織培養におけるネズミおよびヒ）　Ｍ　ｘ蛋白の生物学的活性を評価するため、次の方法を用いた：（ｉ）細胞中への微量注入および上記したようなウィルス耐性の試験；（ｉｉ）インフルエンザウィルス複製に対する細胞フリー系の使用〔たとえばフルーグ等、パイロロジー、第５６巻、第２０１ −２０６頁（１９８５））（これはＭｘがインフルエンザウィルスＲＮＡ合成を阻止することにより作用すると思われ、この活性につき分析することができる）　；　（ｉｉｉ）Ｍｘ−充填された血小板を用いる細胞中へのＭｘの導入および細胞融合或いはＭｘ生産性イー・コリとＬ細胞との融合、またはＭｘ充項されたリポソームとネズミＬ９２９細胞との融合、或いはＭｘの溶液によるネズミＬ９２９細胞の単なる処理、および上記のようなインフルエンザウィルス耐性についての分析。動物におけるＭｘ蛋白の生物学的活性を評価するため、Ｍｘ−ネズミにヒトもしくはネズミ蛋白溶液またはリポソーム含有Ｍｘを静脈注射した。インフルエンザウィルスを感染させた後、生存するネズミを計数した。以上、本発明を多数の具体例につき説明したが、ここに説明した具体例を改変して本発明の方法および組成物を用いる他の具体例を提供しうろことが明らかであり、したがって本発明の範囲は実施例により上記した特定具体例のみに限定されないことが了解されよう。ＦＩＧ、１ム３ｋｂＴＣＴＴＣＴＣ；ＡＡＴＣＡＡＡＣＣｒＣ；丁ＴＡＴＡＴＣＣＡＡＣＴＣＧ入入ＴＣＣＴＣＣＴＧＧλ入入ＡＣ入ＴＡＣλＡλＧＡＴＣ；入ＧＴＴＣＴＴＡＡＣＡＡＣＧＴＣ入ＧＡＡＧＧ　ＡＡＡＧ入ＧＣＴＧＡＴＴｒＣｒｒＣλＴＣＣ人ＣＴＣ入ＣＴＣＣ；ＡＴＡＣＣＡＡＧＴ７９０　Ｂ１０　２３０８ｇｏ　８７０　ｃ１９０９１０　９コ０　９５０１２１．０　１２３０　１２５０１２７０　１２９０　１：ｌｌ。１３コ０　１コ５０　１３７０１４５０　１４７０　１４り０１８１０　１８：１０　１８５０１Ｅ１７０　１８９０　１９１０２２９０　２３１０　２３コ０ＴＡＣＡ　ｒｒｒｒ丁ｒｒＴτＧＣＡＡＡＡＡＴｒＴＴＡＡＣ入ＡＧＧＡＴｒＣＣＡＣＣＴＣＴＣｒＴＴｒＡＣ；ＣＣＣＡＣＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＧＴＡＧＴＧＧＡＡＣ；ＡＣＡＡＡＡＣＴＴＡＴＴＡ　ＧＣＣＴＡＴＣＣ；Ａ　Ｃ０ＡＡＧ　ｒＣＣＡＣＣＴＧＴｒＣＡ　ＣＣ■lＴＡＣＴＴＣＴＴＴＧＣＧ（、ＣＣＧＡＣ；ＣＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＴＧＣ，ＣＡＣＣＡＧＴＴＣ，１ＣＴＣＣＣＡ”ｆＡＡＣＡＡＡＣＡＣbＡ２６５０　２６７０　２ら９０２７１０　２７コ０　２７５０ＡＧＣＴＡＴＡＧＴＣＣＡＧＴＣＣＴＴｒＣＣＡＣＡＧＧＣＡＧＡＡＡＣＴＡＡＧＡＡＴＧＡＡＴＣＡＧＣ入ＣＣＴＧＡＡＣＴＴＣＡＡＣ；Ｃ；ＡＡＣＣＴＣＡＣＡＡＧτＡＣ；ＴｒＣＴｒＡＣＧτｃＡｃｘ入入ＴσＴＣＧＣＴＣ；Ｔへ人ＡＣＣＡＣＡＡｅＧＡＣＡＧＡＣＣＡＡＡＣＣＡＡＧＣＣＡＡ（、ＣＣＴＣＣＣ；ＴｒＧＣｒＣＡＴＣＴＣＣＣＡＣＴＣτｒｒｃ’ｒｃ入Ｃ；ＧＴＣＡＴＡＴs コ０１０　３０３０　３０５０丁ＡＴＡＣＴＣＣＴＴＣＡＴＣＡＴＧＣＧＴＣＣＴＴｒＣＡＴＧＴＡＴＴＴＧＣＡＡＴＣ；ＴＣＡＴＡＴＣＡＡＡＧＣＡＴＣＣＴｒＴＣ３０７０、３０９０３１１０ＡＧＣＴＧＴＧＴＣＴＧＣＴｒＣＡＧＣＣＡＡＡＣＡＴＴＣＴｒＴＣＡＴＣＴＣＴｒＴｃＣＴＴＣＡＧＣ人ＡＣＡＣ八τＣＡＴＴＴＣ３１３０へ　３１５０　３１７０ＡＣＣＴＣＴＧＴＡＣＣＣＣＡＣＣＡＡＡ−へＣＡＴＣＡＴｒＴにＡＴＡＴＡＡＣＴＡｊｔσＩＴＴＣＣＡ入αシＧＡσ■χ；ＡＡＧＴＡ　（Ａｌａ）　＝　３４　（５，４３＜）　Ｃ（Ｃｙｓ）　ａ　１１　（１，７５８＋Ｄ　ＴＡｓｐｌ　ｇ　３日　（６，５ｋ）　Ｅ　（Ｇｌｕｌ　−５９（９，３５ｇ）’ｒ　（Ｐｈａ）　ａ　２４　＋３．８Ｘ）　Ｇ　（Ｇｌｙ）　−３０（４，７５Ｘ）Ｈ（Ｈｉｓ）　＝　７　（１，１８１１（Ｉｌｅ）　−４４（７，０ｋｌＫ　ＩＬｙｓ）　−５４（Ｅｉ、：５ｋ）　Ｌ　（Ｌｅｕｌ　＝　６８　＋１０．８ｋ１Ｍ　（Ｍｅｔｌ　−１３（２，０５ｋｌ　Ｎ　＋Ａｓｎ１−２５１３．９５に）Ｐ　（Ｐｒｏｌ　ｘ２１　（３，３５″４）　Ｏ（Ｇｌｎ）−３８＋６．ＯＳ＋１ＲＩＡｒｇｌ　＝　３６　（５，７Ｕ　Ｓ　＋５ｅｒｌ　＝　４０　＋５．３５Ｘ１丁　（Ｔｈｒｌ　−３１＋４．９ＸＩ　Ｖ　（Ｖａｌ＋　＝　４０　（Ｅ、３５Ｊ′ｆＪ　（Ｔｒｐ）　＝　３　＋０．５りＩ　Ｙ（丁ｙｒｌ　＝　１５　１２．４ｋｌアミノ酸１２Ｊ　２ＮＭＤＳＶＮＮＬ争　Ｃ’ＲＨＹ　Ｅ　Ｅ　Ｋ　Ｖ　ＲＦ　Ｃｒ　ＤＬＺＩ）ＴＬＲＡＬＧＶＥＯＤＬＡＬＰＡＩＡｖｌＧＤＯ５ｓ（ｉＫｓｓ　ν＋ＬＥＡ［、Ｓ　Ｇ　ＶＡＬＰＲＧＳＧＩＶＴＲＣＰＬＶＬＫＬＲＫＬＫＥＧＥＥＷＲＧＫＶＳＹＤＤＩ　Σ　ν　ＥＬＳＤＰＳＥＩ／ＥＥＡＩＮＸＧＱＮＦＩＡＧＶＧＬ　Ｇ　ｌ５ＤＫＬ１５ＬＤＶ６’ｈＰＮＶＰＤＬＴＬＩＤＬＰＧ　工　ＴＲＶＡＶＧＮＱＰＡＤ　工ＧＲＱｒＫＲＬＩＫＴＹＩＱＫＱＥＴ！ＮＬＶ、ＶＶＰＳＮＶＤＩ　入　丁　ＴＥＡＬＳＭＡＯεＶＤＰＥＧＤＲＴＩＧＶＬＴＫＰＤ［、ＶＤＲＧＡＥＧＫＶＬＤＶＭＲＮＬＶＹＰＬＫＫＧＹＭ　Ｉ　ＶＫＣＲＧＯＱＤＩＯＥＱＬＳＬＴＥＡＦＯＫＥＯＶＦＦＫＤＨ５Ｙｒ　Ｓ　Ｉ　ＬＬＥＤＧＫＡＴＶＰＣＬＡＥＲＬ　Ｔ　ＥＥＬＴ　Ｓ　ＨｌＣに　Ｓ　Ｌ　Ｐ　Ｌ　Ｌ　Ｅ　Ｄ　ＯＸ　Ｎ　Ｅｉ　Ｓ　ＨＱ　Ｓ　Ａ　ＳＥＥＬＱＫＹＧＡＤＩＰＥＤＤＲＴＲＭ　Ｓ　ＦＬＶＮＫＩＳＡＦＮＲＮＩＭＮＬ　工　ＱＡＱＥＴＶＳ　三　ＧＤＳＲ［、Ｆ’ＴＫＬＲＮ　三　ＦＬＡＷＤＤＨＩ　ｚ　Ｅ　ｙｒ　Ｋ　ｘ　Ｄ　ｓｐ＝　ν　ＯＳ　ＫＭＫＥＦＥＮＱＹＲＧＲＥＬＰＧＦＶＤＹ　に　ＡＦＥ　Ｓ　Ｉ　Ｉ　Ｋ　Ｋ　Ｆ２　Ｖ　Ｋ　Ａ　Ｌ　Ｅ　Ｅ　５　Ａ　ｖ　Ｎ　ＨＬ　ＲＲＶＴＫＭＶＱＴ　入　ＦＶＫＩＬ’ＥＮＤＦＧＤＦＬＮＬＣＣＴＡＫＳＫＩ　に　二　ｒＲＬＮＯＥＫ　Ｅ　Ａ’Ｅ　Ｎ　Ｌ　Ｉ　ＲＬ　Ｈｒ　ＯＭ　Ｅ　ＯＩ　 ν　Ｙ　ＣＱＤＯＶＹＫＥＴ（、ＫＴｒＲＥＫＥＡＥＫＥＫ丁　ＫＡＬｒＮＰＡＴＦＯＮＮＳＱＦＰＯＫＧＬＴＴＴＥＭＴＱＨＬＫＡＹＹＱＥ（ＲＲＮＩＧＲＱＩＰＬＩｒＱＹＦＩＬＫ　丁　ＦＧＥＥＩ　ＥＫＭ　阿　ＬＱＬＬＱＤＴＳＫＣ５ＷＦＬＥ二　Ｏ６Ｄ　Ｔ　ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲＬＬＲＬＤＥＡＲＱＫＬ　＾　に　Ｆ　Ｓ　ＤＦＩＧ、２Ｄ９にｐｎｌ　ＱＳａｌｌ　９　０（７１ＩＩ　中　Ｓａｌ　ｌＱ　Ｂａｍ　Ｄ　Ｉ　［；］　Ｅｃｏ旧　７　Ｐｖｕｌｌ　中Ｐｓｔ　ｌＦＩＧ、　５ＦＩＧ、６ＡＦＩＧ、　６ＢＦＩＧ、６ＣＦＩＧ、６Ｄ手続補正書却昭和６２年　５月１８日特許庁長官　黒　１）　明雄　殿１、事件の表示ＰＣＴ／ＵＳ　８６１０１８１８２、発明の名称３、補正をする者事件との関係　特許出願人住所　アメリカ合衆国、カリフォルニア州　９２１２２、サン　ディエゴ、カミノ　ヒュアータ　７８５８５、？！正の対象（１）　明細書および請求の範囲の翻訳文６、補正の内容Ｃ関　Ｔ　麺　存　邦　告１ｍｅｒＭｌ＜Ｐａｌ＾ｌ１ｏｂｃ＋ｈｏｎｌｉｏ、　ＰＣＴ／ｕｓ１０ｕｑ＋ａ[Detailed description of the invention] Insertion of a gene encoding an interferon-induced protein into an animal The present invention relates to the insertion of a gene encoding an inkferon-induced protein into an animal. It is related to. Furthermore, the present invention provides an inoculum that can protect animals from viral infections. Consists of inserting into an animal a gene encoding a tafuerone-induced protein It concerns methods of protecting animals against viral infections. In a preferred embodiment, the invention provides a method for treating influenza viruses, e.g. or how to protect animals such as birds. Orthomyxovirus infection is common in humans (influenza) and horses (equine influenza and various mammals, including swine (swine influenza) and swine (swine influenza) infections in humans, as well as in a variety of avian animals, including turkeys, ducks and chickens. The Influenza Virus (The Influenza Virus) Su and Influenza, edited by Kilbone, published by Academic Press, Japan. (New York (1975)), infections often result in death and/or significant economic consequences. result in loss. Approximately 25 years ago, inbred laboratory rats ff:A2G were introduced to Be resistant to the administration of influenza viruses that are lethal to those infected with the virus. Lindenmann, Pyrology, Vol. 16, p. 203 (1964)), and this It turns out that the trait is inherited by a single dominant allele called Mx. Stopped [Lindenman, Proc, Soc. Exp, B i o 1. , Med, Volume 116, Page 203 (196 4) Since then, only 1ri other resistant experimental species SL/N1AL have been found. In vivo and in vitro studies show that influenza viruses do not. This resistance to viruses is due to inkferon (α or β type, but T type mediated by [Hara et al., Journal Experimental Mejime] Hara et al., Nature, Vol. 149, pp. 601-612 (1979); 283, pp. 660-662 (1980); Arnheiter and Steheli ( Arch, Vir, vol. 76, p. 127 (1983); 132, pp. 456-461 (1984)) and type I IF. After stimulation with N, Mx+ cells (but not Mx- cells) produce a protein named Mx. [Hollisberger, Steheli and Halla, Proceedings National Le Academy Science. USA, Vol. 80, pp. 1910-1914 (1983)). Mx” and Mx-〇 IFN-treated murine cells show against other viruses. There was no difference in sensitivity [Hara et al., Nature, Vol. 283, No. 660- 662 (1980)), the action of the Mx gene is myxovirus specific. ■ type of IFN induces many proteins in addition to Mx or increases their intracellular levels. let Until now, resistance to influenza viruses has not been attributed to Mx expression itself. or whether Mx is required to compensate for other IFN-induced proteins. It was not possible to determine whether or not. In addition, laboratory rats and wild rats Since the frequency of the Mx- gene is high in both species, Mx+ is either wild or mutated. It was not clear whether they would exhibit this phenotype. The present inventors isolated murine MxCDNA, determined its structure, and Mx expression in Zumi cells is consistent with influenza even without IFN (Inkferon) treatment. It was shown that Mx - It was confirmed that the phenotype results from a deletion in the Mx gene. We demonstrated that rat and human cells treated with TFN-α were resistant to anti-Mx antibodies. found that these proteins synthesize proteins that cross-react with each other. This indicates that it has structural homology to Mx protein. The inventors have discovered that human 80. Cells respond to IFN-α (but not IFN-γ) induction. CP, who synthesized a protein of 1,000 daltons and found that this protein shared one antigenic determinant with murine Mx not found in other human or murine proteins. the law of nature. et al., Molecular Cellular Biology, Vol. 5, pp. 2150-2153 (1985)). Furthermore, the present inventors demonstrated that the murine Mx cDNA is found in many mammals. In this specification, unless otherwise specified, the term Mx protein refers to polypeptides that cross-react with anti-Mx antibodies. coded by DNA that hybridizes to Mx cDNA or murine Mx cDNA. It should be understood that it encompasses polypeptides that are coded. . The inventors have demonstrated that animals that have a defective Mx gene and are susceptible to influenza. By inserting the Mx gene into the cells, the resistance of the cells can be substantially improved. I tracked down Seuroko. A cell that has an Mx gene as part of its natural complement of genes. The cells develop resistance to influenza, which can be treated with inkfluoron. Only after that. Furthermore, the present inventors believe that if the Mx protein is produced in animal cells by inserting a permanently expressed Mx gene into the cell, it is possible to generate Mx protein in animal cells. They found that the cells became permanently resistant to the influenza virus. This type of cell, especially in animals, contains this type of cell as part of its natural complement of genes. They are more resistant to influenza viruses than cells with the genes of other species. This is because the latter must first produce inkferons before an antiviral state is established. Similarly, if a gene for an inkferon-induced protein other than the Mx protein is inserted into an animal cell, this type of cell will Inkferon produces TAB protein even if it is not stimulated by Feron. can be set. Additionally, inkferon-induced proteins also confer other beneficial effects. For example, interferon is an HLA class protein and β-microglobulin on the cell surface. It has been shown that cancer cells that induce the expression of bulins and have these proteins on their surface are more easily destroyed by the immune system [Huy et al., Nature, Vol. 311, pp. 750-752 (1984). , Tanari et al., Science, Vol. 228, pp. 26-30 (1985); Warisohi et al., Nature, Vol. 315, pp. 301-305 (1985)), for example, HLA class I protein on the surface. And I eat microglobulin! Once tumor cells develop within an organism, they are rapidly destroyed and do not cause cancer. Thus, the findings of the present inventors indicate that by feeding genes encoding antiviral inkferon-induced proteins to animals, influenza or its Provides a way to protect animals, including humans, against other orthomyxovirus infections. This transfers the excess gene into the cells of the embryonic tissue (preferably also into the fertilized egg cell). or very early embryos) and then facilitate the development of these cells (preferably fertilized egg cells or very early embryos) into animals. Inserting the gene into the animal in this way, rather than into cells that are potential sites of infection in the animal, permanently retains the desired gene and makes it resistant to viral infection. It is possible to produce offspring of this type of animal that become sexually active. Similarly, Ortomy Advantageous properties other than virus resistance properties against xoviruses, e.g. Viral infections such as virus infections (e.g. foot-and-mouth disease virus) or e.g. 1T against rose myxovirus infections such as Stempa or Lindell's plague (which infects cattle)! ! Ink feron-inducing properties or antiviral properties The gene encoding the released protein is transferred to animals (e.g. mammals including humans and birds). species and fish). When inserting a gene into a cell of an embryonic tissue, this insertion can be carried out using cells existing in the animal or cells that have been removed from the animal. For example, eggs The offspring can be flushed out of the animal's oviduct, impregnated in vitro, microinjected with the desired gene, and then surgically returned to the animal or transplanted into other animals. Additionally, embryos (e.g., one- or two-cell embryos) can be microinjected. Ru. These techniques are fully described in Hammer et al., Nature, 315@, pp. 680-683 (1985). The present invention can be used without induction of natural inkferon or with inkferon-induced protein. Regarding the method of producing inkferon-induced protein in animals under insufficient expression of white. In a preferred embodiment of the invention, which involves inserting a gene encoding such a protein into an animal, a recombinant DNA containing a gene encoding an inkferon-induced protein is used. molecules in animal cells, such as one-cell embryos. cells and facilitate the development of these cells into animals. Animal cells into which these recombinant DNA molecules have been inserted are cultured to produce industrially useful amounts of the desired protein. can be built. In a preferred embodiment, the invention relates to a method for protecting animals against viral infections. This method has shown that inkferon-induced It consists of inserting a gene encoding a protein into an animal susceptible to infection. Preferably, the inkferon-induced antiviral protein is For example, a recombinant DNA molecule containing a gene to be coded is inserted into a living organism such as a 11111 blastgerm. into animal cells and facilitate the development of these cells into animals. In a more preferred embodiment, the invention provides for the introduction of Mx proteins into animals susceptible to infection. Concerning a method of protecting animals against infection by the influenza virus, which consists of inserting a gene encoding the color white. Preferably, the Mx protein is It is an Mx protein that can be found in many types of things. For example, a gene encoding pig Mx protein is inserted into a pig. In particularly preferred embodiments, Mx protein (and For example, a recombinant DNA molecule containing a gene encoding a pig Mx protein) is into animal cells such as blastocysts (e.g. tumor cells) and inject this cell into the animal. Facilitates the development of cysts. Preferably, the expression of the Mx gene is driven by a constitutive promoter or by a promoter specific to viral infection. proteins that are active in tissues susceptible to It is under the control of promoters that can be conveniently activated by promoters or exogenous drugs (including inkferon). The methods of the invention are useful when the animal lacks the inkferon-induced gene or when expression of the inkferon-induced protein is insufficient. As used herein, the expression "inadequate expression of inkferon-induced proteins" refers to increased and/or continuous expression of inkferon-induced proteins for one or more reasons. means that it is desirable Ru. This can be one of the following cases: +11 The animal has an inkferon-induced gene, but this gene expresses the desired protein only after inkferon induction, and the expression of the desired protein is continuous. Nisu or (2) the animal has the desired inkferon-induced gene, but one or more additions of such a gene to the cell would be advantageous. The invention further relates to animal cells transformed with recombinant DNA molecules containing genes encoding inkferon-induced proteins, as well as to animals containing such cells. It is something that In a preferred embodiment, the present invention provides for the transformation of an animal naturally susceptible to viral infection with a recombinant DNA molecule containing a gene encoding an interferon-induced protein capable of protecting cells against viral infection. Thin The present invention relates to cells and also to animals containing cells of this type. Particularly preferably, the viral infection is influenza and the viral infection is a gene encoding the Mx protein. It's a legacy. Alternatively, polypeptides that have antiviral effects similar to those of Mx protein (e.g., polypeptides that are fragments of Mx protein or that are more stable or more effective) Genes encoding derivatives of Mx proteins that are modified to be more effective or have a higher therapeutic index in vivo can also be used in place of genes encoding Mx proteins. In other words, in Book 1iI of the present invention, unless otherwise specified, "Ink The term ``eron-induced protein'' refers to naturally occurring proteins such as Mx protein. It should be understood that it also encompasses other polypeptides that have biological effects similar to those of the Inkferon Xff Q protein. In general, the methods of the present invention are suitable for inkferon-induced proteins in their native state. does not have the desired gene, or does not have this gene in a constitutively active form, or can be applied to animal cells that do not produce the protein in sufficient quantities to confer antiviral protection after IFN stimulation. However, the method of the invention further ink-fermented animal cells that already contain one or more of the genes of the species. Adding one or more genes encoding lon-induced proteins production of inkferon-induced proteins constitutively or optionally under natural IFN control in sufficient amounts to produce the desired effect (e.g., resistance to viral infection) in all tissues or tissues of a species; It can also be applied to The invention further relates to polypeptides having the formula: %Formula %, where the amino acids indicated by the single letter amino acid code are defined as follows: AA, Ia C=Cys D =Asp E=G1u F=Phe c=cty H=His I=11e K""L)'S L=Leu M=Met N=Asn P=Pro Q=G1n R=Arg 5=Set T=Th r V =Va I W=Trp' Y=Tyr Furthermore, the present invention provides a protein that is similar to the Fusumi Mx protein synthesized by cells of other animals. IFN-induced polypeptides that can be immunoprecipitated with the monoclonal antibody 2C12 CP, specifically directed against the murine Mx protein (Steheli et al., Journal Biological Chemistry, Vol. 260, pp. 1821-1825 (1985)). 80,000 Dalton human Mx polypeptide. Furthermore, the present invention provides pharmaceutical compositions containing the above-mentioned polypeptides, as well as animals (e.g., humans). Treatment of viral infections in mammals, including animals, birds, and fish. or prophylaxis). Cure for viral infection It will be appreciated that derivatives and fragments of the above polypeptides may also be made that have similar therapeutic uses. Such HR4 forms and fragments are also considered to be included within the scope of the present invention, and descriptions of the above polypeptides (e.g., descriptions of therapeutic methods and compositions below) also include these derivatives and fragments, unless otherwise specified. Then you should understand It is possible. Furthermore, the present invention also relates to recombinant DNA molecules used for producing the above-mentioned polypeptides. It is something to do. Preferred recombinant DNA molecule) C-GTGCGCCCCT TATT CA CCTCA T CCA CA CCCTcACrGGCTCTGGGT A to AATCAGG CTACATGATAGTCAAGTCC AGA(1; CTCAGCAGCACATCCAACACCAGCTGAGCC TGACTCAGGCTTTTCAGAAAGA(, CAAGTCTrCTrC A+IIGC; ATCACTCAGGAA (, ATCλAAτ8λATAG to A GTCATCA(, A to TCCAAGCcAGGAGcτCC enter G person AC. TACCGT(1; (AC; ACATACCAC, enter AGATGACAGAAC (, ^CC enter rcrcr AAτλ person AATCkGTGCCTτ CAATAGGAATATCATC input ATTT GATACAAGCACA , CTCGGCAGAAG C”nGccAAA': DNA sequence of 'τCTCCCAT, ('b) hybridized to the said DNA sequence and expressed. DNA sequences whose amino acid sequences encode the polypeptides shown above or other Mx proteins (including human Mx proteins), and which have degenerated to the above DNA sequences as a result of the TCI genetic code and whose amino acid sequences are or other Mx proteins (including human Mx proteins). The invention is characterized by a DNA sequence selected from the group consisting of DNA sequences that BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS Figure 1 shows the percentage of mRNA from gel fractions 10 to 19 analyzed by electrophoresis. Figure 2A shows the restriction map of the pMx34c DNA insert; Figure 2B shows the restriction map of the pMx34c DNA insert; The figure shows the nucleus of the pMx34 cDNA insert. Figure 2C shows the amino acid sequence of the murine M Starting from the base, Figure 2D shows the vector pH0327 in which Mx-DNA was cloned to generate pMx34, cloned into the 5stT site in an orientation such that the DNA was transcribed from the SV40 early promoter. Inserted, Figure 3 shows pSV2-neo (a) or pSV2-neo and G418-resistant NIH3T3 cells transformed with pMx34 plasmid DNA (b) showed immunofluorescence with Mx-specific antibodies; Figure 4 shows the immunofluorescence caused by specific antibodies of transfected NIH3T3 cells infected with influenza virus (a, b) or vSv (c, d). Synthesis of a, C) and influenza virus protein mountain) or is analyzed for the synthesis of VSV G protein (dl), and this figure shows that it has Mx protein in the school. Figure 5 shows that cells with little or all of the Mx protein in their nucleus contain viral proteins in their cytoplasm, whereas cells with IFN-treated cells show no signs of viral replication. Mx-specific translocation in RNA from Mx''' and Mx- cells Transcripts are shown in which Northern blots (3 μg) of polysome-bound mRNA were analyzed at 1.5 μg of the pMx34 insert. Okb hybridized to BamHI restriction fragment and serum-free medium (C) or 300 U/ml murine IFN-α/ BALB-A2G-Mx (Mx”) treated with either β (IFN) and mRNA was created from B, AL B/C (Mx-) embryonic cells, and Figure 6 shows We present a southern migration analysis of the murine genome sequence for the Mx cDNA, in which Zumi liver DNA sample (10 μg) was cut with restriction endonuclease and 0. 8% Electrophoresed on agarose gel, transferred to nitrose, lulose membrane, and Mx cD Hybridization with a (P”)-radioactively labeled fragment of NA, and further BAL B-A2G-mx (+) or BALB/c (-) D from rat (A) NA to a fragment corresponding to nucleotides 658 to 2317 of Mx cDNA or Mx cDNA 1. Hybridize to 0kb BAM H11 part (B) and EcoRI-cut DNA (C) and H4ndn[-cut DNA (D) from the same murine species as MX CDNA corresponding to nucleotides 658-2317. compared with the same fragment. Genes encoding inkferon-induced proteins other than Mx proteins can also be introduced into animal cells using the methods described below. Other proteins of this type are 2',5' oligoadenylate synthetase [Baglioni, Cell, 117-1! , p. 255 (1979); Baglio et al., Biochemistry, vol. 18, p. 1765-1770 (1979)), protein kinases [Jarvis et al., Cell, vol. 14, p. 879-887 (1978) ), guanosine-binding protein [Ding et al. National Biological Chemistry, Vol. 258, pp. 7746-7750, (1983)) (LA type I [Basham et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, Vol. 79, pp. 3265-3269] (1982); Yoshi et al., Journal Biological Chemistry, Vol. 257, pp. 131 69-13172 (1982)), β2-microglobulin C Rosa et al., E MBOJ, Vol. 2, p. 8239 (1983) ), as well as other proteins isolated by Phil et al. [Nature, Vol. 301, pp. 437-439 (1983) and Antiviral Research, Vol. . The gene encoding the desired inkferon-induced protein is generally It is introduced into the cell as part of a recombinant DNA molecule operably linked to existing control sequences. A method for introducing a recombinant DNA molecule containing a gene encoding an inkferon-induced protein into a host cell is as follows: (al direct microinjection [Hammer et al., Nature, Vol. 315, No. 680). -683 (1985); Yama) Use of viral vectors [Munion et al., Journal Pyrology, Vol. 7, pp. 813-820 (1971)]; fusion of a predetermined number of chromosomes to a cell [Hourniere et al. Proceedings of the National Academy of Sciences, Vol. 74, pp. 319-323 (1977); Cellular endocytosis of trace precipitates of +dl calcium-DNA complexes [Bachiech and Graham, Proceedings of the National Academy of Sciences, Vol. 74, pp. 1590-1594 (1977); Maitland and McDouga Cell, Vol. 11, pp. 233-241 (1977); Pellicell et al., Cell, Vol. 14, pp. 133-141 (1978); Bigsey et al., Cell, Vol. 14, pp. 725-731 (1,978); and PCT patent publication published September 3, 1981. See Application Publication No. WO 31102426]; (e) Minicell fusion; (11 Electroporation [Neumann et al., EMBOJ, Vol. 1, p. 841 (1982)): Fusion with liposomes having fgl DNA [ Flothy and Babhadgop Current Topics in Microbiology and Immunology, Vol. 96, pp. 171-191 (1982)]; Academy Science, Vol. 77, pp. 2163-21, 67 (1980); Rasulzadegan et al., Nature, Vol. 295, pp. 257-259 (1982)). The use of any one of the above techniques can be used to improve the efficiency of information insertion, the specific nature of DNA, etc. It depends on various factors such as quality or selectivity with respect to information, acceptable size of DNA fragments, etc. When using microprecipitates of calcium-DNA complexes, multiple unrelated genes can be used, including genes with selection markers, and mixtures of co-existing unbound DNA can be introduced by compression; In other words, the seeds of DNA Different fragments often enter susceptible cells simultaneously. Therefore, with a selection indicator cells that contain genes that it is desirable to introduce (for example, the MX protein gene) It is thought that they also have the genetic ability to produce offspring. In practicing the present invention, the desired gene will be introduced into a single cell embryo. For example, Hamer et al., supra], this is a method for transgenic rabbits, sheep and sheep by microinjection. and the production of pigs. Furthermore, development of the embryo into the animal is preferably facilitated by transfer into another female animal (foster mother). However, the desired gene may be transferred to cells of other tissues, such as bone marrow cells, liver cells or and cells of the intestinal mucosa [US Pat. No. 4,497,796]. Furthermore, desired genes can also be introduced into cells of the respiratory tract. The general purpose of introducing a gene for an inkferon-induced protein into an animal is to introduce the desired protein into the animal, such as one that has a protective or some other beneficial effect. The goal is to provide proteins that However, the method of the invention can also be applied to the industrial production of inkferon-induced proteins using suitable hosts (eg animal cells). For the latter purpose, one skilled in the art will A suitable host is transformed with an expression vector having the desired DNA sequence linked thereto, the host is cultured under suitable growth conditions, and the desired polypeptide is extracted from the culture. It is possible to select from known methods of recovering putido. Preferably, the desired polypeptide can be recovered after the host cells are allowed to reach stationary phase. The polypeptides of the invention are useful for expression within cells in protecting cells against viral infection. However, polypeptides or other ink In humans, for example, these induced proteins are linked to the influenza virus. For prophylactic and/or therapeutic use against influenza and/or other viruses, the following may also be applied to prevent the transmission of these viral diseases: (g) injection into the lungs), (g) injection, or (C1 local administration). Preferably, the polypeptide or other inkferon-induced protein is lyophilized (preferably with a bulking agent such as glycine) and then formulated with a medically acceptable cream or ointment. Reconstituted before use with a carrier such as sterile water, the polypeptides or other inkferon-induced proteins of the invention may be administered in a single daily dose or in divided doses (eg, four times daily). The exact dosage will be determined by the clinician, such as the prescribing physician, and will depend on the type of patient, the patient's age and weight, the patient's medical condition, the patient's response to the prescribed medication, and any side effects the patient may have. Depends on observation of effects. In a preferred embodiment of the invention, an anti-influenza effective amount of human Mx protein is administered prophylactically or therapeutically to a human in need of this type of treatment. Group 1 The production of human Mx protein by the DNA method is described in Example 9 below. The following description is useful for subsequent research or industrial purposes. Use this as a useful guideline for expressing and then isolating the protein! However, those skilled in the art will appreciate that many of the techniques described are intended to produce a desired biological effect (e.g., an antiviral effect) within an organism or within a cell, without the desire to isolate the inkferon-induced protein. It may also prove useful when attempting to express inkferon-induced proteins. A wide variety of vectors can be used in cloning and expressing DNA sequences encoding inkferon-induced proteins. These include, for example, vectors consisting of fragments of chromosomal, non-chromosomal and synthetic DNA sequences, such as the various known derivatives of SV40, known bacterial plasmids such as those from E. coli, including coIEl, pcRl, pBR322, pMB9. Plasmids and their derivatives, a wide range of host plasmids (e.g. RP4), phage DNA, and For example, numerous derivatives of phage λ (e.g. NM989), as well as other DNA phages such as M13 and filamentous single DNA phages, yeast plasmids such as the 2μ plasmid or its derivatives, and plus Vectors derived from a combination of DNA and phage DNA include plasmids modified to use phage DNA or other expression control sequences. For each specific cloning or expression vehicle, various sites are selected and imprinted. A DNA sequence can be inserted that encodes a protein induced by protein. These sites are commonly named by the diuretic endonucleases that cleave them. and is well recognized by those skilled in the art. Various methods for inserting DNA sequences into these sites to generate recombinant DNA molecules are also well known. These include, for example, dG-dC or dA-dT, f: end ligation, direct ligation, synthetic linkers, endonuclease and polymerase binding following ligation repair reactions or DNA polymerization. DNA strands and elongation of the DNA strands with suitable single-stranded templates followed by ligation. Of course, it is understood that loaning or expression vehicles useful in the present invention may not have restriction endonuclease sites for inserting the selected DNA fragment. It should be understood that Of course, the vehicle could also be attached to the fragments by other means. Expression of DNA sequences encoding inkferon-induced proteins involves linking these DNA sequences to one or more expression control sequences in an expression vector. Match. By operative binding of this type, either before or after insertion of the selected DNA sequence into the cloning vehicle, the expression control sequences control the expression of the inserted DNA sequence. can be controlled and promoted. Any of a wide variety of expression control sequences (sequences that, when operatively linked, control the expression of a DNA sequence) can be used in these vectors to express DNA sequences encoding inkferon-induced proteins. can. Useful expression control sequences of this type include, for example, the early and late promoters of SV40, the upper ac system, the upper ac system, the upper ac system, the 2nd or 2nd promoter systems, the main operator and promoter regions of phage λ, the fd co control region of protein. Promoter of 3-phosphoglycerate kinase or other glycolytic enzymes, acid phosphatase sphatase promoter (e.g. pho5), yeast α-mating factor promoter and other sequences known to control the expression of genes in prokaryotic or eukaryotic cells or viruses thereof and various combinations thereof. In mammalian cells, it is also possible to propagate the expression unit by linking the gene to a unit encoding dehydrofolate reductase and selecting against host Chinese hamster egg cells. Vectors or expression vehicles (particularly selected DNA fragments and expression vehicles used in the present invention) The site selected for insertion of the current control sequence depends on, for example, the number of sites sensitive to a particular restriction enzyme, the size of the protein to be expressed, the start codon and and expression characteristics such as the relative location of stop codons, as well as many other factors recognized by those skilled in the art. Vector for specific protein sequence The choice of expression control sequence and insertion site is determined by the balance of these factors. However, not all choices are equally valid in a given case. In a preferred embodiment of the invention, if it is desired to express the Mx protein in E. coli, an expression control sequence derived from batataeriophage λ (PL) is used and fused to the Mx cDNA. The ATG at the end of the prokaryotic sequence is adjacent to the second codon of the Mx sequence. If it is desired to express an interferon-induced protein, different types of promoters can be used: (11 constitutive promoters; (2) natural inkferon-dependent promoters (e.g. lack (3) have an increased expression rate but are still inkferon-dependent (in all animals For a description of hybrid promoters, see Ryals et al., Cell, Vol. 41, pp. 497-507 (1985). or (4) a promoter dependent on a substance other than inkferon. When attempting to express Mx protein in mammalian or avian cells, including humans. In this case, the mecrothionine promoter is preferably used. A recombinant DNA molecule containing the desired gene operably linked to expression control sequences is then used to transform a wide variety of suitable hosts, and these hosts (transformants) The ink feron that expresses the offspring and is encoded by the no-lambda lift DNA is induced. It is possible to produce a polypeptide that is Furthermore, this recombinant DNA molecule can be used to transform the host into traits 5. This allows this host to induce inkferon during replication. to produce further recombinant DNA molecules as a source of genes encoding You can also. of animal cells (e.g. mammalian cells including humans or avian cells as mentioned above) In addition, there are a wide range of methods for producing recombinant DNA molecules and inkferon-inducing proteins. types of hosts are useful. These hosts include, for example, E. coli, Bacillus and Bacteria such as Streptomyces and fungi such as yeast, as well as tissue culture of plant cells. Selection of an appropriate host for the above applications depends on many factors recognized by those skilled in the art. It is determined. These include, for example, compatibility with the selection vector, toxicity of by-products, desired This includes ease of recovery, expression characteristics, biosafety, cost, etc. of the polypeptide. For a particular recombinant DNA molecule or polypeptide, any of these factors It is not possible to completely select a host solely by All hosts must be equally capable of expressing a particular recombinant DNA molecule. It should be recognized that this is not effective. The DNA sequence inserted into the selected site of the cloning or expression vehicle is May contain nucleotides that are not part of the actual gene encoding the lipeptid. , or may contain only a fragment of the entire gene for this protein. All that is required is that whatever DNA sequence is used, the transformed host is of inkferon-induced polypeptides. for example , the DNA sequences used in the method of the invention are in the same reading frame in the expression vector. a DNA sequence encoding at least one eukaryotic or prokaryotic carrier protein; is a DNA sequence encoding at least one eukaryotic or prokaryotic signal sequence or can be fused into one part of a combination of This type of construction allows for the generation of desired DNA sequences. to improve the purification of the desired polypeptide from host cells or its secretion. and allow for ripening. Alternatively, the DNA sequence can be modified to include the ATG start codon alone or or any other code fused directly to the sequence encoding the first amino acid of the desired polypeptide. It can also be included in combination with don. This kind of configuration is for example methionyl or Allows for the production of other peptidyl polypeptides. This N-terminal link is then Cleavage of thionine or peptide intracellularly or extracellularly by various known methods or use the polypeptide with methionine or other fusions attached to it. It can also be used. The invention will now be explained by way of non-limiting examples. Example Example 1 Partial purification of mRNA encoding protein Mx, corresponding BAL B/c and Murine embryonic cells were generated from syngeneic BALB-A2G-Mx mice [Steheri et al., Journal of Biological Chemistry, Vol. 260, No. 182. 1-1825 (1985), Alumihiter and Steheli, Alchi Pyro. (1983)). These cells were added to 10% fetal bovine Cultures were grown in Julbecco's modified minimal essential medium containing serum. 3 to 3 of these cells Used 5 times. Confluent cell monolayers (approximately 107 cells/150 y1 dish) were grown at 300 units/m 1 of partially purified murine serum containing FN-α/β (107 units/■). The treatment was carried out for 3 hours with a medium containing no supplements [Tobey et al., Proc, Soc, Exp, Bio l. Med, Vol. 146, pp. 809-815 (1974)). polysome-bound m substantially as described by Colon and Bang. RNA was isolated [Journal Biological Chemistry, Vol. 257, pp. 9234-9237 (1982)), but poly(A)” RNA is Further purification was achieved by extraction with phenol/chloroform. Rabbit reticulocyte lysate obtained from Bethesda Research Laboratories, Inc. The mRNA was translated in an in vitro protein synthesis system according to the manufacturer's guidelines. . S25 methionine (1200Ci/mmol; 2p 10. using ci/μff). Translate cog/ml mRNA in 18μβ reaction. Translated. In order to partially purify this mRNA, 60 　　　　g poly(A)'' RNA was size fractionated and methylmercury-hydroxyagaro electrophoresis at 1000 U/ml mu-IFN ct/β as follows. Sea urchin treated for 3 hours: 60 μg of poly(A)'' RNA was added to IFN-treated BALB-A2G-M. x ethanol precipitated from embryonic cells and contains 20 mmol methyl-HgOH 60 μl of 0. 5x electrophoresis buffer (50 mmol La acid and 5 mmol Contains sodium borate, 10 mmol sodium sulfate, and 1 mmol EDTA ) and cultured at 50"C for 5 minutes. 3C111X0. 2CI11 slot in an electrophoresis buffer containing 6 mmol of methyl-HgOH. 12% of LGT (low gelling temperature) agarose (FMC Corporation) The gel was subjected to electrophoresis with 'fE-fi solution, which was treated with Bayso and Da Analytical Biochemistry, Vol. 70, p. 75 (1) 976), then this gel was mixed with 0. 2 moles ammonium acetate and 20 mmol of 2-mercaptoethanol for 10 minutes, then This was cut into 40 slices each having a size of 2 ml. 1 solid Guelph mRNA traction force) and the agarose slice with a solid pH was heated to 65°C for 3 minutes. Dissolve between, extract with phenol and chloroform, and precipitate with ethanol. mRNA was recovered from individual gel fractions. individual gel fractions A part of the mRNA of (10-19) or IFN-treated Mx” BALB - Either A2G-mx cells (+) or Mx-BALB/c cells (-) 100 μg of unfractionated mR, NA was added to 33 g of methionine as a radioactive amino acid. Translation was carried out in an in vitro protein synthesis system of reticulocyte lysate by using a reticulocyte lysate. Dilute 6 μl of each translation product with 43 μl of PBS containing antibodies against Mx protein. 1μ to do! Murine hyperimmune serum [Steheri et al., Journal Biological; Chemistry, Vol. 260, pp. 1821-1825 (1985)), And this mixture was incubated at 4'C for 2 hours. Antibodies with protein A-Sepharose The collected and immunoprecipitated proteins were published in the Journal of Biological Sciences by Steheli et al. Mistry, No. 260t-1, pp. 1821-1825 (1985). Electrophoresis on an 8% 5DS-polyacrylamide gel (top to bottom) It was analyzed by pneumophoresis) and visualized by radiophotography. Approximately 3k long The gel fraction containing mRNA of b contains mRNA encoding protein Mx. (Figure 1). Mx mRNA activity is 10-20 times higher? E-shrinked 0,5/jg poly(A)” Using the mRNA fraction, the method of Okayama and Berg [Molecular Cellular Biology, Vol. 2, pp. 161-170 (1982)) We carried out vector-treated cDNA synthesis, but at this time pKCR [OHA] Le et al., Proceedings National Academy of Sciences USA, No. 7 8, pp. 10527-31 (1981)). Using HG327, insert a 3stl linker into the unique amH1 site of pKCR. The BamH1 site was regenerated and aligned to the linker. By cloning at the SSt site, the cloned sequence and and 13amHI. Using the obtained hybrid plasmid, Hanahan's method [Journal More Biological Biology, Vol. 166, pp. 557-580 (1983)) E. coli strain DH-1 cells were transformed. 1g of RNA is approximately 2X10' transformants were generated. To identify recombinant plasmids harboring Mx″-specific cDNA inserts, Mx The alleles at the site are different [Steheri et al., Pyrology, Vol. 132, No. 456] (1984)) and, as a result, isogenic strains that differ in their ability to synthesize protein Mx. Zumi species B A L B/c and BALB-A2G-Mx were used (Ba lb/c species are Mx- and do not accumulate Mx protein) [Steheri et al., Journal ・Biological Chemistry, Vol. 260, pp. 1821-1825 (19 85); Hollisberger, Proceedings National Academy of Sciences 80, pp. 1910-1914 (1983)). Mx-mRNA complexes in syngeneic murine IFN-treated cells contain protein Mx Colony hybrids are assumed to be almost identical except for the mRNA encoding the [St. Probe, Cell, Vol. 16, p. 443 (1979) i. Isimaker, Gene, Vol. 8, p. 391 (1980)) We screened the existing items. As a hybridization probe, unfractionated (dimensions) Fractionated (approximately 3 kb in length) IFN-treated BA, LB-A2G-Mx cells Or whether the mRNA of IFN-treated BA, LB/c cells is Coli DH-1 (5001 solids per plate with a diameter of 90 mm) was added at 100 μg/ The cells were grown in LB medium containing ml ampicillin. Taub and Thompson Method of [Analytical Biochemistry, 12th Ei! , No. 222-230 (1982)) created a filter for colony high printing. mR recovered from selected methyl-HgOH agarose gel fractions p32 radiation by using oligo dT as a primer for reverse transcription of NA. cDNA (2x 10'c pm/pg RNA) labeled with the following conditions was prepared. “=” m from BALB/C embryonic cells treated with IFN to create probes. Using RN A, syngeneic BA treated with IFN to create a “+” probe mRNA from LB-A2G-Mx embryonic cells was used. First of all, filter Hybridized to the "-" probe. After radioactivity photography, high printing professional 0. Incubate with 5M NaOH for 5 minutes at room temperature and incubate with 0. 5 M Tris- These were then washed from the filter by neutralizing with MCI (pH 8). The filter was vibrated to the "+" probe. Hybridization is 15 0mM Tris-MCI (pH 5) and 0. 75M NaCl and 5mM EDTA and 0. 2% SDS and 0. 0.2% raw serum albumin and 0.02% raw serum albumin. 02% polyvinyl pyrrolidone and 0. 0.02% Ficoll and 0.02% Ficoll. Contains 2■/m+ salmon ellipse DNA The test was carried out at 65° C. for 14 hours at 5×10′ cpm/m+ in a solution containing these Set the filter to 0. 2 xSSC (SSC is 0. 15M NaCl and 0. 015 M sodium citrate) and 0. Wash with 2% SDS solution at 65°C and exposed the filter to Fuji RX film at -70°C through a reinforced screen. I let it out. hybridizes to the “+” probe but not the “−” probe. Colonies that did not become pods were picked up and re-cloned. Analyzed 10. 000 clones, from BALB-A2G-Mx cells. Although it strongly hybridizes to cDNA, cD from BAL B/c cells Two colonies were identified that did not hybridize detectably to NA. These 2 The printed cDNA inserts of seed colonies hybridize with each other, which indicates that This indicates that these were presumably derived from the same type of mRNA. the larger one The insert of the clone (pMx5) was approximately 1 kb in length. This is IFN treated It was hybridized to the mRNA of BALB・A2G-Mx cells. As expected for Mx cDNA, the mRNA of untreated control cells was It was not lidded. This cDNA was further identified by hybridization translation analysis as follows: m Transfer Mx5 plasmid DNA or vector DNA to a nitrocellulose filter. poly(A)”R of BALB-A2G-Mx cells bound and IFN-treated. Hybridized into NA. pMx5 DNA was immobilized, but vector DNA was immobilized. under denaturing conditions, efficiently binds the mRNA encoding Mx protein. The RNA released from the filter was translated in vitro and the product was immunoprecipitated. and analyzed by gel electrophoresis. Thus, pMx5 seems to be (Mx It was concluded that it contains cDNA complementary to MxRNA encoding the protein. Clear proof for this conclusion was obtained by transformation experiments as described below. . Preliminary Northern transformation analysis was performed as follows: methyl- 3 μg of poly(A)” RNA was subjected to electrophoresis using HgOH agarose. . After electrophoresis, the gel was dried at 0. 2M ammonium acetate and 20mM 2-mercapto Soaked in ethanol for 15 minutes, washed with water for 10 minutes, and purified the RNA with 20X SSC. [Thomas, Proceedings National ・Academy Science, Vol. 77, pp. 5201-5205 (1980)) This membrane was baked at 80°C for 2 hours under reduced pressure, and 20mM Pipes (p H6,4), 5xssc, 50% formamide and 0. 2■/II+1 salmon oval DNA and 0. 1% SDS and 0. 0.04% bovine serum albumin and 0.04% bovine serum albumin. 04% poly Vinylpyrrolidone and 0. 6 hours at 42°C in a solution consisting of 0.04% Ficoll. I made a preliminary hybrid. 2 x 10”c pm/μg by Nick Translation Restriction fragment of Mx cDNA radiolabeled to a specific activity of 2 x 10'cp This was then hybridized for 18 hours at 42°C in the same buffer at m/ml. The film was mixed with IX5SC and 0. Wash with 1% SDS at 50°C and bring to -70°C. It was then photographed using radioactivity. This analysis shows that the full-length MX in RNA is approximately 3. 5k b, showing that it is much longer than the cDNA insert of pMx5. Therefore Then, full-length Mx cDNA was isolated. To isolate full-length Mx cDNA clones, cDNA archives (approximately 10, 4 batches with 000 independent transformants) were grown in liquid culture. . Transformed E. coli DH-1 (2. 5X10'), 100 The cells were grown to stationary phase in LB medium containing μg/+ol ampicillin. child Plasmids made from these cultures were incubated at pH 12.4 for 10 minutes at room temperature. followed by regeneration with Tris-HCI (pH 7,5) and phenol extraction and evaporation. This DNA was then concentrated into supercoiled form by ethanol precipitation. 0.0 of LGT agarose. Electrophoresed on an 8% gel, larger than about 2000 bp Plasmids with inserts of up to approximately 500bp (appropriate comparisons and contrasts) (estimated from the observed migration) and used to transform E. coli DH-1. I let it happen. Create a filter for colony hybridization [Taub and Thompson] Analytical Biochemistry, Vol. 126, pp. 222-230 (1 9B2)) and nick-translated pMx5 and P″2 radiolabeled (1 0”cpm/μg) insert.Hybridization and washing The conditions are the same as above. Positive clones were picked up and recloned. Approximately 200,000 ft of ampicillin-resistant colonies were nicked with pMx5. The translational inserts were analyzed by hybridization. 200. Approximately 1% of the 000 colonies gave a positive hybridization signal. Ta. Furthermore, 48 randomly selected clones were characterized. Insert all clones The input had a single BamHI site located approximately lkb upstream from polyA. The insert of one clone is 3. 3 kb (pMx34) and 12 types of The clone (including pMx41) is 2. 5-2. has an insert of 8 k b, and The remaining clones are 2. It had an insert shorter than 5kb. 9MX34 and p Mx41 was characterized in detail as described in Example 2. In addition, in order to express the murine Mx protein in E. coli DS-10, we completed. First, the Trp promoter is fused to the Mx coding sequence to generate A The ends were aligned to the UG codon. Recombinant DNA molecule obtained from E. coli DS-10 and this transformant was grown at 30°C. The metamorphs were destroyed with lysozyme and thawed. After centrifuging the disrupted bacteria, the supernatant The solution was subjected to 5DS-polyacrylamide gel electrophoresis, and then the putative Mx protein was analyzed. Transferred to a membrane filter. The protein-containing membranes were then incubated with murine antibodies against Mx. fed. Using a goat anti-murine antibody conjugated to the S-peroxidase enzyme, anti- Detect antigen-antigen complex and therefore 72. 000 to 75,000 daltons was identified as positive for murine Mx protein. Restriction fragments obtained as described in Example 1 were digested with polynucleotide kinase. 5’ (P”’) labeling or by Klenow DNA polymerase. or terminal transferase using radiolabeled dideoxy-ATP. and 3′(P”’)-labeled, and according to the method of Maxam and Gilbert [Professional Seeding National Academy of Sciences. USA, Vol. 74, pp. 560-564 (1977)). . The restriction map and nucleotide sequence of the cDNA insert of pMx34 is shown in Section 2. Shown below. The heteropolymer sequence consists of 3218 nucleotides and 12 There were about 80 G residues, followed by about 80 A residues. Numbering is Gs strike We started with the first nucleotide following the ring. The most at nucleotide 214 Exists from the first A, TG to the TAA stop codon at position 2107 The open reading frame encodes a protein with 631 amino acids. first ATC The sequence upstream of the codon contains translation stop signals for all three reading frames; means that pMx34 contains the complete coding region of Mx cDNA and the following ATG code: Since the don is located at position 802, translation starts with A, TG at position 214 It shows what is expected to happen. Mx cDNA coding sequence followed by 110 There is an 8 bp 3'-untranslated region, which corresponds to the matched region at position 3199. Poly A additional signal A, 6. , TAA AA. E. coli containing plasmid pMx 34 (E. coli DH-1/pMx 34) as American Type Culture on July 30, 1985. - Deposited in the Collection and assigned ATCC Arashi 53207. To minimize reverse transcriptase errors and other cloning mistakes, pM The nucleotide sequence of pMx41, which was generated independently of x34, was determined. p The Mx41 2650 bp insert is an incomplete copy of the Mx specific mRNA. Ta. The sequence of pMx41 corresponds to nucleotides 658 to 3218 of pMx34. , there was not a single nucleotide difference. The predicted amino acid sequence of protein Mx is shown in Figure 2B. The numbering starts with the first meso of the array. Depart from Onin. Main Mx! The Il translation product consists of 631 amino acid residues. It has a molecular weight of 72,037. The MX and protein deduced from the nucleotide sequence of the cDNA clone were 631 amino acids. Composed of amino acids. Computational molecule of Mx protein! 72,037 to experimental value 72,50 0 C. Hollisberger et al., Proceedings National Academy of Sciences 80, pp. 1910-1914 (1983)), 75. 000 (Steheri et al., Journal Biological Chemistry, Vol. 260, No. 1 821-1825 (1985)) and 78,000 [Hollisberger et al. Journal Biological Chemistry, Volume 260, No. 1730-173 3 (1985)), and these can be compared to the 5DS-polymer of the natural Mx protein. Estimated by lyacrylamide gel electrophoresis. Surprisingly, the Mx protein has several regions that are extremely rich in charged amino acids, even though The segment from position 76 to 89 consists of 3 (solid negatively charged amino acids and 6 positively charged amino acids) The segment from positions 93 to 107 contains eight negatively charged residues. The fragment at positions 511 to 522 has basic and alternating amino acids except for one amino acid. Consists of acidic and residues. 40 carboxy terminal residues are 26 hydrophilic residues , 20 of which are electrically charged. The segment at positions 606-614 is 7 (Composed of solid basic amino acids. Positively charged regions are negatively charged regions such as nucleic acids. interacts with other cellular components. Some of the hydrophilic ranges are made up of dense rows of acidic residues, with alternating basic and acidic, and those consisting mainly of basic residues, especially the sequence Arg-Gl u-Lys-Lys”Lys-Phe-Leu-L’ys-Arg-Arg It is located near the carboxy terminus. Range of basic amino acids (carboxy proximal) Pr o-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val is SV40 large T antigen [Calzolon et al., Cell, Vol. 39, No. 499-509] Page (1984>). Predicted sequence of Mx protein and 4. Computer with known protein sequences of ooo+ffi or more A comparison between the influenza virus protein and the Mx protein revealed significant homology between was not detected. SV 4. 0 relative position to the early promoter and plasmid pMx, 3 The orientation of the Mx cDNA in 4 allows testing of its expression in eukaryotic cells. Make it. 5 x 1o' NIH3T3 murine cells containing 10% fetal bovine serum Cultured for 18 hours in a dish with a diameter of 9011 in Jurube Soko's modified minimum essential medium. 0 then add 10 ml of fresh medium and 4 hours later add 20 parts g of phosphoric acid. Si-precipitated DNA was added. 1 part g pSV2-neo (Southern and Berg, Journal MoI/Cura Applied Genetics, Vol. 1, No. 327-341 (1982)) Plasmid DNA and BAL B/c using 20 parts g of high molecular weight carrier DNA obtained from the liver of 1. c. +g of psV2-neo and 20 parts of S;li+-linear pMx 34 plasmid Using DNA, the method of Wiggler et al. Me Science, USA, Vol. 77, pp. 3567-3570 (1979)) A DNA precipitate was prepared according to the following procedure. After maintaining the mixture at 37°C for 20 hours, The DNA-containing medium was replaced with fresh medium and the cells were allowed to grow for 24 hours. These were then trypsinized and plated on new plates at a split ratio of 1:8. I planted a seed. After 24 hours, the culture medium was mixed with 0418 (Geneticin, Gibco) at 1 μ/1. The containing medium was replaced every 2-3 days. Resistant clone (pre 50 to 100 pieces per sheet) appeared after two weeks. pSV2 into these cells. -neo plasmid DNA (transformed cells have resistance to drug 0418) 20 parts of II) MX34 plasmid DNA linearized with 1 part of were transfected with 20 copies of carrier DNA. these cells , maintained in medium supplemented with 1 μ/ml neomycin congener G418 (Gibco). It was. Permanently transfected cells expressing 0418 resistance were selected and single clones The G418-resistant cells in each plate were saved without separating the cells. immunofluorescence analysis Protein Mx was synthesized for approximately 100 individual 0418-resistant transformants using We analyzed the ability of preserved materials to exhibit the properties of G4. 18M cells were grown on glass coverslips for 20 hours and incubated with PBS. Washed, fixed with 3% formaldehyde for 10 minutes at 25°C, and 0.5% 5% Permeabilized with Triton X-100 for 5 minutes. To detect Mx protein, a fixed The permeabilized cells were then incubated with a 0.4% mouse hyperimmune strain containing an antibody that binds to the Mx protein. Incubate for 15 minutes in PBS containing 5% normal goat serum together with epidemic serum. Steheli et al., Journal Biological Chemistry, Vol. 260, No. 18 21-1825 (1985)), glass coverslips to show bound antibodies. top Incubate for 15 minutes at 25°C with IgGC Nordzhik Co., Ltd., and add 5% normal goat serum. diluted 1:50 in PBS containing PBS, washed with PBS and 5. 0mM Tris -HC1(p)18. 6) and 50% glycerin. Reicheld Used for fluorescence microscopic analysis of ultraviolet incident light using a Jung-Polivar microscope. there was. Original Mx = 3T3 murine cells, and pSV2-neo plasma but not MX cDNA. 3T3 cells transfected with Sumid were treated with IFN. However, protein Mx could not be synthesized (Figures 3A and 4). ), whereas a high proportion of 3T3 cells transfected with Mx cDNA synthesized Mx protein. Mx cDNA is generated under the control of the SV40 early promoter. Since the recombinant Mx protein is expressed constitutively in the transfected cells, and did not require induction with IFH. In IFN-treated Mx+ cells Similar to the naturally occurring protein, the recombinant protein Mx is present in the nucleus of transfected 3T3 cells. The transfected cells originating from plate 34/6 accumulated (Fig. 3B). Approximately 30% of the cells synthesized Mx protein (Figure 3B). Treatment with IFN inhibits Mx protein expression in transfected cells. had no detectable impact. In transformed cells, Mx protein is expressed early in SV40. Since it is constitutively transcribed under the control of the promoter, this means that Mx gene expression is simply 0 Mx proteins in individual cells, an expected result as long as they are under transcriptional control. The level of white expression could be varied. A small number of transfected cells , fully induced M treated with 1000 U10+1 of IFN-α/β for 18 hours. x” embryonic cells contain the same amount of Mx protein (measured by immunofluorescence staining). However, most of the Mx protein-expressing 3T3 cells are 0 recombinant and 0 recombinant cells containing low concentrations of Mx protein. and native Mx proteins differ in their reactivity with 3 different specificity monoclonal antibodies. cannot be separated, and in Western blots they appear to be the same molecule. It had a large amount. Cells from stock 34/6 were grown in medium containing 0418 for over 3 months. this After a period of time, the number of protein Mx expressing cells and the relative expression level (immunofluorescence analysis) were determined. (measured by Mx) remained relatively constant, indicating that protein Mx did not inhibit cell proliferation. It is shown that. By limiting dilution, protein Mx-producing 3T3 cells Cloned. After two cycles of cloning and propagation, approximately 95% protein Mx Although cultures containing productive cells were obtained, these cultures still contained non-productive cells. , protein Mx expression levels of individual cells are not uniform as in culture 34/6. This suggests complex regulation of Mx protein synthesis in transfected cells. ing. Cultures of transfected 34/6 cells on glass coverslips were influenza A virus strain FPV-B or vesicular stomatitis as a comparative experiment. were infected with the Indiana strain of the virus (VSV). Approximately 10' pieces per 1ml Plaque spermatozoa grown on NIH3T3 cells up to 100 plaque-forming units (PFU) Each virus was created from the produced virus. convert these cells into one of the viruses 10 PFU per cell in medium containing 2% FC3 (fetal calf serum). These cells were then infected twice with medium and 2% Culture was performed at 37° C. for 3 to 4 hours in a medium containing FC3. Under these conditions, 98% of individual cells in the NIH3T3 comparative cell culture had specific antiviral antibodies. When analyzed by immunofluorescence analysis, it was positive. Cells were incubated with 3% paraforma at room temperature. fixed with aldehyde for 10 minutes, and fixed with 0. with 1% Triton X-100 The cells were allowed to permeate for 5 minutes. Mx protein and viral protein (i.e. which viruses are sensitive to) Influenza virus protein or VSvG protein depending on whether it is used for infection) Fixed and permeabilized cells were targeted to Mx proteins to simultaneously monitor Murine antibodies and rabbit antibodies against viral proteins (influenza or VSV) Treated with a mixture with the body. 0. Mouse high containing 4% antibodies against Mx protein Immune serum [Steheri et al., Journal Biological Chemistry, No. 260] Vol., pp. 1821-1825 (1985)) and 0. 2% influenza virus rabbit antiserum against Rus; 2. Rabbit antiserum against 5% vsv c protein [Arnheiter et al., Cell, Vol. 39, pp. 99-109 (1984)] used. These antisera were diluted in PBS containing 5% normal goat serum. child The mixture containing these antibodies was incubated at 25°C for 15 minutes. Antibody bound to Mx protein To visualize the body, a rhodamine-conjugated goat anti-mouse antibody (Norzhik Co., Ltd.) was used. )It was used. A rabbit antibody (Tulzink) that binds to viral proteins was used. Cultures were grown for these labeled antibodies in PBS containing 5% normal goat serum. % for 10 minutes at room temperature. Wash the coverslips with PBS and set them aside. in 50mM Tris-HCI (pH 8,6) and 50% glycerin, and Individual cells were analyzed for rhodamine and fluorescin by UV incident light fluorescence microscopy analysis. - Both specific fluorescence was analyzed. In this way, using immunofluorescence technology, individual Cells have the ability to synthesize protein Mx as well as the ability to synthesize influenza virus proteins. I was able to analyze it. As shown in Figure 4, this is evidenced by the fluorescin nucleus. As shown, the cells that produced Mx (Fig. 4a) contained influenza-specific proteins. (Figure 4b), cells producing influenza-specific proteins were Mx negative. be. Thus, transfected cells containing recombinant Mx protein are capable of inhibiting influenza viruses. M! did not enable the synthesis of Rus protein, whereas M! Cells lacking protein are susceptible to influenza. Susceptible to Luenza virus FPV-B (Figures 4a and 4b) . Mx protein-expressing cells were selectively protected against influenza virus. Mx Both cells lacking the protein and cells containing the Mx protein respond to rhodamine vSv. (Figures 4C and 4d) The degree of resistance to enzaviruses was variable. microorganisms with high concentrations of Mx protein. cells were well protected, whereas cells containing only low concentrations of Mx protein were small. or were not protected. Mx protein and influenza A virus at a rate of 10 plaque-forming units per cell. 746 individuals infected with influenza FPV-B The relative amount of viral protein was recorded. After 3 hours at 37°C, each cells that are high producers, constant producers or producers of Mx protein and influenza virus protein were classified as non-producers. Table 1 shows cells that synthesized large amounts of MX protein. This shows that 100% of the patients were resistant to the influenza virus. Table 1 Synthesis and influence of Mx protein in transfected NIH3T3 cells Prevention and abundance of virus 0 0 36 Small amount 24 54 76 Unable to detect 385 162 9 Approximately 50% of cells that produced almost no Mx protein were resistant to influenza virus. MX protein contained no detectable amount. 98% of the cells tested positive for influenza virus. In the same culture, cells expressing high levels of Mx are associated with influenza virus. cells lacking Mx protein are fully susceptible. It was demonstrated that the cloned sequence encodes Mx19 function by showing: M To the question of whether the x protein can exert its antiviral activity without the addition of IFN, In that case, the answer is yes. Levels similar to IFN-induced Mx4″ cells Mx cDNA-transformed 3T3 cells that expressed Mx protein were treated with IFN. It was resistant to influenza virus infection even without it. Thus, unexpectedly, the presence of Mx inhibits influenza viruses even in the absence of IFN treatment. is sufficient to protect cells against infection. However, natural Mx cells , develop resistance to influenza viruses only after being treated with IFN. . Example 5 B A L B / c or syngeneic BALB A2G-Mx rat cells were injected into blood. 3 in medium containing no supernatant or medium containing 300 U/ml IFN-α/β. time treatment to create polysome-bound poly(A)"RNA. Each preparation 3 μg of mRNA was electrophoresed on a methylmercury hydroxyl-agarose gel. Illy and Davidson, Analytical Biochemistry, Vol. 70, No. 75 (1976)), the mRNA was transferred to a nitrocellulose membrane, and then this mR NA was hybridized to a radiolabeled Mx cDNA probe [to T.S., Proceedings of the National Academy of Sciences, Volume 77, No. 5201-5205 (1980)). IFN-treated Mx''' cells are approximately 3. Contains 5kb mRNA and this This strongly viblifted Mx cDNA. m from untreated comparison cells RNA did not hybridize to Mx cDNA (Figure 5), Mx c Probe obtained from coding region of DNA and MxcDNA having repetitive sequence Identical results were obtained with probes obtained from the 3' non-coding region of . In response to IFN-α/β, Mx-embryonic cells hybridize to the Mx cDNA probe. It was discovered that this method synthesizes d-modified mRNA. This mRNA is expressed in Mx+ cells. MX-specific mRN is about 200-500 nucleotides shorter than A. Ta. Polysomal poly(A) = RNA preparations of Mx-cells contain extremely low concentrations of this mR Contains NA, and the concentration was just sufficient to be detected by Northern blot (Figure 5). ), no Mx-specific mRNA could be detected in untreated comparison cells. The synthesis of Mx-specific mRNA in x+ and Mx- cells is therefore under similar control. It seems to be under your control. In addition, 3ug of poly(A)” RNA was added to Q, 5 aoX O, 200 slots. 1. by electrophoresis on a 2% sigma agarose gel. Then, analytical gel electrophoresis was performed. After electrophoresis, these gels were dried at 0. 2M acetic acid A solution of ammonium and 20mM 2-mercaptoethanol for 10 minutes? + 'tM and stain with ethidium bromide or Northern migrate these gels. used for analysis. To investigate the nature of the Mx-murine defect, radiolabeled pMx41 1. 65k b B a mH! By using the fragment as a probe, B Southern plots of chromosomal DNA from LB/c mice were analyzed.　 As shown in FIG. 6A, the same type BALB-A2G-Mx and BALB/ c The restriction patterns of rats were not the same. EcoRI-cleaved Mx±D 5kb of NA and 7. The band in 5 k b is B A L B / cD A new band at approximately 4 kb appeared, although it was not present in NA. Ba　 m 2-3 kb weak band in HI-cleaved DNA and 6. 5 k b The strong band is Mx-BALB/c, which is missing from the DNA but newly added to 7kb. A band was detected. Similarly, Mx:! :D N A 3kb and 10 The H4ndll+ fragment of kb was replaced by the 9kb[i piece in Mx-DNA, One 5kb Pst+ fragment is 2. 5kb fragment. southern blob The BamHT fragment of radiolabeled l and Qkb of Mx cDNA was used as and in DNA from Mx-rats as well as in DNA from Mx-rats. On the other hand, slightly overlapping bands were obtained (Fig. 6B). These results indicate that BALB/C Consistent with a deletion in the Mx gene of the genome. This deletion probably includes both exons and introns, and the Mx cDNA It appears to be located upstream of the BamHI site at position 2317 of A. The control patterns of eight different mouse species were compared (Figures 6C and 6D). Two syngeneic ftBALB-A2G-Mx and SL/NiA and a heterologous parental strain (T9XCBA) FluR was phenotypically Mx'', whereas the same The line species BALB/c J, A/J, 129/J and C57BL/6J are the same E coRI restriction pattern, indicating that these types share the same deletion in the Mx gene. It suggests that it has a similar meaning. The restriction pattern of type CBA is one other Mx type. are clearly different, and even in Hindl-cleaved DNA, CBA DNA and M A clear difference was seen between the two DNAs. The strong band in lOkb obtained with Mx” DNA was detected by CBA juniper Instead, a band at 5kb was found. Thus, at least Two different Mx monoalleles also occur between isotypes and differ in length and/or position. with different deletions at different locations. Are these two types of deletions independent? It is still unknown whether one is induced by the other. These results clearly indicate that the wild phenotype is Mx+ despite the frequency of Mx-. , and Mx- indicates that it is generated from this by deletion. Experiment type The dominance of Mx” in is due to the founder effect, but Hara et al. The high frequency of Mx monoalleles found in more wild species remains unexplained. . Example date Immunoprecipitation analysis of other mammalian proteins with homology to murine Mx Determine whether proteins homologous to murine MX exist in other mammals. murine Mx against inkferon-induced proteins from other animals. The cross-reactivity of specific antibodies was analyzed. Three different monoclonal antibodies (5D11. 6D4 and 2C12) (to Ste. Journal of Biological Chemistry, Vol. 260, No. 1821- 1825 (1985)) to transform human and rat cells into murine Mx. The presence of homologous proteins was screened. TFN treated cells and and untreated cells (comparison) were metabolically labeled with 325 methionine and Cytoplasmic extracts were used for immunoprecipitation analysis. Syngeneic BALB treated with IFN-α/β - Immunization with cell extracts from A2G-Mx (Mx”) cells [Steheri et al., supra] Monoclonal antibody 5D11. 6 D4 and 2C12 were created. In immunoprecipitation analysis of cytoplasmic extracts of murine cells, three monoclonal antibodies All showed high specificity for the murine Mx protein and a single 75,000 dalton protein. The protein precipitated, which was similar to polyclonal anti-Mx antibodies [Steheri et al. , Journal Biological Chemistry, Volume 260, No. 1821-18. 25 (1985)). In immunoprecipitation analysis of cytoplasmic extracts of human cells, we found that after induction of rFN-α, fresh Pulmonary blood lymphocytes (PBL), cultured human fetal lung cells (HF, LC), and by a variety of cells such as cultured skin RT fibroblasts from neonatal and adult donors. A synthesized 2C12-cross-reactive human protein was found. Human from healthy donor PBL was treated with E. coli produced IFN-α2 (10”U/■) or natural IFN. -α (10'U/■). Other PBLs were left untreated as a comparison. I made it. After maintaining these cells at 37°C for 2 hours, the cells were washed and the cell protein Metabolically labeled 0 with 335 methionine, cell extracts were then made and The method of Teheri et al. [Journal Biological Chemistry, Vol. 260, No. 1821-1825 (1985)). Proteins that could be immunoprecipitated using antibodies against the antibodies were analyzed. IFN-treated PBLs of all human donors (all 11) were treated with monoclonal anti- 80. can be immunoprecipitated with body 2C12. 000 Dalton protein was synthesized. this protein could not be detected in untreated comparison cells. IFN-α2 and E. coli-produced and natural IFN-α are distinct in their ability to induce synthesis of this protein in PBL. I couldn't tell. Two squid monoclonal antibodies against murine Mx protein (6 D4 and 5D11) did not react with human proteins. Also, polyclonal The antiserum [Steheli et al., supra] showed a low but significant measure of cross-reactivity. HFLC was then analyzed for the synthesis of proteins homologous to murine Mx. this Also, monoclonal antibody 2C12 induced 80. 000 da Luton protein was precipitated, but 6D4 or 5D11 was not precipitated. This egg White was not detectable on raw HFLC. 5-25 U of IFN- per ml Concentrations of α2 clearly induced the synthesis of cross-reactive human proteins. This trigger is 1 It becomes more pronounced at 25U/ml, and at 625 or 3125U/a+1 The maximum value has been reached. HFLC synthesizes cross-reactive proteins at a relatively low rate 2 hours after the start of IFN treatment. The percentage of 0 synthesis achieved increased with time and reached a maximum between 6 and 12 hours. In the HFLC extract, monoclonal 2C12 is present in low concentrations as a second I FN-α2 attracting protein (molecular weight approximately 75. '000 Gluton). this protein is 80. represents a degradation product or unmodified precursor of a 000 Dalton protein, or This is a unique mRNA product. The HFLC extract was then treated with a high concentration (10' U/ml) for various times. Although treated with IFN-γ (5 × 10'U/■) produced by E. coli, 80. 000 Dalton protein could not be detected. IFN-γ This preparation was otherwise active on HFLC, indicating that GBP in 67, all i.e., guanylate binding induced in fibroblasts by different types of IFN. Ability to induce protein synthesis or inhibit virus replication in HFLC Proven by force. Furthermore, using a similar procedure, IFN-treated but not untreated rat embryonic cells were found that they synthesize proteins that cross-react with anti-Mx antibodies. monoku Local antibodies 5D11 and 6D4 produced a single IFN-induced 72,000 da In contrast, 2C12 immunoprecipitated 80,000 d of the two proteins. Luton protein and a small amount of 72. 000 and 65. Immunoprecipitation of 000 Dalton protein I let it happen. cross-reacts with anti-Mx antibodies as in humans and murine All rat proteins were absent in untreated control cells and in cells treated with IFN-α. was strongly induced in cells treated with IFN-r, but not in cells treated with IFN-r. . Furthermore, antibody 2C12 showed a high degree of specificity. This is present in normal untreated cells. It was not possible to identify all human proteins present. °Furthermore, this protein M It did not specifically react with any murine proteins other than the x group [Drysing, etc. Irology, Vol. 140, pp. 192-196 (1984); National Biological Chemistry, Volume 260, Pages 1821-1825 (1985)). The above results demonstrate that the 2C12 cross-reactive protein has at least one unique antigenic determinant ( (not found in other human or murine proteins) with murine Mx; and the synthesis of both the human and murine proteins described in this example is dependent on IFN-α. but not IFN-γ, and therefore under similar control. It shows what you think. Thus, the above 2012 cross-reactive protein It appears to be the human homolog of the miMx protein. Example 9 Isolation and expression of human Mx cDNA First, for cross-hybridization of human genes to murine cDNAs, The optimal conditions were determined. For this determination, we first need to use a 3ft restriction enzyme (e.g. Using BamHI, EcoIr and BglI [) and murine cDNA comparison A Southern plot of human DNA was created. Negotiate under conditions that tolerate human DNA. After hybridization with Zumi cDNA, it is washed under various strict conditions. The optimal conditions for cross-hybridization were determined. Then, a human cell line or tissue thereof with sufficient Mx, mRNA content, Also, the optimal IFN induction conditions were determined. For this determination, we first start with human lymphocytes and human cell lines (e.g. cells, HEL60 cells, WISHI [1 cell. single cells, lymphoblasts and Daudi cells) at different concentrations (0, 30, 300, 0.3000 U/ml) human ink Feron α. 2. over 4 and 10 hours Processed. Next, add RNA and, if necessary, poly(A)'' RNA to each sample. and purified from positive control cells (IFN-induced murine Mx” cells) 0, then use the nick-translated murine Mx cDNA to The RNA was dotted and noibridized under conditions 6 and then subjected to radioactivity analysis. It is possible to quantify noibridization by using hybrids with appropriate MX mRNA content. The cell line or tissue and optimal IFN induction conditions were determined. To generate and characterize human Mx mRNA-containing poly(A)'' RNA, Under the conditions determined above, it was found to be the best source of human MX mRNA. cells were induced. The poly(A)” RNA is then purified by standard methods and Northern blot analysis was performed to determine the length of Mx mRNA. A cDNA library was then created and screened. Using poly(A)” RNA characterized by Northern blot analysis as a template cDNA was created using the Gabsy-Hoffman method. double stranded cDNA was treated with ECOR COR-ase, and then the double-stranded cDNA was ligated with DNA ligase. and was attached to an EC0RI linker. After fractionation on agarose gel, Mx mR The cDNA fraction corresponding to the length of NA ±200 nucleotides was and then integrated the resulting recombinant phage into the 0 This phage was then used to infect E. coli. Infected bacteria in a regular manner Therefore, the plate was smeared (T. maniatis et al., Molecular Cloning Cold Sprink' Harbor Laboratories, Inc., New York (198 2)). The resulting stocks were then nick-translated under optimal cross-reaction conditions as described above. Screening was performed using the mouse cDNA obtained. To characterize the cloned Mx cDNA, we first extracted the putative Mx cD Smith-Birnstiel method for NA 2387 (1,976)). Next Then, the Maxam-Gilbert method [Proceedings of the National Academy of Sciences] Jens, USA, Vol. 74, pp. 506-564 (1977)), MX cDNA was sequenced and this sequence was compared to that of the murine Mx cDNA. , the degree of homology was determined. h) To test the functional competitiveness of Mx cDNA, first determine as above. (constitutive) mammalian expression of the encoded sequence under the control of the SV40 early promoter. This vector was then cloned into the vector pβG. cells, and into human Hela and Cos cells. Next, murine Mx (which has been shown to cross-react with human proteins) ) in sub- and permanently transformed cells. The expression of Mx in the field was tested. Infecting transformed cells with influenza virus After infection, in situ detection using fluorescent anti-influenza antibodies as described above. Virus replication was evaluated [Steheri et al., Cell, Vol. 44, No. 147-158] (1986)]. To generate human Mx protein, the coding sequence of human Mx is combined with various promoters ( Trp, λ, PL or tac) and different 3' non-coding regions. was fused to the E. coli region and expressed in E. coli. Alternatively, the Mx encoding sequence can be converted to [FN signal sequence and expressed in a DHFR-plasmid, with methotrex Then immunological methods [e.g. P., St. Heli et al. Journal of Biological Chemistry, Volume 260, Nos. 1821-1825 (1985)). Regarding immunoaffinity chromatography Mx was purified by the method described below. Biological studies of murine and human) Mx proteins in cell-free systems and tissue culture To assess activity, the following methods were used: (i) microinjection into cells and testing of viral resistance such as; (ii) testing for influenza virus replication; Use of cell-free systems [e.g. Frug et al., Pyrology, Vol. 56, No. 201] -206 (1985)) (This indicates that Mx regulates influenza virus RNA synthesis. (It appears to work by inhibiting this activity and can be analyzed for this activity.) (iii) Introduction of Mx into cells using Mx-loaded platelets and Cell fusion or Mx-producing fusion of E. coli and L cells, or Mx-enriched Fusion of liposomes with murine L929 cells or murine L9 by Mx solution 29 cells and influenza virus resistance as described above. analysis. To evaluate the biological activity of Mx protein in animals, Mx-murine and human Alternatively, murine protein solution or liposome-containing Mx was injected intravenously. influenza After infection with the virus, surviving mice were counted. The present invention has been described above with reference to a number of specific examples, but the specific examples described herein may be modified. It is clear that the present invention may provide other embodiments of using the methods and compositions of the present invention. Therefore, the scope of the present invention is limited only to the specific examples described above by way of example. It is understood that there is no such thing. FIG.1 Mu 3kb TCTTCTC;AATCAAACCCrC;Ding TATATCCAAACTCG entry TCCTCCTGGλ input AC input TACλAλGATC; input GTTCTTAAC AACGTC entry GAAGG AAAG entry GCTGATTTrCrrCλTCC person C TC input CTCC; ATACCAA GT790 B10 230 8go 870 c190 910 9ko0 950 121. 0 1230 1250 1270 1290 1:ll. 13 pieces 0 1 piece 50 1370 1450 1470 14ri0 1810 18:10 1850 1E170 1890 1910 2290 2310 23ko0 TACA rrrr dingrrTτGCAAAAAATrTTAAC entered AGGATrC CACCTCTCrTTrAC; CCCACCACCCATCAGAGGTAG TGGAAC; ACAAAAACTTATTA GCCTATCC; A C0AA G　CCACCTGTrCA　CC■lT ACTTCTTTGCG(, CCGAC; CTCAGTCTTCCTTGC, C ACCAGTTC, 1CTCCCA”fAACAAAACACbA 2650 2670 2ra90 2710 27ko0 2750 AGCTATAGTCCAGTCCTTrCCACAGGCAGAAAACTAA GAATGAATCAGC entered CCTGAACTTCAAC;C;AACCTCA CAAGτAC;TrCTrACGτcAcx entry TσTCGCTC;T to person A CCACAAeGACAGACCAAACCAAGCCAA(,CCTCCC; TrGCrCATCTCCCACTCτrrc'rc input C; GTCATATs ko010 3030 3050 ATACTCCTTCATCATGCGTCCTTTrCATGTATTTGC AATC;TCATATCAAAGCATCCTrTC3070, 309031 10 AGCTGTGTCTGCTrCAGCCAACATTCTrTCATCTC TrTcCTTCAGC personACAC8τCATTTC3130 3150 3 170 ACCTCTGTACCCCACCAAA- to CATCATrT ATATAA CTAjtσITTCCA input αsiGAσ■χ;AAGTA (Ala) = 3 4 (5,43<) C (Cys) a 11 (1,758+D TAspl g 3 days (6,5k) E (Glul -59 (9,35g)'r (P ha) a 24 +3. 8X) G (Gly) -30(4,75X)H( His) = 7 (1,1811 (Ile) -44 (7,0klK ILy s) -54 (Ei, :5k) L (Leul = 68 +10. 8k1M (Metl-13 (2,05kl N +Asn1-2513. 95)P (Prol x21 (3,35″4) O(Gln)-38+6. OS+1 RIArgl = 36 (5,7U S +5erl = 40 +5. 35 X1 block (Thrl -31+4. 9XI V (Val+ = 40 (E, 35J'fJ (Trp) = 3 + 0. 5ri I Y (ding yrl = 15 12. 4kl amino acid 12J 2N MDSVNNL dispute C’RHY E E K V RF Cr DLZI)TL RALGVEODLALPAIAvlGDO5s(iKss ν+LEA[,S G VALPRGSGIVTRCPLVLKLRKLKEGEEWRGKVS YDDI Σ ν ELSDPSEI/EEAINXGQNFIAGVGL G l5DKL15LDV6’hPNVPDLTLIDLPG engineering TRVAVG NQPAD　工GRQrKRLIKTYIQKQET! NLV, VVPSNVD I enter TEALSMAOεVDPEGDRTIGVLTKPD[,VDR GAEGKVLDVMRNLVYPLKKGYM I VKCRGOQDIOE QLSLTEAFOKEOVFFKDH5Yr S I LLEDGKATVP CLAERL T EELT S HlC S L P L E D O X N Ei S HQ S A SEELQKYGADIPEDDRTRM S FLVNKISAFNRNIMNL Engineering QAQETVS 3 GDSR [ , F’TKLRN 3 FLAWDDHI z E yr K x D sp= ν OS KMKEFENQYRGRELPGFVDY to AFE S I I K K F2 V K A L E E 5 A v N HL RRV TKMVQT enters FVKIL'ENDFGDFLNLCCTAKSKI 2 rRLNOEK E A’E N L I RL Hr OM E OI ν　Y　CQDOVYKET(、KTrREKEAEKEK ding KALrNPA TFONNSQFPOKGLTTTEMTQHLKAYYQE(RRNIGRQ IPLIrQYFILK Ding FGEEI EKM A LQLLQDTSKC 5WFLE2 O6D T REKKKFLKRRLLRLDEARQKL ^ 　F　SD　D FIG, 2D 9 pnl QSall 9 0 (71II middle Sal lQ Bam D I [;] Eco old 7 Pvull medium Pst lFIG, 5 FIG. 6A FIG, 6B FIG, 6C FIG, 6D Procedural amendment written down May 18, 1986 Commissioner of the Patent Office Kuro 1) Akio 1.Display of the incident PCT/US 86101818 2. Name of the invention 3. Person who makes corrections Relationship to the incident: Patent applicant Address: Cami, San Diego, California 92122, United States No Hyata 78585,? ! positive object (1) Translation of the description and claims 6, contents of amendments C Seki T noodles existence country notification 1merMl<Pal^l1obc+honlio, PCT/us10uq+ a

Claims

[Claims] 1. It encodes an interferon-induced protein that can protect animals against viral infections. Animals against viral infections are characterized by inserting a gene into the animal that carries the virus. Protection method. 2. If the viral infection is caused by the influenza virus and the genetic 2. The method according to claim 1, wherein said protein encodes an Mx protein. 3. The claimed gene is operably linked to an expression control sequence in the recombinant DNA molecule. 4. The method described in Scope 1 or 2. Coating interferon-induced proteins A host transformed with a recombinant DNA molecule containing a gene that encodes the host. 5. The host is an animal cell that is susceptible to viral infection in its natural state. interferon, and the recombinant DNA molecule can protect cells against viral infection. 5. The host according to claim 4, which contains a gene encoding the induced protein. 6. The viral infection is influenza and the gene encodes the Mx protein The host according to claim 5, which is a gene. 7. The claimed gene is operably linked to an expression control sequence in the recombinant DNA molecule. The host according to any one of Range 4 to 6. 8. formula: [There is an array] A DNA sequence having 9. (a) DNA sequence according to claim 8, (b) DNA sequence according to claim 8 A DNA sequence that hybridizes to a DNA sequence and upon expression encodes an Mx protein. ,and (c) degenerates to said DNA sequence as a result of the genetic code and upon expression Mx A recombinant D comprising a DNA sequence selected from the group consisting of protein-encoding DNA sequences. NA molecule. 10. the DNA sequence is operably linked to an expression control sequence in the recombinant DNA molecule A recombinant DNA molecule according to claim 9. 11. (a) a constitutive promoter; (b) natural interferon-dependent promoter, (c) interferon-dependent However, hives that show greater expression than the native interferon-dependent promoter lid promoter, and (d) selected from the group consisting of promoters dependent on substances other than interferon; 10. A recombinant DNA molecule according to claim 9, comprising a promoter. 12. (a) Amino acid sequence: [There is an array] a first polypeptide consisting of, and (b) comprising at least one fragment of said first polypeptide, a second polypeptide having a protective effect in animals against A polypeptide selected from the group consisting of. 13. (a) Can be immunoprecipitated with monoclonal antibody 2C12 and human terminal Interferon-α in peripheral blood lymphocytes, human fetal lung cells, and human fibroblasts Alternatively, it can be induced by inkferon-β, but not by interferon-γ. a protein having a molecular weight of about 80,000 daltons that cannot be emitted; and (b) consisting of at least one fragment of said protein, which is effective against influenza in animals; A polypeptide selected from the group consisting of polypeptides having a protective effect. 14. An antivirally effective amount of the polypeptide according to claim 12 or 13. 1. An antiviral pharmaceutical composition comprising Cide and a pharmaceutically acceptable carrier. 15. An antivirally effective amount of the polypeptide according to claim 12 or 13. Administering Tide to animals susceptible to infection. A method of treating or preventing viral infection.