JPS63500515A - 高分子支持体とハプテンとムラミルペプチドとをこのムラミルペプチドの糖質部分で置換する基を介して互いに結合させることにより得られる生成物、及び該生成物を含む選択的免疫原性組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は高分子からなる支持体とハプテンとムラミルペプチドとを、このムラミ ルペプチドの糖望部分で置換する基を介して互いに結合することにより得られる 生成物に係わる。これらの生成物はその構造に含まれるハプテン部分の選択的免 疫原性を有する。本発明はより特定的には、前述の如き生成物を製薬上許容し得 るベヒクルと組合わせて含む免疫原性組成物にも係わる。これらの組成物はハプ テンと共通の抗原部位又はエピトープを有する抗原に対する予防接種に使用でき る。

周知のように合成ペプチド、一般的には分子量の小さい成る種のハプテンが、宿 主をハプテンあるいはより一般的に言えば病原性抗原から保護することのできる ワクチンの有効成分を構成するものとして注目されている二これらのハプテンは 宿主生物の体内にある時には免疫原能力を余り示さない。この種のハプテンの免 疫原性を付与もしくは強化する方法、又は弱い抗原の免疫原性を強化する方法は これまでにも多数提案されてきた。

この場合の弱い抗原は、生来の性質として弱いもの、あるいは免疫原能力が特に ｆｉｌに必要な操作の間に失われたような純度の高い抗原、あるいはこれらの抗 原から誘導され、前記抗原の特徴をなす抗原部位を保持するサブユニットである 。

以下の説明では「ハプテン」という用語を便宜上広い意味で使用することにする 。即ち「ハブテ、ン」は例えばｓ、ｏｏｏ以下の分子量を持つ所謂ハプテンを意 味するだけでなく、前述の弱い抗原も意味するものとする強い免疫原性をもたら すためにこれまでに考えられた方法の１つは、前記ハプテンを分子量の大きい高 分子支持体に固定（接合又は共有結合）することからなる。

このようにして得られる接合又は結合生成物は実際、当該結合生成物中に存在す るハプテンに対する抗体、さらにはこのハプテンと共通の抗原部位又はエピトー プを有し且つ分子量がより大きいような抗原に対する抗体の効果的な産生をｉｎ 　ｖｉｖｏで誘導し得る強い免疫原性をしばしば示す。

生体中で使用し得る高分子支持体が既に多数提案されているが、上記のように製 造される結合体は大きな欠点を有する。即ち、このような結合体はｉｎ　ｖｉｖ ｏでハプテンに対する免疫反応を誘導するだけでなく、高分子支持体自体に対し ての反応も誘り得る。このような事態は特に、高分子支持体が破傷風アナトキシ ンである場合に見られる。破傷風アナトキシンは、このアナトキシンにハプテン が結合されている場合、その免疫原反応に関して大きな増幅効果を示すことが知 られている。また、動物実験の結果、動物を予め成る高分子支持体に対して免疫 処理した動物に、この高分子支持体に結合したハプテンに対する免疫操作を行う と、このハプテンに対する生物の免疫応答能力は増加されず、抑制さえされ得る ことが判明した。従って、被験はできない。これは特に所定ハプテンと破傷風ア ナトキシンとの結合の結果得られる生成物について言える問題である。何故なら 、破傷風アナトキシンは人口の多くに施される破傷風の予防接種に使用されるか らである。この問題は、保護が所望される病原性物質の特異的エピトープを有す るハプテンと、分子量の大きい高分子からなる支持体との結合の結果得られる有 効成分の予防接種への使用を実用化することがこれまで真剣に期持されなかった 理由の１つである。これは研究者達が、予防接種の有効成分として使用できるよ うな程度にこれらハプテンが免疫活性を示すようにするかあるいはその程度まで 増加させる別の方法の探求に向わせた理由でもある。ここで認識しておかなけれ ばならないのは、肯定的な結°果が得られたとしても、問題の免疫原性の所望の 増幅能力が必ず得られるとは限らないという事実である。最も好ましい結果が得 られた場合でさえも、前記増幅はハプテンと分子量の大きい高分子支持体、例え ば破傷風アナトキシン又はジフテリアアナトキシンｌとの間の結合体で既に観察 できた程度でしかない。

本発明の目的は、ハプテンと前述の如き高分子支持体とを用いた結合生成物の使 用に伴い得る諸問題を少なくとも大幅に軽減することにある。本発明はより特定 的には、これらの結合生成物がハプテンの特徴的免疫原効果を有しながらも高分 子支持体に対してはこの効果を殆ど示さないようにすることを目的とする。換言 すれば本発明の目的は、高分子支持体に対する前記免疫原活性を実質的に示さな いような前述タイプの結合生成物を提供することにある。

本発明の前記目的は、選択した高分子支持体を化学基を介して１つ以上のムラミ ルペプチド基に結合させることによって得られる担体分子を使用すれば実現でき る。前記化学基は結合腕の役割を果たし、ムラミルペプチドのグルフピラノシル 核を好ましくはこの核の６位で置換する。

従って本発明の生成物は、前述−の方法で形成した担体分子と、特に保護が所望 される抗原である分子に含まれる１つ以上のエピトープを担持する１つ以上のハ プテンとの間の結合生成物からなる。

従って本発明の生成物は、共有結合により互いに結合された３つの成分を含み、 これら３成分が高分子支持体、グリコピラノシル核を介して化学基により前記支 持体に結合されたムラミルペプチド、及び所望の免疫活性を付与する少なくとも １つのエピトープを担持する少なくとも１つのハプテンのそれぞれからなること を特徴とすると言える。前記結合腕は必要に応じて結合腕−ムラミルペプチドア センブリに両灯性が与えられるように選択するのが好ましい。

実験の結果、この３成分結合生成物はハプテンの免疫原活性の２倍の増幅をもた らすことが判明した。即ち、周知の免疫アシュバント活性を有するムラミルペプ チドと担体分子のそれぞれにより増幅が誘起されるのである。しかもこの３成分 結合生成物は、高分子支持体又は担体分子に関しては免疫原活性を全くとは言わ ないまでも殆ど示さない。この効果（担体分子又は高分子支持体に固有の免疫原 性の抑制又はマスキング）は、ムラミルペプチドと分子量の大きい高分子支持体 との間に形成されるこれまでに発表された結合生成物が当該結合生成物中にも存 在することのあるハブテンに対してだけでなく、高分子支持体に対しても免疫原 効果を示していたことを考えると、極めて注目すべき効果である。

高分子支持体の所望のように改質するための好ましいムラミルペプチドは下記の 一般式で示される。

式中、 −Ｒ１はＯＨ基、０−Ｃｅ　Ｈａ−Ｎ）！２基又は０−（ＣＨ２＞　−Ｒ基であ って、−は１〜１０までの整数で■　ａ あり、Ｒａはアミン基、カルボキシル基、チオール基、ヒドロキシル基又は水素 のいずれかであり、 −八は酸素又はＮＨ基であり、　− −ＲｓＬｔＢ−Ｒ基又はｃｏ−Ｂ−Ｒ基テアＯＴ、Ｂは炭素原子を約１００個ま で含み得る基又は直鎖もしくは分枝鎖であり、Ｒはヒドロキシル、カルボキシル 、アミン、チオール又は水素であり、基ＢはＲとして上記したタイプの壮＝≠＃ 璋官能基、又、はカルボニル、アルコキシルもしくはアシルの辷壬会九を任意に 担持するものであり、 −Ｒ２は水素又は１〜４個の炭素原子を含むアルキル基、特にメチルを表わし、 −Ｘはアラニル残基、アルギニル残基、リシル残基、アスパラギル残基、アスパ ルチル残基、システイニル残基、グルタミニル残基、グルタミル残基、グリシル 残基、ヒスチジル残基。

ヒドロキシプロリル残基、イソロイシル残基、ロイシル残基。

メチオニル残基、フェニルアラニル残塁、プロリル残基、セリル残基、スレオニ ル残基、トリプトファニル残基、又はバリル残基を表わし、 −ＹはＯＨ基、　Ｎ＋−１２基、又は好ましくはＯＲ？又はＮＨＲ７を表わし、 Ｒ７は１〜２０個の炭素原子を含み得る炭化水素基であるか、又はＸとして上記 したようなアミノ酸、例えばアラニル、セリル、バリル又はグリシルであり得、 このアミノ酸は遊離アミノ酸、アミド化アミノ酸又はエステル化アミノ酸であり 、エステル化基は炭素原子を１〜４個含み得るものであり、 −２は１〜１０個の炭素原子を含むカルボキシル基、カルボキサミド基、エステ ル、又は１〜４個の炭素原子を含むアルキル基、好ましくは一〇Ｈ２−ＣＨ３も しくは−（ＣＨ２）２−ＣＨ３を表わす。勿論、基Ｒ１及びＲ６のうち少なくと も一方（好ましくはＲｅ）は、別の分子、特に高分子支持体に担持された相補反 応基との結合を可能にする反応基を有する。

本発明の３成分結合体では、ムラミルペプチド及びハブテンが、高分子支持体上 に最初から存在するが又は該支持体に担持された複数の別個の官能基を介して高 分子支持体に結合されることが好ましい。

従うて前述の如く形成される「３成分結合体（ｃｏｎｊｕｇｕｅｓｔｒｉｐｌｅ ｓ）Ｊは、想到し得る他の結合体に対してより好ましいものとして下記の一般式 で示すことができよう。

式中Ｘ及びｙは同一の高分子支持体に固定されたハプテン基及びムラミルペプチ ド基の夫々の個数を表わすが、この場合ｘ＋ｙの合計値は分子量の大きい高分子 支持体に当初から担持されている官能基の合計数より大きくはなり得ない。分子 量の大きい高分子支持体については後で具体例を挙げる。ｘ＋ｙ合計値は例えば ２〜４００である。

但し、想到し得る別タイプの結合体も本発明の範囲内に含まれる。例えば高分子 支持体に固定されたムラミルペプチド基が更に適当な遊離官能基を担持している 場合には、この官能基もハプテンとの結合操作で使用することが考えられ得る。

但し、本発明の好ましい結合体はムラミルペプチドとハプテンが互いに別々に高 分子支持体に移植されているような結合体である。

本発明の「３成分結合体」に使用される好ましいムラミルペプチド類の１つは次 式で示される。

ＣＳ、−Ｚ 式中、 −Ｒ１は一〇Ｈ又は−〇−Ｏｓ　Ｈ４−ＮＨ２又は０−　（ｌｃＨ２）　−Ｒ， であり、腸は１〜１０の整数、Ｒ８はア■ ミン基、カルボキシル基、チオール基、ヒドロキシル基又は水素を表わし、 −Ｒ２は−Ｈ又は−ＣＨ３であり、 −Ｒｅは一〇〇　（ＣＨ２）　。−Ｒｔ’あっＴｎは１〜１０の整数、Ｒはアミ ン基、カルボキシル基、チオール基、ヒドロキシル基又は水素を表わし、 −ＸはＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ又はｖａｔｒあり、Ｙ　Ｌｔ　Ｏ（ＣＨ２）　ｐ 　Ｈであってｐは１〜１０の整数であり、−ＺはＧｏ−ＮＨ２、Ｃｏｏ　（ＣＨ ２）、−Ｈ又は（ＣＨ２）　ｒ　−ＣＨａであって、「は１〜４の整数を表わす 。

好ましくは、基Ｘの構造に含まれるアミノ酸残塁が左施性である（×がグリシル 残基からなる場合は除く）。

２−（２−７セトアミドー２−デオキシ−３−０−Ｄ−グルコピラノシル）−ア ルカノイル−ペプチドのタイプの誘導体に相当するムラミルペプチドは十分によ く知られているため、その製法め説明は不要であろう。

但し、前述した好ましいムラミルペプチドに属する基の意味の説明から明らかな ように、ムラミルペプチドという用語は２−（２−アセトアミド−２−デオキシ −３−０−Ｄ−グルコピラノシル）−アルカノイル−アミノアシル−ｎＯｒロイ シンのタイプのムラミルペプチド、又はこのムラミルペプチドの誘導体をも意味 すると理解されたい。

この種の化合物は２−（２−アセトアミド−２−デオキシ−３−０−Ｄ−グルコ ピラノシル）−アルカノイル−ペプチドのタイプの公知誘導体の製造に使用し得 る方法と全く同様の方法によって製造でき、より特定的には１９８５年４月３０ 日出願の低回特許出願第８５−０６５９６号に記載されている。この低回特許出 願の内容は、これらの化合物の好ましい製法の詳細説明に関して、本明細書の一 部分もなすと理解されたい。

最後に述べたタイプの好ましい化合物に属するムラミルペプチドは、ＹがＯＲ７ 基又はＮＨＲ７基であり、Ｒ７が前述の意味を有し、且つ下記の基 が布施性ｎｏｒロイシン基の誘導体、より特定的にはＤ−ｎｏｒロイシン基の誘 導体であってＺが−ＣＨ２−ＣＨ３を表わすようなムラミルペプチドである。

また使用するムラミルペプチドのタイプに拘らず、即ち基がグルタミン酸誘導体 であるようなムラミルペプチドを用いるにしても、又は前記基がｎｏｒロイシン もしくはその同族体の誘導体であるようなムラミルペプチドを用いるにしても、 結合体を製造する上で特に有利な別タイプの化合物は、Ａが酸素でありＲ６が一 〇〇−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ基、例えばスクシニル基−Ｇｏ−（ＣＨ２）２− Ｇｏｏｆ−１であるか、又は−Ｃｏ−（ＣＨ２）　ｎ−Ｎ８２基、例えばニブシ ロン−アミノ−カブロイル基−Ｇｏ　−（ＣＨ２）　８−ＮＨ２（７）ような、 ｎが１〜１０の整数であるような化合物である。

本発明の他の好ましい化合物では基Ｒｅが単独で又は前述の基と組合わせられた 状態で直鎖又は分岐鎖を含み、これらの場合結合部は炭化水素鎖からなり、これ ら炭化水素鎖の炭素原子の幾つかが必要に応じて所々で窒素原子及び／又は酸素 原子により置換され、その結果特にエステル、エーテル、アミド、イミノ、イミ ド等の官能基が形成される。

基、特に例えばリシル又はアラニルのタイプのアミノアシル残塁を１〜３個連続 的に含む鎖環（上記のタイプのアミノアシルに代えて、基ｘＢ、：関する説明で 述べたタイプの他の任意のアミノアシルも使用し得る）、又はグリセリル−〇− ＣＨ２−ＣＨ（０）−ＣＨ２−０−もシ＜　ハク’）　ｍｌ　ＩＪ　）Ｌｔ　− ０−ＣＨ２−ＣＨ２−０−１又はグリセロールもしくはグリコールの誘導体、グ リセリン酸もしくはグリコール酸、例えばグリセリルもしくはグリコリルと７ミ ノシルとを組合わせたものが挙げられる。

別の好ましい！！Ｂは分校を有する前述の如き鎖、例えば特に炭素原子を１４〜 ３０個含む脂肪酸のアシル化基、例えばバルミトイル基で構成される。

従って、好ましい基Ｂはとくに次式 ％式％（９） 〔式中Ｒ８及びＲ９は炭素原子を１４〜３０、特に１６〜２４個含むアシル基で ある〕 で示される末端構成要素を有するものである。

−６−〇−ニブシロンーアミノカブロイル−ＭｕｒＮＡＣ−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−Ｇ ｌｎ−Ｏｎ３ｕ　； −６−０−１ブシロン一アミノ力ブロイルーＭｕｒＮＡｃ−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−Ｎ ｌｅ−Ｑｎ［３ｕ　ニー６−〇−スクシニルーＭｕ　ｒＮＡｃ−Ｌ−Ａ　Ｉ　ａ −Ｄ　−Ｇｌｎ−ＯｎＢｕ　ニ ー６−０−スクシニル−Ｍｕ　ｒＮＡＣ−Ｌ−Ａ　Ｉ　ａ−Ｄ−Ｎｌｅ−ＯｎＢ ｕ　： で示すことのできるもの、又はｎ−ブチルエステル基（ＯｎＢｕ）に代えてメチ ルエステルＩ（ＯＭｅ）を含む同様の誘導体が挙げられる。

本発明の「３成分結合体」に使用し得る好ましい高分子支持体としては、ヒト血 清アルブミン、アナトキシン又はその他の分子量が少なくともｓｏ、　ｏｏｏ、 例えば５０．０００〜２５０，０００ダルトンだ、ポリリシンタイプか又は欧州 特許第１３，６５１号に記載のタイプの合成ペプチドポリマーも使用できる。

一般的には、本発明で使用する特定ムラミルペプチド及び／又は免疫原性の誘発 が必要なハブテンへの共有結合による結合を可能にする側方官能基を多数含む配 列からなるペプチド鎖で構成された高分子支持体が好ましい。この点では特に破 傷風毒素及びジフテリア毒素が好ましい。例えば破傷風毒素は約１６０．０００ の分子量を有し、十分な数のハブテン基及びムラミルペプチド基を固定させるこ とのできる約５０の３１１１末端Ｎ８２基を有する。これらの毒素は前記ムラミ ルペプチド及び／又はハブテンの固定後に例えばホルムアルデヒドを用いる従来 の処理法によって容易に解毒することができる。

これら結合体の製造条件及び（必要であれば）毒素の解岳法については、特にＰ ｌａｓｍｏｄｉｕｗにｎｏｗｌｅｓｉスポロゾイトの表面タンパク質の表面エレ メントを含むペプチド及び６−〇−エブシＯンーアミノ力プロイルーＭｕ　ｒＮ Ａｃ−Ｌ−Ａ　ｌ　ａ−Ｄ−Ｇｌｎ−ＯｎＢｕの破傷風毒素への固定に関連して 後で説明する。

本発明は更に、その免疫原性を増幅させる分子に結合させるという条件で、ｉｎ 　ｖｉｖｏでの抗体の誘導に使用し得る「抗原部位」を少なくとも１つ有する任 意のハブテンを用いる「３成分結合体」の製造にも係わる。

「少なくとも１つの抗原部位を有する基」とは、それに対する抗体のｉｎ　ｖｉ ｖｏ産生が所望のものである、抗原に含まれる全ての基、又はこれらの基と免疫 原的に等価である総ての基を意味する。本特許請求の範囲内で考えられ得るハブ テンとしては、例えばビＡｇｅｎｃｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　ｄｅ　Ｖａｌｏｒｉ ｓａｔｉｏｎ　ｄｅ　ｌａ　Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ（ＡＮＶＡＲ）により出願され た欧州特許出願筒８９，２９０号に記載の定義に適合するものが挙げられる。従 って、本発明に係わるハブテンは、これらハブテンが増幅分子に結合された時に 、所定病原体に対する保護作用を持つ抗体をｉｎ　ｖｉｖｏで誘導する能力をこ れらハブテンに付与することになる抗原部位を有するようなハブテンだけではな い。本発明は更に、欧州特許出願筒８９．２９０号に記載の如き他のハブテン、 例えばホルモンを使用する３成分結合体の製造にも係わる。

本発明の「３成分結合体」の構造に含まれ得るハブテンの非限定的具体例として は、ＬＨ−ＲＨという呼称で知られているルテオトロピンの遊離因子、ペプチド フラグメント又は類似の性質を付与された合成ペプチド、例えば−Ｇ　ｌ　ｕ− Ｈｔ　５−Ｔｒ　ｐ−８ｅ　ｒ−Ｔｙｒ−Ｇ　Ｉ　Ｖ−Ｌｅｕ−ＡｒＧ−Ｐｒｏ −Ｇ　Ｉ　Ｖ−Ｎ８２タイプのデカペプチド、或いはその対応遊ｗｉ１ｍ＋）Ｇ ｌｕ−ＨｉｓＪｒｐ−８ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ− Ｇ　ｌ　ｙ。

−ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（１−１０Ｇ）のＣ末端ペプチド、−ＨＣＧのサ ブユニットβのＣ末端ペプチド、特にＨＣＧ−βのアミノアシル残基もしくはＳ 、ＨａｔＳｕｒａ他により開示された（前述の発行物）タイプの合成誘導体末端 のアミノアシル残基に対応するアミノアシル残基を含むトリアコンタペプチド、 ＦＳ）−１等の７ラグメント、又はＡｒｔｈｕｒ、　Ｃ，Ｊ、　（Ｌｅｅ他、” Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｉｍｉｕｎｏｌｏｇｙ″、第１１巻、７４９〜７５６ペー ジ）により記載されているＨＣＧ−βのＣ末端サブユニットの配列１０９−１４ ５及び１１１−１４５で主に構成されるペプチド。

前述のホルモンと既述した如き他の２つの成分とを結合させると、当該天然ホル モンに対する抗体をｉｎ　ｖｉｖｏで極めて効果的に産生せしめる免疫成分が得 られる。

本発明の３成分結合体に使用し得るハブテンとしては、更に抗原ＨＢＳＡＱを構 成するペプチド成分と共通のアミノアシル残基配列を有する種々の合成ペプチド 、特に末端アミノアシルが、ＨＢＳＡＱ配列で下記の部位、 ４８−８１．２−１６．　２２−３５．９５−１００．　１１７−１３７．　１ ２２−１３７゜ｔ１７−１３５　（Ｐａ５ｅｋ他による構造に従い且ッＰｒｏｃ 、　Ｗａｔｔ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７８．　Ｎｏ６．３４０３〜３４０７に記載のＬｅｒｎｅ ｒ他の方法（１９８１年）により再現した）を占めるアミノアシルに対応するよ うなペプチドが挙げられる。また、ジフテリア毒素、感冒ウィルス、ヘルペスウ ィルス、灰白髄炎ウィルス等の特異的抗原部位を有するワクチン用ペプチドも適 切なハブテンとして挙げられる。

その他に、Ｅ、Ｈ，５ｅａｃｈｅｙ等により開示されているタイプの合成ペプチ ドも挙げられる。この種の合成ペプチドはムラミルペプチドと結合すると化膿性 連鎖状球菌の表面のＭタンパク質に対して活性を示す抗体を形成し得る。前記タ ンパク質は後述の実施例■で略号ｒＭ２４Ｊで示されている。更に、米国特許第 ４．２８４，５３７号に記載ペプチド配列、より特定的には略号Ｃ’Ｂ　ｅ及び Ｃ８４で示されているペプチドも挙げられる。

特に好ましいペプチドハブテンは下記のハブテンの１つ又は複数からなる。

使用したパブテンは次の通りである。

−Ｖａ　１−ＡｒＱ−ＡｒＱ−８ｅ　ｒ−Ｖａ　ｌ　−Ｇ　ｌ　ｙ−ｓｅｒ−８ ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｃｙｓ で示される「ジフテリア環」の配列を含むオクトデカペプチド。

２）ＳＣＢ７：下記の配列 Ａｓｎ−Ｐｈｅ−８ｅｒ−Ｔｈｒ−Ａ　ｌ　ａ−Ａｓｐ−８ｅｒ−Ａ　ｌ　ａ− Ｌ　ｙｓ　−Ｉ　ｌ　ｅ−Ｌ　ｙｓ−Ｔｈ　ｒ−Ｌｅｕ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ａ　Ｉ　 ａ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｌｙｓ−Ａ　ｌ　ａ−Ａ　ｌ　ａ−Ｌ　ｅｕ−Ａ　Ｉ　ａ−Ａ 　ｌ　ａ−Ａｒｏ−Ｌｙｓ−Ａ　ｌ　ａ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉ　ｕ−Ｌｙｓ −Ａ　Ｉ　ａ−Ｌｅｕ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｇ　！　Ｖ−Ａ　ｔ　ａ。

を含むＭ２４タイプ連鎖状球菌の特異的エピトープを含むベプチ３）ＨＢｓ（ペ プチド９９−１２１）　：下記の配列Ａｓｐ−ｔｙｒ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｇ　ｌ　ｙ −Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｒ。

０Ｏ −Ｖａ　Ｉ−Ｃｙ９−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｇ　ｌ　ｙ１Ｏ −８ｅ　ｒ−８ｅ　ｒ−Ｔｈ　ｒ−Ｔｈ　ｒ−８ｅ　ｒ−Ｔｈ　ｒ−Ｇ　Ｉ　ｙ を含むウィルスのエンベロープの抗原部位を含むペプチド。

４）ＤＤＰ　Ｍａｔ：　サルのマラリア病原体たるＰｌａｓｗｏｄｉｕｍにｏｗ ｌｅｓｉに対する保護作用をもつ抗原の特異的エピトープを有するペプチド。こ れはＧｏｄｓｏｎ　Ｇ、　Ｈ，他によりＮａｔｕｒｅ、　３０５　（２９−３３ ）　（１９８３年）に記載されており、下記の配列で構成される。

ＴＶヒーＧ　Ｉ　ｎ−Ａ　Ｉ　ａ−Ｇ　Ｉ　ｎ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ａｓ　ｐ−Ｇ　ｌ 　ｙ−Ａ　Ｉ　ａ−Ａｓｎ−Ａ　Ｉ　ａ−Ｇ　Ｉ　Ｖ−Ｇ　Ｉ　ｎ−Ｐｒｏ−Ｇ 　Ｉ　ｎ−Ａ　ｌ　ａ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｇ　Ｉ　ｙ−Ａｓ　ｐ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ａ　 Ｉ　ａ−Ａｓ　ｎ−Ａ　ｌ　ａ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｇ　Ｉ　ｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ。

Ｅｎｅａ他（５ｃｉｅｎｃｅ、　１９８４年、２２５．　６２８）又はＤａＩｅ 他（Ｓｃｉｅｎｃｅ、　１９８４年、２２５．　５９３）により記載されＴいる ヒト寄生虫Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの構造の１つのエレメ ントをコピーするペプチドも使用することができる。これは（Ａｓｎ−Ａ　Ｉ　 ａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ）　ｎ　Ｃ式中ｎは２〜８〕タイプのテトラペプチドである 。

これらの具体例は勿論限定的なものではない。また、使用し得るハブテンはペプ チドには限定されず、例えば糖質又は配糖体ハブテンであってもよい。−例とし て血液型Ａ及びＢ、連鎖球菌ＣのポリサッカライドＣ，Ｈ，Ｆ、　Ｇｏｅｂｅｌ によりＪ、　Ｅｘｐ。

Ｍｅｄｉｃｉｎｅ”　１９３９年、３５３〜３６３ページに記載されているよう なセロビラロン酸（ａｃｉｄ　ｃｅｌｌｏｂｉｕｎｏｎｉｑｕｅ、　Ｐｎｅｕｍ ｏ　ｔｙｐｅ　ｍ　）、又はパラアミノフェニルセロビウＯン酸が挙げられる。

ｎべ 使用し得るハブテンはまた、「ポリワクチン」を得るＭ適した互に異なる複数の 抗原部位を有する合成又は半合成ポリペプチドであってもよい。このようなポリ ワクチンは１９８４年９月１２日出願の低回特許出願第８４．１３９８９号に開 示されている。

ここで高分子支持体とムラミルペプチド及びハブテンとの結合体を形成するため の好ましい方法を数例説明する。

第１の方法では、高分子支持体、ハブテン及びムラミルペプチドがいずれもアミ ン基を有していれば、グルタルアルデヒドを介する結合反応を使用し得る。

高分子支持体とムラミルペプチドとの間の結合に関しては、ムラミルペプチドの グルコピラノシル環上の所定位置での任意の結合形態を使用し得る。この種の結 合は特に、ムラミルペプチドのグルコピラノシル環の０１位、好ましくは０６位 のレベルに生起することになる。

基Ｒ６を用いる！換に関しては、ムラミルペプチドに胆持された適切な官能基と 高分子支持体に担持された適切な官能基、例えばムラミルペプチド及び高分子支 持体のうちいずれが一方に担持されたアミン基と、他方に担持されたカルボキシ ル基。

ヒドロキシル基又はスルフヒドリル基との間のペプチド合成で通常使用される結 合法を使用し得る。

勿論、例えば■、にｉｔａｇａｗａ及びＴ、　Ａ　＋　ｋａｇａｗａにより”Ｊ 、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　”叩（１９７６年）、　２３３に記載されているような 技術を用いて、高分子支持体及びムラミルペプチドのいずれが一方に担持された スルフヒドリル基と他方の反応体に担持されたマレイミド基との間に存在し得る 組合わせを用いる他の任意の結合法を利用することもできる。

結合は従来のジアゾ化法又はイソチオシア本−トを用いる反応性を用いて生起さ せ得る。これは特に、ムラミルペプチドがアミン化芳香族基を（特に基Ｒ１のレ ベルに）有し、且つ高分子支持体が前記反応に使用され得るアミン基を有する場 合に適している。この種の技術は例えばＢ、　Ｆ、　Ｅｒｌａｎｇｅｒにより” Ｐｈａｒｓａｃｏｌ、Ｒｅｖ、”、　２５　（１９７３年）　、２７１に記載さ れている。

結合はまた、前記２つの反応体の一方に担持されたアルデヒド基と他方に担持さ れたアミン基との間に形成されるシッフ塩基を還元することによって生起させる こともできる（Ｇ、　Ｒ，Ｇｒａｙ。

”Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｈｐｙｓ、”　１６３　（１９７４年）、 ４２６参照）。

これらの反応はそれ自体良く知られており、当業者は明らかなように同一の結果 を得るのに様々な変形が可能である。また、より特定的に、ムラミルペプチドの 基Ｒ１を使用する共有結合に関しては、架橋によって結合を生起させ得る。架橋 剤には例えば三官能試薬を用いる。最終結合体のムラミルペプチドと高分子支持 体との間の架ｉ基は、ｐ−デシル炭化水素鎖の長さに相当する鎖長ｌを越えない ことが好ましい。

このような架橋剤は例えば１９７８年６月５日に出願された特許第７８．１６７ ９２号に記載されている。

これまでの説明では特に、選択したムラミルペプチドと画分ハプテンを高分子支 持体又は担体分子に結合させる場合にも勿論同様の方法を使用し得る。

勿論、前述の反応はいずれも、当該結合反応に関与してはならない活性官能基が 結合体構成パートナ−に担持されている場合には、これを必要に応じて保護する ことを前提とする。これは当業者に良く知られている問題であるため、ここでは 詳述しない。

ハプテン及びムラミルペプチドを別々に高分子支持体に結合する場合には、ハプ テンとムラミルペプチドの相対比を当該高分子支持体上に存在し得る遊離官能基 の個数に応じて調整する。

後述の実験及び実施例から明らかなように、高分子支持体は当該タイプのムラミ ルペプチド基で飽和させる必要はない。実際、高分子支持体自体の免疫原反応の マスキング又は抑ＩＩＩは急速に失われることが知見される。これに対し通常は 、高分子支持体又は鎖にできるだけ多くのハプテン基を固定させて、ハプテンに 特異的な最大限の免疫原反応を得るようにすると有利であろう。

有利にはムラミルペプチド基の個数対高分子支持体の鎖数の比（反応に使用され るＮ８２当量で表わされる数の比）を１：１にし、ハプテン基の個数対高分子支 持体の鎖数の比を少なくとも１、好ましくはそれ以上、例えば１〜５にする。

以上、特にバブテン及びムラミルペプチドを別個に高分子支持体に固定させる場 合について説明してきたが、勿論それ以外の組合わせ、例えば既述のように高分 子支持体上にムラミルペプチドをその糖質核の６位で固定し、次いでこのペプチ ド部分の上に、又は好ましくはムラミルペプチドの糖質核の１位にハプテンを固 定するような組合わせも考えられる。また、先ずハプテンをムラミルペプチドの 特に糖質環の１位に固定し、その後このように修飾したムラミルペプチドのグル コピラノシル環の６位を介して前記ハプテン／ムラミルペプチドアセンブリを高 分子支持体に固定することもできる。

本発明の他の特徴は以下の実施例の説明から明らかにされよう。先ず最初は６− ０−ニブシロン−アミノカブロイル−Ｍｕ　ｒＮＡｃ−Ｌ−Ａ　［ａ−Ｄ−Ｇ　 ｌ　ｎ−０ｎＢｕ　（添付の表では略称ｒＭＤＰ−６−０−（ε−アミノカプロ イル）−ムラブチド」で表示）を用いる本発明の３成分結合体の製造の特定実施 例を説明する。次いで、得られた３成分結合体に関して観察された生物学的性質 を説明する。また、比較の目的で本発明で使用されるムラミルペプチドの範躊に は入らないムラミルペプチド、この場合はＮ−アセチル−ムラミル−し−アラニ ル−Ｄ−イソグルタミニルーＬ−リシン（ＭＤＰ−リシン）を用いて得た「３成 分結合体」に関して観察された性質も示した。

■−破傷風毒素上　の結合体の製造 以下の説明は後述の初期成分を種々の特定の割合で用いる結合生成物の製造に係 わる。この方法は勿論異なる割合で初期成分を用いる３成分結合生成物の製造に 同様に使用し得、例えば後述の結合体Ａ−Ｆの製造に使用し得る。

結合用物質としてはグルタルアルデヒドを最終濃度５．２ｓＭで使用する。グル タルアルデヒドは担体分子が未解毒処理毒素であれば、結合機能の他に解毒機能 も果たし、これにより十分なアジュバントムラミルペプチド及び十分な抗原性ペ プチドを結合させるための十分なＮ）−１２％（分子ｆｆｌ　１６０，０００の 分子の場合には約５０個）が得られる（使用する担体分子が非毒性であれば「解 毒」作用は勿論無益である）。

この実施例ではペプチドはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ　Ｋｎｏｗｌｅｓｉスポロシラ イトの表面タンパク質の構造型１イピーである。この構造はＧｏｄｓｏｎ他によ り記述されており（ＮａｔＬＩｒｅ、　１９８３年、３０５．２９）、且つその 免疫原性はｇｙｓｉｎ他により研究されている（Ｊ、　Ｅｘｐ。

Ｈｅｃ、、１９８４年、１６０．９３５）。

反応はｐＨ８，５の炭酸−重炭酸ナトリウム０．１Ｍ　！１　！ｉ液液中生起さ せる。破傷風毒素（２，３５■）、スポロゾイトペプチド（３，７５■）及び６ −０−　（ε−アミノ−カプロイル）−ムラミルペプチド（２１１ｇ）は溶解し 、これにグルタルアルデヒドを撹拌下で加える。反応を１週間持続させ、生成物 を分利り特に商標５ＥＰＨＡＤＥＸ−Ｇ２５で市販されている篩を用いて濾過処 理し、分子！１２０．０００未満の分子に完全に除去する。

ここで使用するペプチドの場合には、破傷風毒素に結合した、ペプチドとムラミ ルペプチドとの間に生じ得る反応は見られない。何故ならこのペプチドはこのｐ Ｈでは反応基を１つしか有さないからである。ペプチドとアジュバントとが結合 したら、この反応の生成物を前記濾過処理によって除去する。形成され得る唯一 の結合体は、ペプチド（ｐｅｐ）及びアジュバントムラミルペプチド（ａｄｊ） が別々に破傷風毒素に結合された（ａｄｊ−支持体−ｐｅｌ））３成分結合体で ある。この方法を複数の官能基を有するペプチドを使用して実施すれば、ペプチ ドを反応媒質に添加する前に、ムラミルペプチドのみ成る程度の時間にわたって 破傷風毒素と反応させることができ、その結果破傷風毒素−アジュバント結合が 高分子支持体に結合されるペプチド−アジュバント結合より促進される。

最終的に得られた結合体を下記のテストにかける。

ａ））ＩＰＬＣ：所望の結合体の分子鎖はモノマーのそれに相当する（　１５０ ，０００〜ｉａｏ、ｏｏｏダルトン）。分子量の大きい生成物が形成された場合 には、これを５ＥＰＨＡＲＯ３Ｅ　６ＢＣＬタイプの架橋アガロース分子篩での ゲル濾過により除去する。

ｂ）結合グリコペプチドの定量：この定量はＲｅ５５１ｇの方法（Ｊ、Ｂｉｏｌ 、ｃｈｅｍ、、　１９５６年、２１７．　９５９）によって実施する。実験した 種々の割合のうち最も好ましいのはムラミルペプチド２＃　（ＭＯＰで表す）対 結合体１００１５であった。ムラミルペプチドの量が結合体１００＃に対して１ 埒であるような結合体でも同様の結果が得られた。

Ｃ）　破傷風毒素の抗原性：この検査はＥＬＩＳＡ法によって行なう。破傷風毒 素と種々の結合体とを５０Ｊ１１中に１０埒の破傷風抗原が得られるように希釈 する。各希釈液５０成をプレートの凹部に配置する。抗原をプレートに固定させ る適当な処理を行なった後、一定量の抗破傷風血清を添加する。この量はペルオ キシダーゼで標識した抗抗体システムによる発現（ｒ６ｖ６１ａｔｉｏｎ）の後 で光学的濃度が約１になるように計算したものである。この実験では下記の数値 が得られた。

友１豊皇皇１ユ遣 破傷風毒素１０埒　０．７１５ 破傷風毒素１０／１１９を含む結合体　０．１４５バツクグラウンドノイズ　０ ．１２０ この実験はムラミルペプチド及びペプチドを破傷風Ｉ１１素に結合させた結果破 傷風毒素の抗原性が変化したことを示している。

後述の諸実験で示すように、この現象は高分子支持体の性質には作用せずに破傷 風毒素の免疫原性も改変せしめた。

ｄ）　毒性の有無：２つのテストを行なった。

これらテストの一方は、破傷風毒素が毒性を消失したことを示した。１０匹のマ ウスの各々に致死量の１０倍の破ａ１１１１！素に相当する量の結合体を投与し た。−週間の観察の結果、破傷風の臨床的兆候は全く表われなかった。

第２のテストは発熱テストである。このテストの結果によれば１．５７５の結合 ムラミルペプチドはテストした３匹のウサギのいずれに関しても０．５℃以上の 体温上昇を誘起することはなかりた。参考までに、同一条件での結合によって得 たＭＤＰ−ＬｙＳと破傷風毒素との結合体は０．８１で体温を１．６℃〜２℃上 昇させた。尚−１この第２のテストでは結合が必要上ムラミルペプチドのペプチ ド基レベルで行なわれていたことに留意され体及びＭＤＰ−リジンを用いた３成 分結合体とに関する生物　的テスト並びに性質の比較 前述の条件でグルタルアルデヒドを用いて共有結合を生起させる方法により、ペ プチドと破傷風毒素と６−０−ε−アミノカブロイルームラブチド（結合体り、 Ｅ及びＦ）又はＭＤＰ−リシン（結合体Ａ、Ｂ及びＣ）とを種々の初期割合で用 いて３成分結合生成物を製造した。ムラミルペプチドの量はＭＤＰ−（Ｎ−アセ チル−ムラミル）−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン）等預で表わす。以下の 説明では後述の３成分結合体に含まれる種々の成分の比を評価する場合にＮ８２ 等量でも表わす。

結合体Ａ及びＤは破傷風毒素２．３５■と、マラリアペプチド３．７５ｒｒｙと 、ＭＤＰ２■とを用いて製造した。結合体Ｂ及びＥはＴＴ２．３５■と、ＰＥＰ ７．５ηとＭＤＰｌｑとを用いて製造した。

また、結合体Ｃ及びＦ　Ｌｔ　Ｔ　Ｔ　１１．７＃ｊと、Ｐ　Ｅ　ＰＩ３．７５ 　ｍｌと、Ｍｏｐｏ、５１１ｇとを用いて製造した。更に、主に比較の目的でＰ ＥＰ−ＴＴ結合体を前述の操作によりＰＥＰと破傷風毒素とを結合させることに よって形成した。破傷風毒素は反応基を７ナトキシンより多く含んでいるため支 持体として用いた。

得られた結合体の解毒処理は、十分な量のグルタルアルデヒドを加え、次いで５ 日間インキュベートすることによって行なった。得られた結合体と、これら結合 体の成分の相対的割合とを表１に示した。各結合体の解毒が完全であるか否かを 、３匹のマウスにマウス致死量の２倍のＴＴに相当する量の結合体を皮下注射す ることによって、結合体使用前に調べた。解毒状態はこのテストで使用したマウ ス、又は後述のテストで使用するマウスに麻痺症状が全く見られないという事実 によって確認した。

成長したメスＢＡＬＢ／Ｃマウス６匹からなるグループを数グループ用意し、各 結合体Ａ−Ｃ（表Ｉｔ　）　５０埒を食塩水溶液の形態で皮下注射することによ りこれらマウスに免疫を与えた。

別の１グループにはＰＥＰ−ＴＴ５０＊′４ｉ：ＭＤＰ−リシン１００Ｉ４との 混合物として食塩水溶液の形態で投与した。対照マウス６四にはＰＥＰ−ＴＴ５ ０Ｉ４をアジュバントを含まない食塩水溶液の形態で投与した。３３！１間後、 これらのマウスに同じ抗原を再び投与し、この２次接種から７日後、又は１４日 後に採血を行った。第２実験シリーズではマウスに結合体Ｄ−Ｆ（表Ｉ　）　５ ０Ｉ４を１１増水溶液の形態で投与するか、又は６−０−７ミノカプロイルーム ラブチド１００ｊＪ！Ｉと混合したＰＥＰ−ＴＴ５０ＪＩ！ｇを食塩水溶液の形 態で投与することによって免疫を与えた。対照マウスにはアジュバントを用いず に５０ｎのＰＥＰ−ＴＴを投与した。

１次免疫処理から２週間後にマウスの採血を行なった。２５日目に２次接種を行 なった。次いで、この２次接種から夫々７日後、１４日後及び１２３日後に採血 を行なった。夫々のグループのマウスから採取した血清をまとめ、ＥＬＩＳＡ法 を用いる診断テストにより、ｔｎ　ｖｉｖｏで抗ペプチド抗体及び抗破傷風抗体 の産生を誘導する能力について調べた。天然タンパク質はＶａｎｄｅｒｂｅｒｇ 他の方法（１９６９年）に従いプラスチックプレート上に固定したスポロゾイト 抽出物を使用するラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）で抗ペプチド抗体により認識 すると共に、ＧＶａｄＺ他の方法（１９７９年）に従い抗体と間接蛍光とを使用 するテスト（間接蛍光抗体テストＩＦＡ）によって認識した。抗ＰＥＰ抗体の生 物学的活性のテストにはＮｏｒｄｉｎ他（１９７９年）によるサーカムスボＯゾ イト（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ＝ｃｓＰ）反応を使用した。

ｉｎ　ＶｉｔｒＱでの抗体産生 マウスから婢臓ＩＢ胞を採取した。無菌状態で得たこれらの細胞を洗浄し、ＲＰ Ｍ　Ｉ　１６４０という名称で知られている培地中に細ｗｉ１０７個／ｄの濃度 で懸濁させた。前記培地は５ＥＲＯＨＥＤ社製ペニシリン１００単位／ｄと、ス トレプトマイシン１００Ｊ＃／ｄと、牛胎児血清５％と、２−メルカプトエタノ ール（２Ｘ　ｉｏ’Ｍ　”）とを含む。これらの懸濁液を１００ＩＪ１の７リコ ートに分け、凹部を９６個有する組織培養用プレート（Ｃｏｓｔａｒ）　；ｆの 凹部に配置した。ＴＴ又はＰＥＰ−ＴＴ２０Ｉｉ１を０．ＩＩ４／ｍｅの割合で 各凹部内に加えた。各凹部内の最終量を０．２７に調整した。対照凹部には抗原 を加えなかった。これらのプレートを００２１０％、ｌ素９０％の雰囲気下３７ ℃でインキュベートした。４日目にプレートを洗浄して抗原を除去した。更に６ 日後、上澄みを回収し、ＥＬＩＳＡ法によってこれら上澄みの抗体含量を調べた 。

下記の結果が観察された。

圧旦ヱエ」Ｊ」」ひυと巳二生えｚｃｏｍｑｏｉ０１１Ｌ組１兇藍１体に関して 産生された抗体の量で表わされるｉｎ　ｖｉｖｏ応答表■の結果から明らかなよ うに、ペプチド及びＴＴに関して産生きれる抗体の力価はＴＴに固定されたペプ チド及びアジュバントの割合に応じ特定の割合で変化する。最も強い抗ＰＥＰ応 答を示したのは、ペプチドを最も多く含む接合体で免疫処理したマウスである。

ＭＤＰ−リジン置換率の増加は抗ＰＥＰ随伴応答の増加となって表われなかった 。逆に、ＭＤＰ−リシン置換率の増加は抗ＴＴ応答の増加となって表われた。Ｍ ＤＰ−リシンとＰＥＰ−ＴＴとの混合物は、抗ＰＥＰ抗体応答を対照に比べてや や増加させた。しかしながら抗体応答の大幅な増加はアジュバントをＴＴに結合 させた場合に観察された。また、ＭＤＰ−リシンで処理しておいたグループ（グ ループ３）のマウスでは対照より大きい抗ＴＴ力価が観察された。この結果はＰ ＥＰ−ＴＴへのアジュバントの結合がペプチドに関しても支持体に関しても応答 の増加として表わされることを明白に示している。

４−０−ε−アミノー力プロイルームラブチドを含む結合体に関する抗体のｉｎ 　ｖｉｖｏ応答 このタイプの結合体に関して２つのテストを行なった。これらのテストの代表的 結果を表■に示す。この表から朗らかなように、アジュバントを投与したグルー プは総て、２次接種から１５日後にほぼ同等の免疫応答を示した。しかもこれは アジュバントをＰＥＰ−ＴＴに結合するか又はしないかに係わりない。

この等優性は結合体Ｄ−Ｆがアジュバントを結合体５０埒当り夫々　１．０４９ ．　０．６巧及び０．３＃Ｌ、か含んでいないのにも拘らず観察された。これら の観察から、結合体はアジュバント含量がルベブチドを用いる混合物と同程度の 抗ペプチド抗体応答を誘導するという結論が得られる。但し、抗破傷風１次応答 のレベルではこれと対照的な現象が観察された。即ち結合体を投与した動物では 極めて小さな応答（力価４００未＠）シか得られなかったが、ＰＥＰ−ＴＴのみ 、又はＰＥＰ−ＴＴとアジュバントとの混合物を投与した動物では８〜４０倍の 力価が観察された。

グループ１−２の間に観察され得る抗支持体応答とグループ３−５に観察され得 る抗支持体応答との間の相違は２次接種の後（３２日目及び３９日目）で更に顕 著になった。結合体で処理したグループのうち、最も大ぎい抗ＴＴ抗体応答を示 したのは、アジュバントを最も小さい割合で含む結合体で処理したグループ５で ある。アジュバントを他の結合体成分と組合わせた（但し結合はしない）状態で 投与した動物における極めて高い抗ＴＴ抗体産生は２次接種後１２３日を経過し ても観察できた。

族ペプチド応答のレベルでは下記の現象が観察された。結合体り及びＥで処理し た動物ではＰＥＰ−ＴＴとアジュバントとの混合物で処理した動物に見られた応 答よりやや強い応答が観察された。結合体Ｆ１従ってアジュバント含量が最初か ら少ない接合体を投与した動物ではアジュバント活性が比較的小さいことが確認 された。これらの結果は、アジュバントの前記使用１（０，３ｕ／マウス／注射 ）が族ペプチド応答を誘導するのに必要な最小限の量の限界値であることを意味 すると考えられる。

しかしながらこれらの結果は全体としては、このようにして形成された単体分子 とペプチドとの結合の後で支持体の表面に露出された両灯性アジュバント基が、 抗ＰＥＰ抗体及び抗ＴＴ抗体の産生の誘導レベルで重要な役割を果すことを示し ている。

前記動物のうち、スポロゾイト抽出物と不完全７０インドアジユバントとで被覆 したプラスチックプレート上で、天然サー・カムスポロゾイトタンパク質を用い てＲＩＡにより反応性をテストしたものに関しては３２日目に同様の現象が観察 された。

Ｃ８Ｐによって測定される生物学的活性も測定した。得られた結果を表■に示す 。ＰＥＰ−ＴＴとアジュバントとの混合物を投与したものであれ、３成分結合体 で処理したものであれ、総てのグループから得た血清に大きな力価が観察された 。但し、最も大きな力価を示したのは結合体りで処理した動物である（ＩＦＡテ ストでもＣ８Ｐでも）。これらの結果は、寄生物を立体形状で認識するだけでな く寄生生体のサーカムスボロゾイトタンパク質の消退も生起させるのは結合体で あることを立証マウスをムラブチド含有結合体で処理した場合にはこれら動物の 抗ＴＴ循環抗体の割合が特に小さいという理由から、ＰＥＰ−ＴＴ又は遊ＩＴＴ による刺激にｄｉ　ｎ　ｖ　ｉ　ｔ　ｒｏｒ　ノ抗ＴＴ抗体産生に間するマウス 牌臓の能力を調べた。結果を表Ｖに示す。これら培養物の上澄みをＥＬｉＳＡシ ステムで調べた。

し、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでＰＥＰ−ＴＴにより刺激すると実験したグループの総て が族ペプチド抗体を生産した。対照動物（グループ１）の牌臓１／ａ胞の上澄み には抗ＰＥＰ抗体は検出されなかった。こったためと思われる。これらの結果は 、ＰＥＰ−ＴＴへの６−〇−（ε−アミノ−カプロイル）−ムラブチドの結合が 、抗原として作用する高分子支持体とアジュバントとの混合物によって得られる ほど効果的な刺激作用を高分子支持体ＴＴに対して示さないことを立証している 。この差違は、ＴＴ決定基が修飾されたためか、又はこれら決定基が免疫システ ムにアクセスし得なくなったために免疫原仕が減少したという事実に起因し得る 。

これらのテストから下記の現象が観察される。

高分子支持体とペプチドは同じであるがムラミルペプチドは異なるような種々の ３成分結合体、特にムラミルペプチドとして夫々６−０−　（ε−アミノ−カプ ロイル）−ムラブチド及びＭＤＰ−リジンを含む複数の３成分結合体に関して行 なったｉｎ　ｖｔｖｏアジュバント活性テストではかなり大きな差違が観察され た。即ちアジュバントがＭＤＰ−リジンの場合には結合体中のアジュバントの割 合が増加すると抗高分子支持体応答も増加したが、結合体の構造に含まれるムラ ミルペプチドが両灯椛６−０−　（ε−アミノ−カプロイル）−ムラブチドであ る場合には、抗ＴＴ抗体応答は全く増加しなかった。但し、アジュバントを最も 多く含む結合体で処理したマウスの血清もペプチド及びその本来有するタンパク 質を認識する抗体の力価が最も大きかった。このタイプの結合体はＣ２Ｆ反応も 誘起した。この反応はマウス及びサルに見ることのできる保護度と相関関係を有 し得る。従って、ＰＥＰ−ＴＴに結合した少量の６−Ｏ−（ε−アミノー力ブロ イルンームラブチドは、同じアジュバントを同量結合せずに用いるか又はＭＤＰ −リジンを用いた場合より明らかに大きい保護抗体応答を誘起させることが判明 した。

ムラブチドを含む結合体で処理したマウスの血清は、（ムラミルペプチド抜きで ）ＰＥＰ−ＴＴを投与した動物の血清より遥かに小さい抗ＴＴ抗体力価を有する ことが判明した。この反応低下の理由については様々な仮説を組立てることがで きる。

第１の仮説としては、本発明の特定ムラミルペプチドの使用が、高分子支持体と ペプチド及びアジュバントとの結合時に高分子支持体の構造変化を誘起したと考 えられる。第２の仮説としては、高分子支持体の抗原決定基がマスキングされ、 それ等が免疫システムの細胞にアクセスできなくなったために、その支持に結合 すると恐らくは、アナトキシンが免疫システムに対して軽くマスキングされるの に十分な疎水性を示すようになり、逆にペプチドはムラミルペプチドのアジュバ ント作用に更にさらされ、作用を受けるようになる。その理由は恐らく、毒素に 対するアジュバント効果がペプチドに対して観察され得るアジュバント効果に加 えられるというＭＤＰ−リシンの親水性にあると思われる。

ｉｎ　ＶｉｔｒＯ抗体産生テストにより、結合体によって刺激されたマウス細胞 が；ｎ　ｖｔｔｒｏでＰＥＰ−ＴＴ又はＴＴによっても刺激され得るか否か、従 って、破ｍｓアナトキシンの決定基が結合体中に発現された程度を決定した。こ のテストの結果は、結合体で処理したグループの細胞が、ＴＴを遊離状態で使用 しよっている。これらの結果は３成分結合体中でＴＴの抗原性が変化したという 仮説を裏付ける。これに対し、ｉｎ　ｖｉｖｏ抗ペプチド応答はグループ１〜４ ではほぼ同じ（表■）であり、グループ５の動物に関してはそれより少し小さか った。また、これら総てのグループの細胞はＰＥＰ−ＴＴによる刺激の後ｉｎ　 ｖｉｔｒｏで族ペプチド抗体を形成していた。全体として見るとこれらの結果は 、グループ１〜３の１１１１によりｔｎ　ｖｉｔｒｏで抗ＴＴ抗体が産生されな い理由が、ｉｎ　ｖｉｖｏ刺激の間に高分子支持体の抗原決定基が変化するか又 はマスキングされたことにあることを示唆する。これらのテストはまた、族ペプ チド抗体の産生が本発明の結合体を使用することによって著しく刺激され得、こ れは結合体が記載した特定のムラミルペプチドを比較的少量しか含んでいない場 合でも変りないことを示している。

前述のテストから、本発明の３成分結合体はハブテンに特異的に向けられる免疫 原性を有するという結論が得られる。

従って本発明は、前述の３成分結合体を製薬上許容し得るベヒクルと組合わせた 状態で含む薬剤組成物にも係わる。

有利な薬剤組成物は本発明の少なくとも１種類の３成分結合体を有効量含む注射 用溶液からなる。この種の溶液は等張性殺菌水相、好ましくは食塩水又はグルコ ース添加水を用いて形成するのが好ましい。本発明は更に、３成分結合体が注射 用懸濁液を形成するのに適したリポソーム中にカプセル封入されているような組 成物にも係わる。

本発明はより特定的には真皮内注射、筋肉注射、皮下注射、静脈注射又は乱切に よる投与に適した前述の如き溶液又は懸濁液に係わる。

本発明はまた、別の方法、特に経口投与、もしくは直腸投与、又は粘膜、特に眼 、鼻、肺もしくは腟の粘膜と接触するのに適した形態で投与し得る薬剤組成物に も係わる。

従って本発明は、本発明の３成分結合体の少なくとも１種類上許容し得る賦形剤 又は直腸投与に適した賦形剤と組合わせられた薬剤組成物に係わる。本発明はま た、肺内投与に適した組成物、特に従来の噴霧器を用いて投与するように調製さ れた溶液にも係わる。

所定抗原に対する宿主の免疫応答を刺激するために投与し得る用量は体重１　Ｋ ｇ当りの埒で表わして、例えば、腸管外投与の場合には５０〜１０００、好まし くは１００〜３００／Ｊ！Ｆ／幻、経口投与の場合には０．５〜１０η／醇であ る。

本発明の好ましいワクチン組成物は更にワクチンの投与を容易にするためのベヒ クル、例えばポリビニルビ０リドンも含む。

ポリビニルピロリドンに代えて、従来の意味でのアジュバント、即ち薬剤の吸収 を容易にし、又は生体内での薬剤の作用を促進させる物質という意味での他の任 意のアジュバントを使用することもできる。このようなタイプの別のアジュバン トとしてはカルボキシメチルセルロース、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニ ウム、又は当業者に良く知られているこのタイプの他の総てのアジュバントが挙 げられる。

従って本発明の薬剤組成物は本質的に宿主体内で免疫応答を誘導するためのもの であり、本発明の３成分結合体に含まれるハブテンに特異的に担持された抗原部 位を有する抗原に対する抗体又は細胞媒介免疫性を生産せしめる。

本発明はより特定的には、ヒト又は動物治療で、例えば種の繁殖又は特定ホルモ ンを抑制するための代謝操作のレベルでヒトや動物の動きを変化させたい場合に 、使用される別のタイプの薬剤組成物にも係わる。このタイプの好ましい組成物 では、使用される結合体に含まれるハブテンがホルモン自体又はホルモンの７ラ グメントからなる。

獣医学分野では、特定要素の生産向上のために他の要素を犠牲にするような場合 もある。その−例として、免疫学的去勢により食肉生産の向上をはかるために動 物に投与される動物ワクチンの使用が挙げられる。

本発明は特に、ハブテン自体がペプチドホルモン又はグリコペプチドホルモンの 部類に属するホルモン自体か、又はそのホルモンと共通の部分を有するペプチド 配列からなるような前述の３成分結合体を有効量含む獣医学用組成物に係わる。

この場合の特に有用なホルモンは黄体刺激（＋ｕｔＪｏｓｔ＋ｌｕ＋ａｎｔｅ） ホルモンＬＨ−ＲＨの遊離因子からなる。

これらの結合体の有効単位用間は体重１　Ｋｇ当りの刀で表わして、例えば腸管 外投与の場合には約５０〜１０００　、好ましくは１００〜３００１５／幻であ り、経口投与の場合には約０．５〜１０η／Ｉ　Ｋｇである。

本発明は更に、主としてこれらの３成分結合体で構成される生物学的試薬にも係 わる。特定的にはハブテン部分が薬剤又は麻薬（例えばモルヒネ）の有効成分、 又はＩＩ瘍遺伝子発現物質で構成され得る。これらの生物学的試薬は従って抗体 、特に−価の抗体又はモノクローナル抗体の産生に使用できる。これらの抗体自 体は、たとえば宿主生体に対する当該薬剤の作用を調べるための試薬を形成する 上で有用である。

以上の説明から明らかなように、本発明は勿論前述の特定実施例には限定されず 、様々な変形、特に本発明の３成分結合体に含まれるムラミルペプチドが前述の ものとは異なる置換基を有するような変形も包含する。但し前記置換基は本発明 の３成分結合体内でこのようにして修飾されたムラミルペプチドの前述の性質を 変化させるようなものではない。

また、本明細書で引用した文献及び特許は本明細書の記述に含まれるものとする 。

轟−１ ＬＪ ＥＬＩＳＡテストで２×バツクグラウンドノイズ×１０４の０、Ｄ、を示す血清 の力価で表わされる値。

表■ 国際調査報告 １１．、ｌＡ＃に、昧　ＰＣＴ／ＦＲ８６１００２０１ＡＮＩＪＤＣＴｏ　’４ りΣ　ＩＮ′１＋？＋ＲＮＡτ工０ＮＡｒ、ｓＥλ：ＩＣＨＲＥ：’ＯＲ丁ＯＮ

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．３つの成分を互いに結合することによって形成され、これら３つの成分が夫 々高分子支持体、少なくとも１種類のムラミルペプチド及び所望の免疫原活性に 関する少なくとも１種のエピトープを有する少なくとも１種類のハプテンからな る免疫原性生成物であって、前記ムラミルペプチドがそのグルコピラノシル核か ら、これと前記支持体との間の結合腕を構成する化学基を介して前記支持体に結 合されることを特徴とする生成物。
2. ２．ムラミルペプチド及びハプテンが、高分子支持体上に最初から存在するか又 は該支持体に担持される複数の異なる官能基を介して前記高分子支持体に別個に 結合されることを特徴とする請求の範囲１に記載の生成物。
3. ３．生成物の構造に含まれるムラミルペプチドが次の一般式▲数式、化学式、表 等があります▼ （式中、 −Ｒ１はＯＨ基、Ｏ−Ｃ６Ｈ４−ＮＨ２基又はＯ−（ＣＨ２）ＩＩＩ−Ｒａ基で あってｍは１〜１０までの整数であり、Ｒａはアミン基、カルホキシル基、チオ ール基、ヒドロキシル基又は水素のいずれかを表わし、 −Ａは酸素又はＮＨ基であり、 −Ｒ６はＢ−Ｒ基又はＣＯ−Ｂ−Ｒ基であって、Ｂは炭素原子を約１００個まで 含み得る基又は直鎖もしくは分枝鎖であり、Ｒはヒドロキシル、カルボキシル、 アミン、チオール又は水素であり、基ＢはＲとして前記したタイプの官能基、又 はカルボニル、アルコキシルもしくはアシルを１つ以上任意に担持するものであ り、−Ｒ２は水素又は１〜４個の炭素原子を含むアルキル基、特にメチルを表わ し、 −Ｘはアラニル残基、アルギニル残基、リシル残基、アスパラギル残基、アスパ ルチル残基、システイニル残基、グルタミニル残基、グルタミル残基、グリシル 残基、ヒスチジル残基、ヒドロキシプロリル残基、イソロイシル残基、ロィシル 残基、メチオニル残基、フェニルアラニル残基、プロリル残基、セリル残基、ス レオニル残基、トリプトフアニル残基、又はバリル残基を表わし、 −ＹはＯＨ基、ＮＨ２基、又は好ましくはＯＲ７又はＮＨＲ７を表し、Ｒ７は１ 〜２０個の炭素原子を含み得る炭化水素基であるか、又はＸとして上記したよう なアミノ酸、例えばアラニル、セリル、バリル又はグリシルであり得、このアミ ノ酸は遊離アミノ酸、アミド化アミノ酸又はエステル化アミノ酸であり、エステ ル化基は炭素原子を１〜４個含み得るものであり、 −Ｚはカルボキシル基、カルボキサミ ド基、１〜１０個の炭素原子を含むエステル基、又は１〜４個の炭素原子を含む アルキル基、好ましくは−ＣＨ２−ＣＨ３又は−（ＣＨ２）２−ＣＨ３を表わし 、 基Ｒ１及びＲ６の少なくとも一方（好ましくはＲ８）は別の分子、特に高分子支 持体に担持された相補反応基との結合を可能にする反応基を有する） で示されることを特徴とする請求の範囲１又は２に記載の生成物。
4. ４．次の全体構造 ▲数式、化学式、表等があります▼ （上記中、 −高分子支持体はこの高分子支持体ヘの別の分子の共有結合を可能にする官能基 を少なくとも２つ有し、−点線はハプテンと高分子支持体との間、又はハプテン とムラミルペプチドのグルコピラノシル核上の１位もしくは６位との間のＸ個の 共有結合を表わし、指数Ｘは前者の場合が１以上、後者の場合が１に等しく、 −実線はムラミルペプチドのグルコピラノシル核上の６位もしくは１位、又はハ プテンが高分子支持体に直接結合される場合には前記２つの位置双方との間のｙ 個の共有結合を表わし、指数ｙは１以上であり、 −ｘ＋ｙの合計値は少なくとも２に等しく、且つ高分子支持体に担持された官能 基の最大数以下の値である）で示されることを特徴とする請求の範囲１から３の いずれかに記載の生成物。
5. ５．次式 （式中、 ▲数式、化学式、表等があります▼ −Ｒ１は−ＯＨ又は−Ｏ−Ｃ６Ｈ４−ＮＨ２又は０−（ＣＨ２）ＩＩＩ−Ｒａを 表わし、ｍは１〜１０の整数、Ｒａはアミン基、カルボキシル基、チオール基、 ヒドロキシル基又は水素であり、 −Ｒ２は−Ｈ又は−ＣＨ３であり、 −Ｒ６は−ＣＯ（ＣＨ２）ｎ−Ｒを表わし、ｎは１〜１０の整数、Ｒはアミン基 、カルボキシル基、チオール基、ヒドロキシル基又は水素であって、 −ＸはＡｌａ，Ｇｌｙ，Ｓｅｒ又はＶａｌであり、−ＹはＯ（ＣＨ２）ｐ−Ｈを 表わし、ｐは１〜１０の整数であり、−ＺはＣＯ−ＮＨ２，ＣＯＯ（ＣＨ２）ｒ −Ｈ又は（ＣＨ２）ｒ−ＣＨ３を表わし、ｒは１〜４の整数である）で示される ことを特徴とする請求の範囲３又は４に記載の生成物。
6. ６．基Ｘの構造に含まれるアミノアシル残基が左旋性である（但しＸがグリシル 残基からなる場合は除く）ことを特徴とする請求の範囲１から５のいずれかに記 載の生成物。
7. ７．前記生成物の構造に含まれるムラミルペプチドが２−（２−アセトアミド− ２−デオキシ−３−Ｏ−Ｄ−グルコピラノシル）−アルカノイルーペプチドのタ イプであることを特徴とする請求の範囲１から６のいずれかに記載の生成物。
8. ８．前記生成物の構造に含まれるムラミルペプチドが２−（２−アセトアミド− ２−デオキシ−３−Ｏ−Ｄ−グルコピラノシル）−アルカノイル−アミノアシル −ｎｏｒロイシンのタイプであることを特徴とする請求の範囲１から６のいずれ かに記載の生成物。
9. ９．ＹがＯＲ７であり、Ｒ７基が１〜１０個の炭素原子を含み、Ｚが基−ＣＯＮ Ｈ２であることを特徴とする請求の範囲１から８のいずれかに記載の生成物。
10. １０．ＹがＯＲ７基であり、Ｒ７が１〜１０個の炭素原子を含み、Ｚが基−ＣＨ ２−ＣＨ３であることを特徴とする請求の範囲１から８のいずれかに記載の生成 物。
11. １１．Ａが酸素であり、Ｒ８がスクシニル基−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＣＯＯＨの ことき基−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ又はエプシロン−アミノ−カプロイル 基−ＣＯ−（ＣＨ２）６−ＮＨ２のことき基−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２であ り、ｎが１〜１０の数であることを特徴とする請求の範囲３から１０のいずれか に記載の生成物。
12. １２．ムラミルペプチド部分が下記のムラミルペプチド−６−Ｏ−エプシロン− アミノカプロイル−ＭｕｒＮＡｃ−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−Ｇｌｎ−ＯｎＢｕ： −６−Ｏ−エプシロン−アミノカプロイル−ＭｕｒＮＡｃ−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−Ｎ Ｉｅ−ＯｎＢｕ： −６−Ｏ−スクシニル−ＭｕｒＮＡｃ−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−ＧＩｎ−ＯｎＢｕ： −６−Ｏ−スクシニル−ＭｕｒＮＡｃ−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−Ｎｌｅ−ＯｎＢｕ： の１つ、又はＮ−ブチルエステル基（ＯｎＢｕ）に代えてメチルエステル基（Ｏ Ｍｅ）を有する前記ムラミルペプチドのうちの１つから誘導されたものである請 求の範囲１から１１のいずれかに記載の生成物。
13. １３．高分子支持体の分子量が少なくとも５０，０００、特に５０，０００〜２ ５０，０００ダルトンであることを特徴とする請求の範囲１から１１のいずれか に記載の生成物。
14. １４．高分子支持体が破傷風アナトキシンから誘導されることを特徴とする請求 の範囲１３に記載の生成物。
15. １５．前記生成物に含まれるハプテン部分の分子量が５，０００以下であること を特徴とする請求の範囲１から１４のいずれかに記載の生成物。
16. １６．ハプテン部分がポリペプチド基であることを特徴とする請求の範囲１５に 記載の生成物。
17. １７．所定抗原に対する保護作用をもつ抗体を誘導する選択的免疫原性を特に有 する薬剤組成物であって、この組成物の活性成分が請求の範囲１から１６のいず れかに記載の生成物からなり、この生成のハプテン成分が、保護作用が所望され る抗原と共通の抗原部位又はエピトープを有することを特徴とする薬剤組成物。