JPS63500207A - 新規な分子量標準とその使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規な分子量標準とその使用方法 この発明はタンパク質の分子量決定において使用するための組成物、およびかか る組成物を利用する方法に関する。

電気泳動によって分離されたタンパク質混合物のウェスタン転移（Ｗｅｓｔｅｎ 　ｔｒａｎｓｆｅｒ　）およびタンパク質プロッティング（ｂｌｏｔｔｉｎｇ） の技術は、現在生物科学分野において広く用いられている。この技術は電流を用 い、ポリアルリルアミド（または他のポリマー）ゲルに溶解したタンパク質を、 タンパク質と強く結合する処理された半硬質または硬質膜または紙担体の表面に 移動せしめるものである。この技術はジエルショニイ（Ｓ、Ｇｅｒｓｈｏｎりお よびパラディ（Ｇ、Ｐａ１ａｄｉｅ）によって論じられている（Ａｎａｌ、　Ｂ ｉｏｃｈ　（１９８３）　１３Ｌ１〜１５）。

移動せしめたタンパク質を、タンパク質の分子量に応じて区分する方法では、既 知の分子量の適当な標準タンパク質が同一の隣接した、または非隣接の分離ゲル の領域から同一の、隣接した、または非隣接の処理された半硬質または硬質紙ま たは膜担体上に同時に移動せしめられる。

電気泳動的に移動した分子量標識を含む紙または膜担体の領域が除去され、タン パク質が着色される。

上記方法に好適な分子量標識は多くの会社から商業的に入手可能である。

本発明は既知のタンパク質分子量標識に比較して下記の利点を有する新規な分子 量標識を提供する。

（ｉ）本発明の分子量標識はすべての担体上で検出することができる。タンパク 質着色法は、すべての担体（たとえばカチオン化されたナイロン膜）上で使用す ることができなかった。

なぜならば、着色剤が担体をも着色し、分子量標識のＴＩＥＬ”ａが不可能にな るからである。

（１１）分子量標識および試料タンパク質の検出は、一般に同時に、かつ−回の 操作でのみ行なうことができる。

他のタンパク質分子量標識を使用したときには、別個の着色操作が必要となる。

（ｉｉｉ　）標識の検出は、標識を含むレーン（ｌａｎｅ）を担体の残余の部分 から除去することを必要としない。

他のタンパク質分子量標識を含む担体は他の検出操作のために除去しなければな らなかった。かかる操作は、担体の大きさに影響を与え、免疫的に検出された（ ｉｍｍｕｎｏｄｅｔｅｃｔｅｄ）成分を分子量標識と並べることが困難になる。

一連の１４ｃラベルを有するタンパク質分子量標識がアメルシャム（Ａｍｅｒｓ ｈａｍ）　（バフキンガムシ＋　−（Ｂｕｃｋｉｎ−ｇｈａｍ　５ｈｉｒｅ）　 、イングランド（Ｅｎｇｌａｎｄ）　）から入手可能である。

これらの標識は免疫的に検出された成分と共に検出することができるが、高価で あり、免疫検出操作が放射性ラベル（たとえば放射性ラベルを有する抗体または タンパク質Ａ）を使用する場合にのみ使用可能である。

本発明の第１の特長によれば、タンパク質の分子量決定に用いるための組成物が 提供され、この組成物はイミュノプロプリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ） およびその断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）およびそのポリマー（以下、Ｉｇ酸成分云 う）から成る群から選ばれた、少なくとも一つの既知の分子量のタンパク質また はポリペプチドを含む。

本発明は、たとえばイミュノグロブリンＡおよびイミュノグロブリンＭを含むす べてのクラスのイミュノプロプリンを使用することができるが、本発明による好 ましい組成物はイミュノグロブリンＧおよびその断片およびそのポリマー（以下 １ｇＧ成分と云う）から成る群から選ばれた既知分子量の少なくとも一つのタン パク質またはポリペプチドから成る組成物である。

好ましくは、本発明のこの特長の組成物は、二つまたはそれ以上のＴｇ酸成分含 み、好ましくはこれらは等量であり、典型的には少なくとも四つまたは五つのか かる成分を含む。

かかる好ましい組成物においては、Ｉｇ酸成分、−連の分子量の範囲にわたって 、好ましくはほぼ規則的な間隔で調整された分子量が分布するように選択される 。

たとえば、ＩｇＧ成分がほぼ２００〜２５ＫＤａの範囲をカバーするように、好 ましくは成分間で規則的な分子量間隔で選択される。

ここでＩｇ酸成分、より詳細に下記するように、異なる動物種から得られる。

この特長に関して、本発明は異なる１ｇ種類、好ましくは５ＤＳ−ポリアクリル アミドゲルおよびウェスタン・ブロン）　（Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｓ）に分 子量標識を与えるのに用いることができるイミュノプロプリンＧ（ガンマグロブ リン）から導かれた明確な分子量のタンパク質を含む組成物を提供する。

ウェスタン・プロットに分子量標識を与えるのに使用したときは、本発明の組成 物は、抗原および分子量標準を同時に検出することができ、抗原種に対して同一 または相互反応種の標識を使用したときに、移動および検出操作の効率の尺度を 与える。

本発明の組成物における分子量成分の範囲は、ＩｇＧ分子のようなイミュノプロ プリン分子を既知の方法によって、重い、および軽い鎖成分および他の成分の種 々の組合せに、部分的な、または十分な還元的アルキル化、酵素による消化、必 要に応じて種々の部分の重合を伴う化学的開裂によって細分化することによって 得られる。

本発明の他の特長によれば、本発明は一種以上の試料タンパク質の分子量を検出 および／または決定するための方法を提供する。

この方法は下記の工程から成る。

ａ、試料タンパク質および上述したような本発明の組成物をポリマーゲルを用い て同時に電気泳動分別にかける。

ｂ、そして、分別された試料タンパク質およびＩｇ酸成分、試料タンパク質の分 子量を検出および／または決定するために検出し、比較する。

電気泳動分別の工程は、−次元または二次元条件で行なわれる。好ましくは、ナ トリウム　ドデシルサルフェート−ポリアクリルアミドゲルがこの分別に用いら れる。

分別された試料タンパク質およびＩｇ酸成分検出はポリマーゲル中で直接行なう ことができる。この代りに、中間的な移動工程を行なうこともでき、この工程で は分別された物質が、たとえば半硬質または硬質担体上に電気泳動により移動さ せ、次いで上述したようなウェスタン移動およびタンパク質プロフティング（ｂ ｌｏｔｔｉｎｇ）の技術によって独立した別個の担体上において移動され、この 移動された物質について検出および比較が行なわれる。

イミュノプロプリン成分、特にＩｇＧ成分の好ましい特長の故に、これらは電気 泳動によって半硬質または硬質ポリマーフィルム上で移動され、ここでこれらは 、タンパク質入、酵素が結合したアンチイミュノプロプリン（ａｎｔｉ−ｉｍｍ ｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）　（無傷の、Ｈ−またはＬ−鎮）および放射性ラベル を有する同族体を含む種々の試薬を用いて検出される。

ヒト、マウス、ヤギ、牛（ｂｏｖｉｎｅ）、ウサギを含む種々の、および適切な 種類のイミュノプロプリンおよびこの断片の使用によって、この方法は分子量決 定および移動および免疫検出（ｉｍｍｕｎｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）の効率の数量 化を確実にする。

たとえば、ヒトーイミュノプロプリン断片を検出システムに使用することができ るが、この場合、アンチヒトーイミュノプロプリンが第２の抗体として利用され る。

本発明の好ましいｒｇｃ成分の製造のだめの出発物質には、種々の動物種（たと えば、ウサギ、ネズミ、マウス、山羊など）の血液またはモノクロナル源から直 接得られた精製ガンマグロブリンを含む。

好ましくは、出発物質は入手可能なＩｇＧの重要な亜型（ｓｕｂｔｙｐｅ）のみ から成る。

ガンマグロブリン鎖の重い（Ｈ）および軽い（Ｈ）ポリペプチドの組合せへの解 離は、ガンマグロブリンを還元剤〔たとえばジチオスレイトール（ｄｉｔｈｉｏ 　ｔｈｒｅｉｔｏｌ）、メルカプトエタノール〕と共に一連の濃度で加熱し、次 いで還元されたタンパク質をヨードアセトアミドまたはヨード酢酸のような適切 なアルキル化剤でアルキル化することによって達成される。

この操作によって、ＩｇＧ　ＬおよびＨ鎖モノマー、ダイマー、トリマーおよび 分子量検出に直接使用できる種々の量のＨｚＬｔ、Ｈ２Ｌ、Ｈ２，ＨＬ、Ｈおよ びＬの組合せのテトラマーの安定な混合物を生ずる。

この代りに、これら混合物中の成分を、ゲル濾過（ｇｅｌ　ｆｉｌｔｒａｔｉｏ ｎ）　（大きさによる排除法（ｓｉｚｅ　ｅｘｃｌｕ−ｓｉｏｎ））、イオン交 換クロマトグラフィおよび配位子としてのタンパク質Ａとのような親和力（ａｆ ｆｉｎｉｔｙ）クロマトグラフィを含む種々のクロマトグラフィ技術によって分 離することもできる。

検出効率の理由の故に、好ましい試薬は、これらの組合せを適当に再組立てして 、これらの成分の等量の生成物を形成することによって得られる。

一方、分離の後に、これらの成分を種々の架橋剤、たとえばホルムアルデヒドま たはグルタルアルデヒド、ビスオキシラン、またはｐ−アジドフェナシルブロマ イド、Ｎ−スクシンイミジルエステル〔たとえば、Ｎ−スクシンイミジル（４− ヨードアセチル）アミノベンゾエート、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミド メチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート〕およびＣ１〜８アルカンジイ ミデート（たとえばジメチルアジポイミデート、ジメチルビメルイミデートなど ）を含む二官能性試薬で一連の範囲の濃度において処理し、ＩｇＧ断片のオリゴ マーを得ることもできる。

これらの混合物を再び組立てることによって、これら異なるオリゴマーの各々の 等しい量を有する生成物が得られる。

分子量ｔｌｌｉは、またこのイミュノプロプリンＧ出発物質から酵素消化によっ て製造することができる。

この製造操作においては、ＩｇＧが種々のタンパク質分解酵素（たとえば、パパ イン、ペプシン、プラスミン）によって消化され、目的とする断片を生ずる。異 なる分子量のＩｇＧ断片が次いで分離される。分離は、ゲル濾過、イオン交換ク ロマトグラフィ、およびタンパク質Ａ親和力クロマトグラフィのような親和力ク ロマトグラフィを含む種々の方法によって達成される。

分離の後に、断片は架橋剤（たとえばグルタルアルデヒド、ｐ−アジドフェナシ ルブロマイド等）の、一連の範囲内の濃度で処理され、種々の重合度のＩｇＧ混 合物を生ずる。再びこの混合物を再構成することによって、各分子量成分の等量 の混合生成物が得られる。

他方、ＩｇＧ断片は他の化学的細分化法（たとえば、シアノゲンプロマイドを使 用する）によっても形成され、次いでアルキル化され、酵素により導かれた断片 について上述したように処理され架橋される。

上述の一つの、またはいずれか一つの方法によって得られたＩｇＧ断片は混合さ れて目的とする断片の混合生成物を得ることができる。

上記のように、本発明のガンマグロブリンから導かれた好ましい分子量標識は、 ５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにおいて標準として用いられる。同様に、移動 の後に、この標準はウェスタン・プロットの標準として機能する。

この標準は、分子量標識を必要とするすべての５ＤＳ−ＰＡＧＥ系に用いること ができる〔たとえば、ライスフェルト（Ｒｅｉｓｆｅｌｄ、Ｒ，Ａ、）　、ルウ イス（Ｌｅｗｉｓ、Ｕ。

Ｊ、）およびウィリアムス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ、　Ｄ、Ｅ、）、Ｎａ　ｔｕｒｅ 本発明によってイミュノプロプリンから導かれた分子゛量標識は、５ＤＳ−ＰＡ ＧＥゲルで分子量標準として用いるときには、いかなる種類のｒｇから選ぶこと ができる。

ウェスタン・プロットの分子量標準として使用するためには、使用するＩｇの種 類が重要である。この操作においては、試料タンパク質および分子量標準として のＩｇ酸成分ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで電気泳動され、荷電した、または 反応性担体（たとえばニトロセルロースまたはナイロン膜またはジアゾフェニル チオ紙）に電気的に移動して、ウェスタン・プロットを生ずる。

ふさがれていない担体上の反応性または荷電した位置は、通常、洗浄剤〔たとえ ばトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）　Ｘ　−１００、トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）　２０ ）および／またはタンパク質（たとえばゼラチン、アルブミン）〕を含むブロッ キング緩衝剤（ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ）でブロックされ、次いで担体 は、要求される抗原に対して向けられた抗体（−次抗体）を含む緩衝剤と共に加 温される。

分子量標準として使用されたＩｇ酸成分、−次抗体と同一種であるべきである。

結合した一次抗体およびＩｇ酸成分、プロットを放射性標識のある、または酵素 が配位したタンパク質Ａ、または放射性標識のある、または酵素が配位した二次 抗体を含む種々の薬剤と共に加温することによって検出される。このようにして 、抗体と分子量標識の同時検出が行なわれる。かかるイミュノプロプリンから導 かれた分子量標識の使用は、また免疫検出および移動操作の感度の測定をも提供 する。

下記実施例は本発明の組成物および方法を、添付図面にもとづきより詳細に説明 する。

図中、第１図は通常の分子量標準（Ｍ、ＨおよびＲは、夫々マウス、ヒトおよび 兎１ｇＧからの免疫標準の、はぼ５μｇ荷重を示し、これらは市販試薬（薬剤） の低および高分子量標準の５μｇ荷重に近接している）に対するＩｇＧ分子量標 準について検量曲線である。

第２図は、ウェスタン・プロット法におけるＩｐＧ分子量標準の使用を説明する ものである。種々のトラック（ｔｒａｃｋ）の工程歴の記述は実施例４に示され ている。

大潮燃上 コーン分層（Ｃｏ１ｍ　ｆｒａｃｔｉｏｎ）　ＩＩペーストからのヒト・ガンマ グロブリンを下記のような操作に従ってジチオスレイトールで還元した。

２、５　ｔｒｙ／　ｒｎｌのＩｇＧを０．５ｍＭおよび５ｍＭのジチオスレイト ールと共に加温した。反応は室温で３０分間、進行させ、１０ｍＭのヨードアセ トアミドの最終濃度を与えるようにヨードアセトアミドを添加して終了させた。

室温で１０分間、アルキル化を行なった。次いで溶液を４℃で５０ｍＭトリス（ Ｔｒｉｓ）／Ｃ１，５０ｍＭ　Ｎａ（ｌ　ｐＨ８，０で透析した。未処理ガンマ グロブリンおよび還元され、そしてアルキル化されたガンマグロブリンは次いで レメリイ（Ｌａｅｍｍｅｌｉ）の方法に従って１０％ゲルで５ＤＳ−ＰＡＧＥに かけられた。

試料あたり２μｇのタンパク質が付加された。

次いでゲルをウーレイの銀着色法（Ｗｒａｙ　Ｗ、、Ｂｏｕｌｉ−ｋａｓ、Ｔ、 、Ｗｒａｙ、Ｖ、Ｐ、Ｉ　Ｈａｎｃｏｃｋ、Ｒ，、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉ ｏｃｈｅｍ（１９８１）１１８　１９７−２０３）によってタンパク質を着色し た。

鍛着色によって、ガンマグロブリンの還元およびアルキル化によるすべての可能 な、かつＨｚＬｚ、Ｈ２Ｌ。

Ｈ２，ＨＬ、ＨおよびＬ鎖に対応する分裂生成物が、ジチオスレイトールの画濃 度の使用によって得られたことが明らかになった。

分子量の対数を相対移動性に対してプロア）したところ、種々の分子量１５０． １２５．１００．７５．５０および２５ＫＤａの成分を夫々含むｒｐｃ成分につ いて直線依存性があることが明らかになった。

実施五叢 実施例１に記述したようにガンマグロブリン断片を製造し、電気泳動にかけ、ト ービンの方法（Ｔｏｗｂｉｎ。

Ｈ，、５ｔａｅｈｅｌ　ｉｎ　、　Ｔ、　、　Ｇｏｒｄｏｎ、　Ｊ、　＋　Ｐｒ ｏｃ、Ｎａ　ｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ（１９７９）川４３５０−４３ ５４．３に従ってニトロセルロースに電気的に移動させた。

電気的移動は２℃、７０■で３時間行なった。

［ｔｌＯ後に、ニトロセルロール膜（Ｎ　ＣＭ）　ヲ２Ｏｎ＋Ｍトリス（Ｔｒｉ ｓ）／（Ｊ　ｐＨ７，５、０，０５％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００，５ ％ゼラチン、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ！緩衝液（緩衝液Ａ）で６０分、室温で保温 し、次いでＩｌｌしあたり分あたり２Ｘ１０’カウントの放射能標識タンパク質 Ａを含む緩衝液Ａ中で保温した。

次いでＮＣＭを緩衝液Ａ中で１０分間洗浄し、十分に水で洗い、次いで乾燥した 。

結合した１１２５−タンパク質Ａを次いで自動放射線写真法（ａｕｔｏｒａｄｉ ｏｇｒａｐｈｙ）によって検出した。

五本の顕著なバンドが検出され、ガンマグロブリンのＨｚＬｚ、Ｈ２Ｌ、ＨＩ　 ＨＬおよびＨ成分に相当した。

大庭班ユ 下記のように３種（ヒト、マウスおよび兎）のＩｇＧから、ガンマグロブリン断 片が得られた。

旦上几旦は骨髄腫血清からタンパク質Ａセファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）に よって分離され、主としてＩｇＧ、から成る。

タンパク質濃度３．７５■／ｍＬの部分標本が１ｍＭおよび４ｍＭのジチオスレ イトールに関して作られ、室温で３０分間保温された。

ヨードアセトアミド（最終濃度８　ｍＭ）の添加によって還元反応が中止され、 室温で１ｏ分の後に５０ｍＭ　）リス（Ｔｒｉｓ）／ＨＣｆ　、　５０ｍＭ　Ｎ ａＣ１ｐＨ８，０に対して透析された。

ＳＤＳの存在下、５〜１６％のポリアクリルアミドゲルで予備分析し、ウーレイ の方法（Ｗｒａｙ、　Ｓ、　、　Ｂｏｕｌ　１ｋａｓ。

Ｔ、、Ｗｒａｙ、Ｖ、Ｐ、およびＨａｎｃｏｃｋ、Ｒ，、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ 旧０−ｃｈｅｍ。

（１９８１０１８１，９７−２０３）の銀着色法によるタンパク質の可視化の後 に、二つの溶液をブレンドして、軽い鎖および重い鎖のすべての可能な組合せの ほぼ等量の薬剤を得た。

マウス・モノクロナルＩＧはタンパクｉＡセファローズにより腹水から分離され た。タンパク質濃度０．２■／ｍＬの部分標本が、ジチオスレイトールに関して 、０．２５．　１および４ｍＭ作成され、室温で３０分間保温された。

還元反応をヨードアセトアミド（最終濃度８　ｍＭ）の添加によって中止し、室 温下１０分の後に、溶液を５０ｍＭＴｒｉｓ／Ｈｆ、ｊ！　、　５０ｍＭ　Ｎａ Ｃｊ！　ｐＨ８，０に対して透析した。

ＳＤＳの存在下、５〜１６％ポリアクリルアミドゲルで予備分析し、ウーレイ（ Ｗｒａｙ）の銀着色法によってタンパク質の可視化に続いて、三つの溶液を混合 して軽い、および重い鎖の全ての可能な組合せのほぼ等量の薬剤を得た。

鬼帥旦はタンパク質Ａセファローズによって血清から分離し、三つの部分標本に 分けた。一つの標本にジチオスレイトールに関して１６ｍＭに調整し、３０分間 、室温で保温した。この溶液をヨードアセトアミドに関して３２ｍＭに調整し室 温下で１０分間放置することによってアルキル化を行なった。次いでこの溶液を ５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／）１ｃ７！　、５０ｍＭ　ＮａＣｐ、ｐＨ８，０に対して 透析した。

第２の標本は１０ｍＭシスティンの存在下に３７℃で１％時間パパインと共に保 温した。ヨードアセトアミドの添加によって反応を止め、溶液を５０ｍＭ　Ｔｒ ｉｓ／ＨＣｊ！　、５０ｍＭ　ＮａＣ１ｐＨ８，０に対して透析した。消化され たＩｇＧのＦｃ断片をタンパク質セファロースで分離し、生成物を５０ｍＭホス フェート、１４５ｍＭ　ＮａＣ１ｐＨ７，０に対して透析した。

この物質は、溶液をジチオスレイトールに関して１４ｍＭ＆こし、室温下で３０ 分間保温することにより還元した。

この溶液をヨードアセトアミドに関して３０ｍＭにしてアルキル化し、次いでｐ Ｈ８，ＯＴｒｉｓｉ衝液に対して透析した。

第３の部分標本は更に処理をしなかった。

全ての三つの標本を５ＤＳ−ＰＡＧＥによって試験し、ヒトおよびマウス■ｃＧ に対して鍛着色した。このデータから、ブレンドによって自然の、および断片化 されたＩｇＧを含む混合物が得られた。

上記のようにして製造した三つの種類からの成分のブレンドの標本を市販の高お よび低分子量標準（薬剤）と並行で５〜１６％ポリアクリルアミドゲルにした。

タンパク質を鍛着色によって可視化した。結果を第１図に示した。

ＲＦ対標準の分子量対数の検量線を作成し、この検量線からｒｇｃ断片が下記分 子量を有することを見出しマウス　１３０．　１２２．　１０８．　８１．　４ ６および２２ヒト　１３５．　１２７．　１１３．　８６．　４７および２２兎 　１２２．　４３．　２５ スｍ それぞれの側に単一の試料に通用するスロワ）　（ｓｌｏｔ）を有し、かつ単一 試料のためのゲルの残部を有する二つの５〜１６％のポリアクリルアミドゲルを 製造した。

Ｓ　Ｄ　Ｓ　緩衝液中のマウス免疫標準の５μｇ（実施例３に記述）を一つのゲ ルの二つの単−側トランク（ｔｒａｃｋ）に添加し、ヒト免疫標準の５μｇを他 のゲルのこれらトラックに加えた。

８０μｇ　（２００μｌ）　の、百日咳（Ｂ、Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）　（Ｗｈｏ ｏｐｉｎｇＣｏｕｇｈ）菌抽出物を、夫々のゲルの中央の、幅の広いトラックに 加えた。

ゲルに約２Ａ時間、３６ｍ、ａｍｐの一定電流を通した。

次いで分離したタンパク質を７０Ｖの一定電圧下、１６時間、ニトロセルロース 膜に移動させた。

ニトロセルロース膜を帯状片に切断し、バイオランド（ＢｉｏＲａｄ）保温トレ イ（ｔｒａｙ）に移した。百日咳菌抗原を含むこの帯状片を種々のマウスおよび ヒト抗体で試験をした。

すべての帯状片（免状標準を含む）は、−次抗体および免疫標準が導かれる種類 に応じて最終的にホース・ラディッシｊ−’ペルオキシダーゼ（Ｈｏｒｓｅ　Ｒ ａｄｉｓｈ　Ｐｅｒ−ｏｘｉｄａｓｅ）　（ＨＲＰ）と結合した山羊の抗マウス ＩｇＧ、またはＨＲＰと結合した山羊の抗ヒＨｇＧで試験をした。

第２図は得られた結果を示す。トランク（Ｔｒａｃｋ）　１〜４は、 （１）マウス超免疫血清、（２）百日咳菌抽出物から精製したフィラメント状の ヘマグルチン（ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎ）　（Ｆ）ＩＡ）の製造に対して生じ たマウス・ポリクロナル血清、（３）マウス・モノクロナル抗体ＦＨＡおよび（ ４）マウス・ポリクロナル抗百日咳原（主として百日咳菌毒素）で試験された百 日咳菌抽出物に相当する。二つの架橋トラックは、マウス免疫標準に相当する。

トランク５〜７は、１／１００の希釈状態における三つの異なるヒト血清で試験 された百日咳菌抽出物に相当する。すなわち、トランク（５）は百日咳の疑いの ある患者、（６）は健康な、ワクチンを接種された個人および（７）はＦＬＩＳ Ａ試験によって抵抗ＦＨＡおよび抗百日咳体力価を有することが知られた患者か らの血清留めからのものである。

これらはヒト免疫標準で架橋されている。

第２図のマウス・パネルから、ＩｇＧ分子量（免疫）標準は種々の血清によって 認められた抗原の分子量を決定するための有用な分子量範囲の種類を提供するこ とが明白である。

ヒト・パネルから全体としての免疫検出がむしろ不得意であることは、電気泳動 、移動、および免疫検出段階の効果のチェックにおける有用な標準であることを 説明していることが明らかである。

免疫標準 マウス免疫標準　ヒト免疫標率 手続補正書動却 昭和６２年　９月２１日

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．イミユノグロブリンおよびその断片およびそのポリマーから成るＩｇ成分の 群から選択された既知分子量の少なくとも一つのタンパク質またはポリペプチド から成るタンパク質の分子量決定に使用するための組成物。
2. ２．前記既知分子量の少なくとも一つのタンパク質またはポリペプチドがイミユ ノグロブリンＧおよびその断片およびそのポリマーから成るＩｇＧ成分から選ば れた請求の範囲第１項記載のタンパク質の分子量決定に使用するための組成物。
3. ３．少なくとも二つの既知分子量の前記タンパク質またはポリペプチドから成る 請求の範囲第１項または第２項記載のタンパク質の分子量決定に使用するための 組成物。
4. ４．少なくとも四つの既知分子量の前記タンパク質またはポリペプチドから成る 請求の範囲第３項記載のタンパク質の分子量決定に使用するための組成物。
5. ５．既知分子量の前記タンパク質またはポリペプチドが前記組成物中にほぼ等量 存なする請求の範囲第３項記載のタンパク質の分子量決定に使用するための組成 物。
6. ６．既知分子量の前記タンパク質またはポリペプチドが分子量の範囲にわたって 規則的間隔で分布する分子量を有するように選択される請求の範囲第３項記載の タンパク質の分子量決定に使用するための組成物。
7. ７．既知分子量の前記タンパク質またはポリペプチドがイミユノグロブリンＧの Ｈ２Ｌ２，Ｈ２Ｌ，Ｈ２，ＨＬ，Ｈおよび／またはＬ鎖から成る請求の範囲第２ 項記載のタンパク質の分子量決定に使用するための組成物。
8. ８．下記の工程から成る一つまたは複数の試料タンパク質の分子量の検出および ／または決定のための方法。 ａ．試料タンパク質および請求の範囲第１項で規定した組成物を同時にポリマー ゲルによる電気泳動による分別にかける。 ｂ．分別された試料タンパク質およびＩｇＧ成分を検出し、比較して試料タンパ ク質の分子量を検出および／または決定する。
9. ９．ポリマーゲルがナトリウムドデシルサルフエートーポリアクリルアミドゲル （ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）である請求の範囲第８項記載の一つまたは複数の試料タン パク質の分子量の検出および／または決定のための方法。
10. １０．分別された試料タンパク質およびＩｇ成分の検出が前記ポリマーゲル中で 直接行なわれる請求の範囲第８項記載の一つまたは複数の試料タンパク質の分子 量の検出および／または決定のための方法。
11. １１．前記検出工程に先立ち、分別された試料タンパク質およびＩｇ成分が独立 した担体に移され、この移された物質について検出工程が実施される請求の範囲 第８項記載の一つまたは複数の試料タンパク質の分子量の検出および／または決 定のための方法。
12. １２．分別された試料タンパク質およびＩｇ成分が電気泳動移動によって半硬質 または硬質の、電荷を有するまたは反応性担体上で移動される請求の範囲第１１ 項記載の一つまたは複数の試料タンパク質の分子量の検出および／または決定の ための方法。