【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
〔技術分野〕
本発明はγ−リノレン酸含量の高いホスフアチ
ジルコリンのモルテイエレラ属糸状菌による製造
方法に関するものである。
〔従来技術〕
モルテイエレラ属に属するイサベリナ、ビナセ
ア、ラマニアナ、ラマニアナ・アングリスポラ、
及びナナ等の糸状菌体を、高濃度の炭水化物を炭
素源とする培地に培養することにより、γ−リノ
レン酸含有脂質含量の高い菌体を高密度で生産す
る方法は既に提案されている。（特願昭59−22394
号）。
ところで、グリセロ型リン脂質の一種類である
ホスフアチジルコリンは次式の様な構造を持つこ
とが知られている。
その構造脂肪酸であるRCOOHあるいは
R′COOHにγ−リノレン酸含量が20％以上含む
ホスフアチジルコリンが微生物から製造単離濃縮
された従来技術は存在しない。
〔目的〕
本発明は、γリノレン酸含量の高いホスフアチ
ジルコリンの製造方法を提供することを目的とす
る。
〔構成〕
即ち、本発明によれば、γ−リノレン酸含量の
高いホスフアチジルコリンの生産にあたり、モル
テイエレラ属に属するイサベリナ、ビナセア、ナ
ナ、ラマニアナ、ラマニアナ・アングリスポラ又
はナナの糸状菌菌株を炭水化物を炭素源とした培
地に培養して、培地中に得られるγ−リノレン酸
を含む脂質の含量菌体より水の存在下でアルコー
ル抽出されたγ−リノレン酸含有脂質、特に多段
抽出（特願昭60−10283号）における第１段アル
コール抽出区分から効率よくγ−リノレン酸含量
の高いホスフアチジルコリンを、例えばクロマト
グラフイーなどで分離、濃縮することを特徴とす
るγ−リノレン酸含量の高いホスフアチジルコリ
ンの製造方法が提供される。
〔菌体培養方法〕
本発明においては、用いる使用菌はモルテイエ
レラ（Mortierella）属のイサベリナ
（isabellina）〔IFO7824、7884、7873、8183、
9309〕ビナセア（Vinacea）〔IFO6738〕、ナナ
（nana）〔IFO8794〕、ラマニアナ（ramaniana）
〔IFO8287〕、ラマニアナ・アングリスポラ
（ramaniana var.anglispora）〔IFO8187〕の各
種菌株である。なお、上記した菌はいずれも財団
法人発酵研究所に保存され、IFOカタログ（菌株
目録）に記載されている糸状菌である。
上記の糸状菌を培養する培地の炭素源である炭
水化物としては、たとえばグルコース、フラクト
ース、サツカロース、糖密、デン粉、木材糖化液
などが用いられる。炭水化物は培地１中に20〜
400ｇ用いられるのが好ましい。また窒素源とし
ては、例えば硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウムなど
の様な無機窒素源、または尿素、ペプトン、酵母
エキス、コーン、スチーブ・リカーなど有機窒素
源が用いられる。無機塩としては、例えば
KH2PO4、K2HPO4、NaCl、FeSO4・7H2O、
MgSO4・7H2O、ZnSO4・7H2Oなどが用いられ
る。その他必要に応じて微量要素、その他の栄養
源を添加する。
上記糸状菌の培養は通常液体培地で、振とう培
養、通気撹拌培養などにより行われる。培地のPH
は3.0〜6.0が良く、通常２日〜10日間位培養が行
われる。更に、培養の初期すなわち初期培地に、
また通気撹拌培養の場合では前培養培地に、ある
いは培養の中間段階で酢酸あるいは酢酸塩（ナト
リウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩）を
炭素源濃度など培養条件に応じて0.1〜20ｇ／
培地の割合で加えることにより菌体の培養が行わ
れる（特願昭59−115162）。かくして、培養物中
にγ−リノレン酸など不飽和脂肪酸含量が高い脂
質の高含量菌体が生産性高く生産されるので、培
養物より菌体を分離し、脂質が糸状菌菌体中に含
まれるので、この菌体よりγ−リノレン酸など不
飽和脂肪酸含量の高い脂質を採取するのが好適で
ある。培養物より菌体の分離に当つては菌糸があ
まりのびず極めて小単位（１〜10細胞）で培養さ
れており、従つて、例えば遠心脱水器などにより
極めて容易に分離され、乾燥度の高い菌体（含水
率約60％）になる利点を有することが明らかにな
つた。
〔抽出方法〕
γ−リノレン酸含量の高い脂質の採取は多段抽
出方法で行われる。すなわち、本発明において
は、モルテイエレラ属糸状菌体を、先ず、水の存
在下、アルコールを用いる第１抽出処理工程にお
いて抽出処理する。この場合、処理原料として用
いる菌体には、培地から遠心分離法や濾過法によ
つて分離された含水率50〜80％程度の含水菌体ケ
ーキや、その乾燥物を用いることができるが、経
済性の点からは、含水菌体ケーキを用いるのが有
利である。また、この第１抽出処理工程では、菌
体は、水の存在下、アルコール溶媒中で、機械力
を加えて破砕させることが必要であり、この菌体
破砕によつて効率的な抽出処理が達成される。こ
のような菌体破砕を伴う抽出装置としては、従来
公知の湿式粉砕機、例えば、ボールミル、マサツ
円板ミル、ヘンセルミキサー等を用いることがで
きる。このような粉砕機により菌体は、圧縮力や
マサツ力等の機械力を受け、その一部が破損ない
し破砕される。この場合、菌体を余りにも徴細に
破砕することは好ましくなく、濾過性の点から
は、その菌体の粒径は実質上変化しない程度に機
械力を加えるのが好ましい。アルコール溶媒とし
ては、通常、メタノール、エタノール、プロパノ
ール等の低級アルコールが用いられるが、人体に
対する安全性の点から、エタノールの使用が好ま
しい。アルコール溶媒の使用割合は、菌体１重量
部（乾燥物基準）に対し、２〜７重量部、好まし
くは３〜６重量部の割合である。この第１抽出処
理工程では、極性脂質を溶出させるために、水の
存在下で抽出処理を行うことが必要であり、水の
存在量は、アルコール溶媒１重量に対し、0.2〜
0.7重量部、好ましくは0.3〜0.6重量部である。こ
の第１抽出処理系に対する水の添加は、水を含む
菌体を用いて実施し得る他、アルコール溶媒に添
加することによつて行うことができる。このよう
な抽出処理により、菌体に含まれる全極性脂質の
90％以上を抽出分離させることができ、また中性
脂質の一部が抽出される。また、この第１抽出工
程では、脂質回収率は、全脂質回収率に対し、通
常、５〜30重量％、好ましくは８〜25重量％であ
る。
次に、前記で得た第１抽出生成物は第１固液分
離工程で破砕菌体成分と極性脂質を含むアルコー
ル溶媒成分とにそれぞれ分離される。この場合、
固液分離法としては、遠心分離法や、濾過分離法
等の慣用の方法が採用される。脂質分は得られた
極性脂質を含むアルコール溶媒成分から常法に従
つて減圧下で溶媒を蒸留留去することにより得ら
れる。
〔吸着分離法〕
前記多段抽出方法のアルコールを溶媒とした第
１段目の抽出操作により得られた脂質成分につい
て吸着カラムクロマトグラフイ法による分離操作
を行うことによりγ−リノレン酸含量の高いホス
フアチジルコリンは分離、精製される。即ち、50
〜300メツシユ、好ましくは100〜200メツシユの
ケイ酸（シリカゲル）、徴粒多孔質シリカ、シリ
カゲルＨ、シリカゲルＧ、ケイ酸マグネシウムな
どを充填剤としたカラムを用いて、ヘキサン、シ
クロヘキサン、四塩化炭素、ベンゼン、クロロホ
ルム、ジエチルエーテル、酢酸エチル、アセト
ン、アセトニトリル、メタノール、酢酸水を溶媒
として用いて溶媒の極性に応じて、一種類ないし
２〜３種類混合した溶媒、例えば、クロムホルム
とメタノール４：１、３：２、１：１、１：２混
合溶媒などを順次流下することにより、各極性脂
質の吸着力の差により分離溶出が可能になり、γ
−リノレン酸含量の高いホスフアチジルコリンが
分離されて含まれる溶出液を得る。この溶出液か
ら常法により溶媒を減圧下で蒸留留去することに
より、γ−リノレン酸含量の高いホスフアチジル
コリンが濃縮されることを見出した。
かくして、本発明によれば高濃度の炭水化物を
炭素源とする培地に高密度に培養された脂質含量
の高い菌体より採取された脂質からγ−リノレン
酸含量の高いホスフアチジルコリンの製造が可能
になる。
〔効果〕
γ−リノレン酸〔18：３（６、９、12）〕はリノ
ール酸と共に哺乳動物では食飼として要求される
必須脂肪酸である。これはγ−リノレン酸が体内
でビスホモ−γ−リノレン酸となり、さらにはア
ラキドン酸となる前駆体であること、ビスホモー
γ−リノレン酸、アラキドン酸はそれぞれプロス
タグランジン、E1、F1a及びE2、F2aとなり生体中
で極めて重要な生理的な役割をはたしているから
である。従つて、γ−リノレン酸含有脂質は医薬
品などとして利用できるものであることは明らか
である。
とくに、γ−リノレン酸は生体内ではリン脂質
として蓄縮されていることが知られており、プロ
スタグランジンになる際の前駆体としてはリン脂
質状態の方がより有効に作用するものと考えられ
ることからこのようにγ−リノレン酸含量が20％
以上と高いホスフアチジルコリンの医薬品として
の用途は十分期待できる。
なお、ホスフアチジルコリンはそれを主成分と
するリン脂質混合物（レシチン）として知られて
おり、乳化剤などの食品添加物としてマーガリ
ン、チヨコレートなどに用いられている。
〔実施例〕
次に本発明を実施例により詳細に説明する。
実施例
グルコース60ｇ、KH2PO42ｇ、
MgSO47H2O0.3ｇ、NaCl0.1ｇ、マルト・エキス
0.2ｇ、イースト・エキス0.2ｇ、ペプトン0.1ｇ、
FeSO4・7H2O10mg、MnSO4・4H2O1.0mgと窒素
源として（NH4）2SO43ｇ、〔Ｃ／Ｎ比（炭素源中
の炭素原子重量／窒素源中の窒素原子重量）は約
40〕を脱イオン水1000mlに混合した培地を基準と
して炭素源である炭水化物（グルコース、糖な
ど）の濃度を増加させた場合、その濃度に応じて
培地成分を増加して、又窒素源を尿素などに変え
た場合は同じＣ／Ｎ比になるように培地を調整し
た。
この培地を30の培養槽では20仕込み、それ
ぞれ菌株を接種し、30℃の培養温度で所定の時
間、通気量0.5〜2.0vvmで300〜700rpmで撹拌し
て培養を行つた。培養後遠心分離法で菌体を集め
た。又、菌体の増殖量、脂質生成量及び培地中の
炭水化物濃度の測定を行うため、培養の中間段階
において所定の時間毎に100mlずつ試料の採取を
行い、ロ過法により菌体と培地の分離を行つた。
分離された菌体はその一部を含水率の定量のた
め、精秤し恒温槽中120℃で一昼夜乾燥し、含水
率を求め、残りの菌体についての脂質の抽出を行
つた。菌体からの脂質の抽出は、残りの湿菌体に
クロロホルム−メタノール（２：1V／Ｖ）混液
を加え、ガラスビーズ存在下にホモジナイズする
ことにより菌体の破砕と脂質の抽出を同時に行つ
た。なお、抽出を完全に行うため、これを５回繰
返し、全抽出液を集めた。上記抽出液をFlochの
分配洗浄法により精製した後、溶媒を減圧留去
し、重量法で全脂質量を測定した。菌体を除いた
培地については高速液体クロマトグラフイー
（HPLC）により炭水化物（グルコース、フラク
トース、サツカロース）の濃度を測定し、濃度が
０になつた時点で培養を終了した。
菌株モルテイエレラ・ラマニアナ・アングリス
ポラIFO8187、モルテイエレラ・ビナセア
IFO6738、モルテイエレラ・イサベリナIFO7824
について、グルコースを炭素源、尿素を窒素源と
した30培養槽により培養して得られた菌体増殖
量（乾燥重量ｇ／）、脂質生成量（ｇ／）、脂
質含量（％）、脂質中のγ−リノレン酸含量を表
−１にまとめて示した。なお培養時間として示し
た時間は炭素源であるグルコースが完全に消費さ
れ、培地中になくなつた時間でありその時間で培
養を停止した。
表−１で３菌株ともγ−リノレン酸を含む脂質
が生産性高く生産されていることがわかる。
[Technical Field] The present invention relates to a method for producing phosphatidylcholine with a high content of γ-linolenic acid using a filamentous fungus of the genus Morteierella. [Prior art] Isabelina, Vinacea, Lamaniana, Lamaniana angrispora, belonging to the genus Morteierella,
A method has already been proposed for producing microbial cells with a high content of γ-linolenic acid-containing lipids at a high density by culturing filamentous microbial cells such as N. and Nana in a medium containing a high concentration of carbohydrate as a carbon source. (Special application 1986-22394
issue). By the way, phosphatidylcholine, which is a type of glycerophospholipid, is known to have a structure as shown in the following formula. Its structural fatty acid RCOOH or
There is no prior art in which phosphatidylcholine containing 20% or more of γ-linolenic acid in R'COOH is produced, isolated and concentrated from microorganisms. [Objective] An object of the present invention is to provide a method for producing phosphatidylcholine with a high content of γ-linolenic acid. [Structure] That is, according to the present invention, in producing phosphatidylcholine having a high content of γ-linolenic acid, a filamentous fungus strain of Isabelina, Vinacea, Nana, Lamaniana, Lamaniana angrispora or Nana belonging to the genus Morteierella is treated with carbohydrates. Content of lipids containing γ-linolenic acid obtained in the medium by culturing in a medium with carbon source. 60-10283), which is characterized by efficiently separating and concentrating phosphatidylcholine having a high γ-linolenic acid content from the first stage alcohol extraction section by, for example, chromatography. A method for producing phosphatidylcholine is provided. [Bacteria cell culture method] In the present invention, the bacteria used are isabellina of the genus Mortierella [IFO7824, 7884, 7873, 8183,
9309] Vinacea [IFO6738], nana [IFO8794], Ramaniana
[IFO8287], various strains of Ramaniana anglispora (ramaniana var.anglispora) [IFO8187]. All of the above-mentioned bacteria are filamentous bacteria that are preserved at the Fermentation Research Institute and are listed in the IFO catalog (inventory of bacterial strains). Examples of carbohydrates used as carbon sources for the medium for culturing the filamentous fungi include glucose, fructose, succalose, molasses, starch, and wood saccharification liquor. Carbohydrates range from 20 to 20 in medium 1
Preferably 400g is used. As the nitrogen source, for example, an inorganic nitrogen source such as ammonium nitrate, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, etc., or an organic nitrogen source such as urea, peptone, yeast extract, corn, or Steve liquor can be used. Examples of inorganic salts include
KH 2 PO 4 , K 2 HPO 4 , NaCl, FeSO 4・7H 2 O,
MgSO 4 .7H 2 O, ZnSO 4 .7H 2 O, etc. are used. Add trace elements and other nutritional sources as necessary. The above-mentioned filamentous fungi are usually cultured in a liquid medium by shaking culture, aeration stirring culture, or the like. PH of medium
A value of 3.0 to 6.0 is good, and culture is usually carried out for about 2 to 10 days. Furthermore, at the beginning of culture, that is, in the initial medium,
In addition, in the case of aerated agitation culture, acetic acid or acetate (alkali metal salts such as sodium salts and potassium salts) is added to the preculture medium or at an intermediate stage of culture at 0.1 to 20 g/min depending on culture conditions such as carbon source concentration.
Culture of bacterial cells is carried out by adding the same amount to the culture medium (Japanese Patent Application No. 115162/1982). In this way, bacterial cells with a high lipid content and high unsaturated fatty acid content such as γ-linolenic acid are produced in the culture with high productivity. Therefore, it is preferable to collect lipids with a high content of unsaturated fatty acids such as γ-linolenic acid from the bacterial cells. When separating the bacterial cells from the culture, the hyphae do not spread very much and are cultured in extremely small units (1 to 10 cells). It has been revealed that this product has the advantage of becoming a bacterial cell (with a water content of approximately 60%). [Extraction method] A multi-stage extraction method is used to collect lipids with a high content of γ-linolenic acid. That is, in the present invention, filamentous fungi of the genus Morteierella are first extracted in the first extraction step using alcohol in the presence of water. In this case, the bacterial cells used as the raw material for treatment can be a hydrated bacterial cake with a water content of about 50 to 80% separated from the culture medium by centrifugation or filtration, or a dried product thereof. From the point of view of economy, it is advantageous to use a water-containing bacterial cell cake. In addition, in this first extraction treatment step, it is necessary to crush the bacterial cells by applying mechanical force in the presence of water and in an alcohol solvent, and by crushing the bacterial cells, efficient extraction treatment can be achieved. achieved. As such an extraction device that involves crushing the bacterial cells, a conventionally known wet grinder such as a ball mill, a Masatsu disk mill, a Hensel mixer, etc. can be used. With such a crusher, the bacterial cells are subjected to mechanical forces such as compressive force and crushing force, and some of the bacterial cells are damaged or crushed. In this case, it is not preferable to crush the bacterial cells too finely, and from the viewpoint of filterability, it is preferable to apply mechanical force to such an extent that the particle size of the bacterial cells does not substantially change. As the alcohol solvent, lower alcohols such as methanol, ethanol, and propanol are usually used, but from the viewpoint of safety for the human body, it is preferable to use ethanol. The alcohol solvent is used in an amount of 2 to 7 parts by weight, preferably 3 to 6 parts by weight, per 1 part by weight of bacterial cells (on a dry matter basis). In this first extraction process, in order to elute polar lipids, it is necessary to perform the extraction process in the presence of water, and the amount of water present is 0.2 to 0.2 to 1 weight of alcohol solvent.
0.7 parts by weight, preferably 0.3 to 0.6 parts by weight. Addition of water to this first extraction treatment system can be carried out using microbial cells containing water, or can be carried out by adding it to an alcohol solvent. This extraction process removes all polar lipids contained in the bacterial cells.
More than 90% of the lipids can be extracted and separated, and a portion of the neutral lipids can also be extracted. Further, in this first extraction step, the lipid recovery rate is usually 5 to 30% by weight, preferably 8 to 25% by weight, based on the total lipid recovery rate. Next, the first extraction product obtained above is separated into a crushed bacterial cell component and an alcohol solvent component containing polar lipids in a first solid-liquid separation step. in this case,
As the solid-liquid separation method, a conventional method such as a centrifugal separation method or a filtration separation method is employed. The lipid component can be obtained by distilling off the solvent under reduced pressure from the alcohol solvent component containing the obtained polar lipid in accordance with a conventional method. [Adsorption separation method] The lipid components obtained by the first stage extraction operation using alcohol as a solvent in the multi-stage extraction method are separated by adsorption column chromatography to obtain phosphants with a high content of γ-linolenic acid. Atidylcholine is separated and purified. i.e. 50
Hexane, cyclohexane, carbon tetrachloride, etc. using a column packed with ~300 meshes, preferably 100 to 200 meshes of silicic acid (silica gel), fine-grained porous silica, silica gel H, silica gel G, magnesium silicate, etc. , benzene, chloroform, diethyl ether, ethyl acetate, acetone, acetonitrile, methanol, aqueous acetic acid as a solvent, depending on the polarity of the solvent, one or a mixture of two or three solvents, such as chromiumform and methanol4: By sequentially flowing 1, 3:2, 1:1, 1:2 mixed solvents, etc., separation and elution is possible due to the difference in adsorption power of each polar lipid, and γ
- Obtaining an eluate in which phosphatidylcholine with a high linolenic acid content is separated. It has been found that by distilling off the solvent from this eluate under reduced pressure using a conventional method, phosphatidylcholine with a high content of γ-linolenic acid can be concentrated. Thus, according to the present invention, it is possible to produce phosphatidylcholine with a high content of γ-linolenic acid from lipids collected from bacterial cells with a high lipid content cultured at high density in a medium containing a high concentration of carbohydrates as a carbon source. It becomes possible. [Effects] γ-Linolenic acid [18:3 (6, 9, 12)] is an essential fatty acid required in mammals' diet, along with linoleic acid. This is because γ-linolenic acid is a precursor that becomes bishomo-γ-linolenic acid and then arachidonic acid in the body, and bishomo-γ-linolenic acid and arachidonic acid are respectively prostaglandins, E 1 , F 1a and E 2 , F2a , which plays an extremely important physiological role in living organisms. Therefore, it is clear that γ-linolenic acid-containing lipids can be used as pharmaceuticals. In particular, γ-linolenic acid is known to be stored in the body as a phospholipid, and it is thought that the phospholipid state acts more effectively as a precursor for turning into prostaglandins. As shown above, the γ-linolenic acid content is 20%.
The use of phosphatidylcholine as a medicinal product is fully expected. Phosphatidylcholine is known as a phospholipid mixture (lecithin) containing it as a main component, and is used as a food additive such as an emulsifier in margarine, thiokolate, etc. [Example] Next, the present invention will be explained in detail with reference to Examples. Example Glucose 60g, KH 2 PO 4 2g,
MgSO 4 7H 2 O0.3g, NaCl0.1g, malt extract
0.2g, yeast extract 0.2g, peptone 0.1g,
10 mg of FeSO 4・7H 2 O, 1.0 mg of MnSO 4・4H 2 O and 3 g of (NH 4 ) 2 SO 4 as a nitrogen source, [C/N ratio (weight of carbon atoms in carbon source/weight of nitrogen atoms in nitrogen source)] is about
40] mixed with 1000 ml of deionized water, if the concentration of carbohydrates (glucose, sugar, etc.) as a carbon source is increased, the medium components are increased according to the concentration, and the nitrogen source is changed to urea. etc., the medium was adjusted so that the C/N ratio remained the same. Thirty culture tanks were filled with 20 of this medium, each strain was inoculated, and cultured at a culture temperature of 30° C. for a predetermined period of time, with an aeration rate of 0.5 to 2.0 vvm, and stirring at 300 to 700 rpm. After culturing, the bacterial cells were collected by centrifugation. In addition, in order to measure the growth rate of bacterial cells, the amount of lipid production, and the carbohydrate concentration in the medium, samples of 100 ml were collected at predetermined intervals during the intermediate stage of culture, and the mixture of bacterial cells and medium was filtered using the filtration method. I did the separation.
A portion of the isolated bacterial cells was accurately weighed and dried overnight at 120°C in a constant temperature bath to determine the moisture content, and the lipids of the remaining bacterial cells were extracted. To extract lipids from bacterial cells, a chloroform-methanol (2:1 V/V) mixture was added to the remaining wet bacterial cells and homogenized in the presence of glass beads, thereby crushing the bacterial cells and extracting lipids at the same time. . In order to perform the extraction completely, this was repeated five times and all the extracts were collected. After the above extract was purified by Floch's partition washing method, the solvent was distilled off under reduced pressure, and the total lipid amount was measured gravimetrically. The concentration of carbohydrates (glucose, fructose, sutucarose) in the medium from which the bacterial cells were removed was measured by high-performance liquid chromatography (HPLC), and the culture was terminated when the concentration reached 0. Strains Morteierella lamaniana anglispora IFO8187, Morteierella vinacea
IFO6738, Morteierella Isabelina IFO7824
The amount of bacterial cell growth (dry weight g/), lipid production amount (g/), lipid content (%), lipid content obtained by culturing in 30 culture tanks using glucose as the carbon source and urea as the nitrogen source. The γ-linolenic acid content of the samples is summarized in Table 1. Note that the time shown as the culture time is the time when glucose, which is a carbon source, is completely consumed and disappears in the medium, and the culture was stopped at that time. Table 1 shows that all three strains produce lipids containing γ-linolenic acid with high productivity.
【表】
表−１のモルテイエレラ属糸状菌の30培養槽
による大量培養により得られたγ−リノレン酸含
有脂質の高含量で含む菌体を遠心脱水器により、
脱水分離し、含水率50〜70％の菌体ブロツク（ケ
ーキ）を得る。この菌体ブロツク（以下、湿菌体
と呼ぶ）をオートクレーブ中で120℃、２気圧で
10分間減菌した後、以下に示すようにして脂質の
抽出を行つた。
前記の湿菌体1.0〜1.7Kgを、内容積６のステ
ンレス製ボールミルに入れ、さらにエタノール２
を溶媒として加え、４時間ボールミルにより菌
体を破砕しながら抽出処理を行つた。抽出液を濾
過した後、得られた菌体（含水率3.4％）につい
て再度ヘキサン２を溶媒として用い、前記と同
様の抽出処理を７時間行つた。
前記２段抽出方法による３菌株についての第１
段のエタノールによる脂質の対菌体抽出率が表−
２に示されている。
このエタノール抽出脂質について、下記の方法
によるケイ酸（100〜200メツシユ）を充填剤とす
るカラムクロマトグラフイーを行いホスフアチジ
ルコリンの濃縮を行つた。即ち、前記抽出脂質１
ｇに対して30ｇのケイ酸を充填したカラムに脂質
を吸着させた後、中性脂質をクロロホルムで糖脂
質をアセトン、クロロホルム、メタノール４：１
及び同１：１溶出液でホスフアチジルコリン以外
のリン脂質を流出した後、クロロホルム、メタノ
ール２：３を溶出液として溶出する区分を得た。
得られた区分について薄層クロマトグラフイーに
よる分析の結果ホスフアチジルコリンが純度ほぼ
100％に濃縮されていることを認めた。
３菌株についてエタノール抽出脂質量に対する
抽出率は表−２の如く6.9〜8.0％と比較的高い値
であり、乾燥菌体に対する抽出率は0.32〜0.46％
であつた。
このホスフアチジルコリンについて加水分解し
た後、メチルエステル化を行い、その脂肪酸組成
を比べた結果γ−リノレン酸含量が25.7％以上と
中性脂質区分の約７％と異なり極めて高い値が認
められた。脂肪酸組成を表−２の欄外に例示した
がγ−リノレン酸以外の不飽和脂肪酸としてはリ
ノール酸含量が高い特殊な脂肪酸組成を有するも
のであることが明らかになつた。[Table] Cells containing a high content of γ-linolenic acid-containing lipids obtained by mass culturing the Morteierella filamentous fungi shown in Table 1 in 30 culture tanks were collected using a centrifugal dehydrator.
Dehydrate and separate to obtain a bacterial block (cake) with a moisture content of 50 to 70%. This bacterial block (hereinafter referred to as wet bacterial cells) was heated at 120℃ and 2 atm in an autoclave.
After sterilization for 10 minutes, lipids were extracted as described below. Put 1.0 to 1.7 kg of the wet bacterial cells into a stainless steel ball mill with an internal volume of 6, and add 2 ml of ethanol.
was added as a solvent, and the extraction process was performed while crushing the bacterial cells using a ball mill for 4 hours. After filtering the extract, the obtained bacterial cells (water content 3.4%) were subjected to the same extraction treatment as above for 7 hours using hexane 2 as a solvent again. The first sample for the three bacterial strains obtained by the two-stage extraction method
The table shows the extraction rate of lipids from bacterial cells by ethanol in stages.
2. The ethanol-extracted lipids were subjected to column chromatography using silicic acid (100 to 200 mesh) as a packing material in the following manner to concentrate phosphatidylcholine. That is, the extracted lipid 1
After adsorbing lipids on a column packed with 30 g of silicic acid per g, neutral lipids were adsorbed with chloroform, and glycolipids were mixed with acetone, chloroform, and methanol (4:1).
After eluting phospholipids other than phosphatidylcholine with the same 1:1 eluent, a section was obtained that was eluted with chloroform and methanol 2:3 as an eluent.
Analysis of the obtained classification by thin layer chromatography revealed that phosphatidylcholine was almost pure.
It was confirmed that it was concentrated to 100%. As shown in Table 2, the extraction rate based on the amount of ethanol-extracted lipids for the three strains is relatively high at 6.9-8.0%, and the extraction rate based on dry bacterial cells is 0.32-0.46%.
It was hot. After hydrolyzing this phosphatidylcholine, it was methyl esterified and the fatty acid composition was compared. As a result, the γ-linolenic acid content was found to be over 25.7%, which is extremely high compared to about 7% in the neutral lipid category. Ta. The fatty acid composition is illustrated in the margin of Table 2, and it has become clear that unsaturated fatty acids other than γ-linolenic acid have a special fatty acid composition with a high linoleic acid content.
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