JPS6344596A - 新規抑制因子ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈発明の背景〉 本発明は新規ヘプチドに関する。更に詳細には、本発明
はミリストイル化酵素の抑制因子として有用な、６−８
個のアミノ酸残基を有する特異なヘプチドに関する、 真核生物の特定の蛋白質での脂肪酸アシル化はよく知ら
れた工程であり、これは便宜上２つに分類することがで
きる。即ち、その１つは、遺伝子の翻訳後に恐らくゴル
ゾ体において、バルミテー）　（Ｃ１６）がエステル又
はチオエステル結合を介して膜蛋白質に結合する工、Ｓ
であり、他の１つは、蛋白質生合成の初期の段階におい
てミｌ）ステート（Ｃ１４）がアミド結合を介して溶解
性の膜蛋白質に共有結合する工程である。Ｎ−ミリスト
イル蛋白質では、そのアシル化部位はアミン末端グリシ
ン残基であることが知られているＣ　Ａｉｔｋｉｎら。

ＦＥＢＳＬｅｔｔ、１５０．３１４−３１８（１９８２
）；５ｃｈｕｌｔｚら、　　５ｃｉｅｎｃｅ　２２７　
ｅ　　４２７−４２９（１９８５）　；　Ｃａｒｒら、
　　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ７９．　６１２８−６１３１　　（１９８２）；
Ｏｚｏ　１　ｓら、　　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５
９．　１３３４９−１３３５４（１９８４）：及びＨｅ
ｎｄｅｒｓｏｎら。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ−Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８　
０　＊　　３３　９　−３４３（１９８３）　　〕。

蛋白質のＮ−ミリストイル化については、今日、ようや
くその機能が認識され始めたところである。

公知の４つのＮ−ミリストイル蛋白質として、ｐ６０５
ｒ０ｔ　サイクリック尼０依存プロティンキナーゼの触
媒サブユニット、カルシノイリンＢ−サブユニット、ネ
ズミ白血病ウィル発癌遺伝子ｇａｇ−ａｂｌａ合蛋白質
があり、これらはプロティンキナーゼ、あるいは細廊の
生合成経路を調節するホスホプロティンキナーゼの調節
因子のいずれかである。ｐ６ｇ’Ｖ−８ｒＣの場合、膜
との結合及びこの蛋白質の細肥形質転換能を発現するた
めにはミ’）ストイル化が必要であることが示されてい
るＣ　Ｃｒｏｓｓら、　　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｃｅ１１．　
Ｂｉｏｌ、　４．　１８３４−１８４２　（１９８４）
　；　Ｋａｍｐｓら、　　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２　ｅ　　４６２５
−４６２８（１９８５））。

ペプチド合成法によシ共有結合せしめて得られる比較的
短鎖の合成ペプチドの開発は、同定する際にまた酵素作
用による脂肪酸アシル化の調ｉを研究する上で非常に望
ましいものである。このようなペプチドによシ、酵母あ
るいは補乳動物細廊のミリストイル化酵素の合成基質を
提供することができる。またこのようなペプチドにより
、天然の基質に対して高置に特異的な競争抑制因子を提
供することも可能である。か（して、ミリストイル化酵
素の基質として提供することのできる新規合成ペプチド
が得られ、これらについては肌Ｓ。

ＰａｔｅｎｔＳｅｒ、／１６８９４．２３５（１９８６
年８月７日出ｄ）号明細書に記載されて２す、これら基
質の好ましい例として次のオクタペプチドがある。

Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａ
ｒｇ　−Ａｒｇミリストイル化反応について表わせば次
のようになる。

〈発明の要旨〉 本発明によれば、以下に示すアミノ酸配列からなる群よ
フ選ばれたアミノ酸配列を有する、ミリストイル化酵素
の押割因子ペプチド又はその生理学的許容し得るアミド
誘導体もしくは塩誘導体が提供される。

Ｇｌｙ−Ｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ　。

Ｇｌｙ−Ｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ
又は１日 Ｇｌｙ−Ｒ−Ａｌａ　−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒ
ｇ−Ａｒｇ　。

（式中、ＲはＬｅｕ　、　　Ｐｈｅ　、　　Ｔｙｒ又は
Ｖａｌを示す）これらペプチドのアミド誘導体としては
カルボキサミドが挙げられ、塩誘導体としてはＨＣｌ塩
が挙げられる。

〈発明の詳細な記述〉 本発明の新規ペプチドは、慣用的なペプチド合成法を適
当に採用することによって合成することができる。構成
アミノ酸をペプチド鎖に付加して行く一連の縮合反応に
よシ、目的とするペプチドを調製することができる。

各種の試粱即ち、カルボベンシルオキシ基、ｔ−ブチル
オキシカルボニル（ＢＯＣ）基などのＮ−保護基；ジシ
クロヘキシル力ルポゾイミド、カルボニルジイミダゾー
ルなどの縮合剤；Ｎ−ヒドロキシフタルイミドエステル
、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどの活性化
エステル；トリフルオロ酢酸、　ＨＣノジオキサン浴液
、ボロントリス（トリフルオロアセテート）、シアノダ
ンプロマイトなどの開裂剤を使用することは、古典的ペ
プチド合成にはよく仰られた事項であり、またｍ液中で
の単離品との反応あるいは中間体の精製などもよく知ら
れている。

本発明のペプチドは、よく知られたＭ６ｒｒｉｆｉｅｌ
ｄの固相支持法［Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　＊　Ｊ、　Ａ
ｍｅｒ、　Ｃｈｅｍ。

Ｓｏｃ、８５．　２１４９−５４（１９６３）：５ｃｉ
ｅｎｃｅ　１５０　、１７８−８５　（１９６５）　〕
によって好ましく調製することができる。この方法では
、古典的ペプチド合成に使用される反応を何回も繰り返
しまた保護基を何回も使用するが、この方法によれば、
通常、架橋ポリスチレン又はスチレンーゾビニルベンゼ
ンコボリマーなどの固相支持体上にそのカルボキシ末端
が固定された目的とするペプチド鎖が得られる。この方
法では、各工程での過剰な試薬を、単にポリマーを洗う
ことによって除去することができるため、多くの操作を
簡略化することが可能である。

Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄのペプチド合成法の一連の工ａｔ
示すと次のようになる。

工程） （ＰＳはポリスチレンを示す。） （ＣＨ３ＣＨ２）３Ｎ”ＨＣ／一 工程） 　　Ｒ２ Ｃ６Ｈ１，ＮＨＣＮＨＣ６Ｈ１工 工程Ｉに次いで、例えば２５％トリフルオロ酢酸のメチ
レンクロライド溶液でｔ　−ＢＯＣを脱離せしめ、更に
過剰のトリエチルアミンを加えて遊離のＮ−アミノ末端
を得て、第２の保護されたアミノ酸（Ｒ２）の活性化エ
ステルとの反応を可能にせしめる。最終工程では、例え
ば無水ＨＦのアニソール溶液で処理して、目的とする完
成されたボリペゾチドｆｔｐｓ樹脂から脱離する。

これらの固相支持法についての更に詳細な事項について
は、Ｓｔｅｗａｒｔ　（！：　Ｙｏｕｎｇの文献”固相
ペプ１９６９　：　Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの総説′″Ａ
ａｖａｎｃ６ｓ　ｉｎＥｎＺ７ｍＯＩＯｇ７”３２．　
　ｐｌ）、２２１−２９６．　　Ｆ、Ｆ。

Ｎｏ１ｄ　、　　Ｅｄ−＋　　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃ
ｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、　ＮｅＷｙｏｒｋ、　１９
６９　；　Ｅｒ１ｃｋｓｏｎとＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄの
文献”　Ｔｈｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　”　Ｖｏｌ　２．
　　ｐ、：２５５　ｅｔ　ｓｅｑ。

（ｅｄ、　ＮｅｕｒａｔｈとＨｌｌｌ　）　ｅ　　Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　ＮｅｗＹｏｒｋ、　１９
７６などが参考とされる。

本発明の好ましい抑制因子ペプチドとしては欠のオクタ
ペプチドが挙げられる。

Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ　−Ａｌａ−
Ａｒｇ−Ａｒｇ及びＧｌｙ−Ｔｙｒ　−Ａｌａ−Ａｌａ
　−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ本発明のへキナペ
ゾチド、ヘプタペプチド抑制因子としては、上記したそ
れぞれのオクタペプチドのカルボキシ末端の１つ又は２
つのアルヤニンが欠失したヘキサペプチド、ヘプタへゾ
チドが好ましいものとして挙げられる。アミノ酸配列の
２番目の位置に、疎水性基を有するペプチドが好ましい
。かかるペプチドはミリストイル化酵素の基Ｇｌｙ−Ａ
ｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒ
ｇのミリストイル化を抑制する。チロシンを含有するオ
クタペプチドは３．１５　ｍの見掛けＫｉ値を有する。

アミノ酸配列の２番目の位置にロイシン又はバリン残基
を有するオクタペプチドは基質として機能するが、それ
ぞれ３．３　ｍＭ、　　３．７　ｍＭの大きな見掛けＫ
つ値を有しており、また基質 Ｇｌｙ−Ａｓ　ｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ　−Ａｌａ
−Ａｒｇ−Ａｒｇに対して小さな最大速度（■ｍａｘ）
含有する。これらのオクタペプチドはいずれも、Ｇｌｙ
−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
Ａｒｇのミリストイル化を抑制する。ロイシン含有オク
タペプチドは、０．０６　ｍＭ　ＣＤ　Ｋ０値を有し、
競争的に抑制する。

本発明の好ましいオクタペプチドは、２＃ｒ目の位置の
アスパラギンの代わりにロイシン、フェニルアラニン、
トリジシン又はバリンが置換した以外は、牛心筋のＣＡ
ＭＰ依存プロティンキナーゼのＮ末端側の６個のアミノ
酸残基と同じ配列を有し、それに続いて２つのアルヤニ
ン残基を有する。このアルヤニン残基は、ｃａｒｒらに
よって報告された（　Ｐｒｏｃ　−Ｎａｔｌ、　Ａｃａ
ｄ、　５Ｃ１−ＵＳＡ　７９　＋　６１２８−６１３１
　（１９８２）ＩＮ末端へブタペプチド配列のりシン残
基に代わる残基に相当する。ｃａｒｒのへブタペプチド
は、もとの蛋白質のシアノ）ｆ７ブロマイド開裂断片が
加水分解を受けて生じた、ブロックされたトリプシン断
片として得られたものである。内在性の蛋白質はすでに
ミリストイル化を受けているので、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで
のアシル化アクセプターとして使用することはできない
。

合成オクタペプチドＧｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−
Ａｌａ　−Ａｌａ−Ａｒ　ｇ　−Ａｒ　ｇ金柑いて、ユ
ニークな酵素活性の確認、即ちミリスチンばをこのヘプ
チドあるいは他のぺする新規ヘプチドの抑制活性は、Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓ　ｉａｅのＮ
−ミリストイルグリシンペプチドシンセターゼ（Ｎ−ミ
リストイルトランスフェラーゼ）を用いて証明すること
ができる。かかる酵素活性は、〔３Ｈ〕−ミリスチン酸
のアクセプターペプチドへの移動をｉｎ　ｖｉｔｒｏで
アッセイすることにより測定した。移動反応は、アデノ
シントリホスフェ−）　（ＡＴＰ　）及びコエンデイム
Ａ（ＣＯＡ）に依存している。次いで、得られるミリス
トイル化酵素生成物を、高速液体クロマトグラフィー（
ＨＰＬＣ）を用いて化学的に合成したミリストイル化ペ
プチド標準物質を一緒に溶出せしめて同定した。酵素反
応生成物と化学的に合成した標準物質とが同一でありそ
れらのグリシン残基にミリステートが共有結合している
ことを証明するために、ＨＰＬＣ槓製標準物質と酵素反
応生成物とをプロナーゼで消化し、逆相ＨＰＬＣで分析
した。これによフ、両者にはＭ−ミリストイル化グリシ
ン残基が含まれていることが判った。

Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの
プロテアーゼ欠損株Ｊ　Ｒ１５３（ＨｅＨｅｍｍ１ａら
、　　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ７８＊　　４３５−４３
９　（１９８１））をＮ−ミリストイルグリシンペプチ
ドシンセターゼの原料として用いて、オクタペプチドの
アシル化を証明した。この酵母を〔３Ｈ〕ミリスチンば
でラヘル化し、細ｋｌ　ｆｅ浴屏し次いでドデシル硫酸
す。

トリウムポリアクリルアミドデル電気泳動（５ＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ　）で細胞蛋白質を分析したところ、この株には
内在性のＮ−ミリストイル化蛋白質が含まれていること
が判った。Ｎ　−（”Ｈ）ミリストイルグリシンは、ラ
ベル化内在性アシル化蛋白質をプロナーゼで消化し、逆
相ＨＰＬＣで分離し分析することにより単離することが
出来る。

以下に本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本
発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１ 不明ａ畳に記述するすべてのペプチドは、ミリストイル
化酵素の基質であるペプチドの合成に用いた以下の合成
法に本質的に従って調製した。

Ａ、　　Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａ
ｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ２の合成 Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの方法（Ｒ，Ｂ、Ｍｅｒｒｌｆｉ
ｅｌｄ　、　Ｊ、　Ａｍ。

Ｃｈｅｍ、　８ｏｃ、、　　８５．　２１４９−２１５
４　（１９６３）：１に従い、樹脂１１当り０−３５　
ｍｍｏｌのアミノ基の置換基を有するｐ−メチルベンゾ
ルヒドリルアミン樹脂上に、ペプチドを合成した。ＢＯ
Ｃ保護アミノ酸（４当量）を用い、ＢＯＣ保護アミノ酸
とジシクロへキシルアミドを２：１でジクロロメタン中
で１５分間混合して、対称性無水物を得た。溶媒を減圧
下に留去し、無水物をジメチルホルムアミドに再溶解し
、樹脂と混合し次いで１時間激しく攪拌した。アスパラ
ギンとの反応では（グルタミン、アルヤーンの場合でも
）、等モルｔｈｔ（アミノ酸に対して〕のヒドロキシベ
ンゾトリアゾールを反応混合物中に加えた。５０％トリ
フルオロ酢酸（ＴＦＡ　）のジクロロメタン＃液を用い
てＢＯＣ保護基を脱離せしめ、アミノ酸と縮合する前に
１０％０％ジイソプロビルエチルアミジメチルホルムア
ミド溶液を加えて樹脂を中和した。

ペプチドを樹脂から除去し、液体ＨＦ／アニソール（９
：　１．　Ｖ／Ｖ　）を用いて０℃で１時間で脱保護せ
しめた。５０％酢酸水浴液で樹脂から粗ペゾチドを抽出
し、次いで凍結乾燥した。

Ｂ、精製 粗ペプチドを水に溶解し、Ｗａｔｅｒｓ　μｍＢｏｎｄ
ａｐａｋＣ工。カラム（１９關Ｘ１５０ｊ１１）＆て杓
し、〇−１５％アセトニトリル（０，０５％ＴＦＡ　）
水（０，０５％ＴＦＡ　）溶液勾配を用いて、流速９ゴ
／分で１５分間溶出せしめた。生成物を含む画分金集め
て凍結乾燥した。ペプチドの純度及び同定は、ＨＰＬＣ
分析及びアミノ酸分析により確認した。

実施例２ 電気泳動分析のだめの酵母蛋臼實のラベル化及び抽出 酵母（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＪＲ１５３，接合
型ａｌｐｈａ、　　ｔ、ｒｐｌ、　　Ｐｒｂｌ　、　　
Ｐｒｃｌ　、　　ｐｅｐ　４−３　）を、回転攪拌機中
のＹＰＤ培地（１％酵母佃出物、２％バクトペゾトン及
び２（７ｏデキストロース蒸留水溶液〕で６０℃で生育
せしめて６６０　ｎｍでの光学密度が１−６とした。〔
３Ｈ〕脂肪酸１．ｎｃｉのエタノール浴液１０μｌ’ｚ
加えて同定条件下で３０分間処理して、酵母の培養液の
１５−アリコート金ラベル化した。ラベル化反応の最後
に、培養液を氷で５分間冷却し、次いで７６００ＸＮで
１０分間遠心して４℃で細胞をペレット化した。次いで
細胞を、Ｉ　Ｑ　ｍＭ　ＮａＮ３の１４０　ｍＭ　Ｎａ
（Ｊ　／　１Ｑ！１１Ｍホスフェート溶液（ｐＨ７，２
）１ｄに再懸濁し、次いでポリプロピレン製の円錐形遠
心チューブ１．５−に移して、４°Ｃで上記と同様にし
て遠心して細胞を集めた。上清液を捨て、細胞を５ｍＭ
Ｔｒｉｓ　（ｐＨ７−４）ｔ　　３　ｍＭゾチオスレイ
トール。

１％ＳＤＳ及び１ｍＭフェニルメチルスルフォニルフル
オライドを含む液１００μｌに再懸濁し、氷で冷却しな
がら６０秒間の激しい渦動を６回繰り返し、細胞１個と
等容量の０．５ｍｍガラスピーズで細胞を破壊した。次
いでテイデルトップエンペンドルフ（ｔａｂｌｅｔｏｐ
　Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ　）遠心分離機で８０００）ｌで
６０秒間遠心して、細胞の破片を除いた。次いで上溝液
を、８　ｍ　Ｍ　Ｔｒｉｓ　（Ｐ）１８．０）１２５μ
ｊ中で’ｌ　ＱｍＭヨードアセトアミドで室ア 温下１時間処理してアルキル化した。２０μ１．ｆリコ
ートを用いて、慣用的ＳＤＳ　−ＰＡＧＥ及び０１ｓｏ
ｎら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５９．　５３
６４−５３６７（１９８４）に記載されたフルオログラ
フィー法によシ分析した。

〔３Ｈ〕脂肪酸の蛋白質結合分析 還元及びアルキル化された〔３Ｈ〕脂肪酸ラベル化酵母
蛋白質２０μノを、新たに調製した４Ｍヒドロキシルア
ミン／　２　Ｑ　ｍ　Ｍグリシン（’ｐＨ１０）７μ！
で処理した。２６°Ｃで４時間処理後、電気泳動及びフ
ルオログラフィー用にサンプルを調製した□ ＪＲＩ　５３の２０．０００ダルトンのアシル化蛋白質
への〔噌〕ミリスチン酸のヒドロキシルアミン安定化結
合を測定するため、脂肪酸を添加する前に酵母脂肪酸合
成の抑制因′子として知られ、ＪＲＩ−５３での特異的
アシル蛋白質のラベル化を数倍に促進するセルレニン２
μｇ／ｍｌで細胞を１５分間処理した以外は、上記した
と同様にして培養液をラベル化した。次いで細胞の蛋白
質を調製し、ＳＤＳ　１２％ポリアクリルアミドデル電
気泳動で分離した。この際サンプルレーンのす＜−隣、
り　ｔＤ　ｖ　−ンに、あらかじめ発色せしめた分子量
標準蛋白質を同時に電気泳動に付した。電気泳動後、未
乾燥サンプルデルレーンの分子！　２０，０００ダルト
ンの領域から、デルスライス２．Ｗｌｌを切シ出した。

ゲルスライスを１０％メタノール水溶液０．５４でリン
スし、次Ａで５　Ｑ　ｍ　Ｍ重炭酸アンモニウム（ｐＨ
７，９）　１　ａｔ中で、３７°Ｃで７２時間、Ｌａｂ
ｑｕａｋｅミキサー（Ｌａｂｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ＋　
Ｂｅｒｋｅｌｅｙｔ　７Ａ）で混合しながらプロナーゼ
Ｅ　（Ｓｉｇｍａ、　８ｔ、　Ｌｏｕｉａ、ＭＯ）１〜
でそれぞれ消化した。消化処理１検体幽９１μｌのトル
エンを加えて微生物の生育を抑えた。

２４時間目に新たなプロナーゼｇ１９を加えた。

消化後、それぞれの消化液のアリコートについて放射活
性の存在を測定した。放射活性を有するスライスから消
化液を除き、ゲルスライスを０．１％ＳＤＳ　５００μ
！でリンスし、消化液とリンス液を合わせて６Ｎ　ＨＣ
Ｉ　４０μｌでｐＨ１−２に調整した。

かくして得たは性溶液をクロロホルム−メタノール（２
：１．Ｖ／Ｖ）１．５ゴで２回抽出した。有機層を集め
、クロロホルム−メタノール−〇、０１　Ｎ５ｃｔ　（
１：　１０　：　１０　、　ｖ／ｖ／ｖ　）　１　ｄで
１回洗浄し、有機層を窒素気流で乾燥した。得られる残
渣ｔ−５０％メタノール−５０％ＨＰＬＣバッファーＡ
（これについては後述する）に再浴解した。抽出操作後
、もとの蛋白質消化液の放射活性の９７％が回収された
。Ｗａｔｅｒｓ　μｍ　Ｂｏｎｄａｐａｋ　ｃｌＢカラ
ムを用い、バッファーＡとして０．１％トリフルオロ酢
酸１０．０５％トリエチルアミン水浴液、バッファーＢ
として０．１％トリフルオロ酢酸のアセトニトリル溶液
を用いて、流速１ゴ／分の逆相ＨＰＬＣに、サンプルを
付し、１分画＃）１％上昇するアセトニトリル匂配で溶
出せしめた６１分間の画分を集めて、その放射活性を液
体シンチレーションカウンターによプ測定した。ミリス
トイル化〔３Ｈ〕グリシン標準物質は、’ｒｏｗｌｅｒ
とＧｌａｓｅｒ　。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２５ｓ　　８７８−８８４　
（１９８６）に記載されたのと本質的に同様にして合成
し、ＨＰＬＵにより分析した〇 脂肪酸アシル化ペプチド標準物質の合成放射活性を有す
る対称性のミリスチン醗無水物又はパルミチン酸無水物
とＧｌｙＡｓｎＡｌａＡｌａＡｌａＡｌａＡｒ　ｇＡｒ
　ｇとをピリジン中で反応せしめることによジアシル化
ペプチド標準物質の合成を実施した。

１ＱＱｍＣｉの〔３Ｈ〕脂肪酸を、それぞれの脂肪酸ア
シルクロライげ４μｊで処理し、次いで、それぞれの非
放射活性脂肪酸４．８〜を含むピリシン１５０μｇに再
懸濁せしめた。２３°Ｃで６０分間反応分進行させた。

次いでこの反応溶液６５μｌをＧｌｙＡｓｎＡｌａＡｌ
ａＡｌａＡｌａＡｒｇＡｒｇ　４００　５００Ａｇに加
えた。Ｌａｂｑｕａｋｅミキサーで攪拌しながら一晩反
応を進行させた。次いで減圧下にピリシンを留去し、得
られる残渣を石油エーテル０．６４で２回抽出し、欠い
て５０％メタノール水浴１４００μＩＶｃ再浴解せしめ
た。反応生成物を精製し、前記した如くシて逆相ＨＰＬ
Ｃで分析した。化学的【合成した標準物質と酵素生成物
とを共にプロナーゼＥで消化し、前記したと同様にして
２０，０００ダルトンのアシル化蛋白質について逆相Ｈ
ＰＬＣで分析した。徂し、この場合にはプロテアーゼ２
００ｐ９で完全な消化を行なうことが出来た。

前記した如くして、６６０ｎｍでのＯ，Ｄ、が１−乙に
なるまで酵母培養物を生育せしめた。培養液４０ゴを４
℃で７６００Ｘ、！９で１０分間遠心して細胞を集めた
。上清液をデカンテーションし、冷却した１　０　ｍ　
Ｍ　ＴｒｉＳ　（ｐＨ７−４）　１　ｍｌｖｃＭ胞ペレ
ットをピペットで移して再懸濁せしめ、次いで１．５コ
の円椎形のポリプロピレン遠心チューブに移し、４°Ｃ
で７６００）ｌで１０分間遠心して細胞を再びベレット
化した。細胞をピペットでコールドアッセイ溶解バッフ
ァーＣ１０ｍＭＴｒｉｓ　（ｐ）Ｉ７．４）、１ｒｎＭ
ジチオスレイトールｙＤ、１ｍＭｚテンンクリコールー
ビス（β−アミノエチルエーテル）　Ｎ　、　Ｎ　、　
Ｎ’　、　Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ　）、　　１０Ａｇ
／Ｒ１アプロチニン〕４００μノに移して再懸濁せしめ
た。（Ｊ、５＋ａｍガラスぎ一ズ約４００μＥを細肥悪
濁液に加え、前記した＠き放射標識化細胞全溶解したの
と同様にして渦動せしめて細１Ｉ８ｔ−崩壊して溶解せ
しめた。ビーズが静止した後、溶解物を集め、４°Ｃで
１ｏｏｏｘｙで１０分間遠心して細胞破片を除いた。次
いで上溝液を、Ｂｅｃｋｍａｎ７５　Ｔｉ　Ｉ：Ｉ−タ
ーで４°Ｃで４５．００　Ｏｒｐｍで３０分間遠心した
。上清液を除き、得られる粗膜ペレットをコールドアッ
セイ溶解バッファー４００μｊにピペットで移して再懸
濁せしめた。３つの細胞フラクションのアリコートヲ、
すぐにアッセイに定であった。蛋白質はＰｅｔｅｒｓｏ
ｎの方法ＣＡｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　８３　、　３４６−３５６　（１９
７７）　］によって測定した。

以下に記載した如き方法により、Ｃ”Ｈ〕脂肪酸アシル
ＣｏＡ　ｆ、酵素的＆て合成し、インキュベーションに
付した。

アシルＣＯＡシンセターゼ反応は次の如き構成（１つの
アッセイチューブ当シ）で行なわれた。

即ち、〔３Ｈ〕ミリスチン酸０．５μＣ１；２Ｘ７：、
／−１＝イバツファ−（２０ｍＭＴｒｉｓ　（ｐ）１７
．４　）ｔ　　２＋ｉＭゾチオスレイ　トール、　　１
０ｍＭＭｇＣｊ２ｙ　　Ｏ，２ｍＭＥＧＴＡ　）　２５
μｚ；ｓｏｍＭＡＴＰ蒸留水溶液５μｌ（ＮａＯＨでｐ
）Ｉ　７．０に調整した）；２０ＦＩＭリチウムＣｏＡ
蒸留水溶液２．５μｌ　；　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｆｌａｓ
　７　シＡ／ＣＯＡシンセターゼ（シグマ社）ｌｒｎＵ
／μＡ！の５０ｍＭＮ−２−とドロキシエチルピペラジ
ン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸（ｐ）ｌ　７．３　）
溶液１５μｌ；及び蒸留水２．５μ！である。３０’Ｃ
で２ｏ分間反応を進行せしめた。典型的には、〔３Ｈ〕
脂肪鍍の４０％−５０％を、この方法によりそのＣｏＡ
エステルに変換した。ＣＯＡエステルへの変換度は、Ｈ
ｏ５ａｋａらの方法ＣＭｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　
７１　、　３２５−３３３（１９８１）〕の変法に従い
、６　ＮＨ（ｊでｐＨ２，０に酸性化し、５倍容のヘプ
トンで６回抽出後、反応液に残存する放射活性を測定す
ることによシ決定した。この反応液５ｏμｌを、アッセ
イ抽出バッファー（上記参照）４０μＺ及び１　ｍ　Ｍ
ＧＩＹＡＳｎＡｌａＡｌａＡｌａＡｌａＡｒｇＡｒｇ　
１０　μｌｌを含むチューブて加えた。チューブ１個当
シ、酵母細胞佃出物（典型的には蛋白質５０μ＆）１０
μｇを加え、次いで３０℃で１０分間インキュベーショ
ンしてアッセイを開始した。チューブ１個轟り、メタノ
ール１１０μｌ及び１００％トリクロロ酢酸（ｗ／ｖ）
１０μｊを加えてアッセイを終止し、次いで氷で１０分
間冷却した。沈澱し７！ｉ１１．ｆ白質を、ティプルト
ップＥｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機で８０００Ｘ、ｌｉ
’で３分間遠心して除いた。（この条件下では、合成〔
３Ｈ〕ミリストイル化ペプチド又は〔３Ｈ〕バルミトイ
ル化ペプチドは、アッセイ混合物に加えた時には溶解し
ていた。〕上溝ｇ５ｏμｊをメタノール７５μノ及びＨ
ＰＬＣバッハファーＡ７５μｌと混合し、同様のＨＰＬ
Ｃバッファーを用い、３０ｃｍｗａｔｅｒｓ　Ａ　−Ｂ
ｏｎｄａｐａｋ　ｃ１８カラムの３．９＋ｉでの逆相Ｈ
ＰＬＣによる分析を行なった。浴出は６５％アセトニト
リルでスタートし、次いで１分間当り１％上昇するアセ
トニトリル勾配で行なった。１分間の画分を渠め、それ
ぞれの両分について、液体シンチレーションカウンター
で放射活性を測定した。〔３Ｈ〕−ミリストイル−Ｇ１
７ＡＳｎＡｌａＡｌａＡ１ａＡｌａＡｒ　ｇＡｒ　ｇは
２４分’ｉＫ溶出Ｌ、（ｓＨ］　−／（’Ａ／　ミドイ
ル−ＧｌｙＡｓｎＡｌａＡｌａＡｌａＡｌａＡｒｇＡｒ
ｇは３ｏ分後に溶出した。

結果 前記した如くにして調製した、（”Ｈ）−ミリストイル
化グリシルペプチド及び〔３Ｆｉ〕バルミトイル化グリ
シルペプチドの化学合成標準物質は、試料を分析したの
と同じ条件下で逆相ＨＰＬＣカラムから、それぞれ５９
％、６５％アセトニトリルでの溶出のときに浴出した。

細胞溶解物質を調良しそれを分別して得た粗膜フラクシ
ョン及び溶解フラクションのいずれにおいても、Ｎ−ミ
リストイルグリシルペプチドシンセターゼ活性が検出さ
れた。セして全比活性、溶解フラクション比活性及び粗
膜フラクション比活性は、それぞれ１４１０゜１３２０
．２２６０ｄｐｍ／μＦ蛋白寅／１分間アッセイであっ
た。最初の反応速度から判断して、活性の６５％は粗膜
フラクションに存在すると考えられる。

酵素反応生成物と化学合成標準物質（３Ｈ］　−ミリス
トイル化ペプチドは、前記した逆相ＨＰＬＣ分析によ勺
、両者は同じであシまたグリシン残基に共有結合したミ
リステートを含んでいることが証明された。

ペプチド基質に対するＮ−ミリストイルグリシルペプチ
ドシンセターゼの特異性を証明するため、他のグリシル
ペプチドについて、そのＧ１７ＡｓｎＡｌａＡｌａＡｌ
ａＡｌａＡｒｇＡｒｇアシル化の競争的阻止能を調べた
。下記表１のテストロから明らかなように、１ｍＭゾペ
プチド、１ｍＭテトラペプチド及び１　ｍＭデカペプチ
ドはいずれも１８μＭペプチド基質のミリストイル化に
対して何んら効果を示さなかった（約九のＫＩｎ）。従
って、Ｎ　−ミリストイルグリシルペプチドシンセター
ゼは、オクタペプチド基質に対して特異性を示すことが
判る。

表　　１ １　　コントロール　　　　　　　　　　　１１１−Ａ
ＴＰ　　　　　　　　　　　　　　　　　９−ＣＯＡ　
　　　　　　　　　　　　　　　１２　　コントロール
　　　　　　　　　　　　８３６　　コントロール　　
　　　　　　　　　　２６．７＋１　α（）Ｎ　　　　
　　　　　　　　２８　、０＋　ｉ　　ｆｆ、Ｍ　Ｃ）
ＰＲＰ　　　　　　　　　　　２５．６＋　１ｎＬＭＧ
Ｓ８ＫＳＰＫＤＰＳ　　　　　　　２７　、４酵母から
得た粗膜フラクションを用いて表１に示した如く種々の
条件下で前記した如くにしてアッセイを実施した。テス
ト１では、アッセイのＡＴＰ　、　　ＣｏＡ依存性を外
因性の脂肪酸ＣＯＡ　ＩＪガーゼの非存在下でテストし
た。テスト２により、酵母の酵素は熱に不安定であるこ
とが証明され、テストロにより、Ｎ−末端グリシンを含
む他のペプチドを添加しても反応は抑制されないことが
証明された。テストロでは、可能な抑制効果を最大限に
発渾させるために、通常の９０μＭではなく１８μＭの
ペプチド基質を用いて測定した。

実施例６ 不明ＭＪｉ曹で例示したいくつかのオクタペプチド金、
実施例１と本質的に同様にして固相Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌ
ｄ法によシ合成し、次いで酵母（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ株ＪＲ１５３）から得たミリストイル化酵素の基質
としてのあるいは抑制因子としての活性をテストした。

オクタペプチド基質の酵素特異性を、アッセイチューブ
１個当り１μＣ１の〔３Ｈ〕−ミリスチン酸を用いる以
外は実施例２のアッセイ条件と同様にしてテストした。

本実施例に用いた酵母の酵素は、堵養酵母細肥の粗ホモ
ジエネートｔ−５ｌ−７０％（ＮＨ４）　２３０４で分
別し次いでＤＥ式−セ７アロース■ＣＬ−６Ｂ（ファル
マシア社製）ｅ用いたイオン交換カラムクロマトグラフ
ィー及びＣｏＡ−アガロースアフイニテイーマトリック
ス（ファルマシア社製）を用いたアフィニティークロマ
トグラフィーにより部分精製した。オクタペプチドは、
下記表Ｈに示した動力学的データ（Ｋｍ＊　”’ｍａｘ
及びＫｉ）によシ特徴付けを行なった。

＊：このオクタペプチド基質のｖ、：、ａ、Ｘば、部分
精製酵母酵素１〜での１分間当りの生成ミリストイル化
ペプチド２８４０　ｐｍｏｌであった。

上記の結果は、アミン末端グリシンから２番目の位置に
チロシンあるいはフェニルアラニンヲ有するオクタペプ
チドが、いずれの速度に２いてもアシル化アクセプター
として作用しないにもかかわらず、Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａ
ｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ基質の
ミリストイル化を競争的に抑制し得ることを示唆してお
り従ってミリストイル化酵素に結合することを示してお
り、これらの結果は予期せぬことであり篇くべきことで
ある。２査目の位置にロイシンあるいはバリン残基金有
するオクタペプチドも上記基質のミリストイル化を抑制
する。

カルボキシ末端の１つまたは２つのアルギニンを除いた
オクタペプチドの場合でも、実質的に同様の結果が得ら
れる。

本明細書に示したペプチドのアミノ酸配列を同定するた
めには、以下に示したアミノ酸の略号が使用される。

Ｌ−アラニン　　　　　　　Ａｌａ又はＡＬ−アルギニ
ン　　　　　　Ａｒｇ又はＲＬ−アスパラギン　　　　
　Ａｓｎ又はＮＬ−アスパラギン酸　　　　　　Ａｓｐ
又はＤＬ−グルタミン　　　　　　Ｇｌｎ又ｄＱＬ−グ
リシン　　　　　　　Ｇｌｙ又はＧＬ−ロイシン　　　
　　　　Ｌｅｕ又はＬＬ−リシン　　　　　　　　Ｌｙ
ｓ又はＫＬ−プロリン　　　　　　　Ｐｒｏ又はＰＬ−
セリン　　　　　　　　Ｅ３ｅｒ又はＳＬ−チロシン　
　　　　　　Ｔｙｒ又はＹＬ−バリン　　　　　　　　
Ｖａｌ又は７本明細書の記載から、本発明の精神及び範
囲内の他の各種の例が当業者によっては明らかであろう
。そしてそのような他の例も本明細書の特ｒ！ｆ請求の
範囲内のものである。

しかして、ペプチドの各々のアミノ酸及び／又は長さは
、ミリストイル化酵素に対する抑制因子としての生物活
性に不利なあるいは決定な影響を与えない限シ、種々変
えることができ、それらはいずれも本明細書の特許請求
の範囲内のものである０

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）以下に示すアミノ酸配列からなる群より選ばれた
   アミノ酸配列を有する、ミリストイル化酵素の抑制因子
   ペプチド又はその生理学的に許容し得るアミド誘導体も
   しくは塩誘導体。 【アミノ酸配列があります】又は 【アミノ酸配列があります】 （式中、ＲはＬｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ又はＶａｌを示す
   。）
2. （２）ＲがＴｙｒである特許請求の範囲第１項記載のオ
   クタペプチド。
3. （３）ＲがＰｈｅである特許請求の範囲第１項記載のオ
   クタペプチド。