JPS6338197B2 - - Google Patents
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- JPS6338197B2 JPS6338197B2 JP54064651A JP6465179A JPS6338197B2 JP S6338197 B2 JPS6338197 B2 JP S6338197B2 JP 54064651 A JP54064651 A JP 54064651A JP 6465179 A JP6465179 A JP 6465179A JP S6338197 B2 JPS6338197 B2 JP S6338197B2
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は酵素を用いる遊離一価脂肪酸（以下
FFAと略す）の定量法に関するものである。な
お、本発明において遊離一価脂肪酸とは、そのカ
ルボキシル基が他の化合物と共有結合していない
一価脂肪酸をいう。 従来FFAの測定法としては、FFAを有機溶媒
で抽出して希アルカリで滴定するドール法、
FFAの金属塩を溶媒抽出し、金属塩を比色する
板谷法等があるが、これ等の方法は有機溶媒によ
る抽出操作が煩雑であること等の理由で、規準化
が困難な方法であつた。 酵素を用いるFFA測定方法としては、既に高
橋等が臨床化学第４巻第２号179ページ〜185ペー
ジ（1975年）に、アシル・コエンザイムＡシンセ
ターゼ（以下ACSと略す）を用いる方法を報告
している。酵素を用いる方法は、反応が特異的か
つ条件が温和である等種々の利点を有しており、
最近特に広く利用される様になつてきた。 しかるに酵素を用いる脂肪酸の定量法におい
て、FFAが蛋白質特にアルブミンの様なFFAと
親和性の強い蛋白質と共存している系（例えば血
清中のFFA）を試料とする場合に次の様な問題
がある。すなわちFFAはアルブミンと強固に結
合しており、酵素反応の行なわれる様な温和な条
件下では、この結合体からFFAは遊離せず、実
際上酵素法の利点を生かすことは出来なかつた。
なぜならば温和でかつ煩雑でない（例えば抽出や
遠心分離等を行なわない）方法で測定しようとす
る場合、酵素法では反応に極めて長時間を要し、
現実的な方法とはなり得なかつたからである。 このFFAとアルブミンの結合の本質について
は定かでなく、疎性結合ともイオン結合ともいわ
れている。 しかるに本発明者等は、この様なFFAに親和
力の強い蛋白特にアルブミンとFFAとの結合を
解離させ、酵素反応を速める様な物質を鋭意検討
した結果、炭素数10〜18の二塩基性脂肪酸または
その誘導体が極めて有効に本目的を達成せしめる
ことを発見し、本発明を完成した。 すなわち、本発明の要旨はアルブミンと一価の
脂肪酸の共存する系で一価脂肪酸をアシル・コエ
ンザイムＡシンセターゼにより酵素的に測定する
方法において炭素数10〜18の二塩基性脂肪酸また
はその水可溶性塩類を共存せしめることを特徴と
する一価脂肪酸の酵素的測定方法に存する。 次に本発明の詳細を説明する。 本発明方法に使用される化合物は、炭素数10〜
18の二塩基性脂肪酸またはその水可溶性塩類であ
る。 これ等の化合物が解離剤として好ましい理由
は、第一にFFA−アルブミン結合を解離させる
作用の強いことがあげられる。上記化合物が強い
解離作用を有する理由は不明であるが、いずれも
分子中に長い疎水性部分およびアニオニツクなイ
オン基を有し、FFAと類似な構造を有すること
から、恐らくこれ等の化合物とFFAのアルブミ
ンに対する結合に競合関係を生じ、大量にこれ等
の化合物が存在する場合には、アルブミンに結合
していたFFAが解離してくるものと考えられる。 第二に、FFA測定に用いられる酵素の基質と
なり難いことがあげられる。FFAの測定にACS
を用いる場合には、FFA−アルブミン結合解離
剤はACSの基質となつてはならない。 第三に、FFA測定に用いる酵素、本発明にお
いてはACSの作用を阻害しないことである。 この様な観点より、本発明に用いられる具体的
化合物としては、セバシン酸、１，９−ノナメチ
レンジカルボン酸、１，10−デカメチレンジカル
ボン酸、１，11−ウンデカメチレンジカルボン酸
（ブラシル酸）、１，12−ドデカメチレンジカルボ
ン酸、１，13−トリデカメチレンジカルボン酸、
１，14−テトラデカメチレンジカルボン酸、１，
15−ペンタデカメチレンジカルボン酸、１，16−
ヘキサデカメチレンジカルボン酸等が挙げられ
る。炭素数９以下の二塩基性脂肪酸では、FFA
−アルブミン結合の解離作用は弱く、また炭素数
19以上の二塩基性脂肪酸では解離剤の水溶性が小
さくなり、反応中に解離剤が析出して濁りを生じ
て光学的測定を妨害する可能性がある。 これらの二塩基性脂肪酸の水可溶性塩類として
は、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩や
アンモニウム塩等が挙げられる。 勿論、二塩基性脂肪酸とその水可溶性塩類を併
用してもよいし、それぞれを二種以上併用しても
よい。 これらの二塩基性脂肪酸またはその水可溶性塩
類の添加量はその効果、測定に用いる酵素類等に
対する影響、溶解度等により異なるが、一般には
測定しようとするFFAの５倍〜1000倍（モル）
程度、また酵素反応系での濃度としては１×10-4
〜10-2モル／程度が好ましい。 添加形態としては固体、水溶液または親水性溶
媒溶液が好ましい。 添加時期としては、FFA含有サンプル中に添
加しても、反応に用いる酵素類等の試薬中に添加
しておいても、また測定時に反応系に添加しても
よく、とにかく測定反応系に上記解離剤が存在し
ていればよい。 なおこの様な解離剤の添加によつて解離した
FFAを、酵素的に測定する方法としては、前述
のACSを用いる測定法が用いられる。 本発明方法によれば、簡便な方法で、精度良
く、アルブミンの妨害もなく目的とするFFAの
測定を行うことができる。 以下に参考例および実施例を挙げて、本発明を
更に詳細に説明する。 参考例 〔ACSの調整〕 ヨーロピアン・ジヤーナル・オブ・バイオケミ
ストリー（European Jounal of Biochemistry）
93巻197−203ページ（1979年）の方法を用いて、
キヤンデイダ・リポリテイカ（Candida
lipolytica）NRRL Y6795株よりトリトンＸ−
100（ローム・アンド・ハース社製非イオン性界面
活性剤の商標、以下活性剤Ｔと略す）処理、ホス
フオ セルロース カラムクロマト、更にブルー
セフアロース（フアルマシアフアインケミカルズ
社商標）カラムクロマト処理により精製されたも
のを、50％グリセリン、10ｍＭ燐酸カリウム緩衝
液（PH7.4）、活性剤T0.063％、２−メルカプトエ
タノール2.5ｍＭの溶液として用いた。 〔試 薬〕 (a) 緩衝液：活性剤T2mg／ml、EDTA2Na（エチ
レンジアミンテトラ酢酸ジナトリウム）２ｍ
Ｍ、MgCl210ｍＭを含有する100ｍＭトリス塩
酸緩衝液（PH8.0） (b) 酵素基質溶液：ATP・ジナトリウム塩40mg、
ホスフオエノールピルビン酸カリウム50mg、ミ
オキナーゼ20U、ピルビン酸キナーゼ15U、乳
酸脱水素酵素15Uを上記緩衝液１mlに溶かす。 (c) NADH溶液：NADH・ジナトリウム塩３mg
を１mlに溶かす。 (d) CoA（補酵素Ａ）溶液：CoA・リチウム塩
12.5mgを１mlに溶かす。 (e) ACS溶液：約4U／mlの上記ACS50％グリセ
リン溶液を水で４倍に希釈して用いた。 (f) FFA溶液：0.5ｍＭオレイン酸カリウム水溶
液 実施例１および比較例 0.5ｍＭのFFA及びヒト血清アルブミン2.5％
（ｗ／ｖ）を含有する試料50μを光路長10mm、
巾５mmのマイクロセルにとり、これに緩衝液1.0
ml更に所定濃度の供試薬剤を含む溶液、NADH
液、酵素基質液、更にACS液を各々50μ添加
し、恒温セルホールダー付の分光光度計UV−
200（島津製作所製）中で37℃で予熱した後CoA
液を20μ添加して反応を開始し、340nｍの吸光
度の減少を経時的に記録し、△OD／minの最大
値を求めた。結果を表−１に示した。 表−１から明らかな様に炭素数10〜18の二塩基
性脂肪酸類を添加した時には、△ODの減少速度
すなわち反応速度が対照のアルブミンのみ添加の
場合に比較して速く、FFAが反応しやすい形に
なつていることがわかる。
FFAと略す）の定量法に関するものである。な
お、本発明において遊離一価脂肪酸とは、そのカ
ルボキシル基が他の化合物と共有結合していない
一価脂肪酸をいう。 従来FFAの測定法としては、FFAを有機溶媒
で抽出して希アルカリで滴定するドール法、
FFAの金属塩を溶媒抽出し、金属塩を比色する
板谷法等があるが、これ等の方法は有機溶媒によ
る抽出操作が煩雑であること等の理由で、規準化
が困難な方法であつた。 酵素を用いるFFA測定方法としては、既に高
橋等が臨床化学第４巻第２号179ページ〜185ペー
ジ（1975年）に、アシル・コエンザイムＡシンセ
ターゼ（以下ACSと略す）を用いる方法を報告
している。酵素を用いる方法は、反応が特異的か
つ条件が温和である等種々の利点を有しており、
最近特に広く利用される様になつてきた。 しかるに酵素を用いる脂肪酸の定量法におい
て、FFAが蛋白質特にアルブミンの様なFFAと
親和性の強い蛋白質と共存している系（例えば血
清中のFFA）を試料とする場合に次の様な問題
がある。すなわちFFAはアルブミンと強固に結
合しており、酵素反応の行なわれる様な温和な条
件下では、この結合体からFFAは遊離せず、実
際上酵素法の利点を生かすことは出来なかつた。
なぜならば温和でかつ煩雑でない（例えば抽出や
遠心分離等を行なわない）方法で測定しようとす
る場合、酵素法では反応に極めて長時間を要し、
現実的な方法とはなり得なかつたからである。 このFFAとアルブミンの結合の本質について
は定かでなく、疎性結合ともイオン結合ともいわ
れている。 しかるに本発明者等は、この様なFFAに親和
力の強い蛋白特にアルブミンとFFAとの結合を
解離させ、酵素反応を速める様な物質を鋭意検討
した結果、炭素数10〜18の二塩基性脂肪酸または
その誘導体が極めて有効に本目的を達成せしめる
ことを発見し、本発明を完成した。 すなわち、本発明の要旨はアルブミンと一価の
脂肪酸の共存する系で一価脂肪酸をアシル・コエ
ンザイムＡシンセターゼにより酵素的に測定する
方法において炭素数10〜18の二塩基性脂肪酸また
はその水可溶性塩類を共存せしめることを特徴と
する一価脂肪酸の酵素的測定方法に存する。 次に本発明の詳細を説明する。 本発明方法に使用される化合物は、炭素数10〜
18の二塩基性脂肪酸またはその水可溶性塩類であ
る。 これ等の化合物が解離剤として好ましい理由
は、第一にFFA−アルブミン結合を解離させる
作用の強いことがあげられる。上記化合物が強い
解離作用を有する理由は不明であるが、いずれも
分子中に長い疎水性部分およびアニオニツクなイ
オン基を有し、FFAと類似な構造を有すること
から、恐らくこれ等の化合物とFFAのアルブミ
ンに対する結合に競合関係を生じ、大量にこれ等
の化合物が存在する場合には、アルブミンに結合
していたFFAが解離してくるものと考えられる。 第二に、FFA測定に用いられる酵素の基質と
なり難いことがあげられる。FFAの測定にACS
を用いる場合には、FFA−アルブミン結合解離
剤はACSの基質となつてはならない。 第三に、FFA測定に用いる酵素、本発明にお
いてはACSの作用を阻害しないことである。 この様な観点より、本発明に用いられる具体的
化合物としては、セバシン酸、１，９−ノナメチ
レンジカルボン酸、１，10−デカメチレンジカル
ボン酸、１，11−ウンデカメチレンジカルボン酸
（ブラシル酸）、１，12−ドデカメチレンジカルボ
ン酸、１，13−トリデカメチレンジカルボン酸、
１，14−テトラデカメチレンジカルボン酸、１，
15−ペンタデカメチレンジカルボン酸、１，16−
ヘキサデカメチレンジカルボン酸等が挙げられ
る。炭素数９以下の二塩基性脂肪酸では、FFA
−アルブミン結合の解離作用は弱く、また炭素数
19以上の二塩基性脂肪酸では解離剤の水溶性が小
さくなり、反応中に解離剤が析出して濁りを生じ
て光学的測定を妨害する可能性がある。 これらの二塩基性脂肪酸の水可溶性塩類として
は、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩や
アンモニウム塩等が挙げられる。 勿論、二塩基性脂肪酸とその水可溶性塩類を併
用してもよいし、それぞれを二種以上併用しても
よい。 これらの二塩基性脂肪酸またはその水可溶性塩
類の添加量はその効果、測定に用いる酵素類等に
対する影響、溶解度等により異なるが、一般には
測定しようとするFFAの５倍〜1000倍（モル）
程度、また酵素反応系での濃度としては１×10-4
〜10-2モル／程度が好ましい。 添加形態としては固体、水溶液または親水性溶
媒溶液が好ましい。 添加時期としては、FFA含有サンプル中に添
加しても、反応に用いる酵素類等の試薬中に添加
しておいても、また測定時に反応系に添加しても
よく、とにかく測定反応系に上記解離剤が存在し
ていればよい。 なおこの様な解離剤の添加によつて解離した
FFAを、酵素的に測定する方法としては、前述
のACSを用いる測定法が用いられる。 本発明方法によれば、簡便な方法で、精度良
く、アルブミンの妨害もなく目的とするFFAの
測定を行うことができる。 以下に参考例および実施例を挙げて、本発明を
更に詳細に説明する。 参考例 〔ACSの調整〕 ヨーロピアン・ジヤーナル・オブ・バイオケミ
ストリー（European Jounal of Biochemistry）
93巻197−203ページ（1979年）の方法を用いて、
キヤンデイダ・リポリテイカ（Candida
lipolytica）NRRL Y6795株よりトリトンＸ−
100（ローム・アンド・ハース社製非イオン性界面
活性剤の商標、以下活性剤Ｔと略す）処理、ホス
フオ セルロース カラムクロマト、更にブルー
セフアロース（フアルマシアフアインケミカルズ
社商標）カラムクロマト処理により精製されたも
のを、50％グリセリン、10ｍＭ燐酸カリウム緩衝
液（PH7.4）、活性剤T0.063％、２−メルカプトエ
タノール2.5ｍＭの溶液として用いた。 〔試 薬〕 (a) 緩衝液：活性剤T2mg／ml、EDTA2Na（エチ
レンジアミンテトラ酢酸ジナトリウム）２ｍ
Ｍ、MgCl210ｍＭを含有する100ｍＭトリス塩
酸緩衝液（PH8.0） (b) 酵素基質溶液：ATP・ジナトリウム塩40mg、
ホスフオエノールピルビン酸カリウム50mg、ミ
オキナーゼ20U、ピルビン酸キナーゼ15U、乳
酸脱水素酵素15Uを上記緩衝液１mlに溶かす。 (c) NADH溶液：NADH・ジナトリウム塩３mg
を１mlに溶かす。 (d) CoA（補酵素Ａ）溶液：CoA・リチウム塩
12.5mgを１mlに溶かす。 (e) ACS溶液：約4U／mlの上記ACS50％グリセ
リン溶液を水で４倍に希釈して用いた。 (f) FFA溶液：0.5ｍＭオレイン酸カリウム水溶
液 実施例１および比較例 0.5ｍＭのFFA及びヒト血清アルブミン2.5％
（ｗ／ｖ）を含有する試料50μを光路長10mm、
巾５mmのマイクロセルにとり、これに緩衝液1.0
ml更に所定濃度の供試薬剤を含む溶液、NADH
液、酵素基質液、更にACS液を各々50μ添加
し、恒温セルホールダー付の分光光度計UV−
200（島津製作所製）中で37℃で予熱した後CoA
液を20μ添加して反応を開始し、340nｍの吸光
度の減少を経時的に記録し、△OD／minの最大
値を求めた。結果を表−１に示した。 表−１から明らかな様に炭素数10〜18の二塩基
性脂肪酸類を添加した時には、△ODの減少速度
すなわち反応速度が対照のアルブミンのみ添加の
場合に比較して速く、FFAが反応しやすい形に
なつていることがわかる。
【表】
実施例 ２
実施例１の反応液組成において試料をFFA又
はFFA＋アルブミンの代りに人の血清試料を用
いて実験を行なつた。 反応は37℃で10分間行ない、CoA液添加前の
OD340をＡ、反応がほぼ完結しODの減少が止つ
た10分後のOD値をＢ、検体ブランクとして、上
記反応系でACS液の代りに蒸留水を用いたもの
のＡ及びＢに相当する値をそれぞれＣ及びＤと
し、求める試料中のFFAを次式により算出した。 なお、FFA−アルブミン解離剤50μを添加し
ない場合には脱塩水50μを添加したが、この時
には20分を経過しても完結せず、いずれの血清で
も測定は下可能であつた。 血清中のFFA（μmole／ml）＝｛（Ｃ−Ｄ）−（Ｂ−Ａ
）｝×全液量（ml）／血清サンプリング量（ml） ×１／1μmole／mlのFFAに基づくNADHの340nｍの吸光度
の減少量の理論値 ＝｛（Ｃ−Ｄ）−（Ｂ−Ａ）｝×1.22／0.05×１／２×
6.22＝｛（Ｃ−Ｄ）−（Ｂ−Ａ）｝×1.96 結果を表−２に示す。
はFFA＋アルブミンの代りに人の血清試料を用
いて実験を行なつた。 反応は37℃で10分間行ない、CoA液添加前の
OD340をＡ、反応がほぼ完結しODの減少が止つ
た10分後のOD値をＢ、検体ブランクとして、上
記反応系でACS液の代りに蒸留水を用いたもの
のＡ及びＢに相当する値をそれぞれＣ及びＤと
し、求める試料中のFFAを次式により算出した。 なお、FFA−アルブミン解離剤50μを添加し
ない場合には脱塩水50μを添加したが、この時
には20分を経過しても完結せず、いずれの血清で
も測定は下可能であつた。 血清中のFFA（μmole／ml）＝｛（Ｃ−Ｄ）−（Ｂ−Ａ
）｝×全液量（ml）／血清サンプリング量（ml） ×１／1μmole／mlのFFAに基づくNADHの340nｍの吸光度
の減少量の理論値 ＝｛（Ｃ−Ｄ）−（Ｂ−Ａ）｝×1.22／0.05×１／２×
6.22＝｛（Ｃ−Ｄ）−（Ｂ−Ａ）｝×1.96 結果を表−２に示す。
Claims (1)
- １ アルブミンと一価の脂肪酸の共存する系で一
価脂肪酸をアシル・コエンザイムＡシンセターゼ
により酵素的に測定する方法において、炭素数10
〜18の二塩基性脂肪酸またはその水可溶性塩類を
共存せしめることを特徴とする一価脂肪酸の酵素
的測定方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6465179A JPS55156598A (en) | 1979-05-25 | 1979-05-25 | Enzymatic determination of monobasic fatty acid |
| US06/145,035 US4349625A (en) | 1979-05-25 | 1980-04-30 | Method for assaying fatty acids |
| DE8080102884T DE3060648D1 (en) | 1979-05-25 | 1980-05-23 | Method for assaying fatty acids |
| EP80102884A EP0019875B1 (en) | 1979-05-25 | 1980-05-23 | Method for assaying fatty acids |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6465179A JPS55156598A (en) | 1979-05-25 | 1979-05-25 | Enzymatic determination of monobasic fatty acid |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS55156598A JPS55156598A (en) | 1980-12-05 |
| JPS6338197B2 true JPS6338197B2 (ja) | 1988-07-28 |
Family
ID=13264345
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6465179A Granted JPS55156598A (en) | 1979-05-25 | 1979-05-25 | Enzymatic determination of monobasic fatty acid |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS55156598A (ja) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS4964495A (ja) * | 1972-06-19 | 1974-06-21 | ||
| JPS5217085A (en) * | 1975-07-30 | 1977-02-08 | Ono Pharmaceut Co Ltd | Method of quantitative determination of free fatty acids in serum usin g fatty acid activating enzymes |
-
1979
- 1979-05-25 JP JP6465179A patent/JPS55156598A/ja active Granted
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS4964495A (ja) * | 1972-06-19 | 1974-06-21 | ||
| JPS5217085A (en) * | 1975-07-30 | 1977-02-08 | Ono Pharmaceut Co Ltd | Method of quantitative determination of free fatty acids in serum usin g fatty acid activating enzymes |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS55156598A (en) | 1980-12-05 |
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