JPS6331737B2 - - Google Patents
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Description
本発明は新規な液体クロマトグラフイー用充填
剤ならびに該充填剤を用いた液体クロマトグラフ
イー、特に高速液体クロマトグラフイーによる生
体試料の分析法に関する。更に詳しくは、液体ク
ロマトグラフイーにより病態特に腎障害、肝障害
等の病変の指標を得るに際し、生体試料中の病変
に関連したピークを鋭く分離し得る充填剤の提
供、ならびに該充填剤を用いて極めて少量の生体
試料を短時間に分析する方法に関する。生体試
料、即ち血漿、血清等の血液、脳脊髄液又は尿等
の性質、成分等を分析して、病態に関する情報を
得ることは病気の診断、治療上の指針として極め
て重要である。従来、該情報は多くの化学的或い
は生化学的分析手段により入手されているが、
様々な症例に対する病態の解明にあたり、該病態
の適確な情報を得る分析方法が要求されていた。 特に、腎臓や肝臓疾患では病態が複雑であるだ
けに新しい指標の開発に対する要望が強かつた。
即ち、従来の病態指標としては、腎臓疾患におい
ては血液の化学分析によるクレアチニン、尿酸、
電解質の値、尿中の蛋白質、糖及びPH値等の腎機
能検査値、また肝臓疾患においてはGOT（グルタ
ミツク―オキザロアセテイツク―トランスアミナ
ーゼ）、GPT（グルタミツク―ピルビツク―トラ
ンスアミナーゼ）、LDH（乳酸脱水素酵素）、LAP
（ロイシンアミノペプチターゼ）等の生体酵素活
性値や蛋白質ビリルピン等の血液成分の化学分析
値等の肝機能検査値がある。該検査値はそれなり
に診断、治療上の指針として重要な役割を果して
実用されている。しかし、近年腎臓疾患において
は各種の尿毒性毒素と病態とに深いかかわりのあ
ることが指摘されはじめたが、上記検査ではその
存在が確認出来ず、また該毒素の容易な分析法も
未だ開発されていない。また、肝臓疾患において
も各種の代謝異常物質や病因物質の存在が示唆さ
れながら適確な測定法がないのが現状である。即
ち、現状の化学的、生化学的分析法は有用ではあ
るが、なお不満足なものであると云わざるを得
ず、従つて新しい病態指標の開発が強く要望され
ている。 上述した現状にかんがみ、従来の化学的、生化
学的分析法とは異なる原理に基く分析手法の１つ
である液体クロマトグラフイーの利用が近年注目
されつつある。液体クロマトグラフイーは熱的、
化学的に不安定な物質であつても該物質を変質す
ることなく測定でき、しかも多成分を比較的少量
の試料で分析できる点で原理的には医学、臨床領
域への適合性の大なものである。しかし、該液体
クロマトグラフイーを医学、臨床領域へ適合して
実用に供する為には、クロマトグラフイー充填剤
の選択、分離条件の設定及び必要に応じて適切な
前処理法の確立等々未だ未解決の問題が多かつ
た。例えば、Chang1)らは、架橋デキストラン系
の多孔性ビーズを充填剤とする液体クロマトグラ
フイーにより、前述の腎疾患に伴う血液中に現わ
れる有害毒素の検査を試みた。〔１）T.M.S.
chang.etal.Trans.Amer.Artif.lnt.Organs，
VOLXX，364（1974）〕 その結果、Changらは正常の血清と異なり、腎
疾患者の血清には特有なピークが現われ、該特有
のピークが有害な性質をもつ物質を含んでいるこ
とを示唆した。しかし、Changらの方法はそれに
より得られる特有ピークが極めてブロードである
という欠点がある。更に該方法は用いる血清試料
も２〜３mlと比較的多量を要し、また分析時間も
４〜７時間かかるものであり、臨床分析法として
は満足すべきものと云い難かつた。 一方FU¨rst2)は高速液体クロマトグラフイーに
よる血清試料の分析法を提案した。〔２）P.
FU¨rst.Clinical Nephrology，Vol5(4)198（1976）〕
しかし、FU¨rstの方法はイオン交換性を有する高
速液体クロマトグラフイーに適する充填剤を用い
ることにより分析時間を短縮したが、Changらの
方法と同様多くのピークが重なり、各成分の分離
同定が困難であるという欠点がみられる。なお、
これらの方法は何ずれも臨床分析を意図したもの
でなかつた。即ち、従来から液体クロマトグラフ
イーによる生体試料の分析が試みられているが、
いずれも腎臓或いは肝臓疾患時の特有ピークを検
出することができても、病態の進行と関係付けら
れる成分（毒素）のきめ細かい分析ができず臨床
分析手法として実用化されるまでには至つていな
いのが現状である。 本発明者らは上記実情に鑑み、特に腎肝臓等の
疾患時の生体試料の臨床分析法として、極く少量
の試料により簡単且つ短時間で病態の進行と関連
あるピークを分離検出することを目的として鋭意
研究の結果、上記目的を達成し得る充填剤を見い
出し、本発明に到達したものである。 本発明はスチレン―ジビニルベンゼン系重合体
のメチロール化物よりなるビーズ状物に血清蛋白
質を担持させて成る液体クロマトグラフイー用充
填剤、並び該充填剤を用いる高速液体クロマトグ
ラフイーにより特に腎臓、肝臓疾患時の生体試料
を分析する方法を提供するものである。なお、こ
こでいう“担持”という用語は血清蛋白質が上記
ピース状物に吸着もしくは付着されている状態を
意味する。後述する如く、本発明は高性能の液体
クロマトグラフイー用充填剤の開発により、該充
填剤を用いた液体クロマトグラフイーによつて、
除蛋白質等の特別の前処理をほどこすことなく、
また10μ程度と云う極めて微量の生体試料から
30分程度の短時間に病態と相関する成分ピークを
鋭く分離検出可能とするものであり、医学、臨床
の分野に大いに貢献するものである。 以下、本発明を詳述する。 本発明の充填剤の基材は水系で使用可能なスチ
レン―ジビニルベンゼン系重合体又はポリエステ
ル系重合体やメタクリル酸系重合体のメチロール
化物であるが、中でも特にスチレン―ジビニルベ
ンゼン重合体のメチロール化物（以下充填剤基材
と称する）が最適である。該充填剤基材は公知の
方法により、例えばスチレン―ジビニルベンゼン
の混合物をラジカル重合開始剤の存在下で懸濁重
合させる等の方法によりビーズ状物とし、次いで
これをホルマリン等を用いてメチロール化するこ
とによつて得ることが出来る。また、充填剤基材
は高速液体クロマトグラフイー用充填剤として市
販されているものでも良い。この際、メチロール
化度及び粒径等は使用目的に応じて任意の範囲で
選択すれば良く、通常メチロール化度は0.05〜
0.5、粒径は５〜50μの範囲のものである。該充填
剤基材は、そのまま液体クロマトグラフイーの充
填剤として用いることも可能ではあるが、生体試
料の分析においては再現性、分離能の点で不安定
で、満足すべき結果を得ることが出来ない。即
ち、本発明により、該充填基材に更に血清蛋白質
を担持させることにより、上述したごとき緒欠点
が解消され、満足すべき結果が得られる。 本発明に係る血清蛋白質はアルブミン、グロブ
リン類等であつて、動物種に限定されることな
く、ヒト、牛、馬、犬又は羊等よりからも得るこ
とができる。該血清蛋白質を上記充填剤基材に担
持させるにはその水系溶液を用いる。ここで用い
る血清蛋白質の水系溶液とは、水、緩衝液、又は
緩衝液に過塩素酸ナトリウムの如き塩成分若しく
はメタノール、エタノール、プロパノール、ジオ
キサン等の有機溶剤を加えたものに該血清蛋白質
を溶解したものである。上記血清蛋白質の水系溶
液の濃度は薄いと血清蛋白質を均質に充填剤基材
に担持しうるが担持のための処理時間は長くな
る。一方、濃度が濃いと短時間に担持処理できる
が血清蛋白質の担持が不均一となり易い。従つ
て、上記血清蛋白質の水系溶液の濃度は通常0.2
〜5wt％の濃度が好ましいが、この範囲に限定さ
れるものではない。 次に、血清蛋白質の水系溶液を用いての上記担
持処理は充填剤基材自身が血清蛋白質を吸着する
性質を有するので、充填剤基材と血清蛋白質の水
系溶液を接触させるだけで良く、特に限定される
ものでない。例えば、ビーカー等の容器中で該蛋
白質水系溶液と充填剤基材を撹拌下に接触させた
後、過等により充填剤基材を分離し、充分水洗
することにより本発明の充填剤を得ることが出来
る。本発明の充填剤は、分析に適したカラムに充
填することにより本発明の目的に適する液体クロ
マトグラフイー用充填カラムとなる。なお、本発
明の充填剤のカラム充填に際しては血清蛋白質の
吸着により充填剤粒子同志の凝集性が増すことが
あるので、均一な充填になるように注意しなけれ
ばならない。この充填時のトラブルを防ぐために
は、予め充填剤基材をカラムに充填しておき、こ
れを通常の液体クロマトグラフイー装置に取付け
た後、血清蛋白質の水系溶液をカラムに流通させ
る方法を採用しても良い。この方法によると、血
清蛋白質の担持のための処理時間は比較的長くな
るが、測定のための準備が簡易となる利点があ
る。上記担持のための処理温度は血清蛋白質の変
質が起らない様に選ぶ必要があり、通常は５〜70
℃であるが、本発明の充填剤を用いた分析法に適
用する温度である20〜40℃が特に好ましい。 血清蛋白質の水系溶液のPHは血清蛋白質の変質
や凝集の起らない範囲であればよく、通常PH５〜
９の範囲で適宜選択する。なお、この際に該血清
蛋白質の等電点は勿論避けなければならない。ま
た、血清蛋白質の水系溶液として、本発明の充填
剤を用いた液体クロマトグラフイーによる測定に
おける移動相のPHに合わせた緩衝液を用いると定
常状態が得易く好適である。 上述したごとく、充填剤基材への血清蛋白質の
担持処理は、本発明の液体クロマトグラフイー用
充填剤の安定性を考慮してできるだけ分析時の条
件で行うことが好ましい。本発明の充填剤におけ
る血清蛋白質の担持量、すなわち、吸着量ないし
付着量は充填剤基材ならびに血清蛋白質の種類に
より若干異なるが、通常乾燥体基準で0.1〜1wt％
好ましくは0.2〜0.5wt％である。 本発明の充填剤を充填して成るカラムは市販の
液体クロマトグラフイー装置又は同等の機能を有
する任意の装置にセツトすることにより、本発明
の目的とする生体試料の分析が可能であり、極く
少量の生体試料から簡単且つ短時間で病態の進行
と関連あるピークを分離検出できる。なお、本発
明で云う生体試料とは血清、血漿等の血液、脳脊
髄液、リンパ液、腹水及び尿等である。 次に、本発明による上記充填剤を用いた液体ク
ロマトグラフイー、特に高速液体クロマトグラフ
イーによる生体試料の分析法は下記の如き条件で
実施できるが、これは本発明の分析法の一実施態
様を示すものであり、特に限定されるものではな
い。即ち、移動相としては水、緩衝液、又は緩衝
液に過塩素酸ナトリウムなどの塩成分若しくはメ
タノール、エタノール、イソプロパノール、ジオ
キサンなどの有機溶剤を加えたものが好ましい。
特に好ましい移動相はリン酸緩衝液であり、極め
て良好に分離したピークを得ることが出来る。な
お、本発明の充填剤は蛋白質を含むため長期の使
用に際しては微生物による分解等の好ましくない
変化が起こる可能性を有するので、この場合は移
動相にナトリウム・アジト等の制菌剤を微量添加
しておくことが好ましい。分析温度は20〜40℃で
あり、生体試料は１〜15μ程度で良い。 なお、分離ピークの検出は紫外及び可視吸光光
度計よりなる検出器の外に、示差屈折率、螢光分
光光度計、赤外分光光度計、放射能検出器、ポー
ラログラフイー、又は伝導率等任意に選択して用
いることが出来る。 また、データの定量化の為、検出器にデータ処
理機を連結してピーク面積を数値化することもで
きる。 本発明の充填剤は上記臨床分析への利用に限ら
ず、例えば大型のカラムに充填して各成分の分取
等にも用いることが出来る。 以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説
明する。 実施例 １ 公知の方法により得たスチレン―ジビニルベン
ゼン共重合ポリマービースのメチロール化物（粒
径10〜15μ）を常法により４mmφ×50cmのステン
レス製カラムに充填し、紫外線検出器を備えた高
速液体クロマト装置にセツトする。 上述のごとく形成したカラムの流路にリン酸塩
緩衝液（PH7.4）を1.2ml／minで流し、記録計及
び面積積分計が安定の後、サンプル注入口より10
％人血清アルブミン溶液を注入する。この10％ア
ルブミン溶液の注入をくりかえし、記録計でのピ
ーク高さ又は面積積分計での面積値が一定になつ
たところでアルブミンによる表面処理を終了す
る。 次に表面処理の終了したカラムを用い、正常人
血清及び透析治療を行なつている慢性腎不全患者
血清の分析を前記高速液体クロマト装置により行
なつた。 その結果、分析時間30分で図―１に示すような
チヤートが得られた。又、表―１には各ピークの
流出時間及び面積積分値を示した。図―１、表―
１より、ピークａ，ｄ，ｅについては正常血清、
腎不全血清の両方について認められ、これに対し
てｂ，ｃ，ｆ及びｇについては腎不全血清のみに
認められた。これら腎不全血清のみに認められる
ピークの分離と数値化が従来の検査値以外の臨床
検査値として有用であることを示唆していた。比
較の為、本発明の血清蛋白質を担持させないスチ
レン―ジビニルベンゼン共重合体ビースメチロー
ル化物を充填剤として用い透析治療を行なつてい
る慢性腎不全者の血清の分析を前記高速液体クロ
マト装置で行なつた。その結果はピークａは本発
明の充填剤カラムを用いた場合に比べ低く、又ピ
ークｂ，ｃ，ｄ等の分離も不良であつた。
剤ならびに該充填剤を用いた液体クロマトグラフ
イー、特に高速液体クロマトグラフイーによる生
体試料の分析法に関する。更に詳しくは、液体ク
ロマトグラフイーにより病態特に腎障害、肝障害
等の病変の指標を得るに際し、生体試料中の病変
に関連したピークを鋭く分離し得る充填剤の提
供、ならびに該充填剤を用いて極めて少量の生体
試料を短時間に分析する方法に関する。生体試
料、即ち血漿、血清等の血液、脳脊髄液又は尿等
の性質、成分等を分析して、病態に関する情報を
得ることは病気の診断、治療上の指針として極め
て重要である。従来、該情報は多くの化学的或い
は生化学的分析手段により入手されているが、
様々な症例に対する病態の解明にあたり、該病態
の適確な情報を得る分析方法が要求されていた。 特に、腎臓や肝臓疾患では病態が複雑であるだ
けに新しい指標の開発に対する要望が強かつた。
即ち、従来の病態指標としては、腎臓疾患におい
ては血液の化学分析によるクレアチニン、尿酸、
電解質の値、尿中の蛋白質、糖及びPH値等の腎機
能検査値、また肝臓疾患においてはGOT（グルタ
ミツク―オキザロアセテイツク―トランスアミナ
ーゼ）、GPT（グルタミツク―ピルビツク―トラ
ンスアミナーゼ）、LDH（乳酸脱水素酵素）、LAP
（ロイシンアミノペプチターゼ）等の生体酵素活
性値や蛋白質ビリルピン等の血液成分の化学分析
値等の肝機能検査値がある。該検査値はそれなり
に診断、治療上の指針として重要な役割を果して
実用されている。しかし、近年腎臓疾患において
は各種の尿毒性毒素と病態とに深いかかわりのあ
ることが指摘されはじめたが、上記検査ではその
存在が確認出来ず、また該毒素の容易な分析法も
未だ開発されていない。また、肝臓疾患において
も各種の代謝異常物質や病因物質の存在が示唆さ
れながら適確な測定法がないのが現状である。即
ち、現状の化学的、生化学的分析法は有用ではあ
るが、なお不満足なものであると云わざるを得
ず、従つて新しい病態指標の開発が強く要望され
ている。 上述した現状にかんがみ、従来の化学的、生化
学的分析法とは異なる原理に基く分析手法の１つ
である液体クロマトグラフイーの利用が近年注目
されつつある。液体クロマトグラフイーは熱的、
化学的に不安定な物質であつても該物質を変質す
ることなく測定でき、しかも多成分を比較的少量
の試料で分析できる点で原理的には医学、臨床領
域への適合性の大なものである。しかし、該液体
クロマトグラフイーを医学、臨床領域へ適合して
実用に供する為には、クロマトグラフイー充填剤
の選択、分離条件の設定及び必要に応じて適切な
前処理法の確立等々未だ未解決の問題が多かつ
た。例えば、Chang1)らは、架橋デキストラン系
の多孔性ビーズを充填剤とする液体クロマトグラ
フイーにより、前述の腎疾患に伴う血液中に現わ
れる有害毒素の検査を試みた。〔１）T.M.S.
chang.etal.Trans.Amer.Artif.lnt.Organs，
VOLXX，364（1974）〕 その結果、Changらは正常の血清と異なり、腎
疾患者の血清には特有なピークが現われ、該特有
のピークが有害な性質をもつ物質を含んでいるこ
とを示唆した。しかし、Changらの方法はそれに
より得られる特有ピークが極めてブロードである
という欠点がある。更に該方法は用いる血清試料
も２〜３mlと比較的多量を要し、また分析時間も
４〜７時間かかるものであり、臨床分析法として
は満足すべきものと云い難かつた。 一方FU¨rst2)は高速液体クロマトグラフイーに
よる血清試料の分析法を提案した。〔２）P.
FU¨rst.Clinical Nephrology，Vol5(4)198（1976）〕
しかし、FU¨rstの方法はイオン交換性を有する高
速液体クロマトグラフイーに適する充填剤を用い
ることにより分析時間を短縮したが、Changらの
方法と同様多くのピークが重なり、各成分の分離
同定が困難であるという欠点がみられる。なお、
これらの方法は何ずれも臨床分析を意図したもの
でなかつた。即ち、従来から液体クロマトグラフ
イーによる生体試料の分析が試みられているが、
いずれも腎臓或いは肝臓疾患時の特有ピークを検
出することができても、病態の進行と関係付けら
れる成分（毒素）のきめ細かい分析ができず臨床
分析手法として実用化されるまでには至つていな
いのが現状である。 本発明者らは上記実情に鑑み、特に腎肝臓等の
疾患時の生体試料の臨床分析法として、極く少量
の試料により簡単且つ短時間で病態の進行と関連
あるピークを分離検出することを目的として鋭意
研究の結果、上記目的を達成し得る充填剤を見い
出し、本発明に到達したものである。 本発明はスチレン―ジビニルベンゼン系重合体
のメチロール化物よりなるビーズ状物に血清蛋白
質を担持させて成る液体クロマトグラフイー用充
填剤、並び該充填剤を用いる高速液体クロマトグ
ラフイーにより特に腎臓、肝臓疾患時の生体試料
を分析する方法を提供するものである。なお、こ
こでいう“担持”という用語は血清蛋白質が上記
ピース状物に吸着もしくは付着されている状態を
意味する。後述する如く、本発明は高性能の液体
クロマトグラフイー用充填剤の開発により、該充
填剤を用いた液体クロマトグラフイーによつて、
除蛋白質等の特別の前処理をほどこすことなく、
また10μ程度と云う極めて微量の生体試料から
30分程度の短時間に病態と相関する成分ピークを
鋭く分離検出可能とするものであり、医学、臨床
の分野に大いに貢献するものである。 以下、本発明を詳述する。 本発明の充填剤の基材は水系で使用可能なスチ
レン―ジビニルベンゼン系重合体又はポリエステ
ル系重合体やメタクリル酸系重合体のメチロール
化物であるが、中でも特にスチレン―ジビニルベ
ンゼン重合体のメチロール化物（以下充填剤基材
と称する）が最適である。該充填剤基材は公知の
方法により、例えばスチレン―ジビニルベンゼン
の混合物をラジカル重合開始剤の存在下で懸濁重
合させる等の方法によりビーズ状物とし、次いで
これをホルマリン等を用いてメチロール化するこ
とによつて得ることが出来る。また、充填剤基材
は高速液体クロマトグラフイー用充填剤として市
販されているものでも良い。この際、メチロール
化度及び粒径等は使用目的に応じて任意の範囲で
選択すれば良く、通常メチロール化度は0.05〜
0.5、粒径は５〜50μの範囲のものである。該充填
剤基材は、そのまま液体クロマトグラフイーの充
填剤として用いることも可能ではあるが、生体試
料の分析においては再現性、分離能の点で不安定
で、満足すべき結果を得ることが出来ない。即
ち、本発明により、該充填基材に更に血清蛋白質
を担持させることにより、上述したごとき緒欠点
が解消され、満足すべき結果が得られる。 本発明に係る血清蛋白質はアルブミン、グロブ
リン類等であつて、動物種に限定されることな
く、ヒト、牛、馬、犬又は羊等よりからも得るこ
とができる。該血清蛋白質を上記充填剤基材に担
持させるにはその水系溶液を用いる。ここで用い
る血清蛋白質の水系溶液とは、水、緩衝液、又は
緩衝液に過塩素酸ナトリウムの如き塩成分若しく
はメタノール、エタノール、プロパノール、ジオ
キサン等の有機溶剤を加えたものに該血清蛋白質
を溶解したものである。上記血清蛋白質の水系溶
液の濃度は薄いと血清蛋白質を均質に充填剤基材
に担持しうるが担持のための処理時間は長くな
る。一方、濃度が濃いと短時間に担持処理できる
が血清蛋白質の担持が不均一となり易い。従つ
て、上記血清蛋白質の水系溶液の濃度は通常0.2
〜5wt％の濃度が好ましいが、この範囲に限定さ
れるものではない。 次に、血清蛋白質の水系溶液を用いての上記担
持処理は充填剤基材自身が血清蛋白質を吸着する
性質を有するので、充填剤基材と血清蛋白質の水
系溶液を接触させるだけで良く、特に限定される
ものでない。例えば、ビーカー等の容器中で該蛋
白質水系溶液と充填剤基材を撹拌下に接触させた
後、過等により充填剤基材を分離し、充分水洗
することにより本発明の充填剤を得ることが出来
る。本発明の充填剤は、分析に適したカラムに充
填することにより本発明の目的に適する液体クロ
マトグラフイー用充填カラムとなる。なお、本発
明の充填剤のカラム充填に際しては血清蛋白質の
吸着により充填剤粒子同志の凝集性が増すことが
あるので、均一な充填になるように注意しなけれ
ばならない。この充填時のトラブルを防ぐために
は、予め充填剤基材をカラムに充填しておき、こ
れを通常の液体クロマトグラフイー装置に取付け
た後、血清蛋白質の水系溶液をカラムに流通させ
る方法を採用しても良い。この方法によると、血
清蛋白質の担持のための処理時間は比較的長くな
るが、測定のための準備が簡易となる利点があ
る。上記担持のための処理温度は血清蛋白質の変
質が起らない様に選ぶ必要があり、通常は５〜70
℃であるが、本発明の充填剤を用いた分析法に適
用する温度である20〜40℃が特に好ましい。 血清蛋白質の水系溶液のPHは血清蛋白質の変質
や凝集の起らない範囲であればよく、通常PH５〜
９の範囲で適宜選択する。なお、この際に該血清
蛋白質の等電点は勿論避けなければならない。ま
た、血清蛋白質の水系溶液として、本発明の充填
剤を用いた液体クロマトグラフイーによる測定に
おける移動相のPHに合わせた緩衝液を用いると定
常状態が得易く好適である。 上述したごとく、充填剤基材への血清蛋白質の
担持処理は、本発明の液体クロマトグラフイー用
充填剤の安定性を考慮してできるだけ分析時の条
件で行うことが好ましい。本発明の充填剤におけ
る血清蛋白質の担持量、すなわち、吸着量ないし
付着量は充填剤基材ならびに血清蛋白質の種類に
より若干異なるが、通常乾燥体基準で0.1〜1wt％
好ましくは0.2〜0.5wt％である。 本発明の充填剤を充填して成るカラムは市販の
液体クロマトグラフイー装置又は同等の機能を有
する任意の装置にセツトすることにより、本発明
の目的とする生体試料の分析が可能であり、極く
少量の生体試料から簡単且つ短時間で病態の進行
と関連あるピークを分離検出できる。なお、本発
明で云う生体試料とは血清、血漿等の血液、脳脊
髄液、リンパ液、腹水及び尿等である。 次に、本発明による上記充填剤を用いた液体ク
ロマトグラフイー、特に高速液体クロマトグラフ
イーによる生体試料の分析法は下記の如き条件で
実施できるが、これは本発明の分析法の一実施態
様を示すものであり、特に限定されるものではな
い。即ち、移動相としては水、緩衝液、又は緩衝
液に過塩素酸ナトリウムなどの塩成分若しくはメ
タノール、エタノール、イソプロパノール、ジオ
キサンなどの有機溶剤を加えたものが好ましい。
特に好ましい移動相はリン酸緩衝液であり、極め
て良好に分離したピークを得ることが出来る。な
お、本発明の充填剤は蛋白質を含むため長期の使
用に際しては微生物による分解等の好ましくない
変化が起こる可能性を有するので、この場合は移
動相にナトリウム・アジト等の制菌剤を微量添加
しておくことが好ましい。分析温度は20〜40℃で
あり、生体試料は１〜15μ程度で良い。 なお、分離ピークの検出は紫外及び可視吸光光
度計よりなる検出器の外に、示差屈折率、螢光分
光光度計、赤外分光光度計、放射能検出器、ポー
ラログラフイー、又は伝導率等任意に選択して用
いることが出来る。 また、データの定量化の為、検出器にデータ処
理機を連結してピーク面積を数値化することもで
きる。 本発明の充填剤は上記臨床分析への利用に限ら
ず、例えば大型のカラムに充填して各成分の分取
等にも用いることが出来る。 以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説
明する。 実施例 １ 公知の方法により得たスチレン―ジビニルベン
ゼン共重合ポリマービースのメチロール化物（粒
径10〜15μ）を常法により４mmφ×50cmのステン
レス製カラムに充填し、紫外線検出器を備えた高
速液体クロマト装置にセツトする。 上述のごとく形成したカラムの流路にリン酸塩
緩衝液（PH7.4）を1.2ml／minで流し、記録計及
び面積積分計が安定の後、サンプル注入口より10
％人血清アルブミン溶液を注入する。この10％ア
ルブミン溶液の注入をくりかえし、記録計でのピ
ーク高さ又は面積積分計での面積値が一定になつ
たところでアルブミンによる表面処理を終了す
る。 次に表面処理の終了したカラムを用い、正常人
血清及び透析治療を行なつている慢性腎不全患者
血清の分析を前記高速液体クロマト装置により行
なつた。 その結果、分析時間30分で図―１に示すような
チヤートが得られた。又、表―１には各ピークの
流出時間及び面積積分値を示した。図―１、表―
１より、ピークａ，ｄ，ｅについては正常血清、
腎不全血清の両方について認められ、これに対し
てｂ，ｃ，ｆ及びｇについては腎不全血清のみに
認められた。これら腎不全血清のみに認められる
ピークの分離と数値化が従来の検査値以外の臨床
検査値として有用であることを示唆していた。比
較の為、本発明の血清蛋白質を担持させないスチ
レン―ジビニルベンゼン共重合体ビースメチロー
ル化物を充填剤として用い透析治療を行なつてい
る慢性腎不全者の血清の分析を前記高速液体クロ
マト装置で行なつた。その結果はピークａは本発
明の充填剤カラムを用いた場合に比べ低く、又ピ
ークｂ，ｃ，ｄ等の分離も不良であつた。
【表】
実施例 ２
実施例１と同様の手法により得た充填剤入りカ
ラムを用い、軽度の腎不全から病態が進行し、入
院から透析治療に至つた患者についての血清の分
析を行ない、病態の変化に追跡した。又同時に尿
素（BUN）クレアチニンについても生化学分析
を行なつた。 その結果、表―２に示されるように本発明によ
る充填剤を用いての高速液体クロマト分析、臨床
検査値及び所見をみると症状、臨床検査の悪化に
対応して異常ピークが増加し、臨床検査手段とし
ての有用性が示された。
ラムを用い、軽度の腎不全から病態が進行し、入
院から透析治療に至つた患者についての血清の分
析を行ない、病態の変化に追跡した。又同時に尿
素（BUN）クレアチニンについても生化学分析
を行なつた。 その結果、表―２に示されるように本発明によ
る充填剤を用いての高速液体クロマト分析、臨床
検査値及び所見をみると症状、臨床検査の悪化に
対応して異常ピークが増加し、臨床検査手段とし
ての有用性が示された。
【表】
実施例 ３
Ｄ―ガラクトサミンをJCL―SD系雌ラツトに
1000mg／Kg投与し、肝障害のモデルをつくり、投
与前，正常時，肝障害時及び回復期の血清につい
て実施例１と同様に調整した液体クロマトカラム
を用い、分析を行ない、その結果、図―２に示す
ようなチヤートを得、又表―３に示すような各ピ
ークの面積値を得た。別に各血清についてGOT，
GPT及びビリルビンの化学分析を行なつた。 図―２及び表―３に示されるようにＤ―ガラク
トサミン投与による肝障害の血清において正常時
及び回復時に比べGOT，GPT、ビリルビン値が
明らかな異常を示すのに対応して、流出時間５分
以降のピークは大きく変化した。 このように本発明の充填剤を用いた高速液体ク
ロマト分析により肝障害時においても病態変化に
対応するクロマトパターンが得られた。一方、ア
ルブミンの担持処理しないスチレン―ジビニルベ
ンゼン共重合体ビーズのメチロール化物を充填剤
として用いて、上記血清の分析を行なつたが、実
施例１の場合と同様にピーク１が低く、又ピーク
２，３，４及び７，８の分離が悪く、本発明の有
効性が示された。
1000mg／Kg投与し、肝障害のモデルをつくり、投
与前，正常時，肝障害時及び回復期の血清につい
て実施例１と同様に調整した液体クロマトカラム
を用い、分析を行ない、その結果、図―２に示す
ようなチヤートを得、又表―３に示すような各ピ
ークの面積値を得た。別に各血清についてGOT，
GPT及びビリルビンの化学分析を行なつた。 図―２及び表―３に示されるようにＤ―ガラク
トサミン投与による肝障害の血清において正常時
及び回復時に比べGOT，GPT、ビリルビン値が
明らかな異常を示すのに対応して、流出時間５分
以降のピークは大きく変化した。 このように本発明の充填剤を用いた高速液体ク
ロマト分析により肝障害時においても病態変化に
対応するクロマトパターンが得られた。一方、ア
ルブミンの担持処理しないスチレン―ジビニルベ
ンゼン共重合体ビーズのメチロール化物を充填剤
として用いて、上記血清の分析を行なつたが、実
施例１の場合と同様にピーク１が低く、又ピーク
２，３，４及び７，８の分離が悪く、本発明の有
効性が示された。
第１図は実施例１で得られる高速液体クロマト
グラフイーのクロマトグラムであつて、ａ は正
常の血清、ｂ は腎不全血清の試料である。 第２図は実施例３で得られる高速液体クロマト
グラフイーのクロマトグラムであつて、ａ は正
常時の血清、ｂ は肝障害時の血清、ｃ は回復
時の血清試料である。
グラフイーのクロマトグラムであつて、ａ は正
常の血清、ｂ は腎不全血清の試料である。 第２図は実施例３で得られる高速液体クロマト
グラフイーのクロマトグラムであつて、ａ は正
常時の血清、ｂ は肝障害時の血清、ｃ は回復
時の血清試料である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ビーズ状形体に成形したスチレン―ジビニル
ベンゼン系重合体のメチロール化物に血清蛋白質
を担持させて成る液体クロマトグラフイー用充填
剤。 ２ 血清蛋白質がアルブミン又はグロブリンもし
くはそれらの混合物である特許請求の範囲第１項
に記載の液体クロマトグラフイー用充填剤。 ３ 前記血清蛋白質の担持量が、通常乾燥体基準
で0.1〜1wt％である特許請求の範囲第１項に記載
の液体クロマトグラフイー用充填剤。 ４ ビーズ状形体に成形したスチレン―ジビニル
ベンゼン系重合体のメチロール化物に血清蛋白質
を担持させて成るものを充填剤として用いること
を特徴とする液体クロマトグラフイーによる生体
試料の分析法。 ５ 生体試料が血液、脳脊髄液、リンパ液、腹水
もしくは尿である特許請求の範囲第４項に記載の
分析法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1316179A JPS55106357A (en) | 1979-02-07 | 1979-02-07 | Filler for liquid chromatography |
| GB8003946A GB2042557B (en) | 1979-02-07 | 1980-02-06 | Filler composition for use in liquid chromatography |
| CA000345165A CA1145737A (en) | 1979-02-07 | 1980-02-06 | Filling composition for use in liquid chromatography |
| DE3004356A DE3004356C2 (de) | 1979-02-07 | 1980-02-06 | Füllmasse zum Füllen einer Flüssigkeitschromatographiesäule, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung zur Durchführung einer Flüssigkeitschromatographie |
| FR8002734A FR2448718A1 (fr) | 1979-02-07 | 1980-02-07 | Composition pour le garnissage des colonnes de chromatographie liquide et procede chromatographique l'utilisant |
| IT19759/80A IT1150076B (it) | 1979-02-07 | 1980-02-07 | Composizione di riempimento per colonne di cromatografia in fase liquida |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1316179A JPS55106357A (en) | 1979-02-07 | 1979-02-07 | Filler for liquid chromatography |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS55106357A JPS55106357A (en) | 1980-08-15 |
| JPS6331737B2 true JPS6331737B2 (ja) | 1988-06-27 |
Family
ID=11825439
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1316179A Granted JPS55106357A (en) | 1979-02-07 | 1979-02-07 | Filler for liquid chromatography |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS55106357A (ja) |
| CA (1) | CA1145737A (ja) |
| DE (1) | DE3004356C2 (ja) |
| FR (1) | FR2448718A1 (ja) |
| GB (1) | GB2042557B (ja) |
| IT (1) | IT1150076B (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE457797B (sv) * | 1982-01-13 | 1989-01-30 | Kureha Chemical Ind Co Ltd | Foerfarande foer framstaellning av poroest substrat innefattande paerlor som har metylolgrupper av sampolymer paa basis av tvaerbunden styren och anvaendni ng av substratet vid vaetskekromatografi |
| JPS58120607A (ja) * | 1982-01-13 | 1983-07-18 | Kureha Chem Ind Co Ltd | 蛋白質吸着能を有する液体クロマトグラフィー用担体及びその製造方法 |
| JPS58147647A (ja) * | 1982-02-26 | 1983-09-02 | Kureha Chem Ind Co Ltd | 分析用担体及びその製造方法 |
| DE19605003A1 (de) * | 1996-01-30 | 1997-08-07 | Abion Ohg | Im Durchfluß beladbares Trägermaterial für Festphasenassays |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3442819A (en) * | 1965-03-26 | 1969-05-06 | Mount Sinai Hospital Research | Molecular sieve coated particulate adsorbent and processes using same |
| FR2388584A1 (fr) * | 1977-04-26 | 1978-11-24 | Mo Khim T | Procede de preparation de sorbants compatibles avec le sang pour l'extraction des toxines exo- et endogenes |
-
1979
- 1979-02-07 JP JP1316179A patent/JPS55106357A/ja active Granted
-
1980
- 1980-02-06 CA CA000345165A patent/CA1145737A/en not_active Expired
- 1980-02-06 GB GB8003946A patent/GB2042557B/en not_active Expired
- 1980-02-06 DE DE3004356A patent/DE3004356C2/de not_active Expired
- 1980-02-07 FR FR8002734A patent/FR2448718A1/fr active Granted
- 1980-02-07 IT IT19759/80A patent/IT1150076B/it active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA1145737A (en) | 1983-05-03 |
| FR2448718A1 (fr) | 1980-09-05 |
| IT1150076B (it) | 1986-12-10 |
| IT8019759A0 (it) | 1980-02-07 |
| FR2448718B1 (ja) | 1985-03-01 |
| GB2042557A (en) | 1980-09-24 |
| DE3004356A1 (de) | 1980-08-14 |
| GB2042557B (en) | 1983-01-26 |
| DE3004356C2 (de) | 1982-04-01 |
| JPS55106357A (en) | 1980-08-15 |
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